Krooninen sairaus

tiivistelmä

TIG3 on tuumorisuppressoriproteiinia joka rajoittaa keratinosyyttien selviytyminen normaalin erilaistumisen. On myös tärkeää, syövän, kuten TIG3 alenee kasvaimissa ja ihosyöpä solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että menetys ilmentäminen voidaan tarvita syöpäsolujen hengissä. Tärkeä tavoite on tunnistaa kuinka TIG3 rajoittaa solujen eloonjäämistä. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että TIG3 ilmentymistä epidermaalinen okasolusyöpä SCC-13-solujen vähentää solujen lisääntymistä ja edistää morfologiset ja biokemialliset apoptoosin. Tunnistaa mekanismia, joka ajaa näitä muutoksia, osoitamme, että TIG3 paikallistaa lähellä sentrosomimäärän ja että pericentrosomal kertyminen TIG3 muuttaa mikrotubulusten ja microfilamentti organisaatio ja organelle jakelu. Organelle kerääntyminen sentrosomimäärän on tunnusmerkki apoptoosin ja osoitamme, että TIG3 edistää pericentrosomal organelle kertymistä. Nämä muutokset liittyy alentunut sykliini D1, sykliini E ja sykliini A, ja lisääntynyt p21 tasolla. Lisäksi, Bax taso on kasvanut ja Bcl-XL alenee, ja lohkaisu prokaspaasi 3, prokaspaasi 9 ja PARP on parannettu. Ehdotamme, että pericentrosomal lokalisointi TIG3 on keskeinen tapahtuma, joka johtaa mikrotubulusten ja microfilamentti uudelleenjako ja pericentrosomal organelle klustereiden ja joka johtaa syöpäsolun apoptoosin.

Citation: Scharadin TM, Jiang H, Jans R, Rorke EA, Eckert RL (2011) TIG3 tuumorisuppressoriproteiinia riippuva organelle Jakelu ja apoptoosi Skin Cancer Cells. PLoS ONE 6 (8): e23230. doi: 10,1371 /journal.pone.0023230

Editor: Janine Santos, University of Medicine ja hammaslääketieteen New Jersey, Yhdysvallat

vastaanotettu 25 maaliskuuta, 2011; Hyväksytty: 12 heinäkuu 2011; Julkaistu: 17 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Scharadin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health myöntää RE (NIH R01 AR094713 ja NIH R01 AR04694). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

TIG3 (Tazarotene indusoiman geenin 3), jota kutsutaan myös retiinihapporeseptorin vasteen 3 (RARRES3) ja retinoidi-geenin, 1 (RIG1) [1] – [5], on sata sixty- neljä aminohapon proteiini [6]. TIG3 tunnistettiin alun perin lisätä käsittelyn jälkeen viljelty epidermaalinen keratinosyyttien tai psoriaattisen orvaskeden synteettisen retinoidi, Tazarotene [6]. Se ilmaistaan ​​matalalla tasolla hyperproliferatiivisissa orvaskeden (esim levyepiteelisyöpä ja psoriaasi) ja ilmaisun palauttaa retinoidi hoito [7] – [9]. Retinoidimuotoisen hoidetuista psoriaattinen iho, lisääntynyt TIG3 ilmentyminen liittyy normalisointi erilaistumisen [6], [10]. Yhdistyksen lisääntyneen TIG3 ilmentymisen normaaleissa epidermaalisen fenotyyppi viittaa siihen, että TIG3 voi toimia pro-eriyttäminen säädin. Tutkia vaikutusmekanismia, olemme tutkineet TIG3 toiminto normaaleissa ihmisen keratinosyyteissä [10] – [12]. Nämä tutkimukset osoittavat, että TIG3 on läsnä häviävän pieniä määriä keratinosyyteissä yksikerrosviljelmässä, mutta on lisääntynyt eriytetty lauttaa kulttuureissa [12]. Vector-välitteisen ilmentymisen TIG3 keratinosyyteissä aiheuttaa alentuneen proliferaatio ja lisääntynyt Sarveistuneiden kirjekuori muodostumista, mikä viittaa siihen, että TIG3 säätelee keratinosyyttien erilaistumista [10] – [12]. Käynnissä tutkimukset osoittavat, että TIG3 toimii useiden mekanismien kautta, mutta merkittävä vaikutusmekanismi on sääntelyn transglutaminaasiaktiivisuus [10], [11]. Tyypin I transglutaminaasi (TG1) on keskeinen entsyymi keratinosyyteissä ja muut pinta epiteeli, joka on ilmaistu suprabasaalisissa erilaistuneita soluja [13] – [20]. Transglutaminaasia katalysoi muodostumista ∈- (γ-glutamyyli) lysiini proteiini-proteiini siltoja koota Sarveistuneiden kirjekuoren, olennainen osa orvaskeden [21], [22]. Tutkimustemme mukaan TIG3 lokalisoituu TG1 mikä lisää transglutaminaasiaktiivisuus [10], [11]. Lisätutkimukset osoittavat, että TIG3 vähentää keratinosyyttien proliferaatiota, mutta ei aiheuta apoptoosia [10], [11]. TIG3 koostuu aminopään hydrofiilisen segmentin, ja c-terminaalinen kalvon ankkurointi domeenin [6], [23]. Mutageneesin tutkimukset osoittavat, että mutantit, joilta puuttuu c-terminaalinen membraanin ankkuroitumisdomeeni eivät ole aktiivisia [10], [11], [23]. Sitä vastoin N-päästään typistetyn muuntaa TIG3 proteiiniin, joka aiheuttaa apoptoosin keratinosyyteissä [12].

