Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Viimeaikaiset kliiniset kokeet osoittivat, että peräkkäinen yhdistelmä kasvutekijän reseptori tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI) ja kemoterapia voisi pidentää PFS ja /tai OS kehittyneen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla, joilla on EGFR-mutaatio. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida optimaalinen yhdistelmä järjestyksessä ja tutkia sen mahdollinen mekanismi.

Methods

PC-9 solua ja A549-soluja, keuhkon adenokarsinooma soluja mutantti ja laaja-tyyppinen EGFR vastaavasti hoidettiin dosetakselilla /gefitinibin yksinään tai eri yhdistelmänä aikatauluja. EGFR ja K-ras-geenin asema määritettiin qPCR-HRM tekniikalla. Soluproliferaatiota havaittiin MTT-määrityksellä. Ilmaisu ja fosforylaatio EGFR, ERK, Akt: n ja IGF-1 R havaittiin Western blot. Solusyklin jakautuminen havaittiin virtaussytometrialla.

Tulokset

Only peräkkäinen dosetakselista seurasi gefitinibin (D → G) indusoi merkittäviä synergististä vaikutusta molemmissa solulinjoissa (Combination Index 0,9). Päinvastaisessa järjestyksessä (G → D) johti antagonistista vuorovaikutusta molemmissa solulinjoissa (CI 1,1), kun taas samanaikainen (D + G) osoitti lisäainetta (0,9 CI 1,1) -synergistic vaikutus PC-9 solua ja antagonistinen-additiivinen vaikutus A549-soluja. Mekanismi tutkimukset osoittivat, että dosetakseli aiheuttama fosforylaatiota EGFR ja ERK oli tukahdutettu käytettiin myöhemmin gefitinibi, mutta ei samanaikainen altistuminen gefitinibin. Gefitinibi-tukahdutettu fosforylaatioon EGFR ja ERK purettiin ole samanaikainen eikä myöhempien dosetakselista. D + G vahvistivat estoa fosforylaation IGF-1 R PC-9 solua.

Johtopäätökset

sytostaattien seurasi EGFR-TKI voi olla optimaalinen yhdistelmä antiproliferatiivisia vaikutuksia EGFR -mutant NSCLC-solut, ja fosforylaatiota EGFR ja ERK saattaisi edistää tätä vaikutusta.

Citation: Chen B, Zheng J, Zeng Y, Li B, Xie B, Zheng J, et al. (2014) Sequence-Dependent Antiproliferative vaikutukset Gefitinibin ja Doketakseli on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) Solut ja mahdollinen mekanismi. PLoS ONE 9 (12): e114074. doi: 10,1371 /journal.pone.0114074

Editor: Karl X. Chai, University of Central Florida, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 03 marraskuu 2014; Julkaistu: 04 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro. 81172225, 81101821 ja 81000819) (https://www.nsfc.gov. cn /). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti. On tunnettua, että edenneen NSCLC, epidermaalisen kasvutekijän reseptorin tyrosiinikinaasin estäjä (EGFR-TKI) ja kemoterapian suositellaan ensilinjan hoitoa potilaille, joilla on aktiivinen EGFR-mutaatio ja villin tyypin EGFR, vastaavasti. Tämä suositus perustuu tulokset vaiheen III satunnaistetussa tutkimuksessa IPASS jossa potilaalla on EGFR mutaatioita, jotka saivat gefitinibi nousseen ilman taudin etenemistä (PFS 24,9% vs. 6,7%), vaste (RR 71,2% vs. 47,3%) ja elämänlaatu verrattuna niihin, jotka saavat kemoterapiaa [1]. Kuitenkin sovellettaessa platinapohjaisen kemoterapian ja EGFR-TKI on saavuttanut terapeuttisen tasanteen. Vaikka mitään uutta versiota ilmestyy viimeksi ohjeen, jotkut vaiheen III kliinistä tutkimusta lukien FASTACT-2 [2] ja ilmoittaa [3] ovat ottaneet uuden askeleen ja osoittivat, että kemoterapia yhdessä EGFR-TKI tietyillä aikataulujen voisi parantaa ennustetta, varsinkin potilailla, joilla on EGFR mutaatioita. Niinpä me olettaa, että lisäparannukset saattaa tulla havaintoja uuden tavoitteen, voittaminen EGFR-TKI: toleranssi ja yhdistelmä EGFR-TKI kemoterapiaa, koska mekanismeja niiden antituumorivaikutus ovat erilaiset.

