Krooninen sairaus

tiivistelmä

Perimän ja proteomiikka-analyysi normaalista ja syövän kudoksissa on tuottanut runsaasti molekyylitason tietoa mahdollisille biomarkkereiden ja terapeuttisia tavoitteita. Käsittelemällä mahdollisia etuja saatavuuden farmakologinen interventio, tunnistaminen tavoitteet asuvat verisuonen endoteelin kasvaimiin on erityisen houkutteleva. Käyttämällä massaspektrometriaa (MS) välineenä proteiinien tunnistamiseksi, jotka ovat yli-ilmentynyt kasvaimeen liittyvien endoteelin suhteessa normaaleihin soluihin, pyrittiin löytämään tavoitteet, joita voitaisiin käyttää kasvaimen angiogeneesiä syövän hoidossa. Kehitimme proteomic menetelmiä, antoi meille mahdollisuuden keskittää tutkimuksia löytö solun pinnan /eritettyjä proteiineja, koska ne edustavat avaimen vasta-terapeuttinen ja biologisten merkkiaineiden mahdollisuuksia. Ensin eristettiin endoteelisolujen (EC) ihmisen normaaleissa ja munuaissyövän kudoksista FACS käyttäen CD146 markkerina. Lisäksi hajallaan ihmisen paksusuolen ja keuhkosyöpää kudoksia ja niiden vastaavat normaalit kudokset viljeltiin

ex-vivo

ja niiden endoteelin pitoisuus oli ensisijaisesti laajennettiin, eristetty ja siirrostettiin. Solunpintaproteiinit sitten edullisesti kiinni, pilkottiin trypsiinillä ja alistettiin MS-pohjainen proteomiikka-analyysi. Peptidit ensin määrällisesti, ja sitten sekvenssit ilmentyvät eri peptidien erotettiin MS-analyysillä. Kaikkiaan 127 ainutlaatuinen kuin päällekkäin (157 yhteensä) kasvain endoteelisolujen yliekspressoitujen proteiinit tunnistettiin suoraan eristetty munuaisen liittyvän tiedon hankittua ja ne tunnistaa

ex-vivo

viljellyt keuhkojen ja paksusuolen kudoksiin myös tunnetut EY markkereita, kuten CD146, CD31, ja VWF. Ilmaisu analyysit paneelin yksilöityihin tavoitteisiin vahvistettiin immunohistokemiallinen (IHC) sisältäen CD146, B7H3, Thy-1 ja ATP1B3. Sen määrittämiseksi, proteiinit tunnistettu välittävät mitään toiminnallista roolia, suoritimme siRNA tutkimuksia, jotka johtivat aiemmin tunnistamattomia funktionaalinen riippuvuus B7H3 ja ATP1B3.

Citation: Mesri M, Birse C, Heidbrink J, McKinnon K, merkki E, Bermingham CL, et ai. (2013) tunnistaminen ja karakterisointi Angiogeneesin Tavoitteiden kautta proteomiikan profilointi endoteelisolujen Human Cancer kudokset. PLoS ONE 8 (11): e78885. doi: 10,1371 /journal.pone.0078885

Editor: Benedetta Bussolati, Center for Molecular Biotechnology, Italia

vastaanotettu: toukokuu 30, 2013; Hyväksytty: 16 syyskuu 2013; Julkaistu: 13 marraskuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoittajat: Nämä kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut. Tämä Tutkimuksen rahoittivat ja suoritetaan Celera, työnantajan kaikista tekijöistä aikana näiden tutkimusten. Celera on 3 myönnetty patentteja Yhdysvalloissa julistaa: 7582441, 8110373, ja 8334106, joissa kuvataan yhdistysten Na-K ATPaasi beta3 proteiinin eri pahanlaatuinen valtioissa. Ei ole niin kehitteillä tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Angiogeneesi on kasvua uusien verisuonten pre-vanhoja ja on tärkeä luonnollinen prosessi esiintyy kehossa, sekä terveys ja sairaus. Normaali fysiologinen angiogeneesiä esiintyy aikuisilla aikana haavan paranemista ja kohdun limakalvon uudistumista kuukautiskierron aikana. Kuitenkin patologinen liiallinen angiogeneesi voi esiintyä myös olosuhteissa, kuten syövän, diabeettinen sokeus, ikään liittyvä makularappeuma ja kroonisten tulehdustilojen [1] – [3].

Jo pitkään on ollut tiedossa, että endoteelin muodostavat verisuonten ja ympäröivän strooman tuumoreissa erota normaaleissa kudoksissa, mutta vasta viime aikoina nämä erot ovat alkaneet olla tunnusomaista molekyylitasolla [4], [5]. Esto epänormaalit verisuonet liittyy syövän ja muiden sairauksien avulla antiangiogeeniset aineet on tullut merkittävä terapeuttinen strategia. Koska angiogeneesi tarvitaan normaaliin fysiologisiin prosesseihin, markkereita, jotka voivat erottaa fysiologiset ja patologiset angiogeneesin tarvitaan valikoivasti toimittaa antiangiogeeniset aineet sairaisiin kudoksiin minimoida mahdollisia sivuvaikutuksia.

