Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vihreä ohran uute (GB) tutkittiin mahdollisia syövän vastaista aktiivisuutta tutkimalla sen antiproliferatiivisia ja pro-apoptoottinen vaikutus ihmisen leukemia /lymfooma solulinjoja. Tuloksemme osoittavat, että GB osoittaa selektiivisiä antiproliferatiivista aktiivisuutta paneelin leukemia /lymfooma solujen verrattuna ei-syöpäsoluja. Erityisesti GB häiritsi solusyklin etenemisen sisällä BJAB, joka ilmenee G2 /M vaiheessa pidätyksen ja DNA pirstoutuminen, ja indusoi apoptoosin, mistä on osoituksena fosfatidyyliseriini (PS) translokaatiota ulomman solukalvon kahden B-sukuperää leukemia /lymfooma solulinjat. Pro-apoptoottinen vaikutus GB havaittiin olevan riippumaton mitokondrion Depolarisaatio, mikä syytetään ulkoisia solukuolemareittejä käyttämään sen sytotoksisuuden. Todellakin, GB sai aikaan kasvua TNF-α tuotanto, kaspaasi-8 ja kaspaasi-3-aktivaation, ja PARP-1 katkaisun ennalta-B akuutti lymfaattinen leukemia Nalm-6 solua. Lisäksi, kaspaasi-8 ja kaspaasi-3-aktivaation ja PARP-1 katkaisun voimakkaasti inhiboi /estetty lisäämällä erityisten kaspaasi-inhibiittorit Z-VAD-FMK ja Ac-DEVD-CHO. Lisäksi solunsisäinen signalointi analyysit määritetään, että GB hoito tehostetun konstitutiivisen aktivaation Lck ja Src tyrosiini- kinaasien Nalm-6 solua. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että GB indusoi etuoikeutettu antiproliferatiivisia ja proapoptoottisiin signaaleja B-sukuperää leukemia /lymfooma solujen, kuten määritetään seuraavien biokemiallisten apoptoosin tuntomerkkejä: PS ulkoistamista, parannettu vapautuminen TNF-α, kaspaasi-8 ja kaspaasi-3 aktivaation, PARP-1 pilkkominen ja DNA: n fragmentoituminen Meidän havainnot paljastavat, että GB on potentiaalia kuin anti-leukemia /lymfooma aine yksinään tai yhdessä standardin syövän hoitojen ja näin optio lisäarviointia

in vivo

kohteeseen tukevat näitä havaintoja.

Citation: Robles-Escajeda E, Lerma D, Nyakeriga AM, Ross JA, Kirken RA, Aguilera RJ, et al. (2013) etsiminen Luontoäidin Anti-Cancer Activity: antiproliferatiivisia ja proapoptoottisiin Effect aikaansaamaa Vihreä ohra on leukemia /lymfooma Cells. PLoS ONE 8 (9): e73508. doi: 10,1371 /journal.pone.0073508

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 22 heinäkuu 2013; Julkaistu: 09 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Robles-Escajeda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitusta tämä työ tarjosi NIGMS SCORE Grant 1SC3GM103713-01 kohteeseen RJA; Edward N. ja Margaret G. Marsh Foundation, Lizanell, ja Colbert Coldwell säätiötä RAK; Avustukset 8G12MD007592 Border Biomedical Research Center (BBRC) ja P20MD002287-06 Hispanic Health erot Research Center (HHDRC) National Institutes vähemmistöasiain terveys- ja terveys, eroavat (NIMHD), osa National Institutes of Health (NIH) . ER-E ja DL tukivat RISE Scholars Program UTEP kautta NIGMS Grant nro R25GM069621-08 ja REU-NSF Grant No. DBI-0851881, vastaavasti. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Maailmanlaajuisesti ohra pidetään myrkytön kasvi [1], joka tuottaa viljanjyvät joka toimii alustana mallas panimoteollisuudessa. Se on myös terve osa erilaisten ruokien ja juomien (leipä, keitot, pataruoat, olut, jne.) Sekä suurten eläinten rehusta. Riippumaton sen viljaa, 10- 12-tuumainen-pitkä nuori ohraa lehdet, kutsutaan myös vihreä ohra, niellään infuusiona ja myös valmistaa ihmisravinnoksi kuin jauhe. Nuoret ohraa lehdet suositellaan ravintolisänä, koska niiden vitamiinit ja kivennäisaineet [2].

