Krooninen sairaus

tiivistelmä

fluoropyrimidiinejä 5-fluorourasiilin (5-FU) ja FdUrd (5-fluorideoksiuridiini; floksuridiini) ovat selkäranka solunsalpaajahoitoa paksusuolen syövän ja muiden kasvaimien. Huolimatta laajasta käytöstä, on epäselvää, miten nämä aineet tappavat syöpäsoluja. Täällä olemme analysoineet tarkistuspisteen ja DNA korjaus polkuja, jotka vaikuttavat paksusuolen kasvain vastauksia 5-FU ja FdUrd. Nämä tutkimukset osoittavat, että sekä FdUrd ja 5-FU aktivoida ATR ja ATM tarkistuspisteen signalointireittejä, mikä osoittaa, että ne aiheuttavat genotoksinen vaurioita. Erityisesti kuitenkin ehtyminen ATM tai ATR ei herkistä koolonkarsinoomasoluissa 5-FU, nämä tarkistuspiste reittejä edistää selviytymistä käsiteltyjen solujen FdUrd, mikä viittaa siihen, että FdUrd kiinnostavuus sytotoksisuus hajottamalla DNA: n replikaatio ja /tai indusoimaan DNA-vaurioita, kun taas 5-FU ei. Olemme myös havainneet, että poistamalla pohja leikkaaminen (BER) korjaukseen liittyvän reitin kuluttamalla XRCC1 tai APE1 herkistynyt paksusuolensyöpä solujen FdUrd mutta ei 5-FU. Yhdenmukainen rooli ryhmäpoikkeusasetuksen koulutusjakson, osoitamme, että pienimolekyylinen poly (ADP-riboosi) polymeraasin 1/2 (PARP) estäjät, AZD2281 ja ABT-888, erittäin herkistyneet sekä mismatch korjaus (MMR) -proficient ja vajausta paksusuolen syöpä solulinjojen FdUrd, mutta ei 5-FU. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että roolit genotoxin aiheuttaman tarkistuspiste signalointi ja DNA korjaus eroavat huomattavasti näiden aineiden ja myös ehdottaa uutta lähestymistapaa paksusuolen syövän hoidossa, jossa FdUrd yhdistetään pieni molekyyli PARP estäjä.

Citation: Geng L, Huehls AM, Wagner JM, Huntoon CJ, Karnitz LM (2011) Checkpoint Signaling, Base Excision korjaus, ja PARP edistää Survival of koolonkarsinoomasoluissa Käsitelty 5-fluorideoksiuridiini mutta ei 5-fluorourasiilia. PLoS ONE 6 (12): e28862. doi: 10,1371 /journal.pone.0028862

Editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 elokuu 2011; Hyväksytty: 16 marraskuu 2011; Julkaistu 15 joulukuuta 2011

Copyright: © 2011 Geng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health Avustukset R01-CA084321 (LK), P50-CA136393 (LK), GT32-M072474 (AH), Mayo Clinic Eagles Pilottihanke palkinnon, ja Mayo Clinic. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

5-fluorourasiili on aktiivisuus useita syöpiä, ja se on yksi yleisimmin määrätty syöpälääkkeiden, mutta sen yleisin käyttö on paksusuolen syöpä, jossa se on perusta kaikki nykyaikaiset paksusuolen syövän hoitomuotoja. Oton soluihin, 5-FU tapahtuu kompleksin metabolinen reaktioita (Fig. 1A, rev. In [1]), jolloin saatiin 3 tunnettuja sytotoksisia aineenvaihduntatuotteita: FUTP (5-fluoriuridiini trifosfaatti), FdUMP (5-deoksiuridiinin monofosfaatti), ja FdUTP ( 5 deoksiuridiini trifosfaattia). FUTP vaikuttaa RNA aineenvaihdunnan sen sisällyttäminen RNA, jossa se häiritsee snRNA, tRNA ja rRNA käsittely sekä ribonucleolytic aktiivisuus eksosomi ja pseudouridylation RNA [2] – [8].

( A) Metabolism of 5-FU: n ja FdUrd. (B, C) HT29 (B) ja HCT-8 (C) Soluja käsiteltiin 5-FU: ta (80 uM, HT29, 200 uM HCT-8-soluista), FdUrd (40 uM sekä solulinjoja), tai 10 mM hydroksiurea (HU) varten osoitetut ajat. Solu-uutteet blotattiin varten fosfo-Ser317-Chk1 (P-Chk1), fosfori-Thr68-Chk2 (P-Chk2), Chk1 tai Chk2. TS, tymidylaattisyntaasin; TP, tymidiinifosforylaasi; UP, uridiinifosforylaasin; UK, uridiini kinaasi; OPRT, orotaatti fosforibosyylitransferaasigeeniä; RR, ribonukleotidireduktaasia; FUR, 5-fluoriuridiinia; FUMP, 5-fluoriuridiinia monofosfaatti; FUDP, 5-fluoriuridiinia difosfaatti; FUTP, 5-fluoriuridiinia trifosfaattia; FdUMP, 5-fluorodeoksiuridiini monofosfaatti; FdUDP, 5-fluorodeoksiuridiini difosfaatti; FdUTP, 5-fluorideoksiuridiini trifosfaatiksi.