Kohdeproteiinit sijaitsee noin kasvain verisuonia ja strooman soveltuvat erityisesti kohdennettuja syövän vastaisia ​​strategioita ottaen huomioon niiden saavutettavuus suonensisäisesti annettujen terapeuttisten [4], [6]. Strategiat tunnistamiseen kasvaimeen liittyvien endoteelisolujen markkereita ovat

in vitro

hankittua isolaatit alttiina viljelyolosuhteet matkii niitä normaaleissa ja tuumorikudoksissa [7], globaali profilointi geenitranskriptien [8], [9], bioinformatiikka analyysi ilmenevän geenin osiksi [10],

in vivo

kohdistaminen käyttämällä phage display peptidikirjastojen [11], [12], piihappopinnoitteeksi menettely seuraa strippaus solukalvon [13] ja

in vivo

biotinyloinnilla menetelmiä [14].

tekninen rajoitus molekyyli- profiloinnissa hankittua on, että ne edustavat pientä prosenttiosuutta solujen kudokseen. Olemme kehittäneet menetelmän louhinta, tunnistaminen ja laajamittainen kartoitus solun pinnan proteomiin mikrovaskulaaristen endoteelin koska se on olemassa

in vivo

ihmisen munuaisen kasvaimia ja niiden viereisten normaaleissa kudoksissa. Tämä menetelmä perustuu virtaussytometristen värjäytymisen verisuonten elinten tunnettujen markkereita hankittua. Stained solut voidaan puhdistaa tehokkaasti solujen lajittelua. Kun solu suface proteiinin talteenotto ja tryptisen ruoansulatusta, tuloksena proteolyyttiset peptidit altistetaan nestekromatografia – massaspektrometria (LC /MS), jotta voidaan tunnistaa vastaavan proteiineja. Vertaileva analyysi proteiinien tunnistettu kudosnäytteet voi paljastaa eroja sen erilaisissa elimissä tai olosuhteissa esim. normaali verrattuna syöpä. Lisäksi olemme analysoineet

ex-vivo

viljeltyjen solujen saatu syöpä- ja viereisen normaalin ihmisen keuhko- ja paksusuolen mikrovaskulaarisen hankittua.

Methods

Kemikaalit ja materiaalit

Chemical reagenssit hankittiin Aldrich-Sigma (St. Louis, MO). POROS R2 sarake (POROS R2 /10, 4,6 x 50 mm) ja POROS MC pylväässä (2,1 x 30 mm, IMAC-pylvääseen) hankittiin Applied Biosystems (Framingham, MA) ja käänteisfaasi-HPLC-kolonnit on saatu Vydac (Hesparia, CA). DC proteiinimääritykset hankittiin BioRad (Richmond, CA). Modifioitu trypsiini hankittiin Promega (Madison, WI). Vasta-aineita CD146, CD31, CD45, EpCAM, CD105, CD62E, Thy-1 (CD90) ja B7H3 (CD276) hankittiin BD Biosciences. Dil-Ac-LDL hankittiin Biomedical Technologies Inc., MA.

paperi-ja fenotyypin karakterisointi

Ihmisen munuaisen, paksusuolen, keuhko- ja mahalaukun kudokset saatiin kaupallisista lähteistä pian kirurgisen poiston jälkeen. Kaupalliset lähteet sisältävät Asterand (Detroit, MI, www.asterand.com) ja BIOOPTIONS (Brea, CA, www.biooptions.com). Normaalia kudosta otettiin alueita 10 cm irtotavarana kasvainkudoksen joka oli selkeästi määritelty marginaalit. Kudokset punnittiin, leikataan 1 cm: n kuutioiksi saksilla, huuhdellaan, ja hakattu 1 mm palasiksi. Sitten kudosta inkuboitiin kudospilkkoutumisasteisiin alustaa, joka sisälsi kollagenaasia, tyyppi I, hyaluronidaasia, DNaasi I, CaCl

2, ja dispaasi yhden tunnin ajan 37 ° C: ssa jatkuvasti sekoittaen. Mikä tahansa pilkkoutumattomiin kudos suodatettiin 40 um mesh, ja punasolut poistettiin inkuboimalla ACK lyysipuskuria 5 min. seuraa solun pesut ja solujen määrä. Alikvootit yhden solun suspensioita värjättiin CD146, CD31, CD45, ja EpCAM, määrittää profiilin endoteelisolujen, epiteeli- ja infiltroivia leukosyyttisoluja. EpCAM negatiivinen, CD146 positiivisia endoteelin pitoisuus solupopulaation Sitten lajitellaan ja eristää MoFlo -solulajittelijalla. Virtaussytometriako-, EC värjättiin Thy-1 tai B7H3 vasta-aineita (BD Biosciences) tai valvontaa, ja analyysi suoritettiin koskevasta LSR I (BD Biosciences) -virtaussytometriä.