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että otteita Kokojyväohra ytimiä esiintyy antioksidantti ja antiproliferatiivisia vaikutuksia paksu- ja peräsuolisyövän Caco -2-solut [3]. Kuitenkin antiproliferatiivista toimintaa vihreät ohraa lehdet vielä selvittämättä. Vihreä ohra tuotteet ovat anti-inflammatorisia ominaisuuksia ja voi moduloida tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α) tuotanto /release ihmisen monosyytti THP-1-soluissa [4]. Samoin toinen tutkimus kertoo, että yhdiste eristettiin vihreät ohran lehtiä hallussaan antioksidantti ominaisuuksia [5]. Lisäksi pienet molekyylit (alle 1 kDa) puhdistettiin vihreä ohran uute (GB) inhiboi TNF-α vapautumisen mononukleaariset solut on saatu nivelreuma (RA) potilaat, viittaa siihen, että GB voi olla luonnollinen lääke antioksidantti ja anti- inflammatorinen aktiivisuus, joka lievittää oireita kärsivien potilaiden RA [6]. Puhdistus suoritettiin käyttäen kehittyneitä menetelmiä kuvaamaan erityisiä yhdisteitä, jotka ovat vastuussa havaittu biologista aktiivisuutta GB. Markham ja Mitchell osoitti, että flavone-c-glykosidit, saponarin ja lutonarin, nuorilta vihreät ohrasta lehdet olivat vastuussa antioksidantti ominaisuuksia [7]. Vastaavasti, biomassat vihreästä ohrakasveilla niillä merkittäviä määriä antioksidantti entsyymit katalaasin ja superoksididismutaasi, samoin kuin ei-entsymaattisten antioksidantteja vitamiinit C ja E [8,9]. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen,

in vivo

tutkimuksissa, joissa oli mukana 36 potilasta ehdotti, että päivittäinen täydentää ohran lehtiä yhdessä antioksidantti vitamiineja (C ja E) pienensi LDL (LDL) -vitamin E sisältöä ja esti pieni tiheä-LDL hapettumisen ja sitä kautta vähentää joitakin suuria riskitekijöitä ateroskleroosin ja suojata tyypin 2 diabeetikoilla vastaan ​​verisuonitaudit [10]. Lisäksi yhdistelmä saponarin /lutonarin (4,5 /1 osa) eristettiin nuorista ohran lehtiä havaittiin antioksidantti vaikutuksia, jotka olivat verrattavissa saatu α-tokoferoli ja butyloitu hydroksitolueeni. [11]

on ehdotettu, että antioksidantti ja anti-syöpä toiminnan hedelmiä ja vihanneksia johtuvat lisäaineen tai synergistinen seuraus niiden monimutkainen seos phytochemical osia [12]. Lisäksi koko polyfenolien murto sisällä karpalot näytteillä tehokkaampia antiproliferatiivista aktiivisuutta verrattuna sen yksittäisten osien, mikä viittaa yhdistetty lisäaine tai synergistinen vaikutus [13]. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvi tuotteita voi toimia solukierron tukahduttaa tekijöille, keskeyttäen aloittamista tai etenemisen vaiheita syövän [14-17]. Lisäksi on havaittu, että syöpäpotilailla on usein nielemään kasvituotteiden lisäksi niiden lääkkeillä [18], joka perustuu oletukseen, että tehtaan tuotteet ovat harmitonta sivuvaikutuksia ja ovat hyvin tutkittu hoitovaihtoehto.

huolimatta näyttöä GB potentiaali tulehduksia välittäjänä, on niukka todisteita sen suorasta antiproliferatiivisia ja /tai sytotoksista aktiivisuutta normaaleja tai transformoituja soluja. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet tutkia anti-proliferatiivista ja sytotoksinen aktiivisuus GB eri leukemia /lymfooma solulinjoja. Tuloksemme osoittavat, että GB on valikoiva antiproliferatiivinen vaikutus useaan leukemia /lymfooma soluja, joilla on vain vähän jos mitään ei-syöpäsoluja. Neljä syöpäsolulinjoissa, pre-B (Nalm-6) ja kypsä-B (BJAB) solut olivat herkkiä GB: n antiproliferatiivista aktiivisuutta. Ensimmäistä kertaa, meidän tutkimus osoitti, että GB johti apoptoottista aiheuttama solukuolema kautta TNF-α release, kaspaasi 8 ja kaspaasi-3 toimintaa, PARP-1 pilkkominen, PS translokaatio, solusyklin pysähtymisen liittyvää DNA: n fragmentoituminen. Nämä tutkimukset tukevat mahdollisen käyttökelpoisuuden GB leukemiaa /lymfooman ja takaa lisätutkimuksia eläinmallissa järjestelmiä.