sillä yhdistelmähoito, pohjimmiltaan kolme aikatauluja keskusteltiin viime kliinisissä tutkimuksissa: 1. samanaikainen; 2. kemoterapiaa seurasi EGFR-TKI; 3. EGFR-TKI jälkeen kemoterapiaa. INTACT-2, TRIBUTE ja TALENT tutkimukset osoittivat, että vaste ja yleinen (OS) suosi samanaikainen yhdistelmä ainoastaan ​​EGFR-mutantti potilaita, mutta ei villityypin tai valitsematta potilailla [4] – [6]. WJTOG0203 ja INFORM kokeet osoittivat, että peräkkäinen kemoterapian seurasi EGFR-TKI tuntui hyödyllistä valitsematta väestölle (tarvitaan huomattavasti nykyistä OS ja PFS) [7], [3]. Toinen vaiheen III tutkimuksessa FASTACT-2 raportoi äskettäin, että intercalated kemoterapiaa ja erlotinibin oli toinen elinkelpoinen ensilinjan vaihtoehto potilaille, joilla on tuntematon EGFR tila. Kävi ilmi, että PFS ja OS merkittävästi pidentynyt kemoterapiaa plus erlotinibin vs. kemoterapiaa plus lumelääke (PFS: 7,6 m vs. 6,0 m, P 0,0001; OS: 18,3 m vs. 15,2 m, P = 0,042). Hyöty oli jopa suurin EGFR-mutantti potilailla [2]. Sen sijaan, Kanda et ai osoittivat faasin II tutkimuksessa että gefitinibi jälkeen kemoterapiaa saaneet parempaa PFS EGFR-mutantti potilailla verrattuna aikaisempien raporttien avulla gefitinibin yksin ensimmäisenä hoitona [8]. Kuitenkin nyt ei kliininen tutkimus on vertaillut kolmen aikataulun keskenään ja kertoi kumpi oli optimaalinen. Tältä osin ensimmäinen tavoite Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää optimaalinen aikataulu kolmesta eri yhdistelmästrategioista doketakselin ja gefitinibin.

Toisaalta, solumekanismin sekvenssi riippuvainen vaikutus gefitinibin yhdessä kemoterapia-aineiden edelleen avoin kysymys. Jotkin aiemmat tutkimukset osoittivat, että synergistinen aiheutuvaa peräkkäin annetaan EGFR-TKI seuraavat sytotoksisia voidaan korreloida EGFR fosforylaatiota, kun taas antagonistivaikutusta EGFR-TKI jälkeen kemoterapiaa liittyi kanssa säätelyyn solusyklin jakelun [9], [ ,,,0],10]. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset raportoitu, että insuliinin kaltaisen kasvutekijän reseptori-1 (IGF-1 R) vaikutti solun herkkyyttä kemoterapiaa sekä EGFR-TKI kautta sääntelyn signalointireitin kuten PI3K /AKT ja MARK /ERK [11], [12]. Perustamalla Näiden havaintojen meidän toinen tavoite on mittapää solumekanismin sekvenssi-riippuvia vaikutuksia dosetakselin ja gefitinibin keuhkosyöpään solujen kautta arvio mahdollisista muutoksista edellä signalointireittejä ja solusyklin jakeluun.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Gefitinibi (Astra Zeneca, UK) ja doketakselin (Sanofi Aventis, Ranska) valmistettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (Sigma Aldrich, USA) ja säilytettiin – 20 ° C: ssa. Lääkkeet laimennettiin tuoreeseen elatusaineeseen ennen koetta, ja lopullinen DMSO-pitoisuus ei ylittänyt 0,1%.