In vitro

kulttuuri normaalin ja kasvaimen paksusuolen ja keuhkojen hankittua

alikvootit yksisolususpensioita kaupallisesti saatiin (edellä) normaalin ja kasvaimen paksusuolen ja keuhkojen kudoksiin valmistettiin kuten edellä on kuvattu. Endoteelisolujen populaatio sitten positiivisesti valittu Dynal n CD31 endoteelisolujen helmiä per tuoteseloste. Valitut solut ympättiin T-pulloja, joissa Lonzan EGM ™ -2-MV media. Tämä media on kehitetty parantamaan endoteelisolukasvu- (Cambrex). Kasvatusalusta vaihdettiin joka 2-3 päivä, kunnes viljelmä saavutti 90-100%. Solut kerättiin käyttäen Lonzan ReagentPack ™. Pullot pestiin Hepes puskuroidulla suolaliuoksella sen jälkeen trypsiini /EDTA itämisaika vapauttamaan soluihin ja trypsiini neutralisointiliuokseen. Positiivinen valinta endoteelisolujen toistettiin edelleen puhdistaa endoteelisolujen populaation. Valitut solut ympättiin T-pulloja, joissa Lonzan EGM ™ -2-MV media. Nämä ensisijainen solut eivät johda solulinjojen synnyttäminen ja niiden rajallinen laajentamisen kapasiteetti riittävästi soluja vain täydentää kokeita tässä kuvatulla tavalla.

Solulysaattia ja peptidi valmistelu

Puhdistetut hankittua pestiin ja inkuboitiin 1 mM natriumperjodaattia 4 ° C: ssa 10 minuuttia hapettaa glykoproteiinien [15]. Solut pestiin ja tarkastettiin elinkelpoisuuden. Solut olivat suurempia kuin 85% elinkelpoisia määritettynä PI syrjäytyminen käyttämällä virtaussytometria. Solut lyysattiin lyysipuskurissa, joka sisälsi 0,05 M HEPES, pH 7,0, 150 mM NaCl, 2% SDS, 5 mM EDTA, 0,5% NP40: tä ja proteaasi-inhibiittoriseosta (Sigma) vorteksoimalla ja leikkaamalla läpi 18 gaugen neulan. Proteiinipitoisuus määritettiin sitten käyttämällä DC-proteiinin reagenssilla (BioRad, Hercules, CA). Hapetetaan glykoproteiineja sitten konjugoida hydratsidia hartsia (Bio-Rad), 4 ° C: ssa yön yli. [16] Pesun jälkeen peräkkäin 2 M NaCl, 2% SDS, 200 mM propanoliamiini (0,1 M NaOAc, pH 5,5), 40% etanolia ja 80% etanolia; sitoutuneet proteiinit vähennetty 2,5 mM ditiotreitolia (DTT) (BioRad, Hercules, CA) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja alkyloitiin ICCAT (kevyt vain ”C0”) menettelytapojen mukaisesti valmistajan suosittelema (Applied Biosystems, Framingham, MA).

alkyloidut proteiinit pilkottiin yön yli 37 ° C: ssa käyttämällä sekvensointia luokka, modifioitu trypsiini (Promega, Madison, WI), jossa entsyymin substraatti-suhde 01:25. Tryptic digestiot suolat käyttäen 3-cm3 Oasis HLB kiinteän faasin kolonnierästä (Waters, Milford, MA) ja kuivattiin tyhjiössä.

Kysteiinit ja glykopeptidien talteenotto ja näyte siivous

Peptidit rekonstituoitiin liuokseen, jossa oli 10% asetonitriiliä PBS: ssä. Peptidit ladattiin avidiini pylvääseen (2 ml, Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen Vision työaseman järjestelmä (Applied Biosystems) PBS: llä. Avidiini Pylväs pestiin 50 mM ammoniumbikarbonaattia (EMD, Gibbstown, NJ), 20% metanolia, mitä seurasi vesipesu. Ei-kysteiiniä sisältävät peptidit pestiin päälle R2 /10-pylväässä (4,6 x 50 mm, Applied Biosystems), jossa oli 5% asetonitriiliä 0,1% TFA: ta, ja eluoitiin sen fraktionkeräimeen vaihegradientilla 95% asetonitriiliä, 0,1% TFA: ta. Kysteiini-sisältävät peptidit eluoitiin käyttäen 50% asetonitriiliä, 0,1% TFA: ta (Pierce, Rockford, IL), kerättiin ja kuivattiin tyhjössä. Captured ICCAT-leimattua peptidit katkaistiin kuvatun protokollan tarjoamia Applied Biosystems. Ylimääräinen ja halkaistut ICCAT reagenssia poistettiin käyttäen samaa avidiini /R2 uudelleenjärjestäminen kuvattu edellä. R2 /10 fraktiot (kysteiiniä sisältävät peptidit) kuivattiin vakuumissa ja säilytettiin -80 ° C: ssa ennen LC-MS-analyysi.