Sen sijaan, FdUMP ja FdUTP häiritä DNA aineenvaihduntaa. Nämä metaboliitit valmistetaan muuntamisen jälkeen 5-FU ja FdUrd (5-fluorodeoksiuridiini, floksuridiini), joka on myös FDA-hyväksytty kemoterapiaa aineena hoitoon paksusuolen syöpä [9] ja se on usein katsotaan olevan samanlainen vaikutusmekanismi 5-FU. FdUrd sitten fosforyloituu FdUMP ja edelleen fosforyloituu FdUTP [1]. FdUMP ehkäisee tymidylaattisynteesin (TS), joka estää muuntaminen kaatopaikalle dTMP lopulta aiheuttaa ehtyminen dTTP, kertyminen dUTP, ja häiriöitä dNTP suhde. Sen sijaan FdUTP sekä kertynyt dUTP, sisällytetään DNA.

Yhdenmukainen kykynsä häiritä dNTP tasoilla sekä FdUrd ja 5-FU aktivoida ATR tarkistuspisteen signalointireitin [10] – [17 ], joka on polku, joka laukeaa, kun DNA: n replikaatio estyy, ja joka soittaa myös kriittisiä rooleja edistämisessä selviytymistä solujen kokee replikaation stressiä tuottama dNTP häiriöitä ja /tai DNA vaurioiden [18]. Aktivoinnin jälkeen ATR fosforyloi useita substraatteja, mukaan lukien Chk1. Kollektiivinen kinaasiaktiivisuudet ATR ja Chk1 orchestrate S-vaiheeseen tarkistuspisteen ja säädellä DNA korjaus edistää solujen elinkelpoisuuden ja hyödyntämistä [19]. Lisäksi 5-FU ja FdUrd aiheuttaa kaksijuosteisen DNA katkoksia [20], [21], joka puolestaan ​​aktivoi ATM tarkistuspisteen signalointireitin. ATM polku myös säätelee solujen selviytymistä joko indusoimalla apoptoosin tai estää solusyklin etenemisen ja aktivoimalla DNA korjaukseen, jotka molemmat edistävät selviytymistä [22]. Erityisesti on kuitenkin edelleen epäselvää, ATR ja /tai ATM tarkastuspiste väyliä tärkeä rooli määritettäessä selviytymisen ihmisen paksusuolen syövän, solut, jotka on kohdistettu 5-FU ja FdUrd potilailla, kun ne käsitellään näiden aineiden .

urasiili ja 5-FU, jotka sisällytetään genomiin hyväksytään myös 2 DNA: n korjaukseen väyliä, jotka voivat pelata rooleja eloonjäämisen käsiteltyjen solujen 5-FU ja FdUrd. Yksi polku on perusta Leikkauskorjauksessa (BER) polku [1], [23]. Tässä reitissä genomisesti sisällytetty urasiili ja 5-FU ensin tunnustettu urasiili glykosylaaseja, joka Leikataan vaurio, jättäen emäksetön päällä. Emäksetön sivusto jatkojalostetaan endonukleaasilla (esim APE1), yhtenäisen DNA: tauko, joka tunnistaa poly (ADP-riboosi) polymeraasin, joka poly (ADPribosyl) Ates itseään sekä muita korjaus proteiineja, rekrytointi XRCC1 ja muut proteiinit, jotka täyden korjaus- [24]. Tutkimukset rooliin ryhmäpoikkeusasetuksen soluissa käsiteltiin 5-FU tai FdUrd ovat saavuttaneet erilaisia ​​johtopäätöksiä käyttäen erilaisia ​​mallin järjestelmiä. Ottaen huomioon, että nämä tutkimukset ovat osoittaneet, että poistamalla BER suojaa, herkistää tai ei ole vaikutusta sytotoksisuuteen aiheuttama 5-FU: n ja FdUrd näiden erilaiset järjestelmät, mukaan lukien hiiren [17], [23], [25] – [35], on epäselvää, mitä, jos mitään, rooli BER pelaa selviytymisen koolonkarsinoomasoluissa altistettiin 5-FU tai FdUrd.

Toinen osallinen korjaukseen liittyvän reitin on epäsuhta korjaus (MMR) järjestelmä.

In vitro

tutkimuksissa on todettu, että MMR polku voi poistaa 5-FU keinotekoisista sisältävien kasvualustojen 5-FU: G mispairs. Erityisesti kuitenkin tutkimukset soluissa mukaan MPR on vain vähäinen merkitys poistoleikkauksen 5-FU vaurioita genomissa [35]. Analyysit vaikutusten MMR reitin solujen elinkelpoisuuden hoidon jälkeen 5-FU: n ja FdUrd ovat yleisesti osoittaneet, että soluja, joilla on viallinen MMR ovat resistenttejä 5-FU: n ja FdUrd [10], [36] – [38], tuloksena yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että viallinen MMR paksusuolensyöpä potilaat eivät hyödy 5-FU-hoidon [39].