TIG3 ilmaistaan ​​alhaisemmilla ihotuumoreissa [7]. Siten tärkeä tavoite Tämän tutkimuksen on kuvata vaikutus TIG3 ilmentymisen ihon syöpäsoluja. Osoitamme, että palauttaminen TIG3 ilmentyminen vähentää eloonjäämisen epidermaalinen okasolusyöpä soluja mekanismilla, johon liittyy pericentrosomal TIG3 lokalisointi mikä muuttaa mikrotubulusten organisointia ja organelliin jakelu. Tämä liittyy muutoksiin tason solusyklin ja apoptoosisäätelijät.

Tulokset

TIG3 ilmaisu vähentää solujen määrä

Aloitimme tutkimalla vaikutusta TIG3 on SCC- 13 solujen eloonjäämistä. TIG3 toimitti adenovirusinfektion. Kuva. 1A osoittaa, että tyhjän vektorin-tartunnan saaneiden solujen määrä kasvaa yli 72 tuntia, mutta solujen määrä on merkittävästi vähentynyt 48 ja 72 h TIG3 ilmentäviä soluja. Kuva. 1B osoittaa, että TIG3 taso on maksimaalinen infektoiduissa soluissa 24 ja 48 tuntia infektion jälkeen ja pienenee 72 h. Lisäksi TIG3 monomeerin, havaitsemme kertyminen korkean molekyylipainon muotoja, joiden arvellaan olevan kovalenttisesti silloitettu TIG3 [10] – [12]. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin, TIG3 ilmentyy alhaisilla tasoilla useimmissa transformoiduissa soluissa [10], [11] ja siksi ei havaita ajanhetkellä nolla.

aliyhtyvät viljelmistä SCC-13-solut, kasvavat 3,8 cm

2 kaivot, tartutettiin 10 MOI tAd5-EV tai tAd5-TIG3. 0, 24, 48, ja 72 h infektion jälkeen, solut laskettiin ja lysaatit valmistettiin. TIG3 ilme vähentää solujen määrä. Arvot ovat keskiarvo ± SEM, n = 3. Ne vertailut Tähdellä ovat merkittävästi erilaisia ​​määritetty Studentin t-testiä (p 0,001). B TIG3 havaitaan immunoblottauksella in tAd5-TIG3 tartunnan SCC-13-soluissa. Monomeeri on nähtävissä 18 kDa ja kannatin osoittaa korkeamman molekyylipainon silloittunut TIG3 [10], [11]. Molekyylipainot on merkitty vasemmalle blottia kDa.

TIG3 vähentää solujen lisääntymistä estämällä solusyklin etenemisen

seuraavan seurataan solusyklin etenemisen. Aloitimme arvioimalla prosenttiosuus solujen S-vaiheen avulla BrdU merkintöjä. SCC-13-solut infektoitiin TIG3 ilmentävien virus ja sen jälkeen 24 h leimataan BrdU: ssa 2 tunnin ajan ennen havaitsemista BrdU ja TIG3. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, 54 ± 2,8% (keskiarvo ± SEM) EV-infektoiduista soluista oli positiivisia BrdU verrattuna 23% ± 4% TIG3-ilmentävien solujen. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, näkyvin solusyklin muutokset ovat väheneminen G1 ja kasvaa subG1 tapahtumiin. Tutkia mekanismi vastuussa näistä muutoksista, mittasimme tason avaimen solusykliä sääteleviä proteiineja. Kuva. 2C osoittaa, että sykliini-riippuvaisen kinaasin (cdk1, cdk2, CDK6, CDK4) tasoja ei muuta TIG3, mutta sykliini D1 ja sykliini E tasot ovat laskeneet ja p21 taso on kasvanut. Nämä muutokset ovat yhdenmukaisia ​​alentunut etenemisensä G1 vaiheen ja G1 /S siirtyminen. Kuva. 2D osoittaa, että p21 mRNA nousee rinnakkain lisääntyminen p21-proteiinin.