Lisäksi kysteiiniä sisältävä peptidi osa, peptidit hartsiin sitoutunut oli myös kerätty ja analysoitu. Vapautuminen peptidien saatiin aikaan PNGaasi-F ruoansulatus (New England BioLabs, Ipswich, MA). Vaikka olemme löytäneet joitakin päällekkäisiä proteiinien tunnistettu kahteen jakeeseen, analysointi sekä kysteiiniä sisältävä fraktio ja hartsi sitoutunut osuus johti täydentäviä kattavuus solunpintaproteiinia väestöstä.

Käänteisfaasi LC /MS ja LC /MS /MS

Käänteisfaasi-HPLC-erotus suoritettiin laitteella Agilent 1100 järjestelmää (Palo Alto, CA) asetetaan virtausnopeudella 2 ul /min. Järjestelmä oli varustettu C18 esikolonnin suolan poistoa (50 mm x 0,15 mm), kytkentä- venttiilin, ja C18-analyyttistä pylvästä (150 mm x 0,15 mm) peptidin erottaminen. MS ja MS /MS-analyysit suoritettiin Q-Star massaspektrometri (MDS /Sciex, Toronto, Kanada). Tiedonhankintaa aika oli asetettu 3 s kohti spektrin yli

m /z

välillä 400-1500 Da LC /MS-analyysit. Ioni spray jännite asetettiin 5,2 kV.

peptidi tunnistaminen ja kvantitointi

Peptide ionipiikkien LC /MS karttoja havaittiin suhteen

TM ohjelmisto (PPL, UK), ja MASCOT (www.matrixscience.com) käytettiin etsimään MS /MS-spektri peptidin /proteiinin tunnistaminen massaspektrometrialla proteiinisekvenssitietokannassa (msdb, Imperial College London, London, UK). Peptidi ionipiikkien LC /MS karttoja normaalista ja kasvainnäytteissä yhtenäistettiin perustuvat Massan ja varauksen suhde (

m /z

), korjattu retentioaika (RT) ja varaustila (

z

). Intensiteetit ionien jokainen kartta verrattiin keskimääräistä intensiteettiä näiden ionien kaikissa karttoihin linjaus. Normalisointitekijä luotiin (käyttäen ioneja keskiarvolla intensiteetit 10

th-90

th persentiilit) kunkin kartan avulla rajoittamaton epälineaarinen optimointi, minimoi summan eroja intensiteettiä kunkin ionin ja keskimääräinen voimakkuus että ioni kaikissa kartat. Sen jälkeen intensiteetti normalisointi, peptidi-ioneja, joiden ero ilmaus yli 3-kertaiseksi välillä kasvain ja normaali näytteet manuaalisesti tarkastetaan ennen LC-MS /MS-pohjainen peptidisekvensointia.

immunohistokemia (IHC) B

Immunohistokemia suoritettiin elinikä Biosciences on formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset käyttäen kudossiruina. Syöpä joukko koostui homogeeninen syöpäsoluja. Kudokset poistettiin parafiini, ja antigeeni haku suoritettiin käyttäen EZ-noutaja (Biogenex, San Ramon, CA). Näytteet ennalta blokattiin ei-seerumin proteiineihin lohkon (DAKO A /S, Carpinteria, CA) 15 minuutin ajan. Vastaava ensisijainen vasta-aineita inkuboitiin yön yli huoneen lämpötilassa. Kuvitella Plus järjestelmä HRP (DAKO) käytettiin havaitsemiseen 3, 3′-diaminobentsidiini substraattina piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita. Objektilasit sitten manuaalisesti tekee yhden patologi ja perustuivat (i) värjäys voimakkuus ja (ii) värjäys taajuus määritteet. Negatiivinen värjäys voimakkuus oli annettu pistemäärä ”0”, blush värjäys pistemäärä ”1”, heikko värjäytyminen pistemäärä ”2”, kohtalainen värjäytyminen pisteet ”3”, ja vahva värjäytyminen pistemäärä ”4”. Lisäksi, kun 0,1%: sta 30% soluista osoitti positiivista värjäytymistä, värjäytyminen kvantitoitiin kuten harvinaisia ​​tai satunnaista, 30%: sta 75% soluista osoittaa positiivista värjäytymistä oli määrällisesti ”paljon tai usein”, ja yli 75% soluista värjäämällä positiiviset nimettiin ”useimmat”. Hematoksiliini käytettiin vasta-tahra. Kuvat ovat hankittiin käyttäen 40 X tavoite (400 X suurennos).

Immunofluoresenssikoe

Ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC, Cambrex) kasvatettiin Lab-Tek kammio kudosviljelmässä dioja. Soluja inkuboitiin 10 ug /ml Dil-Ac-LDL 37 ° C: ssa normaalissa median 4 h. Media poistettiin sitten ja solut pestiin kerran koetin elatusaineessa 10 min ajan, huuhdeltiin PBS: lla, ja sitten kiinnitettiin 10% puskuroidussa formaliinissa fosfaattia 5 min. Peitelaseja päälle asennettu luisti tipalla 10% PBS glyseroliin ennen katselua.

