Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

määrittämiseksi ekspressiokuvioita NF-KB: n sääntelyviranomaisten ja kohdegeenien kirkas cell munuaissyövän (ccRCC), niiden vastaavuus von Hippel Lindaun (VHL) mutaatiostatuksesta tila, ja niiden yhdessä selviytymisen tuloksia.

Methods

Meta-analyysit tehtiin julkaistuihin ccRCC geeniekspression aineistoja jonka RankProd, ei-parametrinen tilastollinen menetelmä. DEGS kanssa False Discovery Valuuttakurssi 0.05 Tällä menetelmällä pidettiin merkittävinä, ja leikkaavat valikoidun listan NF-KB: n sääntelyviranomaisten ja tavoitteet määrittämiseksi luonteesta ja laajuudesta NF-KB sääntelyn purkamiseen ccRCC.

Tulokset

Erittäin -disproportionate osa (~ 40%;

p

0,001) NF-KB: n sääntelyviranomaisten ja kohde- geenejä havaittiin olevan säädellään ylöspäin ccRCC, osoittaa kohonnut NF-KB toimintaa tällä syöpä. Osaa näistä geeneistä, joka käsittää avaimen NF-KB-säädin (

IKBKB

) ja vahvistetaan välittäjäaineita NF-KB-solun eloonjäämistä ja pro-inflammatorisia vasteita (

MMP-9

,

PSMB9

, ja

SOD2

), korreloi suurempi suhteellinen riski, huonompi ennuste, ja vähentää yleistä potilaan selviytymistä. Yllättäen tasot useat interferoni sääntelyn tekijöitä (IRFs) ja interferoni kohdegeenien myös koholla ccRCC, mikä osoittaa, että ”interferoni allekirjoitus” voi edustaa uutta ominaisuus tämän sairauden. Menetys VHL-geenin ilmentymisen korreloi voimakkaasti ulkonäkö NF-κB- ja interferonigeenillä allekirjoitukset sekä familiaalinen ja satunnaisia ​​tapauksia ccRCC. Koska NF-KB säätelee ilmentymistä keskeisten interferoni signalointi solmujen tulokset viittaavat siihen, välillä syy VHL menetys, kohonnut NF-KB toimintaa, ja ulkonäkö interferoni allekirjoituksen aikana ccRCC tuumorigeneesin.

Johtopäätökset

Nämä havainnot tunnistaa NF-KB ja interferoni allekirjoituksin kliinisiä piirteitä ccRCC, tarjoavat vahvat perusteet sisällyttäminen NF-KB-inhibiittorit ja /tai hyödyntämiseen riippumatta interferoni signaloinnin hoidossa ccRCC, ja toimittaa uusia NF-KB tavoitteet for potentiaalisen terapeuttisen intervention tällä hetkellä-parantumaton maligniteetti.

Citation: Peri S, Devarajan K, Yang DH, Knudson AG, Balachandran S (2013) meta-analyysi Tunnistaa NF-KB terapeuttisena kohteena munuaisten Cancer . PLoS ONE 8 (10): e76746. doi: 10,1371 /journal.pone.0076746

Editor: Edward W. Harhaj, Johns Hopkins School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 23 elokuu 2013; Julkaistu: 07 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Peri et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat amerikkalainen Cancer Society Research Scholar Grant (RSG-09-195-01-MPC) SB. Lisävaroja toimittivat Fox Chase Cancer Center kautta institutionaalista tukea munuaissyöpää Keystone Program, ja NIH myöntää N01 CN-95037 ja P30 CA 06927. Rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

munuaiskarsinoomia (RCC) osuus on noin 3% kaikkien aikuisten syövistä, ja syy ~ 116000 vuosittain maailmanlaajuisesti kuolemat [1]. Useita histologisia alatyyppejä RCC on kuvattu, mukaan lukien kromofobista leikettä, papillaarinen ja selkeä solu, josta kirkas solu variantti (ccRCC) osuus ~ 85% kaikista RCC tapauksista [2,3]. Varhaisen vaiheen ccRCC on yleensä parannettavissa leikkauksella, ja potilaat diagnosoidaan paikallisluonteisia munuaisten massat 4 cm. on erinomainen ennuste [4]. ccRCC on kuitenkin pitkälti oireeton tauti, ja noin kolmannes kaikista potilaista on paikallisesti levinnyt tai metastaattinen aikaan diagnoosin. Toisin lokalisoitu alkuvaiheen ccRCC, kehittynyt ccRCC on tappava, kemoterapia-resistentti syöpä [1,5].

Advanced ccRCC käsitellään pääasiassa pienimolekyylisiä hoitomuotoja. Frontline vaihtoehtoja ovat tyrosiinikinaasiestäjiksi sunitinibi ja sorafenibia ja mTOR-inhibiittorit temsirolimuusin ja everolimuusin. Nämä aineet kuitenkin vain lyhytaikaisen hyöty viivästyttämällä taudin etenemistä, ja eivät ole parantava [6-8]. Lisäksi tällaiset aineet edellyttävät jatkuvaa antamista, aiheuttaa potilaille merkittäviä sivuvaikutuksia [7,9]. Metastaattisen RCC on siis edelleen terapeuttinen haaste tarvitsevat uusia vaihtoehtoja.