Cell Culture

Ihmisen keuhkon adenokarsinoomasolulinjaan A549 ja PC-9 [13] ystävällisesti antanut Institute of Biokemian ja solubiologian (Shanghai, Kiina) ja National Cancer Center Hospital of Japan (Tokio, Japani), tässä järjestyksessä. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea ja Review Board of meidän sairaalassa. Soluja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan seerumia (Gibco, Grand Island, NY, USA) kostutetussa atmosfäärissä (Forma Scientific, Marietta, OH, USA), joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa .

tunnistaminen EGFR ja K-ras-geenin asema

DNA uutettiin A549 ja PC-9-soluissa käyttäen QIAmp kudoksen (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eksonit 18, 19, 20 ja 21 EGFR-geenin sekä eksonit 2 ja 3 K-ras-geenin havaittiin käyttäen kvantitatiivista PCR korkean resoluution sulava (qPCR-HRM) tekniikkaa.

MTT-määritys

A549 ja PC-9-soluja siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille (10

4 solua kuoppaa kohti) ja jaettiin 6 ryhmään ja käsiteltiin seuraavasti: 192 Kontrolliryhmä (C): solut, jotka inkuboitiin PBS: llä 72 h; 193 Doketakseli ryhmä (D): solut käsiteltiin dosetakselia 72 tuntia; 194 Gefitinibi ryhmä (G): solut käsiteltiin gefitinibin 72 tuntia; Doketakseli → Gefitinibi ryhmä (D → G): soluja inkuboitiin doketakseliin 24 tuntia, minkä jälkeen gefitinibi 48 tuntia; Gefitinibi → doketakseliryhmässä (G → D): solut inkuboitiin gefitinibin 48 tuntia sen jälkeen dosetakseli 24 tuntia; Samanaikainen ryhmä (D + G): soluja inkuboitiin samanaikaisesti doketakselin ja gefitinibin 72 tuntia. Solujen proliferaatio määritettiin MTT-määrityksellä. Optinen tiheys (OD) 490 nm: ssä määritettiin käyttäen 96-kuoppaista multiscanner auto-lukija (Dynatech MR 5000). Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Esto% = 100% – (OD

test-OD

tyhjä) /(OD

control-OD

tyhjä) x 100%. Jokainen koe toistettiin kolmena kappaleena.

laskeminen Combination Index (CI) B

antiproliferatiivisia vaikutuksia Yhdistetyn hoidon arvioitiin Combination Index (CI). Soluja käsiteltiin kolmella eri sekvenssejä, kuten edellä on mainittu: D → G; G → D; D + G. Lääke annokset yhdistettiin käyttäen jatkuva suhteita IC 50-arvot lasketaan MTT-määritys. Siten käytimme 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 ja 4 kertaa IC50 annosten doketakselin ja gefitinibin. Tulokset peräkkäisten hoitojen analysoitiin menetelmän mukaisesti Chou [14]. CI-arvo laskettiin käyttäen CompuSyn ohjelmistoa (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ, USA), jossa on CI 1,1, CI = 0,9-1,1 ja CI 0,9 ilmaisee antagonistista, lisäaineiden ja synergiavaikutukset, vastaavasti. Kukin koe toistettiin kolme kertaa.