RNA Häiriöitä

Yksittäiset duplex synteettinen siRNA spesifinen B7H3 ja ATP1B3, ostettiin Dharmacon (Lafayette, CO). SiRNA transfektiota, HUVEC tai ihmisen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja (HMVECs, Cambrex) ympättiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille tiheydellä 10000 solua /kuoppa. Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 ja Plus-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Knockdovvn B7H3 mRNA-tasojen seurattiin kvantitatiivinen RT-PCR 1 päivä transfektion jälkeen käyttäen TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems). Prosenttia mRNA lauseke Knockdown validointi laskettiin ΔΔCt menetelmää [17]. RPLP0 toimi endogeeninen kontrolli normalisoimaan mallin kuorman ja transfektoitujen solujen negatiivinen kontrolli siRNA olivat vertailunäyte. Solujen kasvua arvioitiin 3 päivää transfektion jälkeen käyttäen Alamar Blue reagenssia (Invitrogen) ja SPA-tymidiinin kit GE Healthcare (Piscataway, NJ). Solujen apoptoosi mitattiin kaspaasi 3/7 toiminta -kittiä Promega (Madison, WI).

Tulokset

arviointi endoteelin sisältöä eri syöpätyyppejä

arvioimiseksi suhteellinen EY sisällön kasvainten useiden syöpätyypin merkkejä, yksittäiset solut saadaan seuraava kudosten käsittely kasvaimen ja normaalin viereisen kudoksia munuais-, keuhko-, paksusuoli- ja syöpien ja analysoitiin EY läsnäolon (kuvio 1). Hankittua ovat enmeshed monimutkaisessa sisältävän kudoksen soluväliaineen vaihtelevan koostumuksen ja useita ei-endothelail solutyyppejä, kuten epiteelisoluja ja valkosoluja. Meidän alkuperäinen yritetty puhdistaa hankittua mukana vasta-tunnustamista tavanomaisten tunnettujen EY solupinnan kuten CD31, CD105, ja CD146. Kuitenkin, CD31 osoittautui olevan optimaalista, koska sen ristireaktiivisuus hematopoieettisia soluja. CD105 myös voidaan ilmaista aktivoidut monosyytit ja myös osoittautunut optimaalinen havaitsemisessa kaikista lähteistä hankittua. Anti-CD146 osoitti maksimaalinen EY tunnustusta vahvistanut kaksi värjäys CD31 ja CD146 FACS ja positiivinen asetyloitu LDL (Dil-Ac-LDL) oton immunosolukemiallisella viljellyissä hankittua peräisin paksusuoli- ja keuhkojen kudoksiin. Anti-CD146 Ab käytettiin siksi EY lajitteluun, eristäminen, rikastus ja suhteellinen arvio hankittua sisältöä kasvain kudosten. Meidän analyysit osoittivat, että munuaisten kudoksiin sisälsivät suurin prosenttiosuus (0,6-33,1) ECS (kuvio 2), minkä jälkeen keuhko- (0,8-7,2), paksusuolen (0,2-5,1) ja mahalaukun kasvaimet (0,2-1, ei esitetty kuviossa 2) . Yhteensä 46 täsmäsi kasvaimen ja viereisen normaalin munuaisen kudosta analysoitiin tyypillinen kaikki neljä vaihetta munuaissyöpä. Pitoisuus normaalin munuaisen hankittua vaihteli 1,1-14,7% verrattuna 0,6-33,1% munuaisten syövistä. Kohonnut pitoisuus hankittua munuaisten kasvaimet näkyi myös verrattuna kuhunkin vastaavaan vastaaviin normaaleihin viereisen hankittua viittaa siihen, että munuaisten kasvain hankittua voi olla proliferatiivisen verrattuna niiden enemmän levossa normaali vierekkäisen hankittua. Tämä suuntaus ei kuitenkaan ollut ilmeistä keuhkojen ja paksusuolen kudoksiin. Koska proteiini määrä on rajoittava tekijä MS-analyysia siksi suoritettu meidän löytö vaivaa munuaissyövän joka antoi korkeimmat hankittua toipuminen kudoksista.

B) eristämiseksi puhdasta EY populaatioita kollagenaasi hajallaan kudoksia, EpCAM negatiivinen, CD146 positiivisia endoteelin pitoisuus solupopulaation lajiteltiin, eristetty ja rikastaa MoFlo -solulajittelijalla. Solut jätettiin LC-MS ja ominaisuus havaitsemiseen joko suoraan tai välillisesti laajennuksen jälkeen viljelmässä.

Yhden soluissa kudosten käsittely kasvaimen ja normaalin viereisen munuais-, keuhko- ja paksusuolen kudokset värjättiin anti -CD146 Ab ja analysoitiin EY läsnäolon.