Geneettinen tunnusmerkki ccRCC on inaktivaatio von Hippel Lindaun (VHL) tuumorisuppressorigeeniä [10].

VHL

geeni inaktivoidaan joko mutaation tai hypermetylaation jopa 90% satunnaisia ​​ccRCC tapauksista [10-12]. Parhaina kuvatussa asemassa, pVHL, tuote

VHL

geeni, toimii osana degradaatioreitti E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkaisia, että tiukasti ohjaa proteiinin tasot hypoksian indusoima tekijä (HIF), transkriptiotekijä ja master säätelijänä soluvasteen hypoksia [11,13]. Kun pVHL on poissa, HIF kertyy jopa happiolosuhteissa, ja epäasiallisesti transaktivoi ilmaus sen kohdegeenien. Kuten monet HIF tavoitteet ovat voimakkaasti tuumorigeenisia, mis-ilmentyminen HIF kohdegeenien pidetään ensisijaisena Orkesterisovitus on

VHL

vajausta ccRCC syövän etenemiseen, ja kohdistaminen polkuja alavirtaan HIF (esim VEGF signalointi) edustaa ensisijaista farmakologinen lähestymistapa hoitoon RCC [11].

lisäksi säätelemällä HIF, pVHL on osoitettu useissa soluviljelmätutkimukset ohjata myös aktiivisuutta transkriptiotekijän NF-KB: n [14]. Kun pVHL ilme on kadonnut (tai ablatoitu RNAi), NF-KB aktiivisuus on kohonnut; päinvastoin, uudelleen käyttöönotto pVHL osaksi

VHL

-null RCC-solujen alentaa NF-KB: n aktiivisuuden [15-17]. Nämä havainnot ovat tärkeitä kliinisiä seurauksia. Ensinnäkin, kuten NF-KB: n (kuten HIF) on keskeinen säätelijä tulehdus- ja solujen eloonjäämisen vasteita, on hyvin todennäköistä, että kohonnut NF-KB signalointi seuraavat pVHL menetys edistävät vaiheet synnyssä, eteneminen, selviytyminen, ja /tai leviämisen ccRCC. Toiseksi, jos NF-KB on itse asiassa koholla ccRCC kasvaimia – eikä vain RCC solulinjoissa – sitten kohdistaminen NF-KB tarjoaa jännittävä uusi hoitovaihtoehto kokeneille ccRCC. Tässä suhteessa alkuperäiseen tutkimukset ovat osoittaneet, että pienimolekyylinen NF-KB: n herkistää muuten kestävä ccRCC soluja (: 1) kasvaimia tuhoavaa aktiivisuutta EGFR: n estäjien, (2) apoptoosia anti-kasvain sytokiini TRAIL, ja (3) oncolysis by enkefalomyokardiittivirusympillä [14,18-21]. Näistä syistä saaminen käsityksen luonne ja laajuus NF-KB de-sääntelyn ccRCC kasvaimissa tulee tärkeä tavoite.

aloitti tämän tutkimuksen määrittää laajamittaisen bioinformatiikan lähestyy esiintyvyys NF-KB transcriptomic sääntelyn purkamisen potilaasta johdettujen ccRCC näytteitä. Näiden analyysien, olemme havainneet, että NF-KB näyttää olevan konstitutiivisesti aktiivisia suuri osa ccRCC tapauksissa ja että suhteettoman suuri osa NF-KB: n sääntelyviranomaisten ja tavoitteet (ccRCC ”NF-KB allekirjoitus”) näyttö jatkuvasti koholla ilme in ccRCC, verrattuna normaaliin munuaisten kudosta. Lisätutkimuksia myös paljasti vankan ”interferoni (IFN) allekirjoitus” in ccRCC. Osoitamme, että ulkonäkö sekä NF-KB: n ja IFN allekirjoitukset ovat hyvin korreloi VHL mutaatiostatuksesta riippumatta, ja tunnistaa keskeiset osajoukon NF-KB: n sääntely- ja tavoitteista, joiden kohonnut ilmentyminen korreloi korkeamman suhteellisen riskin, huonompi ennuste, ja vähentää yleistä selviytymistä ccRCC. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että kohonnut NF-KB: n ja IFN signalointi voi edustaa yhteisiä piirteitä pVHL-negatiivinen ccRCC, ja antaa perustelut kohdistamista NF-KB: n tässä sairaudessa.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka selvitys

käyttö ihmisen kudosnäytteitä potilaista Fox Chase Cancer Center hyväksyi Fox Chase Institutional Review Board. Kirjallinen tietoon perustuva suostumus, hyväksymä eettinen komitea, saatiin käyttöön näiden näytteiden.

