Krooninen sairaus

tiivistelmä

Niemann-Pickin tyypin C2 (NPC2) on tärkeä rooli sääntelyn solunsisäisen kolesterolin homeostaasin suora sitoutuminen ilmaisella kolesteroli. Kuitenkin tiedetään vähän merkitystä NPC2 syövässä. Tässä tutkimuksessa olemme poimi vaikutusta erilaisia ​​syövät NPC2 ilme. Sarja anti-NPC2 monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t) ja IgG2a-isotyyppi ja tehtiin peptidin seulonta osoitti, että reaktiivinen epitooppi oli aminohappotähteet 31-40 ihmisen NPC2 proteiinia. Spesifisyys Näiden mAb: iden vahvistettiin Western-blottauksella käyttämällä shRNA välittämää knock-down of NPC2 ihmisen SK-HEP1 soluissa. Immunohistokemiallisella värjäyksellä, NPC2 ilmentyy normaaleissa munuaisissa, maksassa, rinta-, koolon-, keuhko-, ruokatorven, kohdun kohdunkaulan, haiman ja mahalaukun kudosta. Vahva ilmentyminen NPC2 havaittiin distaalisen ja proksimaalisen kiemuratiehyessä munuaisten ja hepatosyyteissä maksassa. Normaali ruokatorven, kohdun kohdunkaulan, haiman, mahalaukun, rinnan, paksusuolen ja keuhkojen kudosten värjätään kohtalaisen heikosti. Verrattuna normaaliin kudokseen ekvivalenttia, NPC2 yli-ilmentyminen havaittiin rinta-, paksusuolen ja keuhkojen. Mitä tulee rintasyövän, NPC2 ylössäätöä liittyy estrogeenireseptorin (-), progesteronireseptori (-) ja ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori (+). Toisaalta, NPC2 todettiin säädellä vähentävästi munuaissyövän, maksakirroosia ja hepatooma kudoksiin. Antigeenin capture entsyymi-immunomääritys ELISA, seerumin NPC2 on suurentunut potilailla, joilla on maksakirroosi ja maksasyöpä. Mukaan western blot tietojen muutos glykosyloidun rakenteessa NPC2 seerumissa liittyy maksakirroosi ja maksasyöpä. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen kattava immunohistokemiallinen ja serologinen tutkimus tutkii ilmaus NPC2 erilaisissa ihmisen erilaisten syöpien. Nämä uudet monoklonaalisia vasta-aineita pitäisi auttaa valaisemaan roolit NPC2 kasvaimen kehitystä, erityisesti maksassa ja rintasyöpiä.

Citation: Liao YJ, Lin MW, Yen CH, Lin YT, Wang CK, Huang SF, et al. (2013) karakterisointi Niemann-Pickin tyypin C2 Protein Expression Monta Syövät käyttäminen Novel NPC2 monoklonaalinen vasta-aine. PLoS ONE 8 (10): e77586. doi: 10,1371 /journal.pone.0077586

Editor: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Japani

vastaanotettu: toukokuu 30, 2013; Hyväksytty: 04 syyskuu 2013; Julkaistu 17. lokakuuta 2013