Koska useat vaikutusmekanismit 5-FU: n ja FdUrd ja monenlaisia ​​kokeellisia käytettävien järjestelmien näissä tutkimuksissa (mukaan lukien tutkimukset hiiren solulinjoissa ja ihmisen solulinjoissa johdettu kasvaimia, joita ei yleensä hoidettu 5-FU tai FdUrd), olemme aloittaneet tutkimukset käsitellä rooleja yksittäisten tarkistuspiste signalointi ja DNA korjaus reittejä ihmissoluissa peräisin ihmisen kasvaimista. Meidän ensimmäinen analyysi, huomasimme, että 5-FU ja FdUrd on hyvin erilaiset vaikutusmekanismit vuonna munasarjasyöpäsoluja [17]. Poistaminen ATR tai BER herkistyneet näiden solujen FdUrd, mutta ei 5-FU, mikä osoittaa, että FdUrd tappaa soluja aiheuttamalla DNA-vaurioita ja että 5-FU kykenee sen sytotoksisuuden toinen mekanismi, mahdollisesti häiritsevät RNA aineenvaihduntaa. Erityisesti olemme myös havainneet, että PARP-inhibiittorit, jotka ovat osoittaneet ennennäkemätöntä aktiivisuutta munasarja- kasvaimet ja muut kasvaimet, jotka ovat muuntunut

BRCA1

ja

BRCA2

[40] – [43], huomattavan herkistynyt munasarjasyöpä solujen FdUrd, mutta ei 5-FU: [17]. Koska FdUrd toimii munasarjasyöpä [44], [45], että viat

BRCA1

ja

BRCA2

(tai muita geenejä homologisten korjaukseen liittyvän reitin) ovat yleisiä munasarjasyöpä [ ,,,0],46], ja että PARP-inhibiittorit todennäköisesti on rooli munasarjojen syöpien [24], nämä havainnot ehdotti uusia terapeuttisia strategia munasarjasyöpä. Erityisesti kuitenkin, biologia munasarjasyöpä on hyvin erilainen kuin biologian paksusuolen syöpä. Onkogeenit ja tuumorisuppressorigeeneille yleisesti mutatoitunut koolonsyöpien (

APC, p53, PI3K, KRAS

) poikkeavat geenit yleisesti mutatoitunut munasarjasyöpiä (

NF1, RB1, CDK12, CCNE1, NOTCH

) [46], [47]. Lisäksi DNA korjaukseen polkuja, jotka ovat häiriintyneet koolonkarsinoomasoluissa ovat hyvin erilaiset kuin häiriintyy munasarjojen syöpiä. Esimerkiksi geenejä tarvitaan mismatch korjaukseen liittyvän reitin (esim

MLH1

ja

MSH2

) ovat usein mutatoitunut tai epigeneettiseltä vaiennettu paksusuolen syövissä [39], [48], kun taas viat homologisia rekombinaatio (esim

BRCA1

ja

BRCA2

mutaatioita) esiintyy munasarjasyöpiä [46], [47]. Lopuksi, munasarjojen ja paksusuolen kasvaimet ovat hyvin erilaisia ​​vastauksia 5-FU. Kun taas 5-FU on hyvin rajallinen aktiivisuus munasarjasyöpä [49], [50], 5-FU on kulmakivi kaikkien sytostaattihoitoon hoitoon käytettävä paksusuolen syövät, koska sen korkea aktiivisuus tässä sairaudessa [1]. Näin ollen, kun otetaan huomioon nämä biologiset erot munasarja- ja paksusuolen syöpiä, ja siitä, että 5-FU on yleisesti käytetään paksusuolen syövän kemoterapiahoitoihin, olemme nyt määrittää, kuinka 5-FU: n ja FdUrd tappaa koolonkarsinoomasoluissa saada tärkeitä tietoja taustalla biologiaa näiden aineiden ja parantamaan niiden käyttöä klinikalla tämän sairauden hoidossa. Tätä varten käynnistimme järjestelmällisen analyysin roolien genotoxin aktivoituvan tarkastuspiste signalointi, BER polku, ja MMR reitin kuluttamalla avain signalointi välituotteita Näitä reittejä käyttäen erittäin tehokkaita siRNA. Nämä löydökset eivät vain entisestään valaista ymmärrystämme signalointi ja DNA korjaus polkuja, jotka ovat tärkeitä näissä soluissa, ne myös paljastavat, että koolontuumorisolut herkistyneet FdUrd pienmolekyylisalpaajilla PARP-inhibiittorit, jotka ovat tällä hetkellä kliinisissä tutkimuksissa, mikä viittaa siihen uusi terapeuttinen lähestymistapa, jossa yhdistyvät FdUrd, hyväksytty lääke hoitoon paksusuolen syöpä, joiden PARP-inhibiittorin, syntymässä luokan aineita jännittäviä syövän vastaista aktiivisuutta.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri

HT29, HCT-8, ja HCT-116-solut saatiin American Type Culture Collection. HCT-116.ch2 ja HCT-116.ch3 [51] soluja Scott Kaufmann (Mayo Clinic). Soluja viljeltiin RPMI-1640-media (Mediatech), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Atlanta Biologicals) 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Sillä klonogeenisten määrityksissä, väliaine, jota oli täydennetty 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Mediatech).