Materiaalit ja menetelmät

Green ohra uutteita (GB) valmistelu

Green ohra jauhe nuorista lehdistä on

Hordeum vulgare

L., myydään kaupallisesti kasviperäisten täydentää ennakoivana vitamiinien ja kivennäisaineiden (Vitamin Maailman; www.vitaminworld.com), käytettiin. Kuivattu GB jauhe suspendoitiin uudelleen fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS; Life Technologies, Grand Island, NY), jonka pitoisuus on 10% w /v. Uudelleenhydratoitujen jauhe suspensiot altistettiin sitten kolme peräkkäistä jäädytys /sulatus-syklien -80 ° C: ssa /huoneenlämpötilassa, vastaavasti. Sitten näytteet toistuvasti sonikoitiin (Vibra Cell, Sonics and Materials Inc., Newtown, CT) suurimmalla amplitudi 40%, ~ 14 wattia käyttäen ¼ ”mikrokärjellä, jonka 20 sekunnin sonication pulssin jälkeen 30 sekunnin lepo välein , seitsemän peräkkäisen kierrosta. Putkia, jotka sisältävät suspensiota Seoksia pidettiin ennalta jäähdytetty jää-vesihauteessa koko menettelyn estämiseksi lämmitys. Kun oli sentrifugoitu 15000 x

g

30 min, supernatantit otettiin talteen ja suodatetaan aseptisesti, aluksi 0,45 um kalvon huokosia, jota seurasi toinen suodatus 0,22 um: n kalvon huokosten (Cole-Parmer, Chicago, IL). Näytteitä steriiliä PBS ilman GB käytettiin verrokkeina. Lisäksi, kuivapaino GB liukoista materiaalia mitattiin pitoisuuden määrittämiseksi kasvin kuivapainosta, mg /ml, jota käytetään kussakin käsittelyssä. Kolme erää 1 ml sekä GB näytteistä valmistettiin PBS lyofilisoitiin (Labconco 4.5 L pakastekuivaimesta, Stanford, CA) yön yli. Lisäksi alikvootit 1 ml PBS yksinään käytettiin vähentää PBS liuottimen osuus, ja kuivapaino laskettiin. Tyypilliset määrät tässä tutkimuksessa käytetyt ja niiden ekvivalentteja GB on esitetty taulukossa S1.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

neljä ihmisen leukemia /lymfooma solulinjaa käytettiin: YT Natural Killer- kuten [19], kypsän-T akuutti lymfaattinen leukemia Jurkat [20], pre-B akuutti lymfaattinen leukemia Nalm-6 [21], ja kypsä-B Burkittin lymfooma BJAB- [22]. Vertailun vuoksi, yksi solulinja ei-syöpä alkuperää, ihmisen ihon vastasyntyneen esinahan HS27 fibroblastit (HS27, ATCC, Manassas, VA), oli myös mukana. Elatusaineet leukemia /lymfooma (YT, Jurkat, Nalm-6 ja BJAB-) ja fibroblasti (HS27) soluja RPMI ja DMEM (HyClone, Logan UT), tässä järjestyksessä. Molemmat viljelyalustassa, johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (Hyclone), 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä ja 0,25 ug /ml amfoterisiini B: tä (Lonza, Walkersville, MD). Eksponentiaalisesti kasvavat solut, noin 60-75% konfluenssiin, laskettiin ja ympättiin 24-kuoppaisille levyille. Inkubointiolosuhteissa soluista oli 37

° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. Varmistaa korkean elinkyvyn, solut käsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [23].

Anti-proliferatiivinen määrityksessä

Leukemia /lymfooma ja ei-syöpäsolujen ympättiin 24-kuoppalevylle formaatin 1×10

5 solua /kuoppa ja 1.25×10

4 solua /kuoppa 1 ml media, vastaavasti. Sen jälkeen, kun solut altistettiin 50 ul /ml GB 96 tuntia, absoluuttinen solujen lukumäärä millilitraa kohti kvantitoitiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia ja Neubauer-kammiossa (hemosytometriä), arvioida antiproliferatiivista aktiivisuutta verrattuna käsittelemättömiin negatiivisiin kontrolleihin. Kasvavien solujen suspensiota suoraan homogenisoitiin, ja näyte ladattiin hemosytometrillä ja laskettiin. Adherenttien HS27 solujen supernatantti, joka sisältää kelluvien solujen (pääasiassa kuolleet) kustakin kuopasta kerättiin putkeen, kun taas kiinnittyneet solut irrotettiin trypsinoimalla, kuten aikaisemmin on yksityiskohtaisesti [24]. Kelluvat ja kiinnittyneet solut homogenoitiin ja laskettiin, kuten edellä on esitetty. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona neljän rinnakkaisen viljelmän. PBS-käsiteltyihin kontrolleihin, laimennusaineen ja GB, normalisoitiin 100%: iin, ja joita käytetään viitteenä laskea prosentteina GB-käsiteltyjen solujen lisääntymisen.