Copyright: © 2013 Liao et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta National Science neuvosto Kiinan tasavallan (myöntää NSC100-2325-B-010-008 ja NSC102-2320-B-038-003) ja Taipei Medical University (myöntää TMU101-Ä1-B29). TLCN on tukenut avustusta National Science neuvosto vuodesta 2005 (NSC 100-2325-B- 182-006) ja National Health Research Institutes, Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Niemann-Pickin tyypin C2 (NPC2) proteiini on pieni liukoisen glykoproteiini, joka sisältää yhdeksäntoista aminohappoa signaalipeptidiä. Proteiini Ensimmäinen tunnettu merkittävänä eritysproteiinia ihmisen lisäkiveksiin [1]. NPC2 tärkeä rooli säätelyssä solunsisäisen kolesterolin homeostaasin kautta suorasta sitoutumisesta vapaa kolesteroli [2]. Puute NPC2 johtaa kertyminen vapaan kolesterolin lysosomissa [3]. Analyysi NPC2 mRNA Northern blotting on paljastanut yhden transkriptio 0,9 kb kaikissa tutkituissa kudoksissa, jolla on korkein mRNA tasot kiveksissä, munuaisten ja maksan [4]. Ihmisen kypsän NPC2 proteiini koostuu 132 aminohaposta, ja se ilmaistaan ​​eri isoformeja; nämä ovat kooltaan 19-23 kD kudosspesifisellä tavalla [5,6]. Viime aikoina olemme osoitti NPC2 toimii coordinately glysiinikomplekseja N-metyylitransferaasi säädellä maksan kolesterolia homeostaasiin ja rasvamaksa etenemisen [7]. Lisäksi NPC2 on välttämätöntä pötsinystyt muodostumista ja moduloi papillaarinen kasvua [8]. NPC2 ilmentyy myös alveolien epiteelisolujen tyypin II solujen keuhkojen [9]. Koska NPC2 säätelee negatiivisesti ERK1 /2 mitogeeni aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) fosforylaation fibroblastisoluissa [10], häiriön NPC2 ilmentyminen saattaa liittyä merkittäviä ihmisen sairauksia kuten syöpää. Kuitenkin ilmauksia NPC2 ihmisen syövissä ei ole tutkittu yksityiskohtaisesti. Siksi Tutkimuksemme tavoitteet olivat (a) kehittää paneelia monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t) kohdennetut vastaan ​​NPC2 proteiinia ja (b) kuvaamaan niiden ominaisuuksia ja mahdollisia kliinisiä sovelluksia. Käyttämällä immunohistokemiallisella värjäyksellä, vahva ekspressiotasot NPC2 havaittiin distaalisen ja proksimaalisen kiemuratiehyessä munuaisten ja hepatosyyteissä maksassa. Ilmentyminen NPC2 havaittiin olevan säädelty ihmisen rinta-, paksusuolen ja keuhkojen syöpiin, mutta toisin oli alas-säätely NPC2 ilmentymisen munuaisten ja maksan syövät. Lopuksi vielä osoittaneet, että säätely ylöspäin NPC2 korreloi tila estrogeenireseptorin (ER), progesteronireseptori (PR) ja ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptori (HER-2) ilmentymistä. Lisäksi häiriöstä sera NPC2 liittyy maksakirroosia ja hepatosellulaarista karsinoomaa (HCC).

Materiaalit ja menetelmät

Generation monoklonaalisia vasta-aineita NPC2

Voit luoda sarja mAb: iden vastaan ​​NPC2, puhdistettua GST-NPC2 tai puhdistettua His-NPC2 (kuvio 1A) rekombinanttiproteiinin (RP) sekoitettiin Freundin täydellisen adjuvantin (alkuperäisen immunisoinnin) tai epätäydellisen Freundin adjuvantin (ja tehosteinjektiot) (Sigma Co., St. Louis, Mo., USA) ja saatua seosta käytettiin immunogeeninä. His-NPC2 RP käytettiin seulontaan antigeeni vasta-aineen syntyi GST-NPC2 RP. Hiiren mAb: t valmistettiin hybridoomatekniikka [11]. Hybridoomat jaettiin kuuteen 96-kuoppalevyille ja viljeltiin valittu väliaineessa [12]. Viljelmän supernatantit seulottiin käyttäen entsyymi-immunomääritys, jossa GST-NPC2 RP ja His-NPC2 RP antigeenejä. Hybridoomasoluja, joilla on korkea optinen tiheys entsyymi-immuno- varmistettiin Western blot -määritys välittömästi. Kukin kuoppa soluja, jotka tuottivat positiivisen tuloksen oli kloonattiin 96-kuoppaisella levyllä, jossa solutiheys 0,5 solua per kuoppa. Tuloksena yksittäisen kloonien positiivisen tuloksen inokuloitiin sitten annostuksella 2 x 10

6 osaksi BALB /c-hiirestä, jotka oli esikäsitelty 0,5 ml: lla epätäydellistä adjuvent (Sigma) aiemmin. Monoklonaalinen vasta-aine puhdistettiin hiiren askeetti nestettä käyttäen proteiini G plus proteiini A Agrose (Calbiochem, San Diego, CA, USA) ja sitten konsentroitiin Vivaspin 20 (GE Healthcare). Isotyyppi Kunkin mAb määritettiin käyttäen hiiren monoklonaalinen vasta-aine Isotyping Reagenssit (Sigma).

(A) rakentaminen plasmideja GST-NPC2 ja His-NPC2. (B) Bakteerien NPC2 fuusioproteiineja ilmennettiin BL21-soluissa ja sitten indusoitiin käyttäen 1 mM IPTG: tä. SDS-PAGE: lla ja Coomassie-sinivärjäyksellä käytettiin osoittamaan molekyylipainot kaksi proteiinit olivat noin 43,3 kD GST-NPC2 ja 17 kD His-NPC2. (C) Western blot-analyysi käyttäen mAb: itä (14-8D, 5-5B, 5-4B, 4-12C, 3-6B, 2-7D, 1-5B ja 1-2g) vastaan ​​GST-NPC2 ja His-NPC2 . (D) Western blot-analyysi käyttäen mAb: itä vastaan ​​hiiren lisäkives.