Western blot

A549 ja PC-9-soluja lyysattiin puskurissa, joka sisälsi proteinaasi-inhibiittoreita. Proteiinin kokonaismäärän solujen saatiin käyttäen Nuclear Extract Kit (Active Motif Corp, USA). Proteiinipitoisuus määritettiin BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford, IL, USA). Näytteet, jotka sisälsivät 100 ug kokonaisproteiinia ajettiin elektroforeesissa 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle elektroforeesin. Blotteja tutkittiin käyttäen seuraavia vasta-aineita: anti-EGFR (1:1000; Santa Cruz, CA), anti-fosforyloitu-EGFR (1:1000), anti-ERK1 /2 (1:600), anti-fosforyloitu-ERK1 /2 (1:600), anti-AKT (1:1000), anti-fosforyloitu-AKT (1:1000), anti-IGF-1 R (1:600), anti-phosphorilated-IGF-1 R (1:600 ) ja anti-β-aktiini-vasta-aine (1:800) (kaikki edellä mainitut vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling Technology, USA), jonka jälkeen inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (Santa Cruz, CA, USA). Blotit visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi-kittiä (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Solusyklianalyysiä

Vasta valmistettu solut siirrettiin kylmäsäilytys putkiin. Kukin ryhmä koostui 3 putkia. Käsittelyjen jälkeen solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kiinnitettiin sitten 70%: lla alkoholilla 4 ° C: ssa yön yli. Kun oli sentrifugoitu 1000 rpm: ssä 5 minuutin ajan, soluja inkuboitiin propidiumjodidilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan pimeässä, ennen kuin sille tehdään virtaussytometrillä (FACScan, Becton Dickinson , Mountain View, CA). Solusyklin analysoitiin Multicycle-DNA Cell Cycle Analysoitu ohjelmisto. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Tilastollinen analyysi

väliset erot avulla analysoitiin ANOVA ja tiedot ilmoitetaan keskiarvona ±

SD

. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 13.0 ohjelmistoa (Chicago, IL). Erot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun

P

0,05.

Tulokset

EGFR ja K-ras-geenin asema A549- ja PC-9 solulinjojen

qPCR-HRM tekniikka osoitti, että A549-soluja kanna mutaatio K-ras eksonien 2 eikä mutaatio EGFR geenissä. PC-9 solua kanna mutaatiota EGFR eksonit 19 ja ei-mutaatio K-ras, mikä oli sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten [13].

vaikutukset eri altistumisen aikataulut gefitinibin ja doketakselin soluproliferaatioon

MTT-analyysi osoitti, että doketakseli (10

-4 M~10

-10 M) tai gefitinibin (10

-4 M~10

-8 M A549-soluja; 10

-4 M~10

-10 M PC-9 solua) yksinään merkittävästi inhiboivat A549 ja PC-9-solujen annoksesta riippuvaisella tavalla (

P

0,05). IC

50 Doketakselin ja gefitinibin olivat 2,05 x 10

-7 mol /l ja 1,22 x 10

-5 mol /l respe ctively varten A549-soluja (kuvio. 1A), ja olivat 2,41 x 10

-8 mol /l ja 5,65 x 10

-8 mol /l, tässä PC-9-soluissa (kuvio. 1 B). Erityisesti estävä vaikutus gefitinibin PC-9-soluissa oli lähes 10

3-taittuu voimakkaampi kuin että A549-soluja (

P

0,05).

Soluja käsiteltiin kaltevuus pitoisuuksilla (10

-4 M~10

-10 M) gefitinibin tai doketakselin 72 tuntia. Solujen proliferaatio määritettiin MTT-määrityksellä. (A) A549-soluja; (B) PC-9-soluja. *

P

0,05 verrattuna kontrolliryhmään.

Bars

: ± SD, n = 3.

sitten arvioitiin antiproliferatiivisia vaikutuksia eri altistumisen aikataulut gefitinibin ja doketakselin molemmin EGFR-TKI-resistenttejä (A549) ja EGFR -TKI herkkä (PC-9) solulinjat. Kuten kuvassa 2, vain peräkkäinen dosetakselista seurasi gefitinibin (D → G) aiheuttama selvä synergistinen vaikutus (CI 0,9) molemmissa solulinjoissa (estäviä vaikutuksia IC

50 oli 60,00 ± 4,90% A549- ja 62.15 ± 3,84% PC-9 solua). Päinvastoin, G → D järjestyksessä johti antagonistista vuorovaikutusta (CI 1,1) molemmissa solulinjoissa. Samanaikainen dosetakselista ja gefitinibin (D + G) osoittivat antagonistista ja lisäaine (0,9 CI 1,1) vaikutuksia A549-soluja lääkepitoisuudeksi lisääntynyt; kun taas PC-9 solua, D + G osoitti lisävaikutuksia pieniannoksisten yhdistelmänä ja yhteisvaikutukset suurina annoksina yhdistelmänä.