sytotoksisuutta seurataan vitaaliväri propidiumjodidia syrjäytymisen määritys

määrällistä sytotoksisuuden, solun kerättiin, värjättiin kalvo-läpäisemätön väriaine propidiumjodidi (PI) ja seurataan elävien solujen tilassa

kautta

virtaussytometria (Cytomics FC500, Beckman Coulter, Miami , FL). Tämä määritys identifioi yhden PI-positiivisten solujen kanssa häiritsi solukalvojen, joita pidetään kuolleita soluja. Noin 10.000 tapahtumat kerättiin jokaisesta näytteestä ja analysoitiin kuten aiemmin on raportoitu [25]. Positiivisena antiproliferatiivista /sytotoksisten valvontaa, solut altistettiin 1 mg /ml G418: aa, joka on proteiinisynteesi-inhibiittorin. Lisäksi, negatiivisina kontrolleina, soluja käsiteltiin yhtä tilavuudella GB pelkkää laimennusainetta, PBS, ja käsittelemättömät solut olivat mukana samanaikaisesti kulttuureissa. Tietojen hankinnan ja analyysi suoritettiin käyttäen CXP ohjelmistoa (Beckman Coulter).

Solusyklianalyysiä mittaamalla solujen DNA-sisällön

analyysi solun DNA-pitoisuuden ja solusyklin jakautuminen suoritettiin PI värjäystä ja seuranta sen fluoresenssia

kautta

virtaussytometria. Vaikutus GB mahdollisena solusyklin disruptor tutkittiin asynkroninen BJAB- solulinjassa jälkeen 96 h inkubaation. Solut ympättiin 24-kuoppalevylle, viljeltiin, kuten on kuvattu edellä ja kerättiin, kuten aikaisemmin on yksityiskohtaisesti [24]. Solutumat valmistettiin käyttäen DNA-Prep Coulter reagenssit kit (Beckman Coulter), seuraten valmistajan ohjeita. Lyhyesti, solut kerättiin ja sentrifugoitiin 262xg 5 minuuttia. Supernatantti heitettiin pois ja sen jälkeen solupelletit suspendoitiin varovasti uudelleen alhaisen nopeuden vortex käyttäen 100 ui DNA-Prep lyysin ja läpäiseväksi reagenssia (pesuainetta), minkä jälkeen lisättiin 400 ui DNA-Prep tahra-reagenssia (50 ug /ml PI: n ja 4 kU /ml RNaasi). Sen jälkeen näytteitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa pimeässä 60 minuutin ajan, jota seurasi virtaussytometria-analyysi (LSRII, BD Biosciences, San Jose, CA). Positiivisena kontrollina solujen solusyklin pysähtymiseen, kaksi itsenäistä koetta suoritettiin, jossa solut altistettiin 1 mg /ml G418: aa ja 80 nM etoposidi (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) 96 tuntia. Kontrollina epäspesifistä vaikutuksia, laimentimen GB, PBS (10 ja 50 ui), jotka sisältyvät koenäytteiden, oli mukana. Käsittelemättömiä soluja käytettiin kontrolleina. Prosenttiosuudet solujen eri DNA-pitoisuus jakaumat määritettiin histogrammin portteja sub-G0 /G1, hypodiploid; G0 /G1, diploidinen; S, hyperdiploid; ja G2 /M, tetraploidi. Gating levitettiin jättää dupleteiksi. S-vaihe populaatio määritellään prosenttiosuutena solujen DNA-sisällön välillä G0 /G1 (diploidi) ja G2 /M (tetraploideja). Lisäksi tämän tyyppinen analyysi on käytetty sen kyky havaita apoptoosia liittyvän DNA: n fragmentoituminen-kuvion yhden solun tasolla, mikä ilmenee kasvua sub-G0 /G1 solujen alaryhmästä [26]. Jotta deconvolute DNA sisällön histogrammeja, FACS Diva (BD Biosciences) tai FlowJo (Puu Star, Ashland, OR) ohjelmisto hyödynnettiin.

analyysi fosfatidyyliseriinin (PS) jakeluun solukalvoissa

tutkii, onko häiriö solukalvon PS epäsymmetria on mukana mekanismi solukuoleman aiheuttama GB, solut seurattiin

kautta

virtaussytometrialla, kun kaksi värjäytymistä anneksiini V-FITC: llä ja PI. Solut siirrostettiin 24-kuoppaisille levyille t tiheydellä 100,000 solua per kuoppa 1 ml: ssa viljelyalustaa. Yön yli inkuboinnin jälkeen solut käsiteltiin 50 ui GB tai PBS vielä 48 h ja 96 h, ja Nalm-6 ja BJAB, vastaavasti. Solut otettiin talteen, pestiin kylmällä PBS: llä ja käsitellään sen jälkeen, kun valmistajan ohjeiden (Beckman Coulter). Lyhyesti, solut värjättiin liuoksella, joka sisälsi seosta, jossa oli anneksiini V-FITC: ja PI-100 ul: aan sitoutumispuskuria, inkuboitiin jäissä pimeässä 15 minuutin ajan, minkä jälkeen lisättiin 400 ui jääkylmää sitomispuskuria ja analysoitiin välittömästi