immunohistokemia

munuaiskudosnäytteillä mikrosiru (TMA), joka sisältää päällekkäisiä viipaleita 20 ccRCC kasvaimia ja 8 normaalia munuaiset, rakennettiin arkistointia formaliinilla kiinnitetyt paraffiiniin upotettuja Fox Chase Cancer Center potilaan näytteitä. TMA kudos leikattiin, jonka paksuus on 5 mikronia, parafiini, jonka ksyleeniä ja niihin lisätään vähentämällä etanolipitoisuus. Antigeeni haku saavutettiin keittämällä osioista, 10 mM sitraattipuskuria, 20 minuuttia. Jälkeen estää endogeenisen peroksidaasin 3% vetyperoksidaasin metanolissa, leikkeitä inkuboitiin tausta Sniper (biocare Medical) huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Leikkeet seuraavaksi inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla, NF-KB: n (Cell Signaling) on ​​laimennoksena 1: 500, ja STAT1 (BD Biosciences) laimennoksena 1: 100, 4 ° C: ssa yön yli. Pesun jälkeen PBS: ssä, leikkeitä inkuboitiin leimatun Polymer-HRP anti-kani-anti-hiiri (DAKO) sekundaarisella vasta-aineella huoneenlämpötilassa 1 h, altistuvat diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla liuokseen, ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Sen jälkeen kuivatukseen lisäämisessä pitoisuuksia etanolia ja clearing ksyleenissä, leikkeet kiinnitettiin vuonna Permount-peitinlaseilla. Kuvat on otettu Nikon Eclipse E600 mikroskooppi NIS Elements D3.0 ohjelmisto.

Meta-analyysi

meta-analyysit, me koonneet listan julkaistun RCC tutkimusten Geenien ilmentyminen Omnibus ( GEO) tai ArrayExpress (taulukko S1), jonka tiedot olivat (i) tuotetaan käyttäen Affymetrix alustojen U133A, U133B, ja U133Plus2; (Ii) tarkasti selityksin kun talletetaan tietokantoihin; ja (iii) sisälsi normaalia kudosta valvontaa. Tutkimuksiin käyttämällä U133A ja U133B sirut, me vain harkita jotka profiloidut näytteitä

molemmat

sirut; Tämä maksimoi määrä geenejä saatavilla myöhemmin meta-analyysi. Raakadataa normalisoitiin käyttämällä Tukeva Multi-array Average (RMA) [22]. Tapauksissa, joissa näytteet profiloitua kahdella eri alustoilla (esim Affymetrix U133A ja U133B), koetin asetetaan korkeammat tarkoittaa ilme arvot valittiin jos useita koetinsarjojen kartoitettu samaa geeniä. Aineistot sitten sulautetaan perustuu geenin symboli käyttäen MergeMaid paketti (https://astor.som.jhmi.edu/MergeMaid) saatavilla Bioconductor [23]. Meta-analyysit tehtiin käyttäen RankProd menetelmää [24], ei-parametrinen tilastollinen menetelmä, joka utlilzes joukkoon erilaisesti ilmaisi geenien (DEGS) kesken eri tutkimusten tuottaa luettelon DEGS kahden olosuhteissa (esim ccRCC vs. normaali). Merkitys ero geenien ilmentyminen on sitten lasketaan prosentteina vääriä positiivisia ennusteita (eli False Discovery Rate FDR). Tätä tutkimusta varten valitsimme meidän luettelot DEGS perustuu FDR 0,05 (5%) laskettu 10000 yhdistelmää. Jos haluat määrittää NF-KB ja IFN allekirjoitukset, kuratoinut NF-KB ja IFN geenien leikkaavat jopa säädelty degs. Tutkia NF-KB: n ja IFN allekirjoitusten näytteiden kanssa mono- tai bialleelisen inaktivoimiseksi

VHL

, DEGS laskettiin Limma [25] ja RMA-normalisoitu data. Menetelmämme on esitetty vuokaaviossa esitetty kuvassa S1.

Survival analyysi

Geenien ilmentyminen ja Eloonjääntitulokset saatavilla 55 ccRCC potilaille TCGA tietokannassa (https: //tcga-data.nci .nih.gov /TCGA /) käytettiin selviytymisen analyyseistä univariate Coxin suhteellisten riskien (PH) ja Accelerated Failure Time (AFT) mallit [26]. Hyvyyttä-of-fit (GOF) testi Cox PH malli suoritettiin [27]. Vaikka Cox PH malli implisiittisesti oletetaan, että vaara ja eloonjäämiskäyrien vastaavat kahta eri arvoja kovariaattina eivät ylitä, AFT malli mahdollistaa ylitys käyrien [28,29] ja osuus kuin suhteellisuus vaarojen (tai kuoleman riski ) näissä kahdessa ryhmässä. Kaikki testit olivat kaksitahoisia ja ne käytetään tyypin I virhe 0,05 määrittämiseksi tilastollista merkittävyyttä. Sen lisäksi, että

p

-arvot kunkin mallin sovitus, suhteellisen riskin (RR) Cox PH ja kerroin (β) päässä AFT malleista, vastaavasti, käytettiin määrittämään suuruus yhdistyksen välillä geenien ilmentyminen ja kokonaiselossaolo. RR arvio on yli 1 tai negatiivisen arvion β osoittaa huonon ennusteen yhä ilme. Visualisoida yhdistys geeniekspressiotasot kanssa kokonaiselinaika, yksittäisten geenien ilmentyminen profiilit kahtia mediaania jaettu ”korkea” tai ”alhainen” ilmaisun ryhmiä, ja Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyrissä piirrettiin jokaiselle ryhmälle. Laskelmat tehtiin käyttäen pakettien

selviytymisen

ja

lss

R tilastokieltä ja ympäristö (https://www.r-project.org).