Solut ja plasmidit

SK-HEP1 soluja, ostettu ATCC, viljeltiin DMEM (Gibco BRL, Grand Island , NY), jossa oli 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (HyClone, Logan, UT, USA), penisilliinillä (100 U /ml), streptomysiiniä (100 ug /ml), ei-välttämättömiä aminohappoja (0,1 mM), ja L-glutamiinia (2 mM) kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Plasmidi-DNA transfektoitiin käyttäen TurboFect ™ Reagent (Fermentas, Hanover, MD, USA). Alukkeen sekvenssit ja restriktioentsyymejä käytetään täyspitkän ja eripituisia ihmisen NPC2 geenejä on aiemmin descried Liao, et al [7]. Plasmidi koodaus shRNA varten NPC2 (TRCN0000029323) saatiin National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan).

Human näytteitä

HCC kudoksen diat (n = 50) ja seerumit (n = 165) saatiin Taiwan Maksasyöpä Network (TLCN) ja Taipei kaupungin sairaala. Kliiniset piirteet näistä potilaista on esitetty taulukossa S1 ja Taulukko S2. Terveet ohjaus ja potilailla, joilla on krooninen hepatiitti-infektio, rasvamaksa, maksakirroosi ja HCC oli otettu palvelukseen vuosien 2008 ja 2010 osastolta International Medicine, Taipei kaupungin sairaala, Ran-Ai Branch, Taipei, Taiwan ja TLCN. Yhteensä 33 invasiivisen rintasyövän aiheita tunnistettiin Kaohsiung Municipal Ta-Tung sairaala. Me käsitellään kaikkia kudosnäytteitä samoissa olosuhteissa. Eettinen komitea Institutional Review Board of National Yang-Ming University (IRB nro 1000041) ja Taipei kaupungin sairaala Institutional Review Board (IRB nro TCHIRB980509) hyväksyttiin kliiniset tutkimukset, ja kaikki potilaat antoivat tietoon perustuvan suostumuksen. Diagnoosi HCC vahvistettiin histologinen tutkimus. Rinnan (BR721), paksusuoli (CO803), keuhkoissa (LC1006), munuainen (KD991), useita syöpä (BCN721), useat sairaudet maksan (LV1201) ja maksakirroosi ja hepatiitti (LV805) kudosten paneelit hankittiin Biomax, USA . Kliiniset ja patologiset tietoa yksittäisistä syövän näytteet ovat saatavilla, ja saatiin joukko valmistajalta.

Peptide seulonta, Western blotting ja immunohistokemiallinen (IHC) värjäys

ELISA-levy on päällystetty peptidejä käytettiin kartoittaa epitoopit eri anti-NPC2 mAb: t. Nämä peptidit (kunkin pituus on 10 aminohapot) kattoi koko pituus 1-40 a.a alueella NPC2 proteiinia. Western blotting, solu tai hiiren lisäkiveksen proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla. fosfo-ERK1 /2 ja ERK1 /2; fosfo-p38 ja p38; fosfo-JNK ja JNK ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Immunoblottausmääritys signaalit normalisoitiin käyttäen α-tubuliinia tai β-aktiini ja kvantifioidaan densitometrinen skannaus. IHC havaitseminen NPC2 proteiinin suoritettiin käyttäen NPC2 monoklonaalisia Ab (3-6B) laimennoksena 1: 200 [7]. Parafinoidut kudosleikkeiden inkuboitiin primaarisen vasta-aineen ja havaittiin käyttämällä Universal LSAB

TM2 kit (DakoCytomation) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

antigeeni-capture entsyymi-immunomääritys ELISA

Lyhyesti, 100 ui polyklonaalista NPC2 vasta-aineen (5 pg /ml) 0,1 M karbonaatti-puskurissa (pH 9,6) lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaiselle mikrotiitterilevylle (Corning Costar, Acton, MA) ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Sitten, estää 5% BSA PBST (PBS, joka sisälsi 0,05% Tween) 37 ° C: ssa 2 tuntia. Kunkin potilaan seerumia (100 pl klo 1: 1 laimennosta) lisättiin 96-kuoppaisille-levyille ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Sen jälkeen, kun kolme laajaa pesua PBST: llä, monoklonaalinen NPC2 vasta-ainetta (1: 1000 laimennos) lisättiin ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan, jonka jälkeen inkuboitiin 200 ui substraattia (0,015% o-fenyleenidiamiinidihydrokloridi) (Sigma-Aldrich) vielä 30 min 37 ° C: ssa. Reaktiot pysäytettiin lisäämällä 3 N HCI: a; Absorbanssi mitattiin spektrofotometrillä 490 nm: ssä.

Glycosidase Hajotus

Kuusikymmentä mikrogrammaa maksan proteiineja seerumia inkuboitiin kanssa tai ilman N-glykosidaasi F (PNGaasi F) mukaisesti valmistajan ohjeiden (NE Biolabs, Beverly, MA). Reaktion tuotteet alistettiin western blot-analyysi.