SCC-13 soluja kasvatettiin peitinlaseilla tartutettiin 10 MOI EV tai TIG3-koodausta virus ja 24 tunnin kuluttua käsiteltiin 10pM BrdU 2 tuntia ja sitten kiinnitettiin ja värjättiin anti-BrdU (punainen) ja anti-TIG3 (vihreä). BrdU on merkki synteesin vaiheen solusyklin. Lukumäärä BrdU-positiivisten solujen prosenttiosuutena solujen kokonaismäärä on esitetty alla kunkin paneelin. Arvot ovat keskiarvo ± SEM (n = 3), ja arvot ovat merkittävästi erilaiset kuin määritetään Studentin t-testillä (p 0,001). Bars = 10 um. B SCC-13 solut kerättiin virtaussytometriseen 24 tunnin infektion jälkeen EV tai TIG3-koodausta virus. Solut värjättiin 50 ug /ml propidiumjodidia ennen analyysiä. TIG3 vähentää tapahtumia G1 ja lisää subG1 tapahtumia. C 24 tunnin infektion jälkeen solut kerättiin ja uutteet valmistettiin havaitsemiseksi solusyklin säätelyproteiineja. Molekyylipainot on merkitty vasemmalle blottia kDa. D Soluja käsiteltiin kuten edellä ja sitten korjattu toteamiseen p21 koodaa mRNA reaaliaikaista-PCR. Samanlainen tulos havaittiin kaikissa kolmessa kokeessa.

TIG3 indusoi apoptoosia

läsnäolo subG1 DNA-pitoisuus voi liittyä solun apoptoosia. Siksi arvioinut TIG3 apoptoosiin. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, TIG3 ilmentyminen aktivoi lohkaisu prokaspaasi 9 ja prokaspaasi 3 ja tuottaa katkaistun PARP. Lisäksi pro-apoptoottisen säädin, Bax, on lisääntynyt ja prosurvival säädin, Bcl-XL, pienenee. Lisääntynyt apoptoosi voidaan havaita myös

in situ

. Kuva. Kuvio 3B esittää, että hyvin harvat lohkaista PARP-positiivisia soluja havaittiin kontrolliviljelmissä (1 ± 1%, keskiarvo ± SD), mutta joka määrä on huomattavasti lisääntynyt TIG3-positiivisia (23 ± 8%) viljelmät. Nämä havainnot, yhdessä kasvua subG1 DNA-pitoisuus (Fig. 2B), viittaavat siihen, että TIG3 indusoi apoptoottista solukuolemaa.

SCC-13-solut infektoitiin 10 MOI EV tai TIG3 koodaavan viruksen ja sen jälkeen 24 h lysaatit valmistettiin havaitsemiseksi apoptoosin merkkejä. Kiinnike ilmaisee suuren molekyylipainon silloittunut TIG3 [10], [11]. Molekyylipainot on merkitty vasemmalle blottia kDa. B At 24 tuntia infektion jälkeen SCC-13 solut kiinnitettiin ja värjättiin anti-halkaistut PARP (punainen). TIG3 kasvaa pilkottiin PARP värjäystä. Prosenttiosuus pilkkoa PARP positiivisten solujen on esitetty kussakin paneelissa (keskiarvo ± SD). Nuolet osoittavat lohkaista PARP-positiivisia soluja. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin jokaisessa kolmessa kokeessa.

TIG3 paikallistaa klo pericentrosomal sijainti ja aiheuttaa organelle uudelleenjako

Saadakseen käsityksen TIG3 vaikutusmekanismi seurasimme TIG3 subsellulaarisista paikalla tAd5-TIG3 virus-infektoitujen solujen. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, TIG3 (vihreä) kerääntyvät solun kehää lähellä solukalvon (nuolenpäät) ja on perinuclear sijainti (nuolet), ja ytimien TIG3 ilmentäviä soluja on pienennetty. Arvioidaan tarkemmin TIG3 sijainti, solut värjättiin havaitsemiseksi pericentrin, joka on sentrosomimäärän merkki. Kuvat kuvassa. 4B paljastaa TIG3 värjäystä rinnastuvat pericentrin värjäytymistä (valkoinen nuoli) vieressä nucleus (n). TIG3 (vihreä) paikantuu yleisessä läheisyydessä pericentrin (punainen), mikä viittaa kertymistä läheisyydessä sentrosomin.

SCC-13-soluja infektoitiin 10 MOI tAd5-EV tai tAd5-TIG3 ja 24 h infektion jälkeen kiinnitettiin ja värjättiin anti-TIG3 (vihreä). Nuolet osoittavat pericentrosomal ja arrowheads osoittavat membraanilokalisaatiota. Ei TIG3 havaitaan tyhjän vektorin infektoimissa soluissa. B Cells, tartunnan kuten edellä, kiinnitettiin ja värjättiin TIG3 (vihreä) ja pericentrin (punainen). Nuolet osoittavat pericentrin värjäys sentrosomin ja n tarkoittaa ytimiä. Bars = 10 pm.