Tulokset

Meta-analyysi tunnistaa NF-KB sääntelyn purkamisen ccRCC

Kun tutustuu julkisesti saatavilla DNA-siru aineisto on ccRCC ja pariksi normaali näytteet [30,31], olemme huomanneet, että useita vakiintuneita NF-KB: n kohdegeenin mRNA: ita yliekspressoidaan ccRCC näytteissä, verrattuna niiden normaaleihin kontrolleihin. Koska terapeuttinen seurannaisvaikutukset Näiden havaintojen pyrimme onko NF-KB on konstitutiivisesti aktiivinen ccRCC. Siksi tutkittiin potilaasta johdettujen ccRCC yksilöitä ydinvoiman lokalisoinnin klassisen NF-KB alayksikössä RelA /p65. Keskityimme RelA /p65, kuten aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että RelA sisältäviä dimeerinen kompleksit ovat vallitseva NF-KB: ccRCC solulinjoissa, ja että nämä kompleksit uudelleen paikallistaa sytoplasmasta tumaan, kun aktiivinen [32-34 ]. Out of 20 erillisten ccRCC yksilöt tutkittiin, 16 (80%) esiin karkeita tumavärjäystä RelA in 50% soluista, osoittaa konstitutiivista NF-KB aktiivisuutta näissä soluissa. Lisäksi kaksi tapausta osoitti heikkoa tumavärjäystä sisään 20% soluista, ja kaksi muuta ilmenee mitään havaittavaa RelA signaalia tumassa. Sitä vastoin mikään (0/8) normaalin munuaisen osat tutkitut näkyvissä havaittavissa ydin- RelA värjäytymistä. Tyypillinen esimerkki intensiivistä ydin- RelA värjäytymistä ccRCC – mutta ei normaalissa munuaisessa – on esitetty kuviossa 1a; Huomaa, että normaalit solut proksimaalisen epiteelissä, josta ccRCC ajatellaan syntyvän, merkkejä

sytoplasman

RelA (kuva 1a, nuolet). Nämä tulokset viittaavat siihen, että konstitutiivisesti aktiivinen ydin NF-KB voi olla yhteinen piirre ccRCC, ehkä seurauksena NF-KB: n aktivaatio epiteelissä aikana RCC tuumorigeneesin.

(a) Immuno-histokemiallinen värjäys osoittaa näkyvä ydinvoiman RelA signaalin ccRCC näytteissä, mutta ei normaalissa munuaisessa. Nuoli osoittaa sytoplasmista RelA värjäytymistä soluissa proksimaalisen epiteelissä. Asteikko bar = 100 uM. (B) Up-geenien (X-akseli) meta-analyysi neljästä ccRCC aineistot piirrettiin väärien löytö määrä (FDR, Y-akseli). Up-geenien kanssa FDR 0,05, punaisella, käytettiin määrittämään NF-KB ja IFN allekirjoitukset. (C) Heatmaps osoittaa ekspressiota NF-KB: n allekirjoitus geenien kunkin neljän osoitettu tutkimuksissa. N = normaali, T = kasvain. Lämpö bar = ekspressiotasot (log

2 asteikko).

selvittää, missä määrin NF-KB: n kohde-geenin sääntelyn purkamisen ccRCC, ensin määritteli geenejä, joiden ilmentyminen on tunnetusti säädellä ja /tai säädellä NF-KB: n. Päättely, että poikkeava NF-KB aktiivisuus näkyy muuttuneen näiden geenien ilmentymistä, yhdistimme julkisesti saatavilla luetteloa selityksin NF-KB kohdegeenien [(HUhttp: //bioinfolifl.fr/NF-KBUH, perustuvat suurelta osin [ ,,,0],35]] omalla aineistot [36,37] kuratoida yhteensä 137 geenien (taulukko S2), joiden tiedetään säännellä NF-KB, jonka promoottorit sisältävät otaksutun /validoitu NF-KB: n sitoutumiskohtia, ja /tai jonka ilmentyminen on osoitettu luottaa NF-KB aktiivisuutta erilaisissa yhteyksissä.