Tilastolliset analyysit

Chi-square hyvyyttä, nonparametric Wilcoxonin Signed Ranks testi tai U-testi käytettiin arvioimaan yhdistyksen välillä NPC2 ilmaisun ja kliinisiä sairauksia.

p

arvo ≦ 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Generation ja luonnehdinta mAbien vastaan ​​NPC2

Jotta voitaisiin kehittää NPC2 mAb: t, jotka tunnistavat NPC2 ilmentymistä eri solulinjoissa ja kudoksissa, olemme alun perin kloonattiin koko NPC2 fragmentti ja ilmaisi GST-NPC2 ja His-NPC2 fuusioproteiinien bakteeri järjestelmässä (kuvio 1A). Kuten kuviossa 1B on esitetty, GST-NPC2 ja His-NPC2 rekombinanttiproteiineja, joiden koot olivat 43,3 ja 17 kD, vastaavasti, ilmestyi IPTG-indusoidun bakteerilysaateista. Puhdistettua GST-NPC2 ja His-NPC2 rekombinanttiproteiineja käytettiin antigeenien muodostumisen aikana mAbs NPC2. Yhteensä kahdeksan mAb: itä (14-8D, 5-5B, 5-4B, 4-12C, 3-6B, 2-7B, 1-5B ja 1-2g) lopulta syntyy ja todettu reagoida GST-NPC2 ja His-NPC2 rekombinanttiproteiineja (kuvio 1 C). Koska NPC2 on suuri eritysproteiinia ilmaistaan ​​epididymal nesteen [1], haimme meidän NPC2 mAbien havaitsemiseksi NPC2 ilmentymistä hiiren lisäkiveksiin käyttäen Western blotting. Kuten kuviossa 1D, NPC2 havaittiin yhteensä lisäkiveksiin uutteiden proteiinivyöhykkeet noin 16-22 kD. Isotyypin määritys tunnisti mAbien kuuluvan IgG2a-isotyyppiä ja niiden kevyttä ketjua todettiin κ ketjuja.

kartta reaktiivisen alueen tunnustettu NPC2 mAb: t, transfektoimme erilliset ilmentävien plasmidien eri pituisia NPC2 -HA (mukaan lukien täyspitkät NPC2 [1-151 aa], domain A ja B [1-80 aa], domain B ja C [40-105 aa], ja verkkotunnuksen C ja D [81-151 aa]) varten 24 tuntia. Kuten kuviossa 2A on esitetty, kaikki kahdeksan NPC2 mAb: t voivat tunnistaa täyspitkä ja N-terminaalinen puoli (1-80 aminohapot) ja pNPC2-HA. Kun taas, fragmentit, jotka sisältävät 41-105 aminohapot alue NPC2 ja C-terminaalin puolisko (81-151 aminohapot) ja NPC2 ei reagoi NPC2 mAbien. Nämä havainnot viittaavat siihen, että kaikki NPC2 mAb: t tunnistavat aminohapoista 1-40 NPC2 proteiinia. Edelleen kartta reaktiivisen tunnistamia epitooppeja NPC2 mAb: t, ELISA suoritettiin käyttäen peptidiä paneeli koostuu neljästä peptidiä, jotka kattoivat aminohapot 1-40 NPC2 proteiinia. Tuloksemme osoittavat, että vain yksi peptidi (aminohapot 31-40) on tunnustettu kuusi valitun NPC2 mAb: t (14-8D, 5-4B, 3-6B, 2-7B, 1-5B ja 1-2g) (kuvio 2B). Kuten kuviossa 2C on esitetty, herkkyys ja spesifisyys NPC2 mAb: iden (3-6B, 14-8D, 5-4B ja 2-7B) sitten todeta käyttäen SK-HEP1 transfektoitujen solujen kanssa tai ilman shNPC2. Näistä NPC2 mAb: t, valitsimme yhden NPC2 mAb (3-6B) parhaana varten jatkotutkimusta ja käyttöä kliinisissä sovelluksissa.

(A) epitoppialueeseen kartoitus monoklonaalisia NPC2 vasta-aineita. Eripituisia pNPC2-HA, mukaan lukien täyspitkät pNPC2-HA, N-terminaalinen puoli (1-80 aminohapot), C-terminaalinen puoli (81-151 aminohapot) ja 41-105 aminohapot transfektoitiin 293T-soluihin ja 24 tuntia myöhemmin kerättiin Western blot-analyysi. Kaista 1, 1-2g; Land 2, 1-5B; Kaista 3, 2-7B; Kaista 4, 3-6B; Kaista 5, mAb-HA; Kaista 6, 4-12C; Kaista 7, 5-4B, kaista 8, 5-5B; Kaista 9, 14-8D. (B) ELISA-levy päällystettiin neljä peptidiä, jotka kattoivat 1-40 aminohapot alue NPC2 proteiinia käytettiin epitooppikartoitukseen. Edustaja tulokset mAb: t (14-8D, 5-4B, 3-6B, 2-7D, 1-5B ja 1-2g) on ​​esitetty. (C) knockdown vaikutus shNPC2 on SK-HEP1 solut havaittiin käyttäen anti-NPC2 mAb: t (3-6B, 14-8D, 5-4B ja 2-7B).