Materiaalit

Reagenssit olivat seuraavilta toimittajilta: 5-fluorourasiilia (APP Pharmaceuticals ), FdUrd (Bedford Laboratories), ABT-888 (Selleck Chemicals ja ChemieTek), AZD2281 (ChemieTek), KU-55933 (Tocris Bioscience), gemsitabiini (Eli Lilly), SuperSignal Pico West (Thermo Scientific). Kaikki muut materiaalit olivat Sigma-Aldrich.

vasta-aineet olivat seuraavat: fosfo-Ser317-Chk1 (R fosfo-Thr68-Chk2, ATR, piparjuuriperoksidaasi sidottu kani IgG, ja piparjuuriperoksidaasiin sidottu hiiren IgG (Cell Signaling); Chk1 (Santa Cruz Biotechnology); Chk2 ja ATM (Epitomics); APE1 (Abcam); XRCC1 (Bethyl Laboratories); beeta-aktiini (Sigma-Aldrich); ja HSP90, D. Toft (Mayo Clinic, Rochester, MN).

Solutransfektiot ja pieniä häiritseviä (si) RNA: iden

siRNA: ita transfektoitiin elektroporaatiolla kuvatulla [17]. Transfektoituja soluja viljeltiin 48 tuntia ennen käyttöä. Sekvenssit siRNA olivat: ATM-1, 5′-GCACCAGUCCAGUAUUGGC-3 ’[52]; ATR-2, 5’-CCUCCGUGAUGUUGCUUGA-3 ’[53]; XRCC1-2, 5’-CUCGACUCACUGUGCAGAA-3 ’[54]; APE1, 5’-GGACAGAGCCAGAGGCCAA-3 ’; MLH1, 5’-GGAAGAUUCUGAUGUGGAA-3 ’; MSH2, 5’-GAUCCUAAUCUCAGUGAAU-3 ’; ja lusiferaasi, 5’-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3 ’[55].

klonogeeninen määrityksiä, solun hajoamista, ja solujen säteilytys

Cell kaarianalyysien, klonogeeniset määrityksiä, solun hajoamista, immunoblottauksen ja immunovärjäys suoritettiin kuten on kuvattu [56], [57]. Sillä klonogeenisten määritykset, joissa käytetään ei-transfektoituja soluja, prosenttia jäänteitä kaikki yksittäiset ja yhdistelmähoidot normalisoitiin soluissa, joita käsiteltiin vain vehikkelillä. Sillä klonogeenisten määritykset, joissa käytetään soluja, jotka on transfektoitu siRNA, prosenttia eloonjääneiden kullakin lääkekonsentraatiolla normalisoitiin apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään annetulle siRNA. Solut säteilytetään RS-2000 Biological losäteilyttimen, Rad Source (Suwanee, GA) 4-6 h kuluttua pinnoitus.

Tulokset

5-FU ja FdUrd aktivoi ATR ja ATM tarkistuspiste signalointi reittejä koolonkarsinoomasoluissa

vaikutusten arvioimiseksi 5-FU ja FdUrd ATM ja ATR tarkistuspisteen signalointireitteihin, vertasimme kykyjä näiden aineiden aktivoimiseksi tarkistuspisteen signalointia kaksi koolonsyöpäsolulinjaa: HT29, joka on toiminnallinen MMR järjestelmä, ja HCT-8, joilla on mutaatioita

MSH6

ja ovat MMR puutteellisia [58]. Soluja käsiteltiin pitoisuuksilla kunkin aineen, joka estää kyky muodostaa klooneja 90% (IC

90) ja positiivisena kontrollina, replikaatio estäjä hydroksiurea. Aktivointi ATM ja ATR reitit arvioitiin sitten immunoblottauksella fosforyloidun Chk1 ja Chk2, kaksi proteiinikinaaseihin jotka ovat fosforyloitua ja aktivoida ATR ja ATM [59]. Nämä tutkimukset paljastivat, että 5-FU ja FdUrd voimakkaasti aktivoitunut Chk1 ja Chk2 in HT29 (Fig. 1 B), jossa on 5-FU aiheuttavat vieläkin suurempaan Chk1 fosforylaation kuin teki FdUrd. Samoin HCT-8 solua kumpikin aine indusoi Chk1 fosforylaatiota (kuvio. 1 C); kuitenkin nämä solut 5-FU indusoi vähemmän Chk1 kuin teki FdUrd. Analyysit Chk2 fosforylaation eivät mahdollista johtuen erittäin alhainen Chk2 on HCT-8-soluista (tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että molemmat aineet aiheuttavat genotoksisia vahinkoa, joka aktivoi tarkistuspisteen signalointi reittejä koolonkarsinoomasoluissa.

