Krooninen sairaus

tiivistelmä

Jäkälät ovat symbioottisia organismeja, jotka tuottavat erilaisia ​​ainutlaatuisia kemikaaleja, joita voidaan käyttää farmaseuttisiin tarkoituksiin. Kun tavoitteena on seuloa uutta syöpälääkkeet, jotka estävät syöpäsolujen liikkuvuutta, testasimme estävä aktiivisuus seitsemän jäkälälajien kerätään Romanian Karpaattien vastaan ​​muuttoliike ja hyökkäys ihmisen keuhko- syöpäsoluja ja tutki tarkemmin molekyylitason mekanismeista niiden anti- metastaattinen aktiivisuus. Niistä

Alectoria samentosa

,

Flavocetraria nivalis

,

Alectoria ochroleuca

, ja

Usnea Florida

osoitti merkittävää estovaikutusta motiliteettia ihmisen keuhko- syöpäsoluja . HPLC Tulokset osoittivat, että usnic happo on tärkein yhdiste näissä jäkäliä, ja (+) – usnic happo osoitti samanlaista estävä aktiivisuus että raakaöljyn ote on. Mekanistisesti, β-kateniinin-välitteisen TOPFLASH aktiivisuus ja KITENIN-välitteisen AP-1: n aktiivisuuden pieneni (+) – usnic happokäsittely annoksesta riippuvalla tavalla. Määrälliset reaaliaikainen PCR-tulokset osoittivat, että (+) – usnic happo vähensi mRNA-tasolla ja CD44, sykliini D1 ja c-myc, jotka ovat alavirtaan kohdegeenien sekä β-kateniinin /LEF ja c-jun /AP-1 . Lisäksi, Rac1 ja RhoA toimintaa vähennettiin käsittelemällä (+) – usnic happoa. Mielenkiintoista on, että suurempi inhiboiva aktiivisuus solujen invaasiota ei havaittu, kun soluja käsiteltiin (+) – usnic happoa ja setuksimabi. Nämä tulokset ymmärtää, että (+) – usnic happo voi olla potentiaalia aktiivisuutta inhibitio syöpäsolumetastaasi, ja (+) – usnic happoa voitaisiin käyttää syövän hoidossa, jossa on erilliset vaikutusmekanismeja.

Johdanto-osan : Yang Y, Nguyen TT, Jeong MH, Crişan F, Yu YH, Ha HH, et al. (2016) estoaktiivisuus (+) – Usnic Acid vastaan ​​ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solun liikkuvuus. PLoS ONE 11 (1): e0146575. doi: 10,1371 /journal.pone.0146575

Editor: Frédéric André, Aix-Marseille University, RANSKA

vastaanotettu: 02 syyskuu 2015; Hyväksytty: 18 joulukuu 2015; Julkaistu: 11 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Research Foundation of Korea (NRF-2013R1A1A2004677, NRF-2013R1A2A2A07067609, NRF-2015R1A4A1041219 ja MRC-2011-0030132) ja Korean National Research Resource Center Program (NRF-2014M3A9B8002115). Tutkimuksessa saanut tukea myös tutkimuksen apurahan rahoittamaa Sunchon Research Center for Natural Medicine.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Lyhenteet: AP-1, aktivaattori proteiini-1; EGF, epidermaalinen kasvutekijä; DMSO, dimetyylisulfoksidi; HPLC, korkean erotuskyvyn nestekromatografia; KITENIN, KAI1 COOH-terminaalin vuorovaikutuksessa olevaa tetraspanin; LEF lymfoidia parantaa tekijä; PBD, p21 sitova domeeni; PCR, polymeraasiketjureaktio; RBD, Rho-sitova domeeni

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolemaan kehittyneissä maissa. Puutteen takia tehokkaiden hoito edenneen taudin, ennuste keuhkosyöpään on edelleen huono, joissa on alle 15% elossa viisi vuotta diagnoosin jälkeen [1]. Vieressä invaasio ja etäpesäkkeiden ovat tärkeimpiä syitä syöpään liittyvä kuolema [2]. Siksi haun estäjiä syöpäsoluinvaasiota ja muuttoliike kyky voisi paljastaa uuden hoidon syövän hoitoon. Vaikka yrttejä on käytetty syövän hoidossa tuhansia vuosia, ne ovat edelleen erittäin tärkeä lähde biologisesti aktiivisia tuotteita. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää mahdollisia terapeuttisia aineita parantaa potilaiden selviytymiseen keuhkosyöpä etäpesäkkeitä.