Differential ilmaus NPC2 ihmisen normaaleissa ja tuumorikudoksissa

tutkiakseen kliininen käyttö NPC2 mAb, havaitsimme ilmaus NPC2 erilaisissa normaaleissa ja syöpä kudoksiin käyttämällä IHC värjäystä. Normaali ruokatorven, kohdun kohdunkaulan, haiman, mahalaukun, rinnan, paksusuolen ja keuhkojen kudoksen osoittivat kohtalaisesta heikko intensiteetti NPC2 värjäytymistä (kuviot 3A ja 3C). Kuten kuviossa 3B on esitetty, voimakas ilmentyminen NPC2 havaittiin normaalissa hepatosyyteissä maksassa. Munuaisten, NPC2 ilmaistiin sekä distaalisen ja proksimaalisen kiemuratiehyessä, mutta ei munuaiskeräsessä (kuvio 3B).

Suurennus: 200x. (A) NPC2 oli säädellään ylöspäin rinta-, paksusuolen ja keuhkojen kasvain näytteissä. (B) NPC2 oli säädellä vähentävästi munuaisten ja maksan kasvain näytteissä. (C) ilmentymistä NPC2 pysyi muuttumattomana haiman, ruokatorven, kohdun kohdunkaulan ja vatsa kudosnäytteen paria.

vertailu näiden normaalien kudosten (N) ja niiden vastaavia tuumorikudoksia (T) toteutettiin ulos ja todettiin, että NPC2 oli merkitsevästi säädellään ylöspäin rinta-, paksusuoli- ja keuhkosyövässä (kuvio 3A). Niistä 23 paria rintasyöpäsolujen ja testatuista normaaleista kudoksista, 18 (78%) kasvainkudoksessa osoittivat korkeampia NPC2 ekspressiotasoja kuin normaaleissa kudoksissa (

p

0,0001, taulukko 1). Out of 44 sovitetun ei-pienisoluinen keuhkosyöpä paria, 30 kasvain kudosnäytteet (68%) oli suurempi NPC2 ilmaus kuin normaalia vastineet (

p

= 0,02, taulukko 1). Sen sijaan NPC2 merkittävästi säädellä vähentävästi munuaissyöpä ja maksasyöpä (kuvio 3B). Niistä 33 paria munuais- kasvain ja normaaleissa kudoksissa, 31 (94%) kasvain kudosnäytteitä oli paljon alhaisempi NPC2 ilmaisu kuin vastaava normaalin kudoksen näyte (

p

0,0001, taulukko 1). Niistä 50 täsmäsi maksan kasvainkudoksen ja kasvaimen viereiseen kudokseen pareina, 36 kasvainkudoksen näytteitä (72%) oli paljon alhaisempi NPC2 ilmaisu kuin kasvaimen vieressä kudosnäyte (

p

= 0,02, taulukko 1). Kuitenkin, ei ollut eroa normaalien ja syövän kudosnäytteiden kohdunkaulan, ruokatorven, kohdunkaulan, haiman ja mahalaukun (kuvio 3C). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että poikkeava ekspressio NPC2 liittyy eri syöpien ja että muutos ilmentyminen voi olla joko ylös tai alas riippuen kudoksesta.

Syövät

T N n (%) B- T = N n (%) B T N n (%) B

p

arvo

kasvaimen tissuesBreast (n = 23) 18 (78%) 4 (17%) 1 (4%) 0.0001Colon (n = 38) 18 (47%) 14 (37%) 6 (16%) 0.0523Lung

# (n = 44) 30 (68%) 5 (11%) 9 (20%) 0.02Decrease kasvaimen tissuesKidney (n = 33) 2 (6%), 031 (94%) 0.0001Liver (n = 50) 2 (4%) 12 (24%) 36 (72%) 0,02 Taulukko 1. immunohistokemia tulokset NPC2 ilmentymisen ihmisen rinta-, paksusuoli-, keuhko-, munuais- ja maksasyöpä pariksi kudoksissa.

t, kasvain kudosten N, normaali kudosten

#, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. CSV Lataa CSV

suhde NPC2 ilmaisun ja tilan ER, PR ja HER-2

Mitä rintasyöpään, me edelleen kerätään 33 invasiivisen rintasyövän aiheita tunnistettu Kaohsiung Municipal Ta-Tung Hospital ja analysoi suhde NPC2 ilmaisun ja kliinis ominaisuudet. Niistä 33 potilasta, 18 (54,5%) kasvain kudosnäytteitä oli paljon suurempi NPC2 ilmaisu kuin vastaava normaalin kudoksen näyte (

p

= 0,002, taulukko 2). Potilaat, joilla NPC2 ylössäätöä olivat todennäköisemmin myöhemmässä patologia vaiheessa (

p

= 0,018), ER (-) (

p

= 0,007), PR (-) (

p

= 0,005), HER-2 (+) (

p

= 0,006), ER (-) plus PR (-) (

p

= 0,011) ja ER /PR (-) plus HER-2 (+) (

p

= 0,011).