Soluja käsiteltiin kolmessa eri sarjoissa gefitinibin ja doketakselin (D → G; G → D ; D + G). Lääkkeen annokset yhdistettiin käyttäen vakio suhde IC 50-arvot (0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 ja 4 kertaa IC 50). (A, B) inhibitio määrä määritettiin MTT-määrityksellä. *

P

0,05, D → G versus G → D; #

P

0,05 D → G versus D + G. D → G, joka on tuotettu voimakkain estävää vaikutusta. (C, D) yhdistelmä-indeksi (CI) laskettiin käyttäen CompuSyn ohjelmistoa. Vain D → G-sekvenssi osoitti synergistisen vaikutuksen. (D-G) dosetakseli seurasi gefitinibi; (G-D) gefitinibin seurasi dosetakseli; (D + G) doketakseli ja gefitinibin antaa samanaikaisesti.

Bars

: ± SD, n = 3.

vaikutukset eri altistumisen aikataulut gefitinibin ja doketakselin solun signalointipolkujen

edelleen probed osaksi mahdollinen mekanismi sekvenssin riippuvaisen vaikutuksen gefitinibin ja doketakselin. Kuvio 3 osoitti, että molemmat solulinjat, dosetakseli yksinään parantaa fosforylaation EGFR ja ERK, kun taas gefitinibiä tukahdutettu fosforylaation näiden kahden proteiinin. D → G aikataulu, dosetakseli-tehostettu fosforylaatioon EGFR ja ERK merkittävästi tukahdutettu myöhemmin käytetään gefitinibin, ja tämä päinvastainen vaikutus oli paljon voimakkaampaa EGFR-mutantti PC-9 solua. Päinvastoin osalta G + D ja G → D aikatauluja, gefitinibi-tukahdutettu fosforylaatioon EGFR ja ERK purettiin ole samanaikainen eikä myöhemmin dosetakselista.

Ilmaisu ja fosfory- joitakin edustavia molekyylien korreloi solun signalointireittien, kuten EGFR, ERK, Akt: n ja IGF-1 R havaittiin western blot. (A) A549-soluja; (B) PC-9-soluja. (C) kontrolliryhmä; (D) dosetakseli yksinään; (G) gefitinibi yksin (D-G) dosetakseli seurasi gefitinibi; (G-D) gefitinibin seurasi dosetakseli; (D + G) doketakseli ja gefitinibin annetaan samanaikaisesti.

Sekä D → G ja D + G helpottavat merkittävästi estivät fosforylaation IGF-1 R PC-9 solua, kun taas A549-solut, kuten esto vaikutus oli tuskin havaittiin. Päinvastoin, G → D aikataulun lisäsi fosforylaation IGF-1 R molemmissa solulinjoissa. Lisäksi yksikään kolmesta aikataulujen osoitti havaittavaa vaikutusta ilmaisun ja fosforylaatiota AKT.