Jäkälät ovat symbioottinen organismeja, jotka tuottavat suuren määrän bioaktiivisia aineita yli 800 [3], joka sisältää monia luokkia yhdisteet: aminohappojohdannaiset, sokerialkoholeja, alifaattiset hapot, γ-, δ- ja makrosyklisten laktonien monosyklinen aromaattinen yhdisteet, kinonit, chromones, xanthones, dibentsofuraaneja, depsides, depsidones, depsones, terpenoidit, steroidit, karotenoidit [4] ja difenyylieetterit [5, 6]. Hitaasti kasvava organismien vähän resursseja luontotyyppien tuottavat suurempia puolustuksen kemikaalien [7]. Siksi jäkälät ovat lähde ainutlaatuinen kemiallisia aineita, joista jotkut ovat jo osoittautuneet tehokkaiksi vastaan ​​eri syöpää

in vitro

mallit [8]. Tässä nykyisessä tutkimuksessa selvitettiin estävä aktiivisuus seitsemän jäkälälajien kerätään Romanian Karpaattien vastaan ​​maahanmuuton ja hyökkäys kyky ihmisen keuhko- syöpäsoluja ja tutki tarkemmin mahdollisia molekyylitason mekanismeista niiden antimetastaattisia aktiivisuutta tunnistaa mahdolliset yhdisteiden uusia anti- etäpesäke aineita.

Materiaalit ja menetelmät

valmistaminen jäkälien uutteiden

lichen yksilöihin, joita käytetään tässä tutkimuksessa kerätty Romania vuonna 2011, oli tunnistettu Korean jäkälä Research Institute ( KoLRI), Sunchon National University, Korea. Lyhyesti, thalli jäkälien kerättiin Romania vuonna 2011 aikana opintomatka Kansallispuiston Calimani (47 ° 07’28.6 ”N, 25 ° 13’34.8” E) ja luonnonpuisto Bucegi (45 ° 20’21.7 ”N , 25 ° 27’41.4 ”E) järjestämä Dr. Crişan Babeş-Bolyain yliopisto, Cluj-Napoca, Romania [9]. Lupa kerätä jäkäliä näytteet näistä paikoista on antanut hallinnon National Park Calimani ja hallinto luonnonpuistoa Bucegi, suostumuksella komission suojaamisesta Natural Monuments (Romanian Academy). Kentän tutkimuksissa ei liittynyt uhanalaisten tai suojeltujen. Kaksoiskappaleet talletettiin osaksi Korean jäkälät ja Allied Bioresource Center (KOLABIC) Korean Jäkälä Research Institute (KoLRI), Sunchon National University, Korea. Kuivattu thalli on jäkälien uutettiin asetoniin huoneenlämpötilassa 48 tunnin ajan. Asetoni uutteet suodatettiin sitten ja kuivattiin tyhjökiertohaihduttimessa 45 ° C: ssa. Kuiva uutteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), kun 5 mg /ml pitoisuus (1000 x) kaikissa kokeissa. Seitsemän Romanian jäkälälajien ja niiden voucher näyte numeroita Tässä tutkimuksessa käytetyt lueteltiin taulukossa 1.

Suuren erotuskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) analyysi jäkälä materiaalin

asetoniuute jäkälien thalli pitoisuutena 5 mg /ml altistettiin korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) analyysit (LC-20A, Shimadzu, Kioto, Japani) YMC-Pack ODS-A (150 x 3,9 mm ID) käänteisfaasi- pylvääseen, joka sisälsi täysin pääteryhmäinen C18 materiaalia (partikkelikoko 5 pm; huokoskoko, 12 nm). Eluutio suoritettiin virtausnopeudella 1 ml /min seuraavissa olosuhteissa ennen seuraavien injektio: pylvään lämpötila, 40 ° C; liuotinsysteemi, metanoli: vesi: fosforihappoa (80: 20: 1, v /v /v). Analyysit valvoo valodiodirividetektoria (SPD-M20A; Shimadzu) vaihteluvälillä 190 ~ 800 nm koko HPLC aikavälillä. Havaitut huiput skannattiin välillä 190 ja 400 nm. Standardi käytetty salazinic acid (t

R = 2,27 ± 0,2 min) eristettiin lichen

raidankeuhkojäkälä

. Usnic käytetty happo tutkimuksessamme ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) (329967-5G). Voucher Näytteet talletetaan kasvio on Lichen Allied Bioresource keskuksen Korean Lichen Research Institute, Sunchon National University, Etelä-Korea.