kautta

virtaussytometrialla (Cytomics FC 500; Beckman Coulter). Kokonaisprosenttiosuus apoptoottisten solujen määriteltiin summana sekä varhaisen ja myöhäisen vaiheen apoptoosin (anneksiini V-FITC positiivinen), ylä- ja oikeassa neljännesten vuonna virtaussytometrianalyysin piste tontteja, vastaavasti. Kunkin näytteen, 10.000 tapahtumaa kerättiin ja analysoitiin käyttämällä CXP ohjelmisto (Beckman Coulter). Jokainen kokeellinen kohta ja valvonta arvioitiin nelinkertaisesti.

Live-solujen havaitseminen intrasellulaarisen kaspaasi-3 aktivaation

kysteiini-asparagiiniproteaaseilla (kaspaasi) -3 aktivaation Nalm-6 GB käsiteltyjä soluja mitattiin käyttäen fluorogeenistä NucView 488 kaspaasi-3 sarja elävien solujen (Biotium, Hayward, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut näytetään vihreän fluoresenssin signaalia seurattiin

kautta

virtaussytometrialla (Cytomics FC500). Solut ympättiin 24-kuoppalevylle muodossa kuin edellä on kuvattu ja altistettiin 6 tuntia ja 8 tuntia 50 ul: GB uutetta. Useat kontrollia sisällytettiin tässä sarjassa kokeita: solut käsiteltiin 8 h GB uutetta altistettiin 10 uM Ac-DEVD-CHO (DEVD, N-asetyyli-Asp-Glu-Val-Asp-aldehydi), joka on tehokas, spesifinen ja palautumaton estäjä kaspaasi-3: [27], ennen kuin lisättiin NucView alustalle; solut, joita käsiteltiin 8 tunnin ajan 2 ug /ml kamptotesiini, tunnettu apoptoosin indusoija

kautta

kaspaasi-3-aktivaation [26], positiivisena kontrollina; ja käsittelemättömiä soluja käytettiin negatiivisena kontrollina. Tietojen keruu ja analysointi kaspaasi-3-positiivisten solujen suoritettiin käyttäen CXP ohjelmistoa.

Western blot-analyysi PARP-1 pilkkominen

lohkaisu poly (ADP-riboosi) polymeraasi-1 (PARP-1) arvioitiin Western blottauksella yksityiskohtaisena aiemmin [28]. Lyhyesti, 50 ui tai 100 ui GB lisättiin 1×10

5 Nalm-6 solua 1 ml: ssa mediassa ja niitä inkuboitiin 24 h. Positiivisena kontrollina PARP-1 pilkkominen induktio, 2 ug /ml kamptotesiini käytettiin. Voimakas estäjä kaspaasi-3, Ac-DEVD-CHO (20 uM), lisättiin soluihin samanaikaisesti GB osuuden määrittämiseksi kaspaasi-3 PARP-1 pilkkominen. Yhtä suuret määrät solun uutteiden, 100 ug proteiinia per kaista Laemmli-pelkistyspuskuria, erotettiin käyttämällä 10% mini-geelillä (Bio-Rad, Hercules, CA) ja SDS-PAGE. Proteiinikonsentraatiot solu-uutteet määrällisesti kanssa bikinkoniini- hapon proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford, IL). Elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin geelistä päälle polyvinylideenifluoridia (PVDF) kalvo (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) kuten aiemmin on kuvattu [29]. Seuraavaksi PVDF-membraanille blot-blokattiin 5% (w /v) kuorittua maitojauhetta TBST 1 h. Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin: kanin anti-PARP-1 (Cell Signaling, Danvers, MA) ja kanin anti-β-aktiini (Sigma, St. Louis, MO), joka oli laimennettu 1: 1000 ja 1: 3000 blokkausliuoksella. Anti-PARP-1 reagenssi tunnistaa täyspitkä PARP-1 (116 kDa), sekä sen suuri fragmentti (89 kDa). Sitten, immunoblotattiin proteiinit on leimattu primaarinen vasta-aine hybridisoitiin HRP-konjugoitua vuohen anti-kani (1: 3000 laimennos, Sigma). Liikkuvuutta molekyylipainomerkkiaineiden on määritelty. Blotteja käsiteltiin tehostetun kemiluminesenssin reagenssilla (Millipore, Billerica, MA) ja valotettiin röntgen- kalvot (Phenix, Candler, NC) proteiinin kaistan visualisointi. Valokuvia kehittyneissä elokuvista otettiin käyttäen geeliä dokumentaatiojärjestelmän (Alpha Innotech, San Leandro, CA).