Näytteiden valmistus ja MS laadunvalvonta

hankkeessa keskityttiin löytö merkkiaineita sisältäviä lyhyitä, tryptically-lohkaistaan ​​5-25 aminohapon peptidejä, jotka koodaavat joko kysteiinitähde tai N-välitteisen glykosylaation, joka tarjoaa laajan kattavuuden proteomin. Arvioida MS-järjestelmän soveltuvuuden, arvioinnin toistettavuus tehtiin määrittämiseksi vähintään luotettava suhde peptidin /proteiinin tasot edelleen kvantitatiivisen analyysin. Kysteiiniä sisältäviä peptidejä trypsiinikartta digest rikastettiin affiniteettikromatografialla, ja LC-MS karttoja peptidin seoksia kaksi näytettä generoidaan. Meidän kokeissa ICCAT (valo vain) etiketti toimi vetokahvaan ulos kysteiiniä sisältävät peptidit, mikä yksinkertaistaa peptidin seoksen. Vaikka analysoidut näytteet teknisesti sisältää etiketin, analyysimme on pohjimmiltaan mitä kutsutaan ”tarra-vapaa” menetelmä että peptidi-ioni piikkialueiden tietystä näytteestä ja LCMS Kartassa verrattiin eri näytettä ja LCMS kartan suhteellinen kvantifiointi. Niinpä kutsumme meidän kokeita ”irrotettu tuotannosta”, mikä tarkoittaa, että leimatut näytteet eivät yhdistetään yhdeksi massaspektrometrianalyysissä kuten tyypillisesti tehdään käytettäessä ICCAT tai merkintöjen työnkulun. Ominaisuus luettelot, esimerkiksi normaali rinnakkaisten 1 ja Normal rinnakkaista 2 linjattu tuottaa intensiteetti matriisi. Kuva. 3 esittää hajontakuvio log2 transformoitujen intensiteettiä (log2 Int) yhteisiä piirteitä irronneessa kokeita (jäljitellä 1 vs jäljitellä 2). Log2 suhteet (suhde = ioni voimakkuus näytteessä 1 /ioni-intensiteetin näyte 2) kaikkien yhteisiä piirteitä laskettiin. Yhteenvedossa tilastot näkyvät kanssa boxplot kaavion. Sillä suhde jakautuminen tuotannosta irrotetun rinnakkaisnäytteiden 2SDUL (yläraja 2 standardipoikkeamaa (SD) keskiarvosta), 2SDLL (alaraja 2SD keskiarvosta), ja keskiarvot lineaarisella asteikolla on esitetty kuvassa. 3. Tämä toistettavuus arviointi osoitti, että kaksoiskappaleanalyysiä kokeita (normaali tai kasvain) 95% koko yhteisiä piirteitä ovat intensiteetit sisällä ~ 2-kertainen ero. Näin ollen mitään eroa ilmaisun suhteessa, joka on 2-kertainen voidaan pitää differentiaalisesti ilmaistaan ​​95%: n luottamusväli. Tässä tutkimuksessa kuitenkin suhteet, jotka olivat 3-kertainen pidettiin ilmentyvät eri.

sirontakaavioissa yhteisiä piirteitä normaalista ja kasvaimen näytteitä ja ero analyysin avulla tuotannosta irrotettua karttoja näytetään. Suhteelliset ekspressiotasot määritetään kohdistamalla peptidi-ioni piirteitä eri MS kokeita (LC /MS karttoja). Log2 voimakkuudet yhteisiä piirteitä havaittu (A) prosessi jäljittelee vertailunäytteen; (B) prosessi jäljittelee kasvaimen näytteen; (C) kontrolli vs. kasvainnäytteestä piirretään. Vastaava rasiakuvaaja (in log2 asteikko) on suhde jakauma kunkin aineisto näkyy vieressä sirontakuvaajaan. Laatikossa 50% ominaisuuksia, jossa 95%: n ominaisuuksia ovat vaaka baareissa. (D) yleisyys tunnettu EY pintaproteiineista tutkittiin ja edustajat esitetään.

Heat kartta globaalin peptidin analyysin ihmisen munuaisen kasvain endoteelin

Yhteensä 6 kasvaimia ja 2 normaali viereinen munuaisen näytteitä käsiteltiin kasvaimen suhteellisen yli-ilmentymisen analyysi. Yhteensä 74 solun pinnan /eritettyjen proteiinien tunnistettiin MS vähintään 3 kertaa suurempi intensiteetti munuaisten kasvaimeen liittyvien endoteelin verrattuna normaaliin endoteeliin.

heatmap rivit lajiteltiin suhde tarkoittaa intensiteetin kasvaimen näytteiden keskimääräinen intensiteetti normaaleissa näytteissä. Lämpö kartta esittelee analyysin 233 kysteiiniä sisältävä peptidi intensiteettiä tunnistettu munuais- kasvain endoteelin ja lajitellaan niin, että kaikkein differentiaalisesti ilmaisi peptidit ovat huipulla (kuvio 4). Rivit olivat mukana vain, jos siellä oli ainakin yksi MS /MS tunnistaminen ionin rivillä. Näyttö värit määritettiin jokaiselle riville erikseen määrittämällä mustasta mediaani intensiteetti rivissä, vihreä alimpaan intensiteettiä rivillä, ja punainen korkeimmalle intensiteettiä. Riveihin mediaani on nolla, nolla arvot näkyvät mustina. Esimerkkejä tunnistettujen proteiinien Kolikon lämpökartassa.