ATR ja ATM edistää selviytymistä koolonkarsinoomasoluissa käsitelty FdUrd mutta ei 5-FU

ATM ja ATR ovat kaksi apikaalisella kinaasin säätelijöinä genotoxin aiheuttama tarkistuspiste signalointi. Sen määrittämiseksi, onko joko ATM- tai ATR aktivoida väyliä, jotka vaikuttavat solujen eloonjääntiä käsiteltiin FdUrd tai 5-FU, me ohimenevästi köyhdytettyä ATM ja ATR käyttämällä siRNA: t, ja sitten arvioitiin kapasiteetin käsiteltyjen solujen arvostellaan pitoisuuksia FdUrd tai 5-FU ja lisääntyä käyttäen klonogeeniset määrityksiä. Yllättäen ehtyminen ATM tai ATR ei herkistä myöskään solulinjassa 5-FU (Fig. 2A ja 2B), vaikka tämä aine aktivoitu näitä reittejä (ks. 1B ja 1C). Paljon erilaisia ​​kuva syntyi, kun solut käsiteltiin FdUrd. Ehtyminen ATR dramaattisesti herkistynyt HT29 ja FdUrd (Fig. 2B) ja gemsitabiinia (Fig. S1A), nukleosidianalogi, joka estää ribonukleotidireduktaasia ja häiritsee DNA: n replikaatiota, jos ne sisältyvät DNA [60]. Sen sijaan ATM ehtyminen (Fig. 2A) ja ATM-inhibiittori KU-55933 [61] (Fig. S1C), jotka molemmat herkistyneet ionisoivalle säteilylle (kuva. S1B ja kuvio S1D), oli vain vähäinen vaikutus FdUrd sytotoksisuutta. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös HCT-8 ja HCT-116-solut, joissa ATR ehtyminen herkistyneet molemmissa solulinjoissa ja FdUrd, mutta ei 5-FU: ta (Fig. 3).

(A, B) HT29, transfektoitu ohjaus (Luc), ATM (A), tai ATR (B) siRNA: t, maljattiin yksittäisinä soluina, altistetaan osoitettujen konsentraatioiden 5-FU tai FdUrd 24 tuntia, pestiin, viljeltiin 10 d, ja värjättiin Coomassie Blue. Transfektoidut solut myös peräkkäin immunoblotattiin (sisäkkeet) havaitsemiseksi ATM, ATR, ja HSP90 (latauskontrollina). *, Ei-tietyllä taajuusalueella.

(A, B) HCT-8 (A) tai HCT-116 (B), jotka on transfektoitu ohjaus (Luc) tai ATR siRNA: ita maljattiin yksittäisinä soluina, alttiina osoitettujen konsentraatioiden 5-FU tai FdUrd 24 tuntia, pestiin, viljeltiin 10 d, ja värjättiin Coomassie Blue. Transfektoidut solut myös peräkkäin immunoblotattiin ATR ja HSP90 (latauskontrollina). *, Ei-tietyllä taajuusalueella.

Häiriöt BER kuluttamalla XRCC1 herkistää ja FdUrd, mutta ei 5-FU

5-FU: n ja FdUrd aiheuttaa kertymistä urasiili ja 5-fluorourasiilin perimän DNA [23], [62]. Tutkimukset käyttäen puhdistettua urasiili glykosylaaseja ovat osoittaneet, että synteettiset substraatit otetaan urasiili ja 5-fluorourasiilin substituentteja ovat substraatteja BER koneiden [35], [63] – [70]. Lisäksi tuoreessa raportissa osoitettu, että ehjät solut, urasiili glykosylaaseja poistamiseksi 5-FU genomeista paksusuolen syöpäsoluja altistetaan FdUrd [35]; erityisesti, mutta näissä tutkimuksissa, ehtyminen glykosylaaseja ei vaikuttanut herkkyys FdUrd. Siksi tutkia käytöstä BER vaikuttaa herkkyyttä HT29 ja FdUrd, käytimme siRNA tyhjentämiseksi XRCC1 ja APE1 kaksi myötävirtaan pääasiallisia osallistujia BER koulutusjakson, ja tutkittiin niiden herkkyyttä FdUrd. Merkittävää on, ehtyminen XRCC1 (Fig. 4) ja APE1 (Fig. S2) herkistyneet solujen FdUrd. Sen sijaan, XRCC1 ehtyminen ei herkistää näiden solujen 5-FU: ta (Fig. 4), mikä osoittaa, että BER ei ole merkitystä edistämisessä solujen eloonjääntiä, käsiteltiin 5-FU: n ja edelleen viittaa siihen, että 5-FU kykenee sen sytotoksista vaikutukset riippumatta DNA: n replikaation tai vaurioita.

HT29 transfektoitu ohjaus (Luc) tai XRCC1 siRNA maljattiin yksittäisinä soluina, altistetaan osoitettujen konsentraatioiden 5-FU tai FdUrd 24 tuntia, pestiin, viljeltiin 10 d, ja värjättiin Coomassie Blue. Transfektoidut solut myös peräkkäin immunoblotattiin varten XRCC1 ja beeta-aktiini (latauskontrollina).

Pieni molekyyli PARP-inhibiittorit herkistää paksusuolensyöpä soluja FdUrd mutta ei 5-FU