sentrosomimäärän on hallintapiste monenlaisia ​​solun toimintoja. Se toimii mikrotubulusverkoston järjestävän keskus (MTOC), joka on paikalla mikrotubulusten kokoonpanoa [24], [25]. Lisäksi se jäljittelee solunjakautumisen aikana ja tytär sentrosomien palvelevat järjestää mitoottisiin karat ohjaavat kromosomi erottelu [24], [26]. Tärkeää on, että MTOC toimii kontrollina pisteen liikkeen molekyylitason moottori kuljettaa lastia, kuten soluelimiin pitkin mikrotubulusten [27]. Lisäksi sentrosomimäärän toimintahäiriö liittyy solujen apoptoosin [28]. Siksi tutkittiin, pericentrosomal TIG3 kertymistä muuttaa mikrotubulusten jakeluun. Kuten on esitetty kuviossa. 5A mikrotubulusten TIG3-negatiiviset solut jakautuvat koko solun tyypillisessä ristikko-tyyppisessä verkossa, joka säteilee ulos sentrosomin (valkoinen nuoli). Sitä vastoin TIG3-ilmentävät solut (musta nuoli osoittaa pericentrosomal TIG3), mikrotubulusten paikallistaa nauhana (punaiset nuolet) solun kehällä ja ei säteile ulos sentrosomin, viittaa siihen, että TIG3 vaikutukset mikrotubulusten sijainnin ja ankkurointi. Tämä on parhaiten havaittavissa kuvassa. 5A (alempi paneeli), joka osoittaa vain β-tubuliinia värjäystä. Mikrotubulusten että TIG3-positiivisten solujen (vasemmalla) puuttuu sentrosomimäärän perustuva klusterointi, kun taas TIG3-negatiivinen solu (oikealla) on sentrosomimäärän-ankkuroitu mikrotubulusten (valkoinen nuoli). Arvioimaan ja TIG3 on mikrotubulusverkon, solujen lukumäärä näyttää mikrotubuluksia säteilevän sentrosomin laskettiin. Kuten käyrässä esitetään, solujen prosenttiosuus näytetään sentrosomin-suunnattu verkoissa vähenee merkittävästi TIG3 ilmentäviä soluja.

SCC-13-soluja infektoitiin 10 MOI tAd5-EV tai tAd5-TIG3 ja 24 h infektion jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin anti-TIG3 (vihreä tahra) ja anti-β-tubuliinia (punainen tahra). TIG3 kertyy odotetun perinuclear sijainti (musta nuoli). β-tubuliinin kertyy epätyypillinen rengas solun reuna (punaiset nuolet). Normaali β-tubuliinin verkon TIG3-negatiivinen solu merkitty valkoisella nuoli osoittaa sentrosomimäärän. Tumat Hoechst petsattu (sininen). Pohjapaneelin on identtinen alkuun, paitsi että vain β-tubuliinia (punainen) signaali on tarkoitettu. Bars = 10 uM. Kaavio osoittaa määrän TAD-EV ja tAd5-TIG3 tartunnan solujen sentrosomimäärän-alkunsa mikrotubulusten taulukot. Solut laskettiin kahdenkymmenen riippumaton mikroskooppikenttää ja vähintään sadan solut laskettiin kohti hoitoryhmässä. Arvot ovat keskiarvo ± SEM. Parilliset Studentin t-testi analyysi paljastaa, että välineet ovat merkittävästi erilaiset (p 0,001). Voit arvioida TIG3 on tubuliinin liukoisuutta, solut infektoitiin tAd5-EV tai tAd5-TIG3 ja 24 tunnin kuluttua koko uute, liukoinen ja pelletti fraktiot valmistettiin ja elektroforeesi seurasi immunovärjäyksellä havaitsemiseksi β-tubuliinia ja β-aktiini. Läsnä ollessa suurin osa β-aktiini liukoisessa fraktiossa osoittaa, että fraktiointi on onnistunut. B TIG3 ilmaisu aiheuttaa aktiinifilamentin romahtaa tuman ympärillä. SCC-13-solut infektoitiin adenoviruksella, kuten yllä, ja sen jälkeen 24 h värjättiin anti-β-aktiini (punainen värjäys) ja anti-TIG3 (vihreä värjäys). Tumat Hoechst petsattu (sininen). Sillä TIG3-positiiviset solut, vasen paneeli esittää TIG3 ja β-aktiini-signaalit (punainen ja vihreä), kun taas oikea paneeli esittää vain β-aktiini (punainen) kanava. Musta nuoli osoittaa TIG3 kerääntyminen sentrosomimäärän ja punainen nuoli osoittaa β-aktiini microfilamentti ydinvoiman rengas. Bars = 10 um. Juoni näkyy, kuinka monta TAD-EV ja tAd5-TIG3 tartunnan saaneiden solujen näyttämällä aktiini microfilamentti renkaat ympäröivät ytimen. Solut laskettiin kahdeksantoista riippumaton mikroskooppikenttää ja vähintään sadan solut laskettiin kohti hoitoryhmässä. Arvot ovat keskiarvo ± SEM. Pariksi Studentin t-testi-analyysi paljastaa, että välineet ovat merkittävästi erilaiset (p 0,001).

