Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

EMX2 on ihmisen ortologin

Drosophila

tyhjä spiracles homeobox geeni, joka on liitetty alkionkehityksen. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat mahdolliseen osallistumiseen EMX2 ihmisen syövissä; kuitenkin, rooli EMX2 karsinogeneesis- on vielä etsintä.

Tulokset

Tässä tutkimuksessa raportoimme että alas-säätely EMX2 ilmaisun korreloi merkitsevästi EMX2 promoottori hypermetylaation mahasyövän. Palauttaminen EMX2 ilmaisua käyttäen adenoviruksen jakelujärjestelmä mahasyövän solulinjoissa puuttuu endogeeninen EMX2 ilmentyminen johti soluproliferaation inhibointi ja Wnt-signalointireitin sekä in vitro että in mahalaukun syövän ksenograftimallissa in vivo. Lisäksi havaitsimme, että eläimillä, joita hoidettiin adenovirus- EMX2 ekspressiovektori oli merkittävästi parempi selviytyminen kuin niillä, joita hoidettiin tyhjä adenovirusvektori.

Johtopäätös

Tutkimuksemme osoittaa, että EMX2 on otaksuttu tuumorisuppressori ihmisen mahasyöpä. Adenoviruksen-EMX2 voi olla potentiaalia uutena geeniterapian hoitoon potilailla, joilla on mahalaukun syöpä.

Citation: Li J, Mo M, Chen Z, Chen Z, Sheng Q, Mu H, et al. (2012) Adenoviraaliset Toimitus EMX2 Gene vaimentaa kasvu ihmisen syöpään. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10,1371 /journal.pone.0045970

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 13 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 23 elokuu 2012; Julkaistu: 21 syyskuu 2012

Copyright: © Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varat kansallisesta Key Basic tutkimus ja kehitys (973) Ohjelma Kiinan (2011CB910800 ja 2012CB917304), National Natural Science Foundation of China (31170732), Natural Science Foundation of Zhejiang (Y2101329) ja tutkijatohtori Science Foundation of Zhejiang Province (2010-BSH-031). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvistä kuolemantapauksista maailmassa [1], [2], [3]. Vaikka sen maailmanlaajuinen esiintyvyys on vähentynyt, esiintyvyys on edelleen suuri Aasian maissa [2], [4], [5]. Suurin osa mahasyöpä potilaita diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa [6]. Huolimatta paraneminen hoitostrategioiden [7], [8], 5-vuoden pysyvyys joilla on pitkälle edennyt mahasyöpä, jotka saivat hoitomuotojen jää alle 30% [4]. Sen vuoksi vaihtoehtoisia lähestymistapoja tarvitaan kiireellisesti.

Geeniterapia, mukaan lukien virus- ja ei-virus-geenin jakelujärjestelmä, on lupaava lähestymistapa syövän hoitoon [9]. Kaikista tällä hetkellä käytettävissä järjestelmä, rekombinantti adenovirus (Ad) vektorit ovat erityisen lupaavia. Edut Ad-vektorit ovat kyky tuottaa suuria tiittereitä, tarttuvuutta jakamalla ja ei-jakautuvia soluja tehokkaasti, genomin vakautta, ja alhainen DNA integroitumisen isännän genomiin [9], [10]. On raportoitu, että palauttaminen geenien Tällä lähestymistavalla johtaa kasvaimen taantumiseen ja indusoi apoptoosia

in vivo

vaikuttamatta normaaleissa kudoksissa [11], [12], [13].

EMX2, ihmisen ortologi

Drosophila

tyhjä spiracles (eMS) homeobox geeni, kuuluu homeobox geeniperheen, joka koodaa transkription säätelyproteiineihin (Homeoprotein) välttämättömiä monia näkökohtia kasvua ja erilaistumista [14]. EMX2 on tärkeä rooli aikana aivot [15] ja luuston kehitykseen [16]. Hiiret kätkeminen homotsygoottinen EMX2 mutaatioita omaavat dramaattinen pienentäminen pyrstöevän-mediaalinen aloilla, kuten takaraivo cortex ja hippokampuksessa [17], [18], [19]. Häiriön EMX2 ilmaisun voi muuttaa leviämisen nopeus aikuisten hermo kantasolujen [20]. EMX2 ohjaa myös nisäkkäiden lisääntymiseen säätämällä kohdun limakalvon solujen lisääntymisen vaikuttamatta erilaistumista [21].

Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat mahdolliseen osallistumiseen EMX2 ihmisen syövissä [22], [23], [24], [25]. Esimerkiksi EMX2 on osoitettu tuumorisuppressorina keuhkosyövän, ja alhainen EMX2 ilmentyminen liittyy vähentynyt eloonjäämiseen ja uusiutumisen elinaika potilailla, joilla on keuhkojen adenokarsinooman [22], [23]. On myös raportoitu, että EMX2 ilmentyminen on runsaasti normaalissa kohdun limakalvon postmenopausaalisilla naisilla, mutta poissa tai pienentää kohdun limakalvon kasvaimia, ja EMX2 tasot korreloivat negatiivisesti leviämisen [24], [25]. Lisäksi EMX2 voi säädellä kasvainten synnyssä kautta Wnt-signalointireitin, kriittinen polku säädellään solun kohtalon määrittämiseen, kudosten kehitystä ja kasvaimen kehittymisen [26], [27], [28]. EMX2 löytyy suorana repressorina Wnt1 ilmaisun, ja nakutuksen-alas EMX2 geenin indusoi ektooppinen ilmentymisen Wnt1 kehittyvässä isoaivot ja aivokuoren dysplasian [29]. Epigeneettiset hiljentäminen EMX2 ilmentyminen voi olla tärkeä poikkeava aktivaatio Wnt signaloinnin keuhkosyöpää, ja siitä lisääntymistä ja etäpesäkkeiden [22]. Kuitenkin toiminta EMX2 aikana kasvaimen kehittymisen ja vastaavan mekanismi on vielä tarkemmin selvitetty. Tässä tutkimuksessa me raportoimme EMX2 putatiivisena tuumorisuppressori ihmisen syöpään. Me osoittaa EMX2 downregulation ja sen korrelaatio metylaatiostatuksen geenin promoottorialueen mahasyövän. Samalla osoitetaan, että palauttaminen EMX2 käyttäen adenoviruksen jakelujärjestelmä estää soluproliferaatiota ja Wnt signalointia

in vitro

, ja johtaa parempaan selviytymiseen mahasyövän ksenograftimallia

in vivo

. Tuloksemme viittaavat vahvasti siihen terapeuttista potentiaalia käyttämällä Ad-EMX2 kuten geeniterapian tulevien potilaiden hoitoon mahasyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyi eettinen komitea Xuanwu sairaala, Capital Medical University Pekingissä. Kirjallinen suostumus hyväksymä eettinen komitea, saatiin kunkin potilaan ennen kudokseen näytteenotosta.

Cell Culture, 5-atsa-2′-deoksisytidiini (DAC) /trikostatiini A (TSA) hoito, ja Tissue Näytteet

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat (AZ521, AGS ja MKN28) saatiin Kiinasta Center for Type Culture Collection (Wuhan, Kiina). Solulinjoja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä ja streptomysiiniä 37 ° C: ssa kosteassa inkubaattorissa 5% CO

2. Analysoida palauttaminen EMX2 geenin, solut käsiteltiin 4 uM DAC tai 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, USA) 4 päivää, ja korvaaminen tuoreella alustalla, joka sisältää saman annoksen DAC tai TSA jokapäiväistä. Ohjaus soluja viljeltiin tuoreella alustalla, joka sisälsi DMSO: ta. Solut ollen korjattu DNA /RNA.

Yhteensä 20 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset lohkot (10 mahasyövän kudosten ja 10 viereisten normaaleissa kudoksissa) sekä kokonais-RNA: 15 mahalaukun dysplasia näytettä ja 20 mahasyövän kirurginen näytettä otettiin Xuanwu Hospital, Capital Medical University Pekingissä. Kokonais-RNA: n ja genomisen DNA: ta aikuisen ihmisen normaaleissa mahan kudoksissa hankittiin BioChain (Hayward, CA, USA).

DNA-konstruktit

Topflash /Fopflash toimittajille, jotka sisältävät villin tyypin ja mutantti-TCF /LEF sitoutumiskohtia vastaavasti ystävällisesti Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Peking, Kiina). Mutantti CTNNB1 (S45Y) cDNA-rakenne myös ystävällisesti Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Peking, Kiina). Rekombinanttiadenovirusvektoreita ilmentävät EMX2 ja ohjaus vektori hankittiin Vector Biolabs (Vector Biolabs, Burlingame, CA, USA).