Nestekromatografia-massaspektrometria (LC-MS) ja optinen kierto analaysis jäkälien materiaalin

LC-MS-spektrit tallennettiin spektrometrillä kanssa sähkösumutusionisaatioon lähde käyttäen Agilent 6460 kolmoiskvadrupolisen LC /MS: llä. Arvot optinen kierto mitattiin 25 ° C: ssa käyttäen Jasco P-1010 -polarimetrillä, jossa on natrium-lamppu, ja kuvataan seuraavasti: [α] D, T (c (g /100 ml), liuotin). Ominaiskiertokyky puhdasta (+) – usnic happo (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) on fysikaalinen ominaisuus tietyssä aallonpituudella ja lämpötilaa ja voidaan katseli kirjallisuudessa.

Soluviljely

ihmisen keuhko- syöpäsoluja, kuten A549, H460, H1650, ja H1975 viljeltiin RPMI 1640 elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 1% penisilliini-streptomysiini liuokseen kostutetussa 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa.

Haavan paranemista määrityksessä

A549-solut maljattiin tiheydellä 2,5 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppaisille kudosviljelylevyille (Corning, New York , USA) ja kasvatettiin yön yli konfluenssiin. Yksikerroksinen solut raaputettiin pipetin kärki luoda haava. Sitten solut pestiin kahdesti seerumittomalla RPMI 1640 poistaa kelluvat solut ja inkuboitiin RPMI1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 2% FBS: ää, jossa 5 ug /ml, lichen uutetta tai 5 uM usnic happoa. Valokuvia solujen otettiin 0, 24, 48, ja 72 h haavoittamisen jälkeen mitata leveys haavan. Kunkin näytteen, keskimäärin viisi haavan määritysten otettiin määrittämiseksi keskimäärin muuttoliikkeen tietyllä pitoisuutena asetoniuute tai usnic happoa. Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Invasion määrityksessä

Invasion määritykset suoritettiin transwell kammioiden (Corning, New York, USA) 8 um huokoskoko polykarbonaattikalvosuodattimia päällystetty 1% gelatiinia. Solut maljattiin 2 x 10

5 solua /kuoppa RPMI 1640, joka sisälsi 0,2% naudan seerumin albumiinia ylempään osastoon kammion kanssa tai ilman 5 ug /ml raakaa lichen uutteet. Sitten RPMI1640 väliaineessa 10 ug /ml fibronektiiniä lisättiin alempaan kammioon toimimaan kemotaktinen aine. Sen jälkeen kun 48-tunnin inkuboinnin jälkeen solut ylemmässä kammiossa kiinnitettiin Diff Quik Kit (Sysmex, Kobe, Japani). Sitten solut kammiossa olivat mekaanisesti poistettiin kalvo vanupuikolla, ja solut kiinni alapinnalle kalvon värjättiin ja laskettiin valomikroskoopilla (5 kentät per säiliö). Kukin invaasiomääritys toistettiin kolmessa riippumattomassa kokeessa. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona liikkuvien solujen lukumäärä per suuritehoisia alalla.

Reporter määrityksessä

HEK293T-soluja maljattiin 24-kuoppaisille levyille 12 tuntia ennen transfektiota. Transfektion jälkeen TOPFLASH tai AP-1-reportteriplasmidilla vastaavien aktivaattori, β-kateniinin tai KITENIN, soluja käsiteltiin usnic hapon 48 tuntia ja sitten analysoitiin käyttäen Dual-Luciferase

® reportterimääritys järjestelmän (Promega, Madison , WI, USA). Renilla lusiferaasireportteriplasmidi (PRL-TK) käytettiin sisäisenä kontrollina transfektiotehokkuudelle. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja vähintään kolme tulokset riippumatonta koetta mukaan analyysiin. Kertamuutoksia laskettiin käyttäen arvoja normalisoitu Renilla lusiferaasiaktiivisuus.

Quantitative real-time PCR

kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [9]. Lyhyesti, kokonais-RNA eristettiin ihmisen keuhkosyövän soluja käyttämällä RNAiso Plus (TaKaRa, Otsu, Shiga 520-2193, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA (1 ug) kustakin ryhmästä käsiteltyjen solujen muutettiin cDNA: ksi käyttäen M-MLV-käänteistranskriptaasia (Invitrogen, Carlsbad, USA) ja SYBR vihreä (Enzynomics, Seoul, Korea). Käytetyt alukkeet real-time PCR oli sykliini D1 (forward) 5′-ccgtccatgcggaagatc-3 ’ja (reverse) 5′-gaagacctcctcctcgcact-3′; c-myc (forward) 5’-aatgaaaaggcccccaaggtagttatcc-3 ’ja (reverse) 5′-gtcgtttccgcaacaagtcctcttc-3′; CD44 (eteenpäin) 5’-tgccgctttgcaggtgtat-3 ’ja (reverse) 5′-ggcctccgtccgagaga-3′; GAPDH (eteenpäin) 5’-atcaccatcttccaggagcga-3 ’ja (reverse) 5′-agttgtcatggatgaccttggc-3’. Reaaliaikainen PCR-reaktio ja analyysi suoritettiin käyttäen CFX (Bio-Rad, Hercules, USA).