Lämpöä kartta esittelee analyysin peptidin intensiteetit 233 peptidien tunnistettu munuais- kasvain endoteelin ja lajitellaan niin, että kaikkein differentiaalisesti ilmaisi peptidit ovat huipulla. Näyttö värit määritettiin jokaiselle riville erikseen määrittämällä mustasta mediaani intensiteetti rivissä, vihreä alimpaan intensiteettiä rivillä, ja punainen korkeimmalle intensiteettiä.

MS-analyysi proteiinien kanssa kohonnut ilmentyminen

in vitro

viljellyissä ihmisen paksusuolen ja keuhkojen kasvain endoteeleissä

viljellään edelleen ja laajennetaan normaalin ja kasvaimen hankittua

in vitro

syöpään tyyppi merkkejä, jotka eivät tuota riittävää endoteelin proteiinit suoralta

in vivo

eristyksissä MS-analyysiä. Nämä merkinnät olivat paksusuolen ja keuhkosyövässä. Identity näiden solujen hankittua varmistettiin dual värjäys CD31 ja CD146 FACS ja positiivinen Dil-Ac-LDL oton immunosolukemiallisella (kuva 5). Nämä solut olivat negatiivisia alfa-aktiinin ilmentymistä, tyypillinen merkki sileän lihaksen soluissa. Mielenkiintoista, vain murto-osa (20-30%) on

in vitro

viljellyissä hankittua on peräisin keuhkojen ja paksusuolen kasvaimet värjättiin Dil-AC-LDL oton immunosolukemiallisella (ei kuvassa), vaikka niiden positiivinen ilmaus CD31 ja CD146 havaittuna FACS (kuvio 5b). Sen sijaan kaikki

in vitro

viljellyissä hankittua johdettu normaalista keuhko- ja paksusuolen värjättiin Dil-AC-LDL oton immunosolukemiallisella (kuvio 5a) ja värjättiin positiivisia CD31 ja CD146, havaittuna FACS (kuvio 5b ). Tämä saattaa viitata, että kasvaimen hankittua voivat poiketa fenotyypiltään tavanomaisesta kollegansa. Kaikkiaan 56 paksusuolen ja 27 keuhkosyövän solun pinnan /erittyvien proteiinien tunnistettiin 3-kertaiseksi yli-ilmentyminen MS kasvaimeen liittyvien endoteelin verrattuna normaaliin.

(A) Voimakas pistemäinen fluoresenssi osoittaa ottoa Dil-Ac-LDL normaalissa keuhkojen mikrovaskulaarisen hankittua. (B) Viljellyt normaali ja kasvainkudoksen johdettua EC paksusuolen ja keuhkojen värjättiin EY spesifisten CD146 ja CD31, ja alistettiin virtaussytometria.

Yhteenveto hankittua kohde löytö kaikkien kolmen syöpä Kirjoita merkinnät on esitetty taulukossa 1. kaikkiaan 127 ainutlaatuinen kuin päällekkäin (157 yhteensä) kasvain endoteelisolujen yliekspressoitujen proteiinit tunnistettiin suoraan eristetty munuaisen liittyvän tiedon hankittua ja ne tunnistaa

ex-vivo

viljellyt keuhkojen ja paksusuolen kudoksiin. Meidän analyysi osoitti, että proteiinien tunnistettu, 4 proteiineja päällekkäin kaikissa kolmessa syöpätyyppeihin; 17 proteiinit päällekkäin välillä munuaisen ja paksusuolen; 9 proteiinit päällekkäin välillä munuainen ja keuhko; ja 8 proteiinit päällekkäin välillä keuhko- ja paksusuolen syöpiin. Luettelo MS tunnistaa tavoitteet, niiden kudoksen lähteenä havaitsemisen ja ilmaisun suhteen on esitetty taulukossa S1. Analysoinnissa yliekspressoidaan proteiineja, tunnistimme tunnetut hankittua markkereita kuten VWF (5-kertainen verrattuna normaaliin, suurin suhde), PECAM (CD31, 36-kertainen), CD36 (16-kertainen), ja MCAM (CD146, 15 kertainen).