Metylaatiospesifinen PCR (MSP) ja bisulfiittimodifiointi Sequencing (BS) B

bisulfiitti muuntaminen kudosten ja solujen tehtiin ilman edellytys DNA: n puhdistus käyttämällä EZ DNA metylointi-Direct Kit (Zymo, Orange, CA, USA). FFPE kudokset olivat ensin de-paraffinized ksyleenissä (Sigma) ja niihin lisätään arvostellaan etanolia, ennen vetysulfiittikäsittelyä kohden valmistajan ohjeiden. MSP, muunnettu DNA monistetaan käyttäen MSP-alukkeita (lueteltu alla), jotka on erityisesti tunnustettu joko metyloituja tai metyloitumattoman EMX2 promoottorisekvenssejä bisulfiittikäsittelyn jälkeen. PCR ajettiin lopullisessa tilavuudessa 20 ui, joka sisälsi 1 x MSP-reaktiopuskuria [30], 0,5 uM kutakin aluketta ja 1 U Zymo

Taq

™ DNA-polymeraasia (Zymo). PCR ehto oli seuraava: 10 min 95 ° C: ssa; 40 sykliä 30 s 95 ° C: ssa, 30 s 50 ° C: ssa ja 30 72 ° C: ssa; ja 7 min loppupidennys 72 ° C: ssa. BS monistaminen bisulfiitti-muunnetun DNA suoritettiin lopputilavuudessa 50 ui, joka sisälsi 1 uM kutakin BS aluketta ja 2 U Zymo

Taq

™ DNA-polymeraasia. PCR ehto oli seuraava: 10 min 95 ° C: ssa; 40 sykliä 30 s 95 ° C: ssa, 40 s 55 ° C: ssa ja 1 min 72 ° C: ssa; ja 7 min loppupidennys 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet kloonattiin PMD-18T (Takara, Dalian, Kiina). Joko 5 tai 3 satunnaisesti valittu positiivista kloonia kummastakin ryhmästä sekvensoitiin Shanghai Invitrogen (Shanghai, Kiina). Alukkeet olivat seuraavat:

MSP-M (eteenpäin): 5’TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3 ’

MSP-M (taakse): 5′- GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3′

MSP-U (eteenpäin): 5′-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 ’

MSP-U (käänteinen): 5′-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3′

BS-A (eteenpäin): 5 ’ -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 ’

BS-A (käänteinen): 5′-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3′

BS-B (eteenpäin): 5′-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 ’

BS-B (käänteinen): 5′-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 ’

immunohistokemia (IHC) B

IHC suoritettiin seuraavan standardin protokollaa. Vasta-aineita käytetään tutkimuksessa mukana hiiren anti-humaani-Ki67 (1:100, BD, San Jose, CA, USA) ja hiiren anti-humaani EMX2 (1:500; Pierce, Rockford, IL, USA), ja Alexa 594-konjugoidun vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (1:200; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Objektilasit myös vastavärjättiin hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss LSM 710 -konfokaalimikroskoopilla (Oberkochen, Saksa) käytettiin tutkimaan värjäystä. Intensiteetti Ki67 kvantitoitiin käyttäen Image Pro® Plus. EMX2 värjäys visualisoitiin Histostain Plus DAB kit (laajakirjoinen, Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden, vastavärjättiin hematoksyliinillä (Sigma), ja valokuvattiin käyttäen Leica SCN400 dia skanneri (Leica, Saksa).

Luciferase Assay

Solut tiheydellä 5 x 10

3 kuoppaa kohti ympättiin 24-kuoppaisille levyille ennen transfektiota. Topflash tai Fopflash plasmidit kotransfektoitiin PRL-TK-plasmidin. Sen jälkeen soluja viljeltiin 18 tunnin ajan, lusiferaasiaktiivisuus mitattiin Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, USA). Suhde tulikärpäsen lusiferaasi aktiivisuuden (Topflash /Fopflash) ja renilla aktiivisuus käytettiin TCF /LEF transkription aktiivisuutta.