seuraava tutkittiin meta-analyysissä ilmaisun profiilit näiden 137 NF-KB kohdegeenien kokonaan genomin transcriptomic tietoja 61 ccRCC ja 34 normaalia näytteiden yli neljä riippumatonta tutkimusta että puhumme täällä nimet ensimmäisen tekijöistä: Cifola, Gumz, Lenburg ja Yusenko [31,38-40]. valintaperusteet näistä tutkimuksista on esitetty yhteenvetona kuviossa S1. tästä meta-analyysi, käytimme RankProd, ei-parametrinen tilastollinen menetelmä, joka kykenee paitsi yhdistämällä tietoja erilaisia ​​alustoja, mutta myös käsitellä kokeellisen vaihtelun välillä aineistot [24]. On ~ 18000 yhteensä geenejä tutkitaan, 3560 havaittiin olevan tasaisesti säädellään ylöspäin ccRCC (kuva 1b), kun taas 2797-geenit olivat johdonmukaisesti alassäädetty kello väärien löytö korko (FDR) on ≤ 0,05. Näistä 58 geenit (~ 42% kaikista kuraattorina NF-KB tavoitteet) olivat säädellään ylöspäin ccRCC näytteissä, verrattuna normaaleihin kontrolleihin. Suhde NF-KB geenejä säädellään ylöspäin ccRCC (58/137) on erittäin merkittävä, (

p

-arvo 0,001, yksisuuntainen suhde

Z

-testi), verrattuna osuus kaikista geeneistä säädellään ylöspäin ccRCC (3560/17997; ~ 20%). Sitä vastoin kolme kertaa vähemmän NF-KB kohdegeenien (18 geenejä, jotka edustavat 13% NF-KB tavoitteet) on säädellä vähentävästi ccRCC; tämä ei havaittu olevan merkittäviä (p-arvo = 0,74). Tulokset Tämän analyysin mukaan ccRCC yksilöt näyttää selektiivinen, tasaisesti kohonnut ilmentyminen osajoukko NF-KB: n kohdegeenien. Me nimettävä nämä geenit ccRCC ”NF-KB-geenin allekirjoitus”. Kuva 1c kuvaa ekspressiovektorin profiilit NF-KB-geenin allekirjoitus jokaisessa neljässä tutkimuksessa.

ccRCC NF-KB-geenin allekirjoitus oli lajitella neljään eri luokkaan: proinflammatoristen, solu-eloonjääminen, NF KB: n säätimet, ja yllättäen, interferoni sääntelyviranomaisten (taulukko S3). Suurin osa sääteli NF-KB tavoitteet olivat proinflammatoristen (43/58). Lopuista geenit, seitsemän oli mukana solun selviytymisen, ja viisi oli syöttää eteenpäin tai palautetta sääntelyviranomaisten NF-KB vasteen itse. Yllättäen, kolme NF-KB tavoitteet (

IRF1, IRF2

, ja

IRF7

) johdonmukaisesti säädelty kaikissa ccRCC näytteet koodataan interferoni sääntelyn tekijöitä (IRFs), perheen transkriptiotekijöiden liittyy yleensä jossa interferoni-välitteistä synnynnäisen-immuunivasteeseen mikrobitulehdusten [41]. Yksittäiset ekspressioprofiilit kahden edustavan geenejä kustakin luokkaan esitetty kuviossa 2. Nämä tulokset tunnistaa sisällä ccRCC NF-KB allekirjoituksen useita vakiintuneita välittäjäaineita NF-KB proinflammatoristen ja solujen eloonjäämisen vasteita, sekä ennakoimattoman alaryhmä IFN sääntelyviranomaisten.

(a) Cell-selviytymisen geenejä

BCL2

ja

SOD2

, (b) proinflammatoristen geenien

CCL5-

ja

ICAM1

, (c) NF-KB sääntelyviranomaisten

NFKB1

ja

TNFAIP3

ja (d) interferoni säätelytekijöitä

IRF1

ja

IRF7

. Data normalisoitiin käyttäen RMA. Fold-muutokset kasvain (T) vs. normaali (N) vertailu saatiin Limma. Y-akseli esittää RMA-normalisoitu ekspressiotason (log

2 asteikko) kunkin mRNA. Siniset laatikot edustavat geeniekspressiotasot normaalissa kudoksessa, ja punainen kuvaa ilmaisun ccRCC. Valkoinen viiva kunkin laatikon on mediaani, ja etäisyys laatikko ja viikset osoittavat kvartiiliväliä. Jokainen neljästä kuvaajat per geeni edustaa ilmentymisen profiilit paneelit tuottamat (vasemmalta oikealla) Cifola, Gumz, Lenburg, ja Yusenko tutkimukset.