Vaikutukset eri aikataulujen gefitinibin ja doketakselin solusyklin distritution

Kuva 4 osoitti, että PC-9 solut, gefitinibi yksinään indusoi merkittävän G

0 /G

1 vaiheen pysähtymisen vertaamalla hallita ryhmään (86,94 ± 2,33% vs. 57.32 ± 3,79%,

P

0,05); vaikka dosetakseli yksinään indusoi merkittävän G

2 /M vaiheen pysähtymisen (45.67 ± 3,90% vs. 15,54 ± 2,57%,

P

0,05). D → G myös merkittävästi pidätetty solusyklin G

2 /M vaiheessa (56,31 ± 1,86% vs. 15,54 ± 2,57%,

P

0,05). Kuitenkin G → D osoitti pelkkä trendi nousi G

0 /G

1 vaihe (74,39 ± 2,78% vs. 57.32 ± 3,79%,

P

0,05).

vaikutukset eri antamisohjelmat gefitinibin ja doketakselin solusyklin jakautuminen havaittiin virtaussytometrialla. (C) kontrolliryhmä; (D) dosetakseli yksinään; (G) gefitinibi yksin (D-G) dosetakseli seurasi gefitinibi; (G-D) gefitinibin seurasi dosetakseli; (D + G) doketakseli ja gefitinibin antaa samanaikaisesti. *

P

0,05 verrattuna kontrolliryhmään. n = 3.

A549-soluja, gefitinibi yksinään ei ollut merkittäviä vaikutuksia solukierron jakeluun, kun taas pelkkää doketakselia indusoi merkittäviä G

2 /M vaiheen pysähtymisen vertaamalla hallita ryhmään (49,58 ± 2,70 % vs. 6,87 ± 1,35%,

P

0,05). D → G myös merkittävästi pidätetty solusyklin G

2 /M vaiheessa (60.74 ± 3,57% vs. 6,87 ± 1,35%,

P

0,05). Kuitenkin G → D osoitti pelkkä trendi nousi G

0 /G

1 vaihe (78,42 ± 2,52% vs. 72,13 ± 3,89%,

P

0,05).

keskustelu

Tässä tutkimuksessa selvitettiin sekvenssi riippuvia antiproliferatiivisia vaikutuksia gefitinibin ja doketakselin kolmessa eri yhdistelmänä aikatauluja sekä PC-9 solua (EGFR mutantti, K-ras WT) ja A549-soluja (EGFR WT, K-ras mutantti). Kun gefitinibin ja doketakselin käytettiin yksinään kahdessa solulinjoissa, estävää vaikutusta gefitinibin PC-9-soluissa oli dramaattisesti voimakkaampaa kuin että A549-soluja, mikä oli sopusoinnussa aikaisempien raporttien kanssa [1]. Kuitenkin IC50 gefitinibin oli vain puolet PC-9 verrattuna A549; vaikka kliinisessä työssä, gefitinibi on paljon tehokkaampaa potilailla, joilla EGFR-mutaatio kuin doketakseli. Meidän pitäisi tämä saattaa olla, koska

vitro

tutkimus, testaus agentit levitettiin suoraan kohdesoluihin, mutta

vivo

tutkimus agentit olivat yleensä annetaan kautta kierrätysjärjestelmään, jotka voivat vaikuttaa jakelu- ja keskittyminen eri aineita.