Immunoblottausmääritys

Sekä koko proteiinia (20 ug) ja sytoplasmassa uutteita (40 ug) suoritettiin immunoblottauksella. Primaaristen vasta-aineiden mukana anti-EMX2 (1:500, Pierce), anti-β-Actin (1:5000; Sigma), anti-sykliini D1 (1:500, BD) ja anti-c-Myc (1:200; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).

proliferaatiotestillä

Solun kasvua määritettiin CellTiter 96 Aqueous proliferaatiotestillä Kit (Promega). Solulinjat maljattiin 96-kuoppaisille viljelylevyille, jossa määrä on 5 x 10

2 solua /kuoppa. Sen jälkeen, kun soluja viljeltiin päivinä 0, 2, 3 ja 4, MTS liuokset lisättiin väliaineeseen ja inkuboitiin 1,5 tuntia. Absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin mikrolevynlukijaa käyttäen mallin 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Colony muodostumisen määritys

Solut (1 x 10

3) tartunnan jossa adenovirusvektori ilmentävien EMX2 tai tyhjän vektorin ympättiin kolmena osaksi 100 mm ruokia. Tuore väliaine vaihdettiin joka 3. päivä. Jälkeen viljeltiin 3-4 viikkoa, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 min ajan, pestiin PBS: llä, värjättiin 0,1% kristallivioletilla 20 minuutin ajan ja valokuvattiin.

RNA uuttaminen ja määrälliset Reaaliaikainen Käänteinen transkriptio -PCR (RT-PCR) B

RNA ja reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [31]. Alukesekvenssejä kuvattu aikaisemmin [22].

eläinmallissa ja adenovirusvektori Delivery

Kaikki hiiret kokeet tehtiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa eläinten laitos Tsinghuan yliopiston ja hyväksynyt Institutional animal Care ja käyttö komitean Tsinghua University. Mahasyöpä -ksenografteja vakiintumassa 5 viikkoa vanhoja BALB /c-nude-hiirissä. Lyhyesti, sen jälkeen, kun niitä viljeltiin konfluenssiin, MKN28 tai AGS solut trypisnized ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään (pH 7,4) ja sekoitetaan sitten 01:01 (v /v) Matrigel (Voimakkaita) 4 ° C: ssa pistää yksi hiiri kokonaistilavuudessa 150 ui. Seos s.c. ruiskutettiin oikeaan kylkeen 16 naarashiirillä 10

7 solua hiirtä kohti (päivä 0). Päivänä 7, hiirillä, joilla on paikalliset kasvaimet vaihteli 50-100 mm

2 sai suoraan sisäisen kasvaimen injektion 1 x 10

9 plakkia muodostavaa yksikköä ilmoitettu adenovirus (laimennettu PBS kokonaistilavuudessa 100 ui). Kasvain muodostumista seurattiin jopa 1½ kuukautta. Kasvaimen koko mitattiin käyttämällä jarrusatula ja määritetään kertomalla 0,5 × leveys

2 x pituus. Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin arvioitaessa selviytymisen kaksi ryhmää hoidettujen eläinten. Tällä loppuun kokeessa kasvaimet kustakin käsittelystä kerättiin 10% puskuroituun formaliiniin, valettiin parafiiniin ja leikattiin 5 um: n paksuisiksi viipaleiksi edelleen Ki-67 havaitsemiseen. Soluliman proteiineja ja kokosolulysaatissa myös erotettu niiden kasvainten Western analyysiä.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot laskettiin keskiarvoina ± standardipoikkeamat. Erot ryhmien välillä verrattiin kaksipuolinen Studentin t-testiä.

P

arvon 0,05 tai vähemmän pidettiin merkittävänä.

Tulokset

alassäätely EMX2 Human mahasyövän

Tutkimme EMX2 ilmaisun yhdeksän ihmisen mahasyöpä solulinjoissa, sekä kasvaimen ja yhdistetty viereisten normaaleissa kudoksissa kymmenen mahasyöpäpotilaista (kuvio 1). Käyttämällä reaaliaikainen RT-PCR, huomasimme, että ilmentyminen EMX2 merkittävästi vaimentua kahdeksassa yhdeksästä solulinjoista tutkitaan verrattuna, että normaalissa mahalaukun kudoksesta (P 0,01, kuvio 1A). Toisaalta, yksi solulinja AZ521 osoitti samantasoista EMX2 ilmaisun, jota normaalissa ohjaus (kuvio 1A). Jotta voidaan havaita EMX2 proteiinin ilmentyminen potilaan kudosnäytteistä, immunohistokemia (IHC) suoritettiin ja intensiteetti IHC värjäytyminen kvantitoitiin kuva Pro® Plus. Kaikki kymmenen näytettä analysoitiin havaittiin osoittavan joko puute EMX2 ilmentymisen tai alentuneet EMX2 ilmentymisen syöpäkudoksiin verrattuna niiden normaaleihin kollegansa (P 0,01, kuvio 1 B). N mahdollisen roolin EMX2 vuonna patologinen etenemisessä ihmisen mahasyöpä, analysoimme EMX2 ilmaisua käyttäen kokonais-RNA että saimme viidestätoista mahalaukun dysplasia näytteitä ja kaksikymmentä mahasyövässä kirurginen näytteitä. Huomasimme, että EMX2 ilmentyminen merkitsevästi vaimentua vuonna dysplasia näytteistä (P 0,05) ja melkein hävisi syöpänäytteissä verrattuna aikuisilla normaalissa mahaan kudosta (kuvio 1 C), mikä viittaa siihen, että EMX2 downregulation saattaa esiintyä ei-invasiivisia precancerous vaiheessa.