Polychromatic analyysi mitokondrion kalvon potentiaali (

Δ

Ψm) B

Nalm-6-soluja käsiteltiin 50 ul: GB ja inkuboitiin 4 h, kuten edellä. Sitten solut värjättiin 2 uM fluoroforin 5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodidia (JC-1) seuraten valmistajan ohjeita (Life Technologies, Grand Island , NY). Häiriöitä mitokondrioiden

ΔΨm

on osoituksena huomattava siirtymä fl uorescence signaali punaisesta vihreäksi. JC-1 aggregaatit tai monomeerejä, säteilevät punaista tai vihreää signaalia, tunnistettiin

kautta

fl ow cytometry (Cytomics FC500) avulla FL2 tai FL1 ilmaisimia, vastaavasti. Positiivisena kontrollina protonin ionofori, joka haihtuu mitokondrion

ΔΨm

, karbonyyli syanidia 3-chlorophenylhydrazone (CCCP, 50 uM), on käytetty. Solut, jotka käsitelty GB laimentimen (PBS) ja käsittelemättömän soluja käytettiin kontrolleina. Tietojen kerääminen ja analysointi suoritettiin käyttäen CXP ohjelmistoa.

Luminex multiplex analyysi

Nalm-6 solua ympätään monikuoppalevyä altistettiin 25 ja 50 ul /ml GB 3 h ennen solujen pelletit ja elatusaineet supernatantit kerättiin sentrifugoimalla. Soluviljelmän supernatantit kustakin näytteestä analysoitiin sitten määrittää tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α) ja liukoisen Fas-ligandin (SFA-L) sytokiinien tasoja, seuraten valmistajan suosituksen (Millipore, Billerica, MA). Lisäksi, solujen pelletit pestiin PBS: llä ja lyysattiin Milliplex MAP soluviestitykseen hajotuspuskuria, joka sisältää proteaasi-inhibiittoreita (Millipore, Billerica, MA). Proteiini kvantitatiivinen suoritettiin käyttäen BCA-reagenssia (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL). MILLIPLEX MAP Human Src-ryhmän kinaasia, Kit (Millipore, Billerica, MA) käytettiin havaitsemaan fosforyloidun Lck (Tyr394), Src (Tyr419), Fyn (Tyr420), Blk (Tyr389) ja FGR (Tyr412), 25 ug kokonais- solulysaatti mukaan valmistajan ehdottaman protokollan. Target proteiinit analysoitiin helmi-pohjainen xMAP (multianalyte profilointi) tekniikka on Luminex 200 alusta (FlexMAP 3D järjestelmä, Millipore, Billerica, MA) yhdistettynä xPONENT 3.1 ohjelmisto (Luminex, Austin, TX) mukaisesti valmistajan ehdottaman protokollan (Millipore ). Jokainen kokeellinen kohta ja kontrollit tehtiin kolmena rinnakkaisena.

reaaliaikainen havaitseminen solunsisäisten kaspaasin 8 aktivaation

kaspaasi-8 aktivaation Nalm-6 solua määritettiin käyttämällä solun läpäisevä ja peruuttamattomasti sitovan kaspaasi-8-estäjä leimattu fluoreseiini, FITC-IETD-FMK, ja seurataan

kautta

virtaussytometria [30]. Solujen 24-kuoppalevyformaatissa, ympättiin tiheydellä 100,000 solua per kuoppa 1 ml: ssa kasvun elatusaineita, altistettiin 10 ja 50 ul /ml GB 4 h ja sen jälkeen inkuboitiin FITC-IETD-FMK reagenssia , värjäystä varten, seuraava valmistajan protokollan (Abcam, Cambridge, MA). Seuraavat säätimet hyödynnettiin: 50 ui GB ote samanaikaisesti lisätty yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK (Abcam) 20 uM, joka estää sitoutuminen FITC-IETD-FMK; 2 mM H

2O

2, positiivisena kontrollina kaspaasin 8 aktivaation; 50 ui PBS: ää liuottimena valvonta; ja käsittelemättömien solujen negatiivisena kontrollina. Solu jakaumat vihreitä fluoresenssisignaalisuhteet analysoitiin käyttämällä FL-1 ilmaisin. Tietojen hankinta ja analysointi kaspaasin 8-positiivisten solujen suoritettiin käyttäen CXP ohjelmistoa (Beckman Coulter).