Tuloksemme osoittivat myös, että dosetakseli seurasi gefitinibin (D → G) oli merkittävästi parempi kuin muut liikennemuotojen osalta antituumorivaikutuksia paitsi EGFR mutantti ja K-ras WT PC-9-soluissa, mutta myös EGFR WT ja K-ras-mutantti A549-solut. Tämä oli mukaisesti useissa prekliinisissä tutkimuksissa, jotka otettiin paneelin eri keuhkosyövän solulinjat kemoterapiaa /EGFR-TKI ja ilmoitetaan, että sekvenssi kemoterapian → EGFR-TKI oli etua muihin tavoin [8], [9], [ ,,,0],15]. Jotkut faasin III kliinisissä tutkimuksissa myös WJTOG0203, INFORM ja FASTACT-2 on myös vahvistanut, että kaikki peräkkäiset kemoterapian seurasi EGFR-TKI paransi huomattavasti tulos [4] – [6]. Siksi meidän havainnot tuottanut vahvan prekliinisissä tukensa voittamisessa terapeuttista ylätasangolla EGFR-TKI ja kemoterapia, ja saattaa olla erityisen tärkeää torjuttaessa vastaan ​​tulenkestävien NSCLC. Sitä tarvitaan kuitenkin huomattava, että esillä olevassa tutkimuksessa, D → G synergia havaittiin myös EGFR villityypin solulinjat. Vaikka samanlaisia ​​tuloksia raportoitiin myös noin prekliinisissä ja kliinisissä kokeissa [8], [16], [17], monet tulokset osoittivat, että potilailla, joilla on villin tyypin EGFR voinut hyötyä EGFR-TKI käsittely [4] – [6] . Me olettaa, että se oli, koska tutkimuksessamme IC50 annoksia gefitnib kutakin solulinjaa levitettiin, mikä tarkoitti tuhat poimuihin gefitibiniä käytettiin A549-soluja verrattuna PC-9 solua. Ilmeisesti tällainen erittäin suuria annoksia ei voitu monistaa suoraan kliinisessä työssä, mutta suhteellisen korkea-annos EGFR-TKI on jo kokeiltu pienisoluista keuhkosyöpää aivojen etäpesäkkeitä ja positiiviset tulokset raportoitiin [18], [19]. Sen pitäisi olla erityisen hyödyllinen potilaille, joilla on villityypin EGFR jos vastaavia tiloja yritettiin ja onnistui niin alaryhmään.

Mitä tulee samanaikainen dosetakselista ja gefitinibin, tuloksemme tuntui sellainen monimutkainen, jossa lisäaine (0,9 CI 1,1) -synergistic vaikutus havaittiin PC-9 solua ja antagonistinen-additiivinen vaikutus A549-soluja. Tämä osoitti, että D + G oli tehokkaampi EGFR mutanttisoluja kuin villityypin soluissa. Tällaiset tiedot vastasivat muut prekliiniset raportit mikä osoitti, että EGFR-geenin asema saattaa olla ennustaja aktiivisuuden samanaikaisen yhdistelmän [9]. Vaikka varhainen vaiheen III tutkimuksessa ei voitu osoittaa hyväkseen samanaikaista yhdistelmän kemoterapia + EGFR-TKI yli kemoterapia yksin valitsematta potilailla alaryhmäanalyysi kunnianosoitus osoitti, että erlotinibin samanaikaisesti yhdistettynä kemoterapia koitui merkittävästi suurempi vaste potilailla, joilla oli mutantti EGFR kuin potilaat villityypin EGFR (53% vs. 18%,

P

0,01) [20]. Siksi oletetaan, että samanaikainen yhdistelmä, EGFR-mutaatio voi ennustaa terapeuttista hyötyä. Samoin tarvitaan myös huomattava, että annokset gefitinibin käytetty A549-soluja oli paljon korkeampi kuin PC-9-solut, jotka ovat saattaneet lyijyä D + G aiheuttama additiivinen vaikutus havaittiin A549-solut.

edelleen probed osaksi mekanismia taustalla synergiaa aiheuttama D → G aikataulu. On osoitettu, että EGFR-TKI kilpailukykyisesti sitoutuu EGFR ja tukossa useita alavirran signalointireitteihin kuten PI3K /Akt ja MARK /Erk, johti esto kasvainsoluproliferaation, kasvaimen verisuonten muodostumista ja etäpesäkkeiden [21], [22]. Aikataulu tutkimuksessa Jiang et al. paljasti, että synergian D → G aikataulu saattaa liittyä kanssa MAPK fosforylaation suhteen [15]. Tuloksemme osoittivat, että fosforylaatiota EGFR ja ERK (pEGFR ja Perk) tehostettiin doketakselia ja tukahdutettiin gefitinibi. Kun gefitibiniä käytettiin jälkeen dosetakseli (D → G), doketakseli-lisääntynyt pEGFR ja Perk oli tukahdutettu käytettiin myöhemmin gefitinibi. Kuitenkin, tämä kääntyminen ei havaittu kahta muuta aikataulut. Tämä oli mukaisesti Giovannetti n [8] ja Van Schaeybroeck n [23] tutkimuksia, jotka kertoivat, että vain ne solut osoittivat lisääntynyt pEGFR voisivat hyötyä peräkkäin käytetty EGFR-TKI. Siksi ehdotettiin, että kemoterapian aiheuttama säätely ylöspäin pEGFR ja Perk vahvistettu herkkyys keuhkosyöpään solujen myöhemmin käytetään EGFR-TKI, ja lopulta paransi tuloksia.