(A) Reaaliaikainen RT-PCR EMX2 ilmentymisen normaalissa mahassa kudosnäytteessä ja mahalaukun syövän solulinjat. (B) IHC värjäys EMX2 proteiinin mahasyövän kudosten ja niiden viereisten normaaleissa kudoksissa samasta potilaista. (100X, asteikko bar = 500 pm; 400X, asteikko bar = 100 um). (C) Reaaliaikainen RT-PCR-tulos 15 mahalaukun dysplasia ja 20 mahasyövän kirurgiset näytteet. Aikuisen normaalin vatsan kudosta näytettä käytettiin kontrollina. 25. ja 75. prosenttipisteet ovat edustettuina laatikko marginaalit, 10. ja 90. prosenttipisteet ovat edustettuina virhepalkeilla, ja mediaani on edustettuna viiva laatikossa.

Korjaus välillä EMX2 Expression ja sen Promoottori metylaatiostatuksen

Tutkimme metylaatio tilan EMX2 promoottorin yhdeksässä mahasyövässä solulinjoissa ja normaali mahalaukun kudosta. Alueet CpG-saarekkeiden (CGI) tunnistettiin MethPrimer -800–470 ja -55-459 suhteessa odotettavissa transkription aloituspaikkoja (+1) ja EMX2 geenin (kuvio 2A). Metylaatiostatuksen analysoitiin käyttämällä bisulfiittia sekvensointi (BS) (kuvio 2B) ja metylaatiospesifinen PCR (MSP) (kuviot 2C-2D). Meidän BS ja MSP tulokset osoittivat, että EMX2 promoottori normaalissa mahalaukun kudosten ja AZ521 soluja oli metyloitumaton, kun taas muut kahdeksan solulinjoissa tutkittiin sen tiheään metyloitu (kuviot 2B-2C). Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​EMX2 ekspressiotasot näissä solulinjoissa: korkea normaalissa kudoksessa ja AZ521, mutta alhainen kahdeksan muun solulinjat tutkittiin. Seosta, jossa oli metyloituneiden ja metyloitumattomien bändi havaittiin useissa solulinjoissa, mukaan lukien MKN28, N87, ja SNU16 osoittaa osittainen metylaatio. Lisäksi olemme havainneet, että metylaatio potilaan tilan kudosnäytteiden paljasti MSP on sopusoinnussa EMX2 ekspressiotasot näissä näytteissä (kuvio 2D, neljä kymmenen paria kudosnäytteiden tutkittiin, koska ei ole saatavilla genomista DNA: ta muista kuusi paria ). Nämä tiedot viittaavat siihen, että downregulation EMX2 ekspressio voi olla seurausta sen promoottorin hyper-metylaatio mahasyövässä.

(A) Kaavamainen esitys 5 ’promoottorialueen EMX2 geenin. TSS ilmaisee transkription aloituspaikan. MSP on MSP amplikonin, ja BS-A /BS-B ovat amplikoneihin varten bisulfiitti sekvensointia. (B) bisulfiittimodifiointi sekvensoinnin tulokset normaalin vatsan kudosnäytteessä ja mahasyövän solulinjoissa. Avoin ja täytetyt neliöt edustavat metyloitumattomalla ja metyloitu sivustot vastaavasti. (C) MSP tulokset EMX2 promoottorialueen normaalissa mahassa kudosnäytteessä ja mahasyövän solulinjoissa. (D) MSP tulokset EMX2 promoottorialueen mahasyövän kudoksiin ja niiden yhteensovitettujen viereisten normaaleissa kudoksissa.