Koska XRCC1 ja APE1 ehtyminen herkistyneet paksusuolen syövän soluja FdUrd, ja että PARP on avainasemassa BER, päättelimme, että PARP-inhibiittorit voivat herkistää paksusuolensyöpä soluja FdUrd. Siksi alttiina HCT-8 ja HT29-solujen arvostellaan pitoisuuksia FdUrd tai 5-FU yhdessä 3 uM ABT-888 (veliparib [71]), joka on pitoisuus, joka on raportoitu aikaisemmin herkistää useita tuumorisolulinjoja erilaisia ​​kemoterapeuttisten aineiden [17], [72]. Kuten on esitetty kuviossa. 5, ABT-888 voimakkaasti herkistyneet HCT-8 ja HT29 on FdUrd, kun taas ABT-888 ei muuttanut antiproliferatiivisia vaikutuksia 5-FU. Edelleen osoittamiseksi, että PARP-inhibiittorit herkistää näiden solujen FdUrd, testasimme myös PARP inhibiittori AZD2281 (olaparib [73]), joka on osoittanut ennennäkemättömän aktiivisuutta voimakkaasti esikäsitellystä potilailla, joilla on BRCA1- ja BRCA2-puutteellisia tuumoreita [40] – [43] . Samanlaisia ​​tuloksia nähnyt ABT-888, AZD2281 voimakkaasti herkistyneet molemmat solulinjat FdUrd (Fig. 5), mikä tukee ajatusta, että PARP esto herkistää paksusuolen syöpäsolujen FdUrd.

HCT-8 tai HT29 maljattiin yksittäisinä soluina, altistetaan osoitettujen konsentraatioiden 5-FU tai FdUrd yhdessä 3 uM ABT-888, 300 nM AZD2281, tai ajoneuvon 24 tuntia. Pesun jälkeen 3 uM ABT-888 tai 300 nM AZD2281 tiin uudelleen lisättiin, ja soluja viljeltiin 10 d ja värjättiin Coomassie Blue.

Pienimolekyylinen PARP-inhibiittorin herkistyminen FdUrd on riippumaton MMR tila

Aikaisemmat raportit osoittivat, että soluja, joilla on puutteita MMR ovat vastustuskykyisempiä FdUrd [10], [36] – [38]. Samoin hoidetuilla potilailla 5-FU eivät hyödy 5-FU-pohjainen chemotherapies [39], mikä viittaa siihen, että ehjän MMR reitin edistää tappaminen 5-FU. Koska yhdistetään FdUrd kanssa PARP-inhibiittori voi olla potentiaalinen terapeuttinen strategia, päättelimme, että olisi tärkeää määrittää, kasvainsolujen puutteita MMR, joita esiintyy 15-20% paksusuolen syövistä [39], olivat herkistyneet FdUrd by PARP-estäjä. Arvioimaan, kuinka MMR tila vaikuttaa herkkyyteen paksusuolen syövän solujen FdUrd yksinään ja yhdistelmä FdUrd plus AZD2281 olemme käyttäneet kahta mallia järjestelmiä. Ensimmäistä mallia järjestelmän, käytimme siRNA tyhjentämiseksi MSH2 ja MLH1. Molemmat siRNA: t olivat erittäin tehokkaita, mikä aiheuttaa lähes täydellinen menetys MLH1 ja MSH2 (Fig. 6A) ja häiritsevät MNNG (N-metyyli-N’-nitro-N-nitrosoguanidiini) indusoidun G2 /M pidätys (Fig. S3), joka vaatii toiminnallinen MMR-reitin [51]. Erityisesti HT29 tyhjentynyt MLH1 tai MSH2 ankarasti herkistyneet FdUrd mukaan AZD2281, ja oli vaatimattomasti resistenttejä FdUrd yksin.

(A) HT29 transfektoitu ohjaus (Luc), MSH2 tai MLH1 sRNAs maljattiin yksittäisinä soluina, altistetaan osoitettujen konsentraatioiden 5-FU tai FdUrd 24 tuntia, pestiin, viljeltiin 10 d, ja värjättiin Coomassie Blue. Transfektoidut solut myös peräkkäin immunoblotattiin varten MSH2 tai MLH1 ja beeta-aktiini (latauskontrollina). (B) HCT116.ch2 ja HCT116.ch3 solut altistettiin ilmoitetut pitoisuudet FdUrd yhdessä ajoneuvon tai 300 nM AZD2281 24 tuntia. Pesun jälkeen, AZD2281 uudelleen lisättiin ja soluja viljeltiin 8 d jotta pesäkkeiden muodostumista.

toinen malli järjestelmä, käytimme pariksi paksusuolen solujen linjat, HCT-116.ch2 ja HCT-116.ch3 [51]. Nämä solulinjat olivat peräisin vanhempien HCT-116-solut, jotka ovat bialleelisen inaktivoiva

MLH1

mutaatioita, jotka tekevät ne MMR-puutosta [74]. HCT-116.ch3 solut sisältävät ylimääräisen kromosomin 3, joka koodaa toiminnallista MLH1 joka palauttaa MMR. HCT-116.ch2 soluja, joita käytettiin kontrollina, sisältävät ylimääräisen kromosomin 2 ja kuten vanhempien solut ovat MMR-puutteellisia. Joka on aiemmin julkaistut tulokset, MMR puutteellinen HCT-116.ch2 solut olivat hieman enemmän resistenttejä FdUrd kuin oli HCT-116.ch3 solut (Fig. 6B), jotka ovat MMR taitavia [75]. Erityisesti kuitenkin AZD2281 voimakkaasti herkistyneet molemmat solulinjat FdUrd. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että paksusuolen syövän soluja vikoja MMR reitin voidaan myös herkistetty FdUrd pieni molekyyli PARP-estäjä.