uudelleenjako tubuliinin solukalvossa TIG3-positiivisten solujen viittaa siihen, että se voi olla liukenematon. Tämän arvioimiseksi olemme valmiita koko solu ote TIG3-negatiivisia että positiivisia soluja ja valmistaa liukenevia ja erityisesti (pelletti) jakeet. Sitten määritettiin β-tubuliinin kussakin fraktiossa immunoblottauksella. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, kalvo-lokalisoitu β-tubuliinia ei näy pellettifraktioon, mikä viittaa siihen, että vaikka se on paikallistaa solussa kehällä tai lähellä kalvon, on edelleen liukoinen.

tubuliinia ja aktiinin verkkojen vuorovaikutuksessa laajasti ja niin me seurataan vaikutusta TIG3 on aktiinifilamentin jakeluun (Fig. 5B). In TIG3-negatiiviset solut (EV), β-aktiini (punainen) jakaa koko sytoplasmassa. Sen sijaan TIG3-positiivisten solujen (vihreä tahra) selvä aktiinifilamentin rengas lomakkeita ydinaseiden reuna (punainen nuoli). Tämä on esitetty sekä yhdistetyn kuvan ja β-aktiinin värjäytyminen yksinään (Fig. 5B). Solujen lukumäärä näyttämään ydin- aktiini rengas laskettiin. Juoni osoittaa, että solujen prosenttiosuus näytetään ydin- aktiini rengas lisääntyy selvästi TIG3 ilmentäviä soluja.

Koska organelle liikkumista ja ankkurointia riippuvat tubuliinia ja aktiini verkkojen [29], odotimme että TIG3 voivat vaikuttaa organelle jakelu. Voit arvioida TIG3 on organelle sijainti, solut värjättiin havaitsemiseksi GM130 (cis-Golgi), mannoosi-6-fosfaatti-reseptori (M6PR, trans-Golgi ja myöhäinen endosomissa) [30], rab11 (kierrätys endosomeihin), kalneksiini ( Endoplasmakalvosto), ja clathrin raskaan ketjun (CHC, solunsisäinen liikenne rakkulat). Kuva. 6A osoittaa, että GM130 (punainen) paikantuu klo perinuclear paikalla TIG3-negatiivisten ja positiivisten solujen; vaikuttaa kuitenkin siltä, ​​enemmän puristettuna TIG3-positiivisten (vihreä tahra) soluja. M6PR, rab11 ja kalneksiini myös näyttävät puristuvat pericentrosomal paikalla TIG3-positiivisten solujen (valkoiset nuolet). Tämä saadaan helposti visualisoida ja kalneksiini, vertaamalla jakauma on esitetty punainen yksivärinen kuva (insert), jossa on havaittu EV-infektoituneissa soluissa (kuvio. 6A), koska voimakas pericentrosomal pitoisuus kalneksiini havaitaan TIG3-positiivisten solujen . Lisäksi, clathrin raskaan ketjun on erityisen dramaattinen esimerkki, että värjäys näkyy jaetaan koko sytoplasmassa EV-infektoiduissa soluissa, mutta olennaisesti kaikki CHC kertyy läheisyydessä sentrosomin on TIG3-positiivisia soluja. Näin ollen vaikuttaa siltä, ​​että TIG3 muuttaa solunsisäisiä organelle jakelun tavalla, joka keskittyy ja pakkaa monet soluelimiin in läheisyydessä sentrosomimäärän. Tämä tiivistys kvantifioitiin mittaamalla kaksiulotteinen alue kattaa yksittäiset organelles neliön mikronia käyttämällä ImageJ Software (Fig. 6B). Tämä analyysi paljastaa merkittävän ja tilastollisesti merkittävä väheneminen alueella GM130, M6PR ja rab11. Kalneksiini ja CHC jakelu ei analysoitu tällä tavalla, koska tiivistyminen oli ilmeinen. Tutkimme myös vaikutusta TIG3 on organellin proteiinin tasolla. Kuva. 7 osoittaa, että TIG3 ilmaisu aiheuttaa vaatimaton alentaminen joidenkin organelle proteiineja, kuten kalneksiini, rab11, GM130 ja EEA1; kuitenkin, taso muut markkeriproteiinien ei muuteta.

SCC-13-soluja infektoitiin 10 MOI tAd5-EV tai tAd5-TIG3 ja 24 tunnin kuluttua kiinnitetään ja värjätään havaita TIG3 (vihreä) ja eri organelle markkereita (punainen). Markkerit ovat GM130 (cis-Golgi), M6PR (mannoosi-6-fosfaatti-reseptorin, trans-Golgi ja myöhäinen endosomissa), rab11 (kierrätys endosomissa), kalneksiini (ER), ja CHC (clathrin raskas ketju, solunsisäinen liikenne rakkula). Valkoinen nuolet osoittavat pericentrosomal lokalisoinnin TIG3. Ytimet värjäytynyt sinisiksi. Sillä GM130, M6PR, ja rab11, kaikki paneelit ovat punainen /vihreä /sininen sulautunut kuvia. EV ja TIG3 kuvia kalneksiini värjäystä ovat punainen /vihreä /sininen sulautunut kuvia. Insertit on TIG3 /kalneksiini kuva ovat yksivärisiä kuvia. Sillä CHC tahra, vain punainen (CHC) kuva näytetään. Bars = 10 um. B TIG3 vaikutus subsellulaaristen organelle jakeluun. Mitata organelle levisi, mikroskooppi keskittyi z-tason näyttämällä maksimaalisen organelle leviämistä ja kattamalla alueella organelle seurattiin ImageJ Software ja esitetään organelle alue um

2. Arvot ovat keskiarvo ± SEM (n = 30 kenttää) sisältäen mittaus vähintään kolmekymmentä solua per hoitoryhmä. Pariksi Studentin t-testi analyysi tunnistaa keinot kuten merkittävästi erilainen (p 0,001).