Interferonit allekirjoitettavaksi ccRCC

kiehtoi havainto, että IRF-koodaavat geenit olivat säädellään ylöspäin ccRCC, me arveltu, että lisäksi kohonnut NF-KB: n aktiivisuutta, ccRCC solut todennäköisesti näyttö lisääntynyt tonic tyypin I (α /β) IFN signalointi. Kolme julkaistu havainnot pohjana tätä hypoteesia. Ensimmäinen, geenit, jotka koodaavat IRFs 1,2, ja 7, sen lisäksi, että NF-KB: n tavoitteet, ovat myös hyvin kuvattu IFN-stimuloidun geenien (ISGs) [42,43]. Toiseksi useimmat solut ylläpitää alhainen autokriinisiä tyypin I (α /β) IFN signalointi, näennäisesti valmisteltaessa akuuttien virusinfektioiden [44-46]. Kolmanneksi, olemme aiemmin raportoitu, että konstitutiivinen NF-KB signalointi on välttämätön ylläpito autokriinisiä IFN signaloinnin [36,44]. Yhdessä nämä havainnot antavat meille ehdottaa mallia, jossa kohonnut NF-KB signalointi ”kiihdyttää” tonic tyypin I IFN signalointi, joka sitten lisää ilmentymistä ISGs (kuten

IRFs

) vuonna ccRCC.

Voit testata tätä mallia, tutkimme RCC näytteitä hyperaktiivinen tonic tyypin I IFN signalointi. Koska suora mittaus tonic tyypin I IFN tasoa terveillä kudos on haastava ja epäluotettava [36], me sen sijaan tutkitaan alavirran seurausta aktiivisen IFN: ydinvoiman lokalisointi keskeisten IFN-reagoiva transkriptiotekijän STAT1. Kuten NF-KB itse STAT1 on normaalisti sytoplasminen kun aktiivinen, mutta nopeasti siirtyy tumaan ajaa ISG ilmaisun upon IFN stimulaation [47]. Jos IFN signalointi konstitutiivisesti koholla RCC: n, STAT1 odotetaan paikallistaa tumaan RCC – mutta ei normaali – kudosta. Olemme havainneet, että 16/20 RCC näytteet, mutta yksikään normaalin munuaisen yksilöt (0/8) – näytetään vahva ydin- STAT1 värjäytymistä (kuvio 3a). Merkillistä, ja suostumuksella välillä syy-yhteys kohonnut NF-KB signalointi ja lisääntynyt tonic IFN-aktiivisuuden, täysin 100% ydin- RelA-positiivisten ccRCC näytteet olivat positiivisia myös ydin- STAT1.

(a) Immuno-histokemiallista värjäystä osoittavat vahvaa ydinvoiman STAT1 signaalin ccRCC näytteissä, mutta ei normaalissa munuaisessa. (B) Heatmap osoittaa ilmaus IFN allekirjoituksen geenien jälkeen IFN stimulaation hiiren alkion fibroblasteissa. Lämpö bar = kertamuutosta (log

2 asteikko). Ekspressiotasot käsittelemättömän solut mielivaltaisesti asetettu 1 (beige). (C) Heatmaps osoittaa ilmentymisen IFN allekirjoituksen geenien kunkin neljän osoitettu tutkimuksissa. N = normaali, T = kasvain. Lämpö bar = ekspressiotasot (log

2 asteikko).

tunnistettu aikaisemmista työstä [36] yhteensä ~ 400 geenien indusoi vähintään kaksinkertaisesti tyypin I IFN: (kuvio 3b), jonka ilmentyminen tiedot olivat läsnä myös neljä ccRCC tutkimuksissa. Kun tutkimme ilmentymistä näiden ISGs vuonna ccRCC aineistoja, yhteensä 164 ISGs todettiin säädellään ylöspäin ccRCC (~ 40% kaikkien testattujen ISGs, p-arvo 0.001 yksisuuntainen osuus Z-testi) , kun taas vain 51 ISGs oli säädeltiin [~ 13%, p-arvo = 0,94]. Nämä tulokset osoittavat, kuten NF-KB, konstitutiivisesti-koholla tyypin I IFN signalointi tapahtuu ccRCC. 164-geeni ”IFN-geeni allekirjoitus” on lueteltu taulukossa S4, ja sen ilmentyminen profiilin kunkin neljän yksittäisistä tutkimuksista on esitetty kuviossa 3c.

seuraavaa käyttöä Ingenuity Keinot analyysi rakentaa verkosto, joka olisi tunnistaa molekyylien välisiä suhteita NF-KB: n ja IFN-geeni allekirjoitukset. Tämä analyysi paljasti vankan välisen yhteyden NF-KB: n ja IFN allekirjoitukset kautta IFN-β (koodaa

IFNB1

) ja IRF solmujen (kuvio 4). Odotetusti, proinflammatoristen ja solu-eloonjäämisen klustereita havaittiin sisällä NF-KB-arm verkon, kun taas lukuisat vakiintunut synnynnäinen-immuunivälittäjäaineiden olivat edustettuina IFN allekirjoitus varsi (kuva 4). Yhdessä nämä tulokset tukevat välillä syy NF-KB ja IFN allekirjoitukset välittämiä autokriininen IFN /IRF signalointi.

Verkko rakennettiin Ingenuity Pathway Analyysiohjelmisto (Ingenuity® Systems, HUhttp: //www. ingenuity.comUH) käyttäen kaikkia geenejä NF-KB-ja IFN allekirjoituksia. Keskeiset klusterit NF-KB (ruskea) ja IFN (sininen) aseet tunnistetaan, ja säätelymolekyyleja valvontaan geeni-verkon solmut on esitetty suuria ympyröitä.