Keskustelu

5-FU on yksi yleisimmin käytetyt syöpälääkitykseen aineita, ja se (tai 5-FU aihiolääke kapesitabiini) on selkäranka kaikki kemoterapiaa järjestelmien hoitoon käytettävä paksusuolensyöpä [1], kolmanneksi yleisin syy syövän liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa [76]. Huolimatta laajaa käyttöä hoidossa paksusuolen syövän, on epäselvää, kuinka tämä aine tappaa koolontuumorisolut. Vastaavasti, FdUrd, joka on usein katsotaan olevan samankaltainen vaikutusmekanismi kuin 5-FU, on myös hoitoon paksusuolen kasvaimia, jotka ovat etäpesäkkeitä maksaan. Jotta saadaan käsitys siitä, miten nämä aineet vaikuttavat koolonkarsinoomasoluissa ensin suorittaa laajat analyysit roolien ATM ja ATR tarkistuspiste signaalireaktioteissä koolonkarsinoomasoluissa altistettiin 5-FU ja FdUrd, ja sitten analysoitiin rooli ryhmäpoikkeusasetuksen koulutusjakson, korjaus polku, joka poistaa urasiili ja urasiili analogeja, jotka sisällytetään genomiin. Olemme aiemmin verrattuna mekanismeja, joilla 5-FU: n ja FdUrd tappaa munasarjasyöpä soluja. Erityisesti kuitenkin 5-FU on hyvin vähän kliinistä tehoaa munasarjasyöpä [49], [50], ja DNA korjaus polkuja, jotka ovat häiriintyneet munasarjasyövän eroavat häiriintyy paksusuolen syöpä. Erityisesti munasarjasyöpiä käyttäytyvät usein ”BRCAness” virheiden vuoksi

BRCA1

tai

BRCA2

tai muu huonosti määriteltyjä muutoksia, jotka häiritsevät homologisesta DNA korjaukseen liittyvä reitti [46]. Sen sijaan, paksusuolen syövät yhteensopimattomuuden korjauksen reitti on usein mutatoitunut tai vaiennettu [39], [48], ja MMR-reitin on raportoitu vaikuttavan solujen tappaminen 5-FU: n ja FdUrd [36] – [38], [77 ], [78]. Siksi tässä raportissa, olemme suorittaneet head-to-head vertailu näiden aineiden MMR-taitavia ja vajausta koolonkarsinoomasoluissa jotka ovat ehtyneet keskeisten tarkistuspiste signalointi ja BER reitin välituotteita. Mikä tärkeintä, nämä mekaaniset tutkimukset ovat paljastaneet uusia oivalluksia miten nämä aineet tappavat koolonkarsinoomasoluissa ja tunnistettu potentiaaliseksi terapeuttiseksi vastaisen strategian paksusuolensyöpä.

Ensinnäkin meidän tutkimukset osoittivat ATR-, mutta ei ATM-tarkastuspiste signalointireittiin näytelmiä on kriittinen rooli helpottaa solujen eloonjääntiä käsiteltiin FdUrd. Vaikka aiemmat tutkimukset dokumentoitu, että FdUrd aktivoi ATM- ja ATR-riippuvaista tarkistuspisteitä [10], [13], [79], nämä tutkimukset eivät verrata vaikutuksia ATM ja ATR heikentämistä selviytymisen syöpäsolujen alttiina molempien aineiden. Tässä olemme käsitelleet tätä kysymystä. Yllättäen huomasimme, että vaikka FdUrd on raportoitu aiheuttavan kaksijuosteisen DNA taukoja [20], [21], ATM on vain vähäinen merkitys FdUrd aiheuttamaa tappamista. Sen sijaan, ATR ehtyminen vakavasti herkistynyt FdUrd, jotka osoittavat, että ATR on kriittinen rooli vakauttamisessa pysähtynyt lisääntymään haarukat ja estää niiden romahtaa, mikä edistää solujen eloonjäämistä, kun soluja käsitellään replikointi estäjiä kuten nukleosidianalogi gemsitabiinin [60]. Näin ollen, esillä oleva tutkimukset viittaavat siihen, että häiriöt DNA: n replikaation, joka tapahtuu, kun TS on lukittu ja myöhempää rikkomista dNTP tasoilla on todennäköisesti merkittävä mekanismi, jonka FdUrd aiheuttaa sytotoksisuutta.