Yhteensä

T N n (%) B T = N n (%)

T N n (%) B

p

arvo

Yhteensä patients3318 (55%) 13 (39%) 2 (6%) 0,002 TNM stageI95 (56%) 4 (44 %) 0 0,043 II166 (38%) 8 (50%) 2 (12%) 0,233 III87 (88%) 1 (12%) 0 0,018 ERPositive209 (45%) 9 (45%) 2 (10%) 0,090 Negative139 ( 69%) 4 (31%) 0 0,007 PRPositive188 (44%) 8 (44%) 2 (11%) 0,092 Negative1510 (67%) 5 (33%) 0 0,005 HER-2 ScorePositive (3) 2012 (60%) 7 (35%) 1 (5%) 0,006 negatiivinen (0-2) 136 (46%) 6 (46%) 1 (8%) 0,091 CombinationER (+), PR (+) 167 (44%) 7 (44 %) 2 (12%) 0,171 ER (+), PR (-) 42 (50%) 2 (50%) 0 0,180 ER (-), PR (+) 21 (50%) 1 (50%) 0 0,317 ER (-), PR (-) 118 (73%) 3 (27%) 0 0,011 ER /PR (+), HER-2 (+) 94 (44%) 4 (44%) 1 (11%) 0,076 ER /PR (+), HER-2 (-) 136 (46%) 6 (46%) 1 (8%) 0,091 ER /PR (-), HER-2 (+) 118 (73%) 3 (27 %) 0 0,011 ER /PR (-), HER-2 (-) 000 0 N /atable 2. NPC2 ilmaisun ja kliinis ominaisuudet rintasyöpäpotilaiden.

t, kasvain kudosten N, normaali kudosten ER, estrogeenireseptori; PR, progesteronireseptori; HER-2, ihmisen epidermaalisen kasvutekijän reseptoria 2; (+), Positiivinen; (-), Negatiivinen. CSV Lataa CSV

häiriöstä NPC2 ilmentymisen ihmisen kirroosi ja HCC

Koska maksa on tärkein plasma ja sapen NPC2 [13], me seuraavaksi tutkittava, onko seerumin NPC2 tasoa voidaan käyttää uutena biomarkkeri maksan sairaudet. Mittasimme määrä seerumin NPC2 tason 42 tervettä verrokkia, 20: llä HBV krooninen infektio, 2 potilailla, joilla HCV krooninen infektio, 27 potilaalla on rasvamaksa, 28 maksakirroosipotilaista ja 46 HCC käyttämällä ELISA (kuvio 4A). Tasot NPC2 ryhmissä terveillä verrokeilla, krooninen HBV-infektio, krooninen HCV-infektio, rasvamaksa, maksakirroosi ja HCC olivat 3,29 ± 1,43 ng /ml, 4,51 ± 1,88 ng /ml, 9,66 ng /ml (maksimiarvo, 15,81 ja pienin arvo, 3,504), 7,49 ± 2,30 ng /ml, 15,30 ± 2,02 ng /ml ja 7,26 ± 2,11 ng /ml, vastaavasti. Kuten kuviossa 4A on esitetty, tasot NPC2 ei ollut eroa terveisiin, krooninen hepatiitti (HBV ja HCV) ja potilailla, joilla on rasvamaksa. Tärkeää on, Kirroosipotilailla ja HCC oli merkittävästi korkeampi NPC2 kuin terveiden verrokkien. Toisaalta, IHC värjäys osoitti, että NPC2 oli merkitsevästi alassäädetty maksakirroosi kudoksissa, vaikka ei ollut eroa normaalin ja hepatiitti kudoksissa (kuviot 4B ja 4C).