SCC-13-soluja infektoitiin 10 MOI tAd5-EV tai tAd5-TIG3 ja 24 tunnin kuluttua solujen lysaatit olivat valmistettu immunoblot havaitsemiseen osoitettujen proteiineja. TIG3 ilmentymisen määrää vähennetään rab11, GM130 ja EEA1, mutta ei muuta LAMP1 tasolla. Molekyylipainot on merkitty vasemmalle blottia kDa.

Keskustelu

TIG3 (Tazarotene-indusoitu geeni 3) tunnistettiin alun perin lisätä käsittelyn jälkeen viljelty epidermaalinen keratinosyyttien tai psoriaattinen orvaskeden synteettinen retinoidi, Tazarotene [6], ja se tunnistettiin myöhemmin mahasyövän solujen ja kutsutaan RIG1 [5]. Myöhemmät tutkimukset paljastavat TIG3 mRNA eri kudosten ja solujen viljelmässä [1], [5], [31] – [33]. TIG3 taso on kasvanut retinoidi hoito [4], [34], ja joissakin solutyypeissä TIG3 geenin ilmentyminen on tukahdutettu MAPK signaloinnin [35].

TIG3 on jäsen NIPC /P60-superperheen proteiinien [ ,,,0],36]. N-terminaalinen domeeni (aa1-134) koodaa alueita, jotka ovat konservoituneita jäsenten kesken lecithin:retinol asyylitransferaasin (LRAT) ja H-rev tuumorisuppressorigeenin perheisiin [37] – [39]. Toiminnallinen analyysi TIG3 rakenne osoittaa, että C-terminaalinen hydrofobinen alue (aa135-164) toimii kalvon ankkuri [6], [23], ja että N-terminaalinen alue koodaa kalsium-riippumaton fosfolipaasi A1 /2: n aktiivisuuden [31] , [32], [40]. Lisäksi, fosfolipaasi A1 /2 toiminta ei vaadi C-terminaalisen hydrofobisen domeenin [40]. TIG3 on osoitettu vähentävän solujen eloonjäämistä useissa solutyypeissä [6], [10], [11], [34], [41], [42], mutta mekanismia vastuussa tukahduttaminen ei ole hyvin ymmärretty. Joissakin solutyypeissä, TIG3 voi toimia säätelemällä MAPK ja PI3K /Akt signalointi [1], [3], [41].

TIG3 vuonna orvaskeden

TIG3 ilmaistaan ​​suprabasaalisissa eriytetty kerrokset sarveiskalvosoluviljelmiä lauttaa viljelmiä [12] ja suprabasaalisissa orvaskeden [7], [8], ja TIG3 ilmentyminen vähenee hyperproliferatiivisissa ihosairaus ja ihon syöpäsoluja [6] – [9]. Retinoid hoito lisää TIG3 taso ja tähän liittyy alentunut soluproliferaatioon [6] – [9]. TIG3 ei ilmenny normaaleissa keratinosyyteissä ylläpidetään yksikerrosviljelmässä ja vektorin välittämän TIG3 ilmentyminen liittyy solujen määrän väheneminen [8], [10] – [12]. Mekaaniset tutkimukset keratinosyyteissä osoittavat, että C-terminaalinen kalvon ankkurointiominaisuuksia domeeni vaaditaan toimintaa [10], [11], [23], ja että ilmentyminen TIG3 normaaleissa ihmisen viljellyissä keratinosyyteissä aktivoi valitun erilaistumista liittyviä tapahtumia [10] – [ ,,,0],12]. Erityisesti TIG3 vuorovaikutuksessa tyypin I transglutaminaasin (TG1) lisäämiseksi TG1 katalyyttinen aktiivisuus [10], [11]. TG1 on keskeinen entsyymi erottaa keratinosyyteissä joka katalysoi muodostumista proteiini-proteiini siltoja johtaa kokoonpanoon Sarveistuneiden kirjekuoren, tärkeä osa ihon läpäisyesteen [43]. Täyspitkä TIG3 proteiini stimuloi erilaistumisen liittyvä transglutaminaasiaktiivisuus keratinosyyteissä. Sen sijaan, amino-terminaaliset lyhennetyt muodot aiheuttavat apoptoosia ja apoptoosin taso on voimakkaampi kuin N-päässä on lyhennetty [12]. Muut tutkimukset osoittavat ainutlaatuinen vaikutuksia eri TIG3 aliverkkotunnuksista [40], [42], [44]. Suprabasaalisissa kuvio TIG3 ilmentymisen orvaskeden on yhdenmukainen asema TIG3 kuin ohjain keratinosyyttien erilaistumisen liittyviä tapahtumia.