Affinity saostaminen Cellular GTPaaseja

Matkapuhelinverkko Rac1 ja Cdc42 toiminta määritettiin käyttämällä GST-RBD /PBD kuten aiemmin on kuvattu [10, 11]. Lyhyesti, solut hajotettiin hajotuspuskuriin (50 mM Tris, pH 7,4, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, ja proteaasi-inhibiittorin seos) . Lysaatit inkuboitiin GST RBD /PBD helmiä huoneenlämpötilassa 1 tunti. Helmet pestiin sitten neljä kertaa pesupuskurilla (50 mM Tris, pH 7,4, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl

2, ja proteaasi-inhibiittorin seosta). Sitoutunut Rac1 ja Cdc42-proteiinit havaittiin immunoblottauksella käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​Rac1 (MILLIPORE 05-389) ja Cdc42 (SANTA CRUZ SC-87). Suhteellinen aktiivisuus kunkin GTPaasi määritettiin määrällisesti kunkin kaistan GTP-sitoutuneen GTPaasina ja kokonaismäärä GTPaasi Multi-Gauge 3,0, ja arvot GTP: hen sitoutuneen bändejä normalisoitiin arvoon kokonaismäärästä. Kaikki tulokset määritettiin käyttäen kolmea erilaista vastuut vähintään kolmen erillisen kokeen.

Tulokset

esto A549 soluliikkuvuus by jäkälää otteet

Solun maahanmuutto on keskeinen rooli aikana syöpä etäpesäke. Löytää anti-muuttavien jäkälää sekundaarimetaboliittien ihmisen keuhko- syöpäsoluja, haavojen määritys suoritettiin joukossa seitsemän Asetoniuutteet Romanian jäkälien taulukossa 1. Jäkälät tuottaa ainutlaatuisia polyketidisyntaasi sekundäärimetaboliitteja lukien depsides, depsidones, dibentsofuraaneja, ja depsones; ja nämä hydrofobiset yhdisteet tavallisesti uutettiin asetonilla [12]. Kuten on esitetty kuviossa 1A,

Alectoria samentosa

,

Flavocetraria nivalis

,

Alectoria ochroleuca

, ja

Usnea Florida

inhiboi A549-solujen vaeltamiseen pitoisuutena 5 ug /ml. Pituus reunojen välillä haavan 72 h näiden ehdokkaiden olivat huomattavasti laajempi kuin DMSO-käsitellyn ryhmän tai ei-aktiivinen näyte (

Bryoria capillaris

). Erityisesti

F

.

nivalis

osoitti yli 60% estävä aktiivisuus verrattuna kontrolliin (kuvio 1A ja 1 B).

(A-B) kvantitatiivinen analyysi migraatiokokeessa A549-soluja käsiteltiin 5 ug /ml asetonia otteita

Alectoria samentosa

,

Flavocetraria nivalis

,

Alectoria ochroleuca

,

Bryoria capillaris

,

Hypogymnia physodes

,

Usnea florida

ja

Evernia divaricata

(A), ja edustavat kuvat migraatiokokeessa A549 käsiteltyjen solujen uutteita

.

samentosa

,

F

.

nivalis

,

.

ochroleuca

,

U

.

Florida

ja

B

.

capillaris

(B). (C-D) Invasion määritys A549-solut käsiteltiin 5 ug /ml: ssa asetonia uutteiden

.

samentosa

,

F

.

nivalis

,

.

ochroleuca

,

U

.

Florida

ja

B

.

capillaris

(C), ja kvantitatiivinen analyysi hyökkäsi solujen määrä kussakin ryhmässä (D). Kuvat ovat näytettiin kolmesta itsenäisestä kokeesta, n = 3. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe). *** P 0,001; NS, ei merkittävää eroa verrattuna 0,01% DMSO-käsiteltyjen A549-solut.

vaikutukset asetonia otteita

.

samentosa

,

F

.

nivalis

,

.

ochroleuca

, ja

U

.

Florida

A549 soluinvaasiota määritettiin sitten käyttämällä siirtokuoppaan kammion invaasiomääritys. Tämän seurauksena jäkälän otteet vähensi hyökkäsi solujen määrä jopa 50% verrattuna DMSO tai

B

.

hiussuonia

(negatiivinen kontrolli) (kuvio 1 C ja 1 D). Nämä havainnot osoittivat, että asetonia otteet

.

samentosa

,

F

.

nivalis

,

.

ochroleuca

, ja

U

.