(A) ELISA-analyysi seerumin NPC2 tasot 42 terveillä verrokeilla, 20 kroonista HBV-infektio, 2 kroonista HCV-infektiota, 27 potilaalla on rasvamaksa, 28 maksakirroosi ja 46 HCC potilaita. (B) IHC värjäys NPC2 proteiinin ilmentymisen normaalissa, krooninen hepatiitti ja kirroosi kudoksiin. (C) IHC-analyysi maksan NPC2 ilmentymistä 44 normaalissa, 21 krooninen hepatiitti ja 60 kirroosi kudosnäytteet (*,

p

0,05, Mann-Whitney U-testi). (D) Ihmisen seerumia (60 ug) inkuboitiin peptidin N-glykosidaasi F (PNGaasi F), ja suoritettiin Western blot-analyysi. (E) Western blot-analyysi seerumin NPC2 ilmaisun 14 terveillä verrokeilla, 7 rasvamaksa, 4 maksakirroosi ja 4 HCC potilasta. Jokainen rivi ladattiin 100 ug proteiinia.

Koska N-glykosylaatio on tärkeää oikea kohdentaminen ja toiminta NPC2 [14], seuraavan kerran käytetty PNGaasi F ruoansulatusta vahvistaa, onko seerumin NPC2 proteiini heterogeenisyys johtuu translaation jälkeisistä glykosylaatio muutos. Sen jälkeen PNGase F hoito, NPC2 tehtiin näkyväksi yhtenä immunoreaktiivisia kaistan (kuvio 4D). Edelleen tutkittiin, glykosyloituneen muodon NPC2 liittyy maksasyövän etenemisen, seeruminäytteet alistettiin western blotting-analyysi. Glykosyloitu ja muodostumassa NPC2 ilmaistiin suhteessa 1: 1 normaaleissa ihmisen seerumeista (kuvio 4E). Mielenkiintoista, vaikka emme löytäneet mitään eroa seerumin NPC2 ilmaisun terveiden ja rasvamaksa potilaita, glykosyloitu NPC2 ilme oli pääasiallinen muoto sekä maksakirroosi ja HCC potilasta (kuvio 4E). Nämä tiedot osoittivat, että määrät ja muutokset glykosyloidun rakenteessa NPC2 liittyy maksakirroosi ja HCC kehittämiseen.

Effects of NPC2 on MAPK signalointi

tunnistamiseksi NPC2 riippuvaisen mekanismin, painotimme asemasta MAPK signalointi. Kuten on esitetty kuviossa 5, jatkuva fosforylaatiota ERK1 /2 on havaittu NPC2 pudotus soluissa. Kuitenkin p38 ja JNK: n ei aktivoidu NPC2 pudotus soluissa.

Yhteensä ja fosforyloitu ERK1 /2, p38, JNK havaittiin Western-blottauksella peräisin SK-HEP1 soluja. Knockdovvn NPC2 johtaa aktivoitumiseen ERK1 /2.

Keskustelu

NPC2 proteiini sitoutuu vapaan kolesterolin ja ohjaa solunsisäisen kolesterolin homeostaasin [2]. Mutaatio NPC2 geenin johtaa kolesterolin kertymiseen myöhään endosomaaliset /lysosomaalisen osastoon solun [6]. Kuitenkin roolit NPC2 ilmentymisen ihmisen syövissä ei täysin ymmärretä huolimatta sen tunnetun rooli kolesteroli sitovia. Tässä tutkimuksessa olemme tuotetaan ja ominaista joukko NPC2 mAb: iden ja sitten arvioitiin immunoreaktiivisuutensa käyttämällä useita kasvain kudosmatriisien. Vuodesta epitoopin kartoitus data, olemme huomanneet, että NPC2 mAb: t kohdennettujen aminohappotähteiden 31-40 ihmisen NPC2-proteiinin (kuvio 2B). Koska aminohappotähteet 31-40 ovat erittäin konservoituneita eri nisäkkään ortologeille [2], nämä NPC2 mAb: t tulisi olla hyödyllisesti suorittaessaan tutkimusta roolista NPC2 monenlaisia ​​nisäkäslajeissa tulevaisuudessa. Herkkyys ja spesifisyys NPC2 mAbien arvioitiin knock-down of NPC2 proteiinin SK-HEP1 soluja (kuvio 2C).

IHC värjäys osoitti, että NPC2 ekspressio lisääntyi rinta-, paksusuolen ja keuhkojen syövät (Kuva 3A). Koska voimakas ilmentyminen NPC2 havaitaan ihmisen intraduktaalisissa rinta- papilloomavirus, paksusuolen polyypit, keuhko- papillaarinen karsinooma ja munasarjojen fimbria [8,15], NPC2 proteiini voi edistää pötsinystyt muodostumiseen. Epidemiologiset tutkimukset osoittivat, että HER-2 alatyypin [HER-2 (+), ER (-), ja PR (-)] ja kolmen negatiivinen [HER-2 (-), ER (-), ja PR (-)] oli pahin selviytyminen, huono ennuste ja korkeamman Paikallista toistumisen [16-19]. Meidän tutkimuksessa todettiin, että NPC2 yli-ilmentyminen liittyy HER-2-alatyyppiä (taulukko 2), mikä viittaa siihen, että NPC2 ylössäätöä voi olla suotuisa ennuste ennustaja rintasyöpään.