TIG3 ilmentymistä ihon syöpäsoluja vähentää proliferaatiota ja lisää apoptoosia

Aikaisemmat tutkimukset osoittavat, että TIG3 mRNA on läsnä pienemmillä ihosyöpää ja ihon syöpäsolulinjoissa [8]. Kuitenkin tiedetään hyvin vähän siitä, onko TIG3 säätelee ihosyöpä solujen eloonjäämistä ja syövän etenemiseen. Osoitamme, että ilmaus TIG3 aiheuttaa vähentynyt selvästi SCC-13 solujen määrä, joka liittyy vähennetään G1 ja S-vaiheessa tapahtumia ja lisätä osa-G1 DNA sisältöä. Nämä solusyklin muutokset liittyvät TIG3 riippuvat muutokset solusyklin sääntelyn proteiinin tasolla. TIG3 ilmentyminen vähentää sykliini D1 ja sykliini E tasoja ja lisää taso p21 sykliinistä riippuvaisen kinaasin estäjä. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​väheneminen solussa etenemisensä G1 /S siirtyminen. Lisäksi osoitamme, että TIG3 lisää SCC-13 apoptoosia osoituksena lisääntynyt tuotanto aktivoitujen kaspaasi 9 ja 3 sekä lisääntynyt pilkotaan PARP. Lisäksi immunovärjäyty- tutkimukset paljastavat pilkotun PARP kerääntyy TIG3-positiivisten solujen. Nämä tulokset ovat erityisen kiinnostavia, koska TIG3 ei aiheuta apoptoosia normaaleissa ihmisen keratinosyyteissä. Sen sijaan, TIG3 aiheuttaa solujen tehdään erilaistumista [10] – [12]. Sen sijaan, mutanttimuotoja TIG3 aiheuttaa apoptoosia normaaleissa ihmisen keratinosyyteissä [12]. Se, että TIG3 aiheuttaa apoptoosia syöpäsoluissa ehdottaa eri vaikutusmekanismi normaaleissa verrattuna transformoiduissa soluissa. Lisäksi, jotkut näistä muutoksista liittyvät muutoksiin kohdegeenin mRNA-tasolla. Esimerkiksi TIG3 riippuvainen lisäys p21-proteiini liittyy samalla lisääntynyt p21 koodaa mRNA, joka osoittaa, että TIG3 säätelee p21-geenin transkription tai RNA: n vakautta. Emme tällä hetkellä tiedä, onko tämä toiminta on suoraa tai epäsuoraa.

TIG3 ilmentyminen liittyy pericentrosomal organelle klustereiden

Tärkeä kysymys on, jos TIG3 on lokalisoitu solussa. Mielenkiintoinen edellisen tutkimuksen HeLa kohdunkaulan syöpäsolut viittaa siihen, että TIG3 paikantuu cis- ja trans-Golgin ja että tämä lokalisointi on tarpeen stimuloida apoptoosia [2]. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, vasta-aine, co-värjäys SCC-13-soluja viittaa siihen, että TIG3 paikantuu cis- ja trans-Golgi (GM130, M6RP), myöhään endosomista (M6PR), kierrätys endosomista (rab11), endoplasmakalvostoon (kalneksiini) ja solunsisäinen liikenne vesikkelit (CHC). Uskomme kuitenkin, että se on epätodennäköistä, että TIG3 on pääasiassa lokalisoitu näissä rakenteissa useista syistä. Ensinnäkin, TIG3 näkyy vain paikallistaa kanssa organelle vain välittömässä läheisyydessä sentrosomimäärän ja enintään perifeerisesti. Toiseksi, osoitamme, että TIG3 muuttaa mikrotubulusten ja microfilamentti jakelua ja tähän liittyy pericentrosomal organelle kertymistä. Kolmanneksi toisessa raportissa tutkimme jakelu TIG3 normaaleissa ihmisen keratinosyyteissä ja nämä tutkimukset voimakkaasti viittaavat pericentrosomal TIG3 sijainti (ei kuvassa). Näiden tulosten perusteella, olemme sitä mieltä, että suuret vaikutukset TIG3 on tällä sentrosomimäärän ja että ulkonäkö rinnakkaispaikantumisen of TIG3 kanssa organelle markkereita on artefakti johtuen pericentrosomal organellin klustereiden.