Jotta voitaisiin edelleen tutkia korrelaatio EMX2 ilmaisun ja promoottorin metylaation, käsittelimme MKN28 ja AGS solulinjoja joiden metyylitransferaasi estäjän DAC ja histonideasetylaasi- estäjä TSA. Solulinja AZ521 käytettiin negatiivisena kontrollina, koska sen promoottorialueen on metyloimaton. Havaitsimme, että unmethylation tietyllä taajuusalueella lisääntyi merkittävästi (kuvio 3A), jossa EMX2 ekspressiotasot ylössäädellään vastaavasti (kuvio 3B) yhteydessä DAC kohtelu sekä AGS ja MKN28 soluja, kun taas ne, AZ521 soluissa pysyi ennallaan (kuvio 3). Hoitoon TSA oli minimaaliset vaikutukset sekä metylaatiostatuksen ja EMX2 ekspressiotasot. Yhdessä tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, alas-säätely EMX2 ilmentyminen korreloi merkitsevästi EMX2 promoottori hypermetylaation ihmisen mahasyövän.

MSP (A) ja Reaaliaikainen RT-PCR (B) analysoi Mahan syöpäsolulinjoissa hoidon jälkeen DMSO: ta, 1 uM DAC, 300 nM TSA, ja yhdistelmä DAC (1 uM) ja TSA (300 nM), vastaavasti (*:

P 0,05

, ***:

P 0,001

).

Inhibition of Cell Growth by Adenovirus-toimitetaan EMX2 in vitro

tarkastellaan seuraavaksi rooli EMX2 solun kasvuun mahalaukun syöpäsolujen . Kasvu AGS ja MKN28 solujen merkittävästi tukahdutetaan kun infektio adenovirus ilmentävien EMX2 (Ad-EMX2) verrattuna tyhjällä vektorisäädön (Ad-ctrl) (P 0,001, kuvio 4A), kun taas kasvu AZ521 solujen ei vaikuttanut (P 0,05, kuvio 4A). Nämä havainnot vahvistettiin myös pesäkemuodostusta (kuvio 4B). Tuloksemme osoittavat anti-leviämisen toiminto EMX2 mahalaukun syöpäsoluja.

(A) MTS-määritys. (B) kvantifiointi pesäkemuodostusta (**:

P 0,01

, ***:

P 0,001

). ad-ctrl ja ad-E2 ilmaisevat tyhjän adenovirusvektori ohjaus ja adenovirusvektori, joka sisältää EMX2 cDNA, vastaavasti.

TCF /LEF reportteriaktiivisuutta analyysi (A), ja Western blotti EMX2, sytosolin β kateniinin ja kanoninen Wnt-reitin kohdegeenien (B) mahasyövän solulinjoissa infektoitu ad-ctrl tai ad-E2. (C) vaikutus leviämisen tukahduttaminen aiheuttama ad-EMX2 jälkeen stabiloitua β-kateniinin transfektiota. 0,5 ug mutantti CTNNB1 (S45Y) cDNA tai tyhjän vektorin kontrolli käytettiin kussakin transfektion. Proliferaatiota arvioitiin päivänä 5 transfektion jälkeen ja infektio. Western oli vahvistaa ilmentymisen mutantti β-kateniinin (*:

P 0,05

, **:

P 0,01,

***:

P 0,001

).

Suppression Wnt-signalointireitin adenoviruksen toimitettujen EMX2

funktio EMX2 on yhdistetty Wnt-signalointireitin; Siksi tutkimme suhdetta EMX2 ja Wnt signalointia mahasyövässä. Käytimme Topflash /Fopflash reportterianalyysi mitata TCF /LEF-riippuvaisen transkription aktiivisuutta säätelevät kanonisen Wnt-reitin. Olemme havainneet, että TCF /LEF-riippuvaisen transkription aktiivisuus inhiboitui merkittävästi Ad-EMX2 in AGS ja MKN28 soluja, joista puuttuu endogeeninen EMX2 ilmentymisen (P 0,05), mutta ei AZ521 soluissa, jotka ilmentävät endogeenistä EMX2 (P 0,05, kuvio 5A). Johdonmukaisesti, proteiini tasot sytosolin β-kateniinin ja kanonisen Wnt-reitin loppupäässä tavoitteet c-myc ja sykliini D1 tukahdutettiin näissä AGS ja MKN28 solut infektoitiin Ad-EMX2, mutta ei AZ521 soluissa (palauttaminen EMX2 ilmentymisen näissä solulinjoissa jälkeen Ad-EMX2 infektio vahvistettiin Western) (kuvio 5B). Tutkimaan edelleen merkitystä, Wnt-reitin alassäätöä ja leviämisen tukahduttaminen Ad-EMX2, me transfektoitu ja ilmaisi vakiintunut β-kateniinin (S45Y mutaatio) näissä mahasyövän solut infektoitu Ad-EMX2. Havaitsimme, että yli-ilmentävät β-kateniinin vaimensi merkittävästi kasvua vaimentava vaikutus Ad-EMX2 sekä AGS ja MKN28 solujen (P 0,01), mutta ei AZ521 soluissa (kuvio 5C). Yhdessä nämä tulokset tukevat tärkeä rooli EMX2 tukahduttamiseen Wnt väylän mahasyövässä.