Toiseksi, esillä olevat tulokset auttavat selventämään rooli BER paksusuolen syöpäsoluja altistetaan 5-FU: n ja FdUrd. Aikaisemmat tutkimukset tutkitaan rooli BER reitin ovat löytäneet erilaisia ​​tuloksia, lisääntynyt, vähentynyt tai sellaisenaan herkkyyttä 5-FU tai FdUrd erilaisissa kokeellisissa järjestelmissä [17], [23], [25] – [35]. Sitä vastoin, esillä olevat tulokset osoittavat, että XRCC1 ehtyminen herkistää ja FdUrd, mutta ei 5-FU. Tämä havainto, yhdessä meidän julkaistut tutkimukset osoittavat, että ehjä BER polku suojaa munasarjasyöpäsoluja käsitelty FdUrd [17] osoittaa, että FdUrd aiheutetaan vaurioita, jotka ovat sytotoksisia joitakin ihmisen syöpäsoluja. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, kaksi voimakas ja erittäin spesifinen pienmolekyylisalpaajilla PARP myös herkistyneet FdUrd. Nämä tulokset ovat samanlaisia ​​kuin mitä havaittiin munasarjasyöpäsoluja [17]. Koska kuitenkin munasarjasyöpäsoluja esiintyy usein BRCAness (virheiden vuoksi homologinen rekombinaatio) [46], [80], fenotyypin, joka tekee solut erityisen herkkä PARP-inhibiittorit [81], se pysyi vastaamattoman onko PARP-inhibiittorit olisivat myös herkistää FdUrd paksusuolen syöpäsoluissa, joilla ei ole vikoja homologinen rekombinaatio. On kuitenkin huomattava, että vaikka meidän XRCC1 havainnot tukevat vahvasti suojaava tehtävä BER, vaikutukset PARP-inhibiittorit voivat olla monimutkaisempia. PARP paitsi tärkeä rooli BER mutta osallistuu myös muihin DNA: n korjaukseen väyliä ja solujen signalointireittejä, nostaa mahdollisuus, että valtava herkistymistä nähty PARP-inhibiittorit voivat johtua vaikutuksista BER sekä muita solureiteillä.

Kolmanneksi esillä tutkimukset osoittavat, että heikentävien apikaalisella säätelijöitä Checkpoint signalointi (ATR ja ATM) tai esto keskeinen BER koulutusjakson jäsentä (jossa XRCC1 ja APE1 siRNA tai PARP-inhibiittorit) ei herkistää 5-FU. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että 5-FU kohdistaa sen sytotoksisia vaikutuksia riippumatta sen vaikutuksista DNA lisääntymään tai eheyttä. Erityisesti tämä tulos on yhdenmukainen useiden tutkimuksia, jotka osoittavat, että 5-FU välittää solukuolemaa sisällyttämällä RNA ja häiritsevät RNA aineenvaihduntaa [82] – [89]. Sen sijaan havainto, että poistamalla ATR ja BER väyliä voimakkaasti herkistää ja FdUrd, osoittaa, että tämä aine tappaa koolontuumorisolut ensisijaisesti vaikuttamalla DNA aineenvaihduntaa, mikä osoittaa, että 5-FU ja FdUrd ovat hyvin erilaisia ​​vaikutusmekanismeja.

Lopuksi, ja mikä tärkeintä, näistä tutkimuksista, jotka aloitettiin tunnistamaan tarkistuspisteen ja DNA korjaus reittejä, jotka säätelevät paksusuolen kasvain vastauksia FdUrd ja 5-FU, osoitti, että BER oli kriittinen korjaus koulutusjakson, kun nämä solut altistettiin FdUrd ( mutta ei 5-FU). Näiden havaintojen perusteella, ja se, että PARP-inhibiittorit häiritsevät BER, me sitten huomattiin, että pienimolekyylisiä PARP-inhibiittorit voimakkaasti herkistyneet MMR-puutosta ja -proficient paksusuolen syövän solut FdUrd (mutta ei 5-FU). Nämä havainnot saattavat olla erityisen tärkeää kasvaimissa vikoja MMR, joiden osuus 15-20% kaikista paksusuolen syövistä [39]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että MMR-puutteellinen solulinjoja ovat vähemmän herkkiä 5-FU ja FdUrd. Tämän mukaisesti tulos, kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että 5-FU on rajallinen tehoaa MPR-puutosta koolonsyöpien verrattuna MMR-taitavia kasvaimia [39]. Ottaen huomioon, että 1) FdUrd on hyväksytty hoitoon paksusuolen syöpä; ja 2) on rajallinen terapeuttinen vaihtoehtoja nämä kasvaimet koska kasvainten virheiden MMR yleisesti pidetään vastetta 5-FU-pohjainen hoitoja, meidän toteamisesta PARP-inhibiittorit voimakkaasti herkistävät MMR-vajaiden solujen FdUrd nostaa esiin mahdollisuuden, että hoidot yhdistyvät FdUrd joiden PARP estäjän voi olla aktiivisuus näitä kasvaimia. Vastaavasti, koska PARP-inhibiittorit myös herkistää epäsuhta hallitsee kasvaimia FdUrd, tämä lääke yhdistelmä voi olla käyttökelpoinen myös hoidettaessa näitä kasvaimia. Lisäksi prekliinisen ja kliinisen tuotekehityksen Tämän yhdistelmän on perusteltua.

tukeminen Information

Kuva S1.

Vaikutukset ATR ja ATM häiriöitä koskevat herkkyyttä gemsitabiinin ja ionisoivan säteilyn. (A) ATR ehtyminen herkistää ja gemsitabiinia. HT29 transfektoitu ohjaus (Luc) tai ATR siRNA kokeesta kuvassa. 2B maljattiin yksittäisinä soluina, altistetaan osoitettujen konsentraatioiden gemsitabiinin 24 tuntia, pestiin ja viljeltiin 10 d jotta pesäkkeiden muodostumista. (B) ATM heikentämistä herkistää säteilylle (IR). HT29 transfektoitu ohjaus (Luc) tai ATM siRNA kokeesta kuvassa. 2A maljattiin yksittäisinä soluina, osoitetuilla annoksilla ionisoivan säteilyn, ja viljeltiin 10 d jotta pesäkkeiden muodostumista.