Florida

esti sekä maahanmuutto- ja hyökkäys kyky A549 keuhkosyöpäsoluissa.

Usnic happo on aktiivinen estäjä päässä jäkälälajien

tunnistaa komponentit asetonia uutteen jäkälä,

.

samentosa

,

F

.

nivalis

,

.

ochroleuca

, ja

U

.

Florida

otteita ajettiin HPLC. Kuten on esitetty kuviossa 2A, usnic happo tunnistettiin tärkein yhdiste nämä kaikki neljä ehdokasta verrattuna sisäiseen standardiin puhdistetun (+) – usnic happoa (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), ja nämä olivat yhdenmukaisia aiempien raportti (taulukko 1) [13-20]. Identiteetin usnic hapon ja niiden optiset tila analysoitiin LC-MS-analyysillä ja optinen aktiivisuus analyysi, vastaavasti (S1 File). Että% intensiteetti piikin varten usnic hapon ehdokas jäkälien pitoisuutena 5 mg /ml, saatiin vertaamalla sen, että piikin puhdasta 5 mg /ml usnic happoa. On syytä huomata, että usnic happopitoisuus on korkein

F

.

nivalis

uutetta, mikä saattaa selittää sen voimakas estävä vaikutus solujen vaeltamiseen (kuvio 2A). Se oli arveltu, että (-) – usnic happo on samankaltainen tai voimakkaampi inhibitorinen vaikutus solun liikkuvuus kuten asetoni uute

.

samentosa

ja

.

ochroleuca

joiden tiedetään olevan (-) – usnic happoa niiden -aliosa [13, 16, 18] osoittivat samanlaisia ​​tai voimakkaampi estävää aktiivisuutta muuttoliikettä ja invaasio, vastaavasti kuin (+) – usnic happoprimerin

U

.

Florida

(kuvio 1). Meidän edellisessä raportissa, osoitimme, että asetoniuute jäkälien

F

.

cucullata

ja sen komponenttien, usnic happo, esti tuumorigeenisyyteen ja liikkuvuus syöpäsolujen [9]. Tämän mukaisesti, (+) – usnic hapon pitoisuus on 5 uM inhiboi merkittävästi muuttoliikkeen ja invaasion A549-solut (kuvio 2). Tässä pitoisuudessa usnic happo eivät osoittaneet sytotoksisuuteen ja /tai estävät solujen lisääntymistä (IC

50 arvo usnic hapon A549 = 65,3 ± 0,65 uM) [9]. Kuten kuviossa 2B-2E, estoaktiivisuus (+) – usnic happo 5 uM on peräti 50% 72 tunnin hoito muuttoliike ja on noin 40% 48 tunnin hoito hyökkäystä. Tarkastella lähemmin inhiboivaa aktiivisuutta (+) – usnic hapon toisessa keuhkosyövän soluja, invaasiomääritys suoritettiin käyttäen H1650 ja H1975-soluissa. Tämän seurauksena, (+) – usnic happokäsittely merkittävästi vähentynyt hyökkäsi solujen määrä H1650 ja H1975-soluja pitoisuutena 5 uM (kuvio 3A). Määrällinen analyysi paljasti, että inhibitio oli niinkin korkea kuin 40% sekä soluissa verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen solujen (kuvio 3B). Yhdessä tulokset osoittivat, että (+) – usnic happo on estävä vaikutus solun liikkuvuus ihmisen keuhkosyövän soluja.

(A) Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) analyysiä lichen Asetoniuutteet. Että% intensiteetti piikin varten usnic hapon uutteen pitoisuutena 5 mg /ml, saatiin vertaamalla sen, että piikin puhdasta 5 mg /ml usnic happoa. (B-C) Migration määritys A549-solut käsiteltiin 5 uM (+) – usnic happo (B), ja kvantitatiivinen analyysi haavan pituus (C). (D-E) Invasion määritys A549-solut käsiteltiin 5 uM (+) – usnic happo (D), ja kvantitatiivinen analyysi hyökkäsi solujen määrä kussakin ryhmässä (E). Kuvat ovat esitetään kolmesta itsenäisestä kokeesta, n = 3. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe). *** P 0,001; NS, ei merkittävää eroa verrattuna 0,01% DMSO-käsiteltyjen A549-solut.