(A) Kasvaimen tilavuus ja tuumorin paino mahasyövän ksenograftimalleja (MKN28 ja AGS) käsiteltiin ad-ctrl tai ad-E2. (B) Kuvia Ki-67 värjäys MKN28 kasvaimia hoidettiin ad-ctrl tai ad-E2 (ylempi paneeli) ja kvantifiointi värjäys (alempi paneeli). (C) Kaplan-Meier-estimaatteja kumulatiivinen selviytyminen käsiteltyjen hiirien ad-ctrl tai ad-E2 (**:

P 0,01

). (D) Western blot of EMX2, sytosolin β-kateniinin ja kanonisen Wnt polku kohdegeenien MKN28 ja AGS kasvaimia käsiteltiin ad-ctrl tai ad-E2.

Suppression mahasyövän Kasvua Adenovirus- toimitetaan EMX2 in vivo

Olemme perustettu MKN28 ja AGS ksenograftimalleja tutkia terapeuttista potentiaalia adenoviruksen toimitettujen EMX2 mahasyövän

in vivo

. Yksi viikko ymppäyksen jälkeen, hiirillä, joilla on paikalliset kasvaimet vaihtelevat 50-100 mm

2 sai suoraan kasvaimeen injektiolla 1 x 10

9 plakkia muodostavaa yksikköä ilmoitettu adenoviruksen. Kasvainten kasvua Ad-EMX2 tartunnan hiiret olivat huomattavasti hitaampaa kuin kontrolliryhmässä (P 0,05, kuvio 6A vasen kaksi paneelia). Vuoden loppuun kokeilun tuumorimassaa Ad-EMX2 tartunnan hiirillä myös huomattavasti pienempi kuin kontrolliryhmässä (P 0,05 MKN28 kasvain, P 0,01 AGS kasvain, kuva 6A oikea paneeli). Värjäys voimakkuus proliferatiivisen markkerin Ki67 kasvaimen yksilöitä loppuun koe osoitti, että toimitus Ad-EMX2 vähentynyt merkittävästi Ki-67-värjäys (P 0,01, kuvio 6B), mikä viittaa siihen, solujen lisääntymisen inhibition kasvaimissa. Lisäksi selviytyminen Ad-EMX2 tartunnan ryhmässä oli merkitsevästi parempi kuin kontrolliryhmän (P = 0,014, kuvio 6C). Vastaa meidän

in vitro

analyysi, soluliman β-kateniinin ja kanonisen Wnt-reitin loppupäässä tavoitteet c-myc ja sykliini D1 myös vaimentua Ad-EMX2 tartunnan MKN28 ja AGS kasvaimet (palauttaminen EMX2 ilmentymisen näissä in vivo kasvaimet vahvistivat myös Länsi) (kuvio 6D). Yhdessä tuloksemme osoittavat terapeuttista potentiaalia adenoviruksen toimitettujen EMX2 hoitoon mahasyöpä.

Keskustelu

Homeobox geenit on tunnettu sen merkitys kehittämiseen vuosikymmeniä, kun taas tutkimus näiden geenien synnyn aikana on vielä lapsenkengissä. Poikkeava homeobox geeniekspressioiden on dokumentoitu erilaisten syöpien [32], [33], joka osoittaa muutokset hemeobox ilmauksia voi olla tärkeää syövän synnyn. Tämä voi tarjota molekulaarisen perustan mahdollisten kliinisten sovellusten. Kuitenkin useat peruskysymyksiä on vielä täysin osoitettu, kuten molekyylitason mekanismeja, jotka ohjaavat poikkeava ilmaisu, ja loppupään tavoitteita ja signalointireitteihin jotka edistävät syövän synnyn. Tässä tutkimuksessa, tarjoamme oivalluksia näitä kysymyksiä tutkimalla EMX2 ihmisen mahasyövän.