organelle siirtäminen on tunnettu ilmiö, joka esiintyy apoptoosin aikana [45]. Uskotaan, parantaa organelliin kalvoon sekoittamalla helpottaa levittämistä pro-apoptoottisten efektorien [45] – [50]. Mutta miten nämä soluelimiin ja organelle fragmentit kokoontuvat apoptoosin aikana se ei ole hyvin ymmärretty, mutta uskotaan ottamaan sentrosomimäärän ja mikrotubulusten. Sentrosomimäärän toimii mikrotubulusten järjestämällä keskus (MTOC) interfaasivaiheessa soluissa ja koska järjestäjä mitoosilaitteen mitoosi soluissa. Koska mikrotubulusten nukleaatiossa keskus, sentrosomimäärän toiminto tarvitaan solunsisäisen organelle kaupan [24], [51]. Soluelimiin liikkuvat mikrotubuleiksi liittyy erityisiä moottori proteiineja [27], [51]. Aiemmat raportit sotkea mikrotubulia moottoreita tuo organelle ja organelle fragmentteja mikrotubulusverkoston järjestävän keskus (sentrosomimäärän) apoptoosin aikana [45], [52]. Näitä ovat Golgin laitteeseen, endosomeihin, endoplasmakalvostossa, mitokondrioiden ja muiden soluelimiin [45], [47], [53], [54]. Paras tunnettu esimerkki on uudelleenjako mitokondrioita Golgi’n proksimaalisen mikrotubulusten järjestäminen keskus altistuneiden solujen TNFa, oksidatiivisen stressin tai virusinfektio [45]. Useat raportit viittaavat siihen, että tämä prosessi aktivoi MAPK signalointi fosfory- kinesiiniin kevytketjun pysäyttämiseksi mitokondriot anterogradista dispersal johtavat kertyminen näistä soluelimiin lähellä sentrosomimäärän [45].

Nämä aiemmat raportit kuvaavat pericentrosomal organelle klustereiden vastauksena hoitoa kasvutekijät, oksidatiivisen stressin tai muiden ärsykkeiden [45]. Nykyinen tutkimukset ovat ainutlaatuisia siinä, että organellin klusterointi laukaisee ilmaus tuumorisuppressoriproteiinia. Lisäksi se, että TIG3 kertyy lähellä sentrosomimäärän viittaa siihen, että sillä voi olla suora rooli sääntelyn organelle liikkeen aikana apoptoosin. Tutkimuksemme osoittavat, että TIG3 läsnäolo muuttaa normaalin subsellulaariseen sijainti mikrotubuleiksi ja mikrofila-, joka voi olla yksi mekanismi, jonka avulla se muuttaa organelle sijainti. Jatkotutkimuksissa on käsiteltävä onko TIG3 myös muuttaa mikrotubulia moottori riippuvaa kuljetusta organelles. Meidän Työhypoteesina on, että TIG3 voi muuttaa sekä mikrotubulusten jakelu ja mikrotubulusten perustuvia motoriikka aiheuttavan pericentrosomal organelliin klusterointi. Analyysimme, TIG3 edistää kertyminen soluelimiin klo sentrosomimäärän lukien Endoplasmakalvosto, Golgin laitteen, kierrätys endosomeihin, myöhään endosomissa, ja liikenne rakkulat. Kuitenkin, etteivät kaikki soluelimiin kuljetetaan sentrosomimäärän. Esimerkiksi lysosomeihin mitattuna havaitseminen LAMP1, jakaa ryhminä pitkin mikrotubulusten, ja TIG3-positiivisten solujen, tämä malli on tehostettu (ei esitetty). Siten lisätutkimukset ovat tarpeen ymmärtää rooli TIG3 säätelyssä mikrotubulusten toiminta ja organellin liikenne.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja adenovirus infektion

SCC-13 -solut saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD) ja pidettiin korkean glukoosin DMEM (Gibco, 11960-044) täydennettynä 2 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 5% naudan sikiön seerumia (Sigma, St. Louis, MO). Adenovirukset tuotettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [10]. tAd5-TIG3

1-164, on tetrasykliini-indusoituva virus, joka koodaa täyspitkää TIG3 proteiinia ja tetrasykliini-reagoiva hostajaelementti [10], [11]. Ad5-TA virus koodaa tetrasykliiniä transaktivaattoria (TA). tAd5-EV on tyhjä virus käytettiin kontrollina. Infektion, solut pestiin PBS: llä, inkuboitiin 10 MOI TIG3-koodausta tai tyhjä viruksen läsnä ollessa 5 MOI Ad5-TA DMEM: ssä, joka sisälsi 6 ug polybreeniä /ml (Sigma, H9268). 5 tunnin kuluttua väliaine korvattiin virus-elatusaineella ja inkubointia jatkettiin vielä 24-72 tunnin ajan ennen valmisteen solujen ja uutteet immunohistologia ja immunoblot.

Immunologiset menetelmät

sillä immunoblot, uutteet valmistettiin soluhajotuspuskurin (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, joka sisälsi 150 mM NaCl, 1 mM etyleeniglykoli-bis (aminoetyylieetteri) tetraetikkahappoa, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM glyserofosfaatti, 1 mM natriumvanadaattia, 1 ug /ml leupeptiiniä (Cell Signaling, 9803, Danvers, MA) ja 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen Bradford Bio-Rad proteiinimäärityksellä (Bio-Rad,