Tilastollinen

Kukin datapiste tehnyt vähintään kolme kertaa. Osoittamaan kokeellisen vaihtelevuuden, data ilmaistiin myös keskiarvoa vastaava keskihajonta. Kaksisuuntainen pariksi Opiskelijan

t

-testaukset tehtiin laatia tilastolliset merkitystä eroista kokeiluista ja niitä vastaavat ohjaimet. Tarkoittamaan onko vertailuissa kaksi hoitoja on tilastollista merkitystä, arvo

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

GB vähentynyt leviämisen leukemia /lymfooma solujen

Aluksi tutkimme mahdollisia antiproliferatiivista aktiivisuutta GB syövän ja ei- syövän alkuperä solut mittaamalla kokonaismäärä solujen jälkeen 96 h. GB-käsitelty leukemia /lymfooma solujen oli tilastollisesti merkittävä väheneminen niiden kokonaismäärät (

P

0,05; kuvio 1). Normalisoinnin jälkeen PBS-käsiteltyihin kontrolleihin 100%, prosenttiosuus leviämisen GB-käsiteltyjä soluja laskettiin. GB kohdistetaan gradienttia proliferaation inhibition on leukemia /lymfooma-soluja, mikä vähentää solujen lisääntymistä 73% on Nalm-6, 40% on BJAB, 34,5% YT ja 24,7% Jurkat-soluja (kuvio 1A-D). Kiinnostavaa kyllä, tämä antiproliferatiivista aktiivisuutta ei merkittävästi vaikuta leviämisen HS27 ei-syöpäsolujen (kuvio 1 E). Lisäksi B-linjan Nalm-6, ja BJAB olivat eniten soluja (kuvio 1A-B). Näin ollen, nämä solulinjat käytettiin edelleen kokeita tutkia mekanismia taustalla GB solutoksisuuteen. Tähän mennessä meidän havainnot viittaavat siihen, että GB hallussaan etuoikeutettu suppressioaktiivisuutta leukemia /lymfooma solujen lisääntymisen.

kokonaismäärät solua ml (

y

-akselin) kvantitoitiin hemosytometrillä jälkeen 96 h hoito: (A) Nalm-6, (B) BJAB, (C) YT NK-like, (D) Jurkat ja (E) HS27-soluja. Positiivisena kontrollina anti-proliferatiivinen vaikutus, 1 mg /ml G418: aa oli mukana. Käsittelemättömiä soluja käytettiin indikaattorina solujen elinkelpoisuuden aikana kaikki inkubaatioajan aikana. Lisätarkastuksia laimentimesta Uutteiden PBS, tutkittiin. Kukin pylväs keskiarvoa neljän toiston ja virhepalkkien edustavat keskihajonta. Soluproliferaatiota, selityksin yläosan 50 ui GB käsitellyissä soluissa, on esitetty prosentteina solujen leviämisen PBS-käsitellyistä soluista, jota pidetään 100% kasvu. Viisikymmentä ui GB PBS vastaa 1,5 ± 0,048 mg /ml lyofilisoitua jauhetta.

GB aiheuttaa sytotoksisuus ennalta B akuutti leukemia /lymfooma Nalm-6 solua

Samanaikainen kanssa määräarviota solujen lukumäärän, päätimme siitä GB aiheuttamaa sytotoksisuutta. Yllättäen, sytotoksisuus havaittiin ainoastaan ​​Nalm-6-soluja, mutta ei BJAB, YT, tai Jurkat-soluja (kuvio 2A-D), mikä tarkoittaa, että havaittu anti-proliferatiivista aktiivisuutta ei välttämättä liity sytotoksisuutta. Lukuun ottamatta Nalm-6, elinkelpoisuus leukemia /lymfooma solulinjoja johdonmukaisesti muistuttivat arvot PBS-käsitellyt tai käsittelemättömien kontrollien (kuvio 2). Samoin ei ole sytotoksisuutta havaittiin myös normaaleissa ei-syöpä peräisin olevia soluja (kuvio 2E).

jälkeen 96 h inkubaation, toksisuutta havaittiin (A) Nalm-6-solut; kun taas (B) BJAB-, (C) YT, (D) Jurkat ja (E) ei-syöpä HS27 solut olivat resistenttejä tälle myrkyllinen vaikutus. Solut värjättiin PI ja prosenttiosuus sytotoksisuuden (

y

-akselin) seurattiin virtaussytometrianalyysin menetelmällä. Positiivisena kontrollina sytotoksisen aktiivisuuden, 1 mg /ml G418: aa käytettiin. Käsittelemättömiä soluja käytettiin indikaattorina solujen elinkelpoisuuden koko inkuboinnin ajan. Laimennin on GB uutetta, PBS, analysoitiin myös. Kukin pylväs keskiarvoa neljän toiston ja virhepalkkien edustavat keskihajonta. 1 x 10

4 tapahtumaa kohti näytettä hankittiin ja analysoitiin käyttämällä CXP ohjelmistoa (Beckman Coulter). Viisikymmentä ui GB PBS vastaa 1,5 ± 0,048 mg /ml lyofilisoitua jauhetta.