tutkimuksessa raportoitiin merkittävää laskua ja menetys EMX2 ilmaisun mahasyövän solulinjoissa ja primaarikasvaimen kudoksia, ja osoitti, että downregulation korreloi merkitsevästi hyper-metylaatio EMX2 promoottorin, mikä viittaa epigeneettiset hiljentäminen tärkeänä mekanismi EMX2 säätelyhäiriötä ihmisen mahasyövän. Todellakin, epigeneettiset muutos on ehdotettu avainmekanismina vastaa homeobox geenien downregulation tai hiljentäminen muissa syöpään kudostyypeissä missä nämä geenit toimivat tuumorisuppressiogeeneksi [14], [32]. Lisäksi meidän havainnointi EMX2 dowregulation ei-invasiivisia mahalaukun dysplasia tukee mahdollisesta tärkeästä roolista EMX2 vuonna patologinen etenemisessä ihmisen mahasyöpä. Yksi rajoitus Tutkimuksemme on määrä kudosnäytteitä analysoitu. Suurempi määrä potilaan näytteitä on tutkittava edelleen vahvistaa toteamisen metylaatiospe- vaiennettu EMX2 mahasyövän. Kuitenkin meidän tulokset antavat ensimmäistä suoraa näyttöä tukemaan tätä mekanismia mahasyövän ja tunnistaa EMX2 otaksutuksi uusi tuumorisuppressori mahasyövässä.

Lisäksi tutkimme tärkeää kasvaimia synnyttävän polkuja joka EMX2 toiminut mahasyövän , ja totesi, että Wnt-signalointireitin voi olla keskeinen rooli välittäjänä EMX2 toiminto. Me havainnollistettu lisääntymismäärityksissä että korkea ilmentyminen eksogeenisen EMX2 merkittävästi kasvun estyminen mahasyövän solulinjojen puuttuu endogeeninen geenien ilmentymistä (AGS ja MKN28 solut), yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien mukaan ero EMX2 ilmentyminen korreloi negatiivisesti leviämisen muihin syöpäsolutyyppien [ ,,,0],24], [25]. Olemme myös osoittaneet, että Wnt-signalointireitin dramaattisesti inhiboitui EMX2

in vivo

ja

in vitro

, joka tarjoaa lisätodiste siitä, että Wnt-signalointireitin saattaa välittää toimintaa EMX2 syövän kuten aiemmin ehdottanut [22 ].

Lopuksi tuloksemme osoittavat mahdollisuuden käyttää EMX2 geeniterapian hoitoon mahasyövän. Infektio Kasvainten Ad-EMX2 merkittävästi tukahdutti lisääntymistä ja mikä tärkeintä, parannettu yleistä selviytymistä. On huomionarvoista, että antojärjestelmä käytimme hoito oli rekombinantti-adenoviruksen serotyyppi 5 (Ad5), yleisimmin käytetty vektorin useiden syöpätyyppien geeniterapia [11], [12], [34], [35]. Verrattuna adenoassosioituneesta virus- (AAV) ja retroviruksen jakelujärjestelmiä, adenovirusvektorit, kuten Ad5, selvästi on monia etuja. Esimerkiksi adenovirusvektoreita on laaja tropismista mahdollistaa tehokkaan kohdistamisen monissa kudoksissa kiinnostavat, suuri hyötykuorma ja suuren transduktiotehon verrattuna AAV järjestelmään [10] ja myös ei-integrointi ominaisuudet, jotka muutoin aiheuttaa vaaraa satunnaismutageneesillä genomin [ ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Lisäksi adenovirusvektoreita voidaan suunnitella syövän selektiivinen onkolyyttisiä viruksia [39], [40], [41], jotka ovat kriittisiä kliiniseen käyttöön syövän geeniterapiassa. Kuitenkin on vielä monia haasteita adenovirusvektoreita käyttäen toimittaa geeni hoitoihin. Esimerkiksi, ne voidaan nopeasti menetetään soluista, jotka jakautuvat nopeasti infektion jälkeen. Muut tekijät, jotka vaikuttavat kliininen käyttö adenovirusten ovat pakkaus kapasiteetin ja isäntäkirjo adenovirusvektoreiden, niiden geeniekspressioprofiili ja taipumus immuunireaktioita, erityisen tärkeää, jos toistuva annostelu on tarpeen [42], [43]. Siitä huolimatta meidän

in vivo

tutkimuksessa Ad-EMX2 infektio viittaa siihen, että EMX2 geeniterapia voi olla potentiaalia tulla kliinisen kasvaimia vastustavaa hoidollista strategia hoitoon mahasyövän tulevaisuudessa.