VHL mutaatiostatuksesta riippumatta korreloi ilmaus NF KB: n ja IFN allekirjoitukset

tulokset soluviljelmämallissa tutkimukset viittaavat välisen syy-yhteyden puuttuessa funktionaalisen pVHL proteiinin ja kohonnut NF-KB: n aktiivisuuden ccRCC [15-17]. Näiden havaintojen kysyimme jos mutaatiostatuksesta tila

VHL

korreloi ulkonäkö NF-KB: n ja IFN allekirjoitusten ccRCC. Tätä analyysiä varten olemme verrattuna niiden normaaleihin kontrolleihin (1) epiteeli- soluviljelmiä pre-neoplastisten munuaisvaurioita kuuden familiaalinen tapauksissa VHL potilaiden kätkeminen yhden toiminnallisen kopion

VHL

[48], (2) ccRCC kudos 32 familiaalinen tapauksissa biallelically inaktivoitua

VHL

[49], ja (3) ccRCC kudoksen 20 satunnaisia ​​tapauksia biallelically inaktivoitua

VHL

[49]. Huomasimme, että kumpikaan NF-KB eikä IFN allekirjoitukset oli läsnä potilailla, joilla on yksi funktionaalinen kopio

VHL

. Sen sijaan ccRCC näytteet kätkeminen bialleelisten menetys VHL (onko familiaalinen tai rajallista alkuperä) esiin karkeita ilmentymistä sekä NF-KB ja IFN allekirjoituksia (kuva 5). Nämä tiedot tukevat voimakkaasti ajatusta, että VHL inaktivointi todennäköisesti olekaan yhteydessä ulkonäön kohonnut NF-KB: n ja IFN aktiivisuutta ccRCC.

Heatmaps näytetään taitettava muutoksista ekspressiotasot NF-KB allekirjoitus geenejä ( a) tai IFN allekirjoitus geenejä (b) välillä VHL +/- näytteitä tapauksia familiaalinen VHL verrattuna

VHL

+ /+ normaali munuaisten epiteelin (sarake 1); VHL – /- familiaalisten ccRCC verrattuna normaaliin munuaisten kudoksen (sarake 2); tai VHL – /- tapaukset satunnaisia ​​ccRCC verrattuna normaaliin munuaisten kudosta (sarake 3). Lämpö bar = kertamuutosta (log

2 asteikko).

Kohonnut ilmaus osajoukon NF-KB tavoitteet korreloivat huono tulos ccRCC potilailla

Voit selvittää lisääntynyt NF-KB-aktiivisuus liittyi huono selviytyminen tulosten ccRCC selvitimme korrelaatio geenien ilmentymistä meidän NF-KB allekirjoitus ja eloonjäämiseen 55 ccRCC potilaille, joiden geenien ilmentymistä ja eloonjääminen oli saatavilla The Cancer Genome Atlas (TCGA) . Tämän analyysin, huomasimme, että kohonnut ilmentyminen neljän NF-KB sääntelyviranomaisten ja kohde- geenejä (

IKBKB

,

MMP-9, PSMB9

, ja

SOD2

) oli merkitsevästi yhteydessä suurempi suhteellinen riski (RR), huonompi ennuste, ja vähentää yleistä potilaan selviytymisen Coxin PH malli (

p

-arvo 0,05, RR 1) tai AFT mallin (

p

-arvon 0,05 tai β kerroin 0; katso menetelmät). Nämä neljä geenit ovat keskeinen säätelijä NF-KB: n signaloinnin itse (

IKBKB

) ja vahvistetaan välittäjäaineita NF-KB-solun eloonjäämistä ja pro-inflammatorisia vasteita (

MMP-9, PSMB9

, ja

SOD2

), nostamalla jännittävä mahdollisuus, että valikoivasti kohdistaminen jäsenet tämän osajoukko on kliinistä hyötyä ccRCC. Kuvassa 6 on esitetty Kaplan-Meier -käyrät näiden geenien ja taulukossa S5 yhteenveto analyysien tuloksista.

Kaplan-Meierin eloonjäämiskäyriä geenien NF-KB-allekirjoitus, jonka lisääntynyt ekspressiotasoja merkittävästi korreloivat huonommat kokonaiselinaikaa tulos näytetään. Yksittäiset geeniekspressioprofiilien oli kaksijakoinen mediaania jaettu ”korkea” (punainen) tai ”low” (sininen) lauseke ryhmiä. Gene nimet on merkitty yllä kunkin kaavion. Katso taulukko S5

p

-arvot.