Target Validation

validoida proteiinit tunnistettiin MS, suoritimme lisävarmistusmenetelmää tutkimukset lukien immunohistokemia (IHC), virtaussytometria ja RNAi-välitteinen vaikutus EY lisääntymistä ja /tai apoptoosin osajoukko proteiineja, jotka valittiin perustuen kriteereihin, kuten druggability proteiinien vasta-aineilla, uutuus, ja intensiteetti kasvain yli-ilmentyminen. Edustavat tiedot useista proteiineista on esitetty alla. Edustaja MS-analyysi peptidien ionien CD146 on esitetty kuviossa. 6. Meidän MS-analyysi tunnistaa 11 johdettujen peptidien CD146 poikki 7 eri sairaus merkinnät ja 4 peptidit munuaisten ECS (tuloksia ei ole esitetty).

yläpaneelissa näyttää uutettu ioni kromatogrammit munuaisten hankittua näytettä normaalista ja kasvaimen näytteet. Massaspektrit on esitetty alemmassa paneelissa. Punainen nuoli osoittaa intensiteetin taso normaalissa kudosnäytteessä.

Expression intensiteetti useiden proteiinien, mukaan lukien CD146, B7H3, Thy-1 ja natrium /kalium-kuljettamiseen ATPaasi alayksikön beta-3 (ATP1B3) arvioitiin IHC. Analysoimme parafiinileikkeet otettu useita toisistaan ​​riippumattomia potilaan kudoksiin eri syöpätyyppejä, kuten rinta-, keuhko-, paksusuoli-, munuais-, tai normaali viereisiin kudoksiin. Kaikki näytteet edustivat jotka eivät liity tapauksia kuin ne, joita käytetään MS analyysejä. Edustavia IHC värjäykset on esitetty kuviossa 7. IHC suoritettiin osissa useista normaalista ja karsinooma näytteet mukaan lukien rinta-, keuhko- ja munuaisten näytteet. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen CD146 esiintyy kasvainsoluissa, kun taas normaalin epiteelin oli negatiivinen useita syöpätyyppejä (Fig. 7a). On huomionarvoista, että meidän lajittelua protokolla ulkopuolelle CD146 ja EpCAM positiiviset epiteelisolut proteomiikka-analyysi. CD146 yli-ilmentyminen on usein havaittu endoteelin kasvainsolujen kun normaalin epiteelin oli tasaisesti negatiivinen (Fig. 7b). IHC kuvia EC viittaavat merkittävään yli-ilmentyminen B7H3 rinta-, koolon-, keuhko- ja munuaiskarsinooman verisuonia verrattuna normaaliin alusta (Fig. 7c). Lisäksi monet kasvaimet tutkittiin, olemme havainneet yli-ilmentyminen B7H3 proteiinin itse kasvainsoluihin (tuloksia ei ole esitetty). Thy-1, IHC kuvia osoitti myös merkittävää yli-ilmentyminen munuaisissa, ja keuhkosyöpä alukset verrattuna normaaliin aluksia (Fig. 7d). IHC kuvia osoitettu yli-ilmentyminen ATP1B3 karsinoomassa aluksiin verrattuna normaaliin näytteitä (Fig. 7e). Yli-ilmentyminen ATP1B3 osoitettiin myös kasvainsoluissa verrattuna normaaliin näytteiden paksusuolen ja keuhkojen syövät (tuloksia ei ole esitetty).

(A) IHC kuvia normaalin ja syövän näytteitä. Yli-ilmentyminen CD146 esiintyy kasvainsoluissa, kun taas normaalin epiteelin oli tasaisesti negatiivinen useita onkologian merkkejä. (B) Kuvaa osoittaa huomattavia yli-ilmentyminen CD146 EC: eissa carcinoma alusten verrattuna normaaliin näytteitä. (C) Merkittävä yli-ilmentyminen B7H3 EC: eissa carcinoma alusten verrattuna normaaliin näytteitä on kuvattu. (D) Merkittävä yli-ilmentyminen Thy-1 karsinooma aluksiin verrattuna normaaliin on esitetty. (E) IHC kuvia hankittua osoittaa huomattavia yli-ilmentyminen ATP1B3 in carcinoma aluksiin verrattuna normaaliin näytteitä.

lisävarmistusmenetelmää tutkimukset suoritettiin virtaussytometrialla. Kuva. 8a esittää FACS tiedot karakterisointi järjestetty solujen kasvain osoittaa läsnäolon epiteelisolujen ja haematolymphoid solut, joilla ei ole ilmentymistä CD146 munuaisten näytteet, kun on merkittävästi yli-ilmentyminen CD146 endoteelisolujen osan kasvaimen verrattuna viereiseen normaaliin munuaisen. Kuviot. 8b ja 8c osoittavat vastaavasti, että CD146 positiivisia endoteelisolujen munuaisten ja keuhkojen kasvaimet ilmentävät B7H3 ja Thy-1-proteiineja. Arvioida mahdollisia toiminnallista roolia edellä proteiinien, suoritimme siRNA analysoi viljellyissä hankittua. Koska siellä oli useita rajoituksia suoritettavissa siRNA kokeita kasvaimen hankittua käytimme HUVEC tai HMVECs oleviksi mallijärjestelmiin. Kyky ylläpitää kasvain peräisin hankittua

ex-vivo

rajattiin passage taajuus ja määrä.