(AB) Invasion määritystä H1650 ja H1975-soluja käsiteltiin 5 uM (+) – usnic happo (A), ja kvantitatiivinen analyysi hyökkäsi solujen määrä kussakin solulinjassa (B). Kuvat ovat esitetään kolmesta itsenäisestä kokeesta, n = 3. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe). ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ei merkittävää eroa verrattuna 0,01% DMSO-käsiteltyjen A549-solut.

(+) – Usnic happo laskee β-kateniinin-välitteisen TOPFLASH aktiivisuus ja KITENIN-välitteisen AP-1-aktiivisuuden

tutkimiseksi olevat mekanismit inhiboivaa aktiivisuutta (+) – usnic happo, teimme TOPFLASH ja AP-1 reportteri määrityksiä sen arvioimiseksi, (+) – usnic happo voi moduloida β-kateniinin-välitteisen ja /tai KITENIN-välitteistä signalointia aktiivisuutta. Kuten on esitetty kuviossa 4A, (+) – usnic happo vähentynyt merkittävästi TOPFLASH aktiivisuutta 18% 1 uM ja 37% 10 uM. Kuten AP-1 aktiivisuutta, annosriippuvaista laskua havaittiin 0,5 uM, ja lasku oli merkittävä, jopa 50% 10 uM. Lisäksi (+) – usnic happoa myös merkittävästi vähentynyt EGF-aktivoitu KITENIN-välitteisen AP-1-aktiivisuutta 32%: lla 1 uM ja 41% 10 uM (kuvio 4B). Voit tarkistaa, onko taso alavirran kohdegeenien β-kateniinin /LEF ja c-jun /AP-1 vaikutti (+) – usnic happokäsittelyllä, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa 5, suhteellista ekspressiotasot CD44, sykliini D1, ja c-myc oli vähentynyt merkittävästi (+) – usnic happokäsittely keuhkosyövän soluja eri tahtiin (kuvio 5A-5D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että (+) – usnic happo esittää estävä vaikutus solun liikkuvuus modulaation kautta β-kateniinin-välitteisen ja KITENIN-välitteistä signalointia aktiivisuus keuhkojen syöpäsoluja.

(A) β-kateniinin-välitteisen transkriptionaalista aktiivisuutta TOPFLASH promoottorin väheni (+) – usnic happokäsittely. HEK 293T-solut transfektoitiin β-kateniinin ja TOPFLASH reportteriplasmidilla. 12 tunnin kuluttua transfektiosta solut käsiteltiin (+) – usnic happoa 48 tuntia. (B) KITENIN-välitteisen transkriptionaalisen aktiivisuuden ja AP1-promoottorin väheni (+) – usnic happokäsittely. HEK 293T-solut transfektoitiin KITENIN ja AP-1-reportteriplasmidilla. 12 tunnin kuluttua transfektiosta solut käsiteltiin (+) – usnic happo 48 tuntia tai ilman EGF. Kokeet suoritettiin vähintään kolme riippumatonta kulttuureissa, n = 3. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ei merkittävää eroa verrattuna 0,01% DMSO-käsiteltyjen HEK 293T-soluissa.

(AD) kvantitatiivinen analyysi mRNA-tasolla ja CD44, c-myc, ja sykliini-D1 A549 (A), H1650 (B), H1975 (C), ja H460 (D) solut käsiteltiin 5 uM (+) – usnic happoa. Data edustaa keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe), n = 3. * p 0,05; *** P 0,001; NS, ei merkittävää eroa verrattuna 0,01% DMSO: lla hoidetussa ryhmässä kussakin solulinjassa.

(+) – Usnic happo vähentää GTP-Rac1 ja -RhoA tasolla

toiminta Rac1 ja Cdc42 osallistuvat mesenkymaalisten tilassa muuttoliike [21, 22]. Sen määrittämiseksi, ovatko (+) – usnic happo voi vaikuttaa toimintaan näiden proteiinien A549-soluja, GST pull-down analyysit suoritettiin käyttämällä GST-PBD (p21 sitova domeeni). Kuten on esitetty kuviossa 6, (+) – usnic happokäsittely merkittävästi vähentynyt taso GTP-Rac1 22% verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen solujen (kuvio 6A). Kuitenkaan mitään merkittävää muutosta tason GTP-Cdc42 havaittiin (+) – usnic happokäsittely (kuvio 6B). RhoA edistää junktionaalinen muodostumista, apikaalisella ahdistus ja vähentää tarttuvuus ja solujen leviämistä [23, 24]. Sen määrittämiseksi, ovatko (+) – usnic happo voi vaikuttaa aktiivisuuteen RhoA A549-soluissa, GST pull-down analyysit suoritettiin käyttämällä GST-RBD (Rho-sitova alue). Kuten on esitetty kuviossa 6C, (+) – usnic happokäsittely merkittävästi vähentynyt taso GTP-RhoA 40% verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin soluihin. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että (+) – usnic happo estää solun liikkuvuus kautta sääntelyn Rho GTPaasit.