Kolesteroli homeostaasiin on tärkeää lamellikappaleisiin keuhkojen alveolaarinen tyypin II solut, jotka palvelevat tuottamaan pinta-aktiivisen aineen. NPC2 proteiini on läsnä keuhkoissa keuhkorakkuloiden tyypin II solujen ja keuhkorakkuloiden makrofagien ja säätelee pinta-aktiivisen kolesterolipitoisuutta [9,20]. Meidän Tulosten mukaan NPC2 paranee keuhkoadenokarsinooma kudoksessa (kuvio 3A). Proteomiikka analyysi on myös osoittanut, että ilmaus NPC2 lisääntyy keuhkojen adenooma ja pleuraalieffuusio [21,22]. Vaikka se ei ole vielä selvää, jos NPC2 on rooli keuhkojen adenokarsinooma, läsnäolo NPC2 proteiinin pleuraeffuusio sairastavien potilaiden keuhkojen adenokarsinooma viittaa siihen, että sillä voi olla käyttöä mahdollisena diagnostinen markkeri keuhkosyöpä.

Vähentynyt ilmentyminen NPC2 nimenomaisesti havaittiin munuaisten ja maksan kasvain kudoksissa verrattuna niiden normaaleihin kollegansa. Koska NPC2 pudotus fibroblasti-solujen on osoitettu kestävää fosforylaation ERK1 /2 MAPK [10], NPC2 voi säädellä negatiivisesti ERK1 /2 MAPK-aktivaation. Itse asiassa, aktivointi ERK1 /2 havaittiin NPC2 pudotus SK-HEP1 soluja (kuvio 5). Mitä tulee vaikutus NPC2 korvaushoito NPC2 – /- hiirissä, havaittiin, että maksan makrofagien tunkeutumista ja määrä rasvaa kuormattuna solut merkittävästi parantunut [23]. Koska lipidien kertymistä ja myöhemmin tulehdus nopeuttaa etenemistä maksakirroosi ja maksasyöpä [24,25], NPC2 antaminen voi parantaa maksan syövän kehitystä. Koska maksa on tärkein plasma ja sapen NPC2 [13], lisäys sera NPC2 maksakirroosi ja HCC potilaat saattavat liittyviä vakavia vaurioita hepatosyyttien. Esillä olevassa tutkimuksessa havaittiin myös muutoksia glykoituneen NPC2 ekspressiokuvioita seerumeista sekä maksakirroosi ja HCC potilailla, viittaa siihen, että tällaiset muutokset voivat olla osoitus maksakirroosi ja syöpä. N-glykosylaatio on tärkeä kohdistamista ja oikea toiminta NPC2 [14]. Lisäksi tutkimus on tarpeen selkeyttää rooleja glykosyloidun NPC2 käyttää enemmän maksakirroosi ja HCC tapauksissa.

munuaiset, NPC2 on runsaasti ilmaista distaalisessa ja proksimaalisessa kiemuratiehyessä (kuvio 3B). Koska NPC2 on säädelty munuaisen kudoksissa Dahl suola arkojen rotalle annetaan korkean suolaa ruokavalio [26], on ehdotettu, että NPC2 voisi säädellä natriumin takaisinimeytymistä nephron. Kuitenkin toiminnallinen merkitystä NPC2 munuaissolukarsinoomassa edelleen epäselvä ja lisätutkimukset tarpeen valaista roolia NPC2 munuaisissa, sekä fysiologisesti ja patologisesti.

Tulokset osoittivat, että NPC2 monoklonaalinen vasta-aine on mahdollisesti hyödyllisiä sovelluksia aloilla kliininen diagnoosi ja syövän etenemistä useiden kudoksia.

tukeminen Information

Taulukko S1.

#, HBV tai HCV osoittavat tapaukset olivat saaneet HBV ja HCV-virus, vastaavasti.

kuin B non-C osoittavat potilaita ei tarttunut HBV ja HCV-virus. *, Luokittelu patologian vaiheista olivat mukaan AJCC UICC ja CUPI.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0077586.s001

(DOC) B Taulukko S2.

#, HBV tai HCV osoittavat tapaukset olivat saaneet HBV ja HCV-virus, vastaavasti.

doi: 10,1371 /journal.pone.0077586.s002

(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme TLCN tarjoamiseksi HCC kudosnäytteitä ja siihen liittyvät kliiniset tiedot. Tämä verkko kuuluu tällä hetkellä viisi suurta terveyskeskukset (National Taiwan University Hospital, Chang-Gung Memorial Hospital-Linko, Veteran General Hospital-Taichung, Chang-Gung Memorial Hospital, Kaohsiung ja Veteran General Hospital, Kaohsiung).