Huomattavaa on, että lisääntynyt ilmentyminen viidennen geenin (

NFKB1

, jotka koodaavat NF-KB alayksikössä P105 /p50) oli myös merkitsevästi yhteydessä heikompaan eloonjäämiseen jonka AFT mallin (

p

-arvo = 0,041). Kuitenkin positiivinen-arvo β kerroin (33,6) ja puute merkityksen mukaan Cox PH malli (p-arvo = 0,41, RR = 0,5) esti meitä selvennetään sen yhdessä ccRCC etenemisen, minkä vuoksi olemme keskittyneet

IKBKB

,

MMP-9, PSMB9

, ja

SOD2

.

keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme päättäneet, että NF-KB on konstitutiivisesti aktiivinen useimmissa ccRCC testatussa, ja ovat osoittaneet meta-analyysi, joka avain NF-KB sääntelyviranomaisten ja tavoitteet ovat tasaisesti ylöspäin säädelty poikki neljä riippumatonta tutkimusta. Raportoimme myös löytö IFN allekirjoituksen ccRCC, ja antaa vakuuttavia todisteita siitä, että menetys VHL toiminta on välttämätöntä sekä NF-KB ja IFN allekirjoitukset. Lopuksi me identifioidaan alaryhmä potentiaalisesti-druggable NF-KB sääntelyviranomaisten ja tavoitteista, joiden kohonnut ilmentyminen korreloi huonon ennusteen ja selviytymistä. Huomattavaa on, että ei ole saatavilla potilaan tietojen esti meitä tarkastelemasta jos NF-KB ja /tai IFN allekirjoituksia korreloi ccRCC vaiheessa /laatu.

Vaikka NF-KB-välitteisen selviytymisen signalointia todennäköisesti kehittynyt suojaamaan soluja mitokondrion flux luonnostaan ​​normaaliin fysiologisia reaktioita (esim aikana sytokiinien perustuva antimikrobinen vasteita), useita havaintoja tekevät uskottavaa, että NF-KB-solujen eloonjääminen vaste on väärinkäytetty kasvainsolujen edistää omaa elinkelpoisuutta. Esimerkiksi perustajajäsen NF-KB perhe – linnun retrovirusgeeninkuljetusta

v-Rel

– on

bona fide

onkogeeni, ja geenit koodaavat NF-KB alayksiköt ja signalointi komponenttien näyttö aktivoivat mutaatiot useissa kasvaimissa [tarkistetaan [50-52]]. NF-KB: n solun eloonjäämisen tavoitteet koodaavat antioksidantti entsyymien puskuri mitokondrioita aikoina lisääntynyt bioenergeettinen kysyntää, samoin kuin muut proteiinit (kuten Bcl-2-perheen jäsenten Bcl-X

L ja Bfl-1), jotka aktiivisesti estävät mitokondrioita antaisi solukuoleman aikana genotoksinen ja metabolisen korostaa luontainen prosessi kasvaimen [51,52].

menetys pVHL on osoitettu lisäävän NF-KB: n aktiivisuuden, mikä osoittaa, että NF-KB: n voi edustavat yhteistä alavirtaan seurauksena

VHL

-puutos [15-17,33]. Kaelin ja Rettig laboratoriot ovat antaneet mekanistinen käsitys siitä, miten pVHL puute johtaa lisääntyneeseen NF-KB-aktiivisuuden selvittämiseksi kaksi erillistä polkuja pVHL riippuvaisen NF-KB: n sääntelyä. Kaelin ja kollegat tunnistettu NF-KB-aktivaattori CARD9 kuin pVHL-vuorovaikutuksessa proteiinin, ja osoitettiin, että pVHL edistää estävä fosforylaation CARD9 kinaasin CK2. Ablatoimiseksi pVHL ilmaisu kasvoi CARD9 perustuvaa NF-KB-aktiivisuutta, kun taas poistamalla CARD9 ilmaisu normalisoitu NF-KB aktiivisuuden pVHL puutosta RCC asetukset [17]. Samanaikaisesti, An ja Rettig todennut, että menetys pVHL kautta HIF → EGFR autokriinisen silmukka lisäksi lisääntynyt NF-KB-aktiivisuuden ccRCC [16]. Molemmat mekanismit yhteyden pVHL puutos kohonneelle NF-KB toimintaa ja antaa biokemiallisia selityksiä havaintomme Kyseinen suurempi NF-KB korreloi hyvin VHL mutaatiostatuksesta riippumatta.

Odottamaton tulos tässä tutkimuksessa oli havainto, että IFN allekirjoitus luonnehtii ccRCC. Yksinkertaisin selitys tälle allekirjoitus on, että se on suora seuraus kohonnut NF-KB: n aktiivisuutta. Suosimme tätä selitystä syistä, jotka (1) geenit koodaavat avain solmut IFN, mukaan lukien IFN-β ja IRF-7, sisältää funktionaalisia NF-KB sivustoja niiden promoottorien [53,54], ja yksinkertainen aktivointi NF KB voi ajaa nämä promoottorit [43,54]; (2) 1: 1-korrelaatiota välillä havaittiin ccRCC näytteiden, jotka sisälsivät ydin- NF-KB: n ja ne, jotka näytetään aktivoitu STAT1, ja (3) IFN allekirjoitus romahtaa soluissa, joista puuttuu NF-KB-alayksikön RelA (kuva 7a).