(AC) tasot GTP-sidottu Rac1, Cdc42 ja RhoA mitattiin A549-soluja käsiteltiin 5 uM (+) – usnic happoa. GTP-Rac1 ja -Cdc42 mitattiin käyttämällä GST-PBD, ja GTP-RhoA mitattiin käyttämällä GST-RBD. Kokonaismäärät RhoA, Rac1, ja Cdc42 myös esitetty. Suhteellinen toiminta Rac1 (A), Cdc42 (B), ja RhoA (C) määritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (standard keskivirhe), n = 3. ** p 0,01; *** P 0,001; NS, ei merkittävää eroa verrattuna 0,01% DMSO-käsiteltyjen A549-solut.

(+) – Usnic happo näyttää lisäaine estoaktiivisuus Setuksimabihoitoa

Setuksimabia (Erbituxia, C225), monoklonaalinen vasta-aine orvaskeden kasvutekijän reseptorin (EGFR), jota käytetään yhtenä anti-EGFR-aineiden metastaattisen paksusuolen ja keuhkosyöpä. Sen tutkimiseksi, (+) – usnic happo on terapeuttinen osuvuutta Setuksimabihoitoa, invaasiomääritys suoritettiin eri pitoisuuden setuksimabin ja /tai (+) – usnic happoa. Kuten on esitetty kuviossa 7, estoaktiivisuus setuksimabin oli ~ 30% 1 ug /ml, ja ~ 40% 10 ug /ml A549-soluja, ja hoito 5 uM (+) – usnic happo osoitti samanlaista inhiboivaa aktiivisuutta 10 gg /ml setuksimabia (~ 40%: n esto) näihin soluihin. Mielenkiintoista on, että suurempi inhiboiva aktiivisuus solujen invaasiota ei havaittu, kun soluja käsiteltiin 1 ug /ml setuksimabia yhdessä 5 uM (+) – usnic happo (kuvio 7). Nämä tulokset viittaavat siihen, että (+) – usnic happo ei vain voi estää keuhkosyövän solun liikkuvuus, jonka yksin, mutta voi myös voimistaa terapeuttista aktiivisuutta setuksimabin. Kuten usnic happo laski KITENIN-välitteistä AP-1-aktiivisuutta (kuviot 4 ja 5) ja KITENIN /ErbB4-välitteistä alavirtaan signaalin EGF soittaa yksi molekyyli perusteella resistenssin anti-EGFR-aineiden [25], nämä tulokset viittaavat siihen, että usnic happo voi olla potentiaalia hyödyllistä aktiivisuutta voittamisessa rajallinen kliininen teho anti-EGFR-hoidon.

(AB) Invasion määritys A549-solut käsiteltiin 5 uM (+) – usnic hapon ja /tai eri pitoisuus setuksimabin (A), ja kvantitatiivinen analyysi hyökkäsi solujen määrä kussakin ryhmässä (B). Kuvat ovat esitetään kolmesta itsenäisestä kokeesta, n = 3. Tiedot edustavat keskiarvoa ± SEM (Vakio keskivirhe). * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001; NS, ei merkittävää eroa osoitettu ryhmä.

Keskustelu

syöpäsolun hankkii biologiset ominaisuudet kuten vastustavat solukuoleman, ylläpitävä proliferatiivinen signalointi, kiertää kasvu vaimentimet, aktivoimalla invaasio ja etäpesäkkeiden, ja niin esiin kehittymässä aikaista loppuvaiheen [26, 27], ja kumman tahansa näistä acquirements voidaan ryhmitellä ”syövän vastaista”. Tältä osin havaintojemme että (+) – usnic happo estää maahanmuutto- ja invaasion kyky keuhkosyöpään solut ovat romaanin syövänvastainen aktiivisuus (+) – usnic happoa. Lisäksi tuloksemme osoittivat, että (+) – usnic happo on erityisiä toimintamekanismeja niiden syövän vastaista aktiivisuutta, ja nämä ovat varsin erilaiset kuin aiempien kirjallisuuden osoittaa sytotoksisuutta, yksi mekanismi toimia syövän vastaisen aktiivisuuden (+) – usnic happo erilaisissa syöpäsoluissa.