Western blot osoitti myös, että gefitinibi aiheuttama tukahduttaminen pEGFR ja Perk ei kumota samanaikainen altistuminen dosetakselia, se on siis oletetaan, että gefitinibi ei vahvistamiseksi estävää vaikutusta samanaikaisesti käytetään doketakselin johtuen vähäisestä pEGFR ja Perk A549-soluissa. Johdonmukaisesti, Van Schaeybroeck et al. [24] osoitti, että kolorektaalisyövässä soluissa, alas-säätely pEGFR johti antagonistista vuorovaikutusta EGFR-TKI ja sytostaattien. Päinvastoin, synergistinen aktiivisuus samanaikaisen annon havaittiin EGFR mutanttisoluista PC-9. Kuitenkin mukaan tuloksemme edellä mainittiin, EGFR ja ERK-fosforylaation ei ehkä ole mahdollista mekanismia. Oli useita todisteita, jotka osoittavat IGF-1 R ilmentyminen korreloi solujen herkkyyttä kemoterapiaa ja EGFR-TKI: [25], [26]. Häiriöitä IGF-1 R ilmentyminen tai IGF-1 R-estäjän että ennuste parani sytostaattien ja EGFR-TKI, joita voidaan korreloida tukahduttaminen PI3K /Akt-reitin [27], [28]. Esillä olevassa tutkimuksessa, D + G estivät merkittävästi fosforylaation IGF-1 R: PC-9-soluissa, kun taas A549-solut, kuten inhibitio vaikutus oli tuskin havaittavissa. Siksi oletetaan, että voimakas esto IGF-1 R fosforylaation voitaisiin edistää synergiaa saavutetaan PC-9 solua. Lisävahvistusta on perusteltua ylössäätöä ja alas-säätely pIGF-1R PC-9 solua.

G → D aikataulu osoittivat antagonistista vaikutusta sekä A549- ja PC-9 solua. Kuitenkin sääntely pEGFR ja Perk eivät toimittaneet uskottavaa selitystä gefitinibi aiheuttama alas-säätely pEGFR ja Perk ei kumota myöhemmin altistuminen doketakselia. Mukaisesti muiden Tutkijat ”aiemmissa tutkimuksissa [29] virtaussytometria analyysi osoitti, että gefitinibi laski solujen S ja G

2 /M vaiheessa. Tällainen vähennys solujen proliferatiivisen vaiheessa saattaa vaimentaa solun herkkyyttä myöhemmin käytetään doketakselin joka valikoivasti suunnattu G

2 /M vaiheessa olevien solujen, ja aiheuttaa antagonistisia vaikutuksia.

Johtopäätös

yhdessä meidän tiedot osoittivat, että joukossa yhdistelmä yksityiskohtaiset saatavilla kliinisessä työssä, tehokkain lähestymistapa oli sekvenssi käyttää sytostaattien seurasi EGFR-TKI. Fosforylaatio EGFR ja ERK voinut osaltaan tätä synergiaa. Koska vain kahta solulinjaa otettiin tässä tutkimuksessa, laajennus paneeli NSCLC solulinjojen eri EGFR asema sekä

vivo

tutkimuksia eläinmalleissa on perusteltua arvioidaan aikataulua riippuvainen vaikutus. On myös syytä vertailla kolmen yhdistelmä aikataulujen kliinisissä tutkimuksissa tunnistaa mahdolliset ”optimaalinen” hoitomuotoa potilailla, joilla on edennyt NSCLC.