maksatoksisuus usnic happo voi rajoittaa niiden potentiaalista lääkkeiden käyttö syöpähoitojen [28]. Kuitenkin suurin osa maksatoksisuuden ihmisen havaittiin, kun suuri annos usnic happoa oraalisesti ravintolisänä varten laihtuminen [29-31]. Vuonna syöpähoitojen, maksatoksisuus voidaan välttää säätämällä annostus, muotoilu ja /tai reitti lääkityksen. Esimerkiksi da Silva Santos et al. osoittivat, että nano-kapselointi usnic happo mahdollistavat ylläpitämiseksi ja parantamiseksi antituumorivaikutus ja vähentää huomattavasti hepatotoxicity [32]. Lisäksi on osoitettu, että täydentäminen antioksidanttia, toisin sanoen E-vitamiinia, sekä usnic happo voidaan merkittävästi alentaa usnic hapon aiheuttama maksamyrkyllisyyttä ensisijainen viljellyissä hiiren hepatosyyttien [33]. Olisi myös huomattava, että jotkut paperit osoittavat maksatoksisuuden tehtiin HepG2-soluja, peräisin maksasyövän kudoksesta 15 vuotta male adolescent [34, 35]. Edellisessä paperi [9], olemme osoittaneet, että usnic hapon jotenkin on selektiivinen sytotoksisuus syöpäsoluissa verrattuna normaaleihin soluihin. Vaihtoehdossa näkökulmista, vaikea sytotoksisuus usnic hapon HepG2-soluissa heijastaa valikoiva ja erityinen syövänvastainen aktiivisuus usnic hapon maksasyöpää tutkimuspitoisuuksilla.

Meidän edellisessä raportissa osoitettiin, että sytotoksisuus usnic happoa on nimenomaan syöpäsoluja, kuten HT29 (peräsuolen syövän solut, IC

50 = 95,2 ± 0,85 uM), AGS (mahalaukun syöpäsolun; IC

50 = 15,01 ± 0,52 uM), A549 (keuhkosyöpäsolua; IC

50 = 65,3 ± 0,65 uM), ja CWR22Rv-1 (syöpäsolujen; IC

50 = 24,1 ± 0,63 uM), kun taas ei-syöpäsoluja, kuten MDCK (Mardin-Darby koiran munuainen; IC

50 = 133,04 ± 3,5 uM), RIE (rotan suolen epiteelisolujen; IC

50 = 126 ± 4,25 uM), NIH 3T3 (hiiren alkion fibroblasti; IC

50 = 164,2 ± 3,7 uM), ja HaCaT ( ihmisen keratinosyyttien; IC

50 = 185,7 ± 4,8 uM) soluihin, ei vakavasti vaurioitunut [9]. Koska keskimääräinen kiertävän veritilavuuden hiiriä on 72 ml /kg [36] ja molekyylipaino usnic happo on 344, LD

50 arvo usnic happoa (hiiri-suullinen; 838 mg /kg) KTT arkki usnic happo voidaan laskea 33,8 mM. Kuten estävä aktiivisuus usnic hapon inhiboimaan keuhkosyövän solun liikkuvuus on havaittu pitoisuutena 5 uM, tuloksemme osoittivat, että usnic happoa voitaisiin käyttää anti-metastaasin aine on vain vähän toksisuutta toimi pitoisuuksina.

Usnic hapon vähäisen vesiliukoisuuden, joka on este lääkekehityksen se todennäköisesti johtaa huonoon hyötyosuuteen. Tämän ongelman välttämiseksi, erilaisia ​​lähestymistapoja voidaan tehdä parantamiseksi liukoisuutta oma yhdisteen hiukkaskoko vähentäminen, Crystal engineering, suolan muodostus, kiinteä dispersio, käyttö pinta-aktiivista ainetta, kompleksoimalla, ja niin edelleen [37]. Valinta lisälaite menetelmän tulisi määrittää jokaisen lääkkeen vaaditaan annosmuodossa ominaisuudet. Sillä usnic happo, tuoreessa artikkelissa raportoitiin, että kaliumsuola usnic happoa (kalium usnate) on 100% liukoisuus menettämättä biologista aktiivisuutta 10 ug /ml (noin 26 uM) [38]. Yhdessä tosiasiat että (+) ja (-) enantiomeerimuodoilla usnic happoa osoittivat kohtalaisesta vahvaa biologista aktiivisuutta [39, 40], jatkotutkimuksia tarvitaan arvioitava mahdollisuudet lääkkeiden käyttö usnic happoa syöpähoidolla erilaisissa syövissä.

tukeminen Information

S1 File. LC-MS-analyysi (kuvassa A S1 File) ja optinen aktiivisuus analyysi (kuva B S1 File) näytteiden käytettiin tässä tutkimuksessa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0146575.s001

(PDF)