GB saa aikaan DNA: n fragmentoituminen ja G2 /M pidätyksen BJAB

Cell cycle jakelu analyysit tehtiin tulkita tarkemmin mekanismi, joka GB käyttää inhiboimaan soluproliferaatiota. Tätä tarkoitusta varten BJAB solut altistettiin 10 ja 50 ui GB 96 tuntia ja sitten ne valmisteltiin analysointia varten solun DNA-pitoisuus

kautta

virtaussytometrialla. Tämä menetelmä perustuu fluoresoiva koettimia, jotka sitovat DNA, jolloin koko DNA-pitoisuus per ydin on seurattava tarkasti [31]. Merkityksellisiä eroja solusyklin jakautuminen havaittiin soluissa, joita käsiteltiin 50 ul: GB, kun taas 10 ui GB-käsiteltyjä soluja, eivät osoittaneet merkittävää muutosta solun taajuuden kaikkien solusyklin vaiheissa (kuvio 3A-D). Solut, joissa apoptoottista hajanainen DNA voidaan erottaa toisistaan ​​hypodiploid DNA sisältöä (sub-G0 /G1peak) aikana univariate solun DNA sisällön analyysi. Hypodiploid arvot nousi 11,8% soluissa, joita käsiteltiin 50 ul Gt, kun taas näytteissä altistuneet 10 ui GB, PBS: ää tai käsittelemättömiä valvonta, hypodiploid arvot olivat alle 1% (

P

= 0,01173; Kuva 3). 25,4% G0 /G1 arvo GB käsiteltyjä soluja väheni merkitsevästi (

P

0,04) verrattuna 40,1% ja 39% PBS-käsitellyn ja käsittelemättömän solut, vastaavasti. Erot taajuus solujen S-vaiheessa oli huomaamaton. Prosenttiosuus soluja G2 /M-vaiheen GB-käsitellyissä soluissa oli 43,7%, mikä oli korkeampi verrattuna joko solut, jotka oli käsitelty PBS: llä, 37,5%, tai käsittelemättömien kontrollien, 37,1% (

P

= 0,01945 ja

P

= 0,02426, vastaavasti).

Kun 96 tunnin GB aiheuttama apoptoottisen DNA: n fragmentoituminen ja G2 /M vaiheessa pidätyksen annoksesta riippuvaa liikennemuotojen. Solut kerättiin, läpäiseviksi ja värjättiin ja analysoitiin

kautta

virtaussytometria. Kukin pylväs keskimäärin kolme riippumatonta rinnakkaista, ja virhepalkkien edustavat vastaava keskihajonta. (A-D) prosenttiosuus solun taajuus piirretään pitkin

y

akselin, ja erilaisia ​​hoitoja on piirretty pitkin

x

akselilla. (E-I) edustaja yksi parametri histogrammit jossa neljä portit selityksin näytteille prosenttiosuus solun taajuuden kunkin vaiheen solusyklin. Gates vasemmalta oikealle: sub-G0 /G1 (hypodiploid; lasketaan apoptoottisen alaryhmästä), G0 /G1 (diploidi), S (hyperdiploid) ja G2 /M (tetraploidi). Tämän koesarjan mukana useita tarkastuksia: kaksi yhdisteet provosoi solukierron muutos, (G) 80 nM etoposidi (ETO) ja (H) 1 mg /ml G418; (F) GB laimentimen, PBS, jotka sisältyvät koenäytteiden; ja (I) käsittelemätöntä (Unt) solut, negatiivisena kontrollina. Merkitystä erot 50 ui GB-käsitellyissä soluissa verrattuna 50 ui PBS-käsitellyistä soluista, ja myös, jossa käsittelemättömät solut, on

P

0,03 (*) ja

P

0,04 (‡), vastaavasti. GB 10 ui = 0,3 ± 0,009 mg /ml, ja GB 50 ui = 1,5 ± 0,048 mg /ml lyofilisoitua jauhetta.

GB herättää fosfatidyyliseriinin ulkoistamiseen B-sukuperää olevien solujen linjat

kaksi B-linjaa solulinjoja altistettiin GB erottaa sen potentiaalia induktio fosfatidyyliseriinin (PS) ulkoistamista. Tämä seurattiin

kautta

anneksiini V-FITC /PI määritys ja virtaussytometria. Sen määrittämiseksi, ovatko GB sytotoksisuus kohdistuu Nalm-6 solua sisälsi myös PS: suoritettiin kokeita 48 tunnin kuluttua inkubaation 50 ui Gt. Tänä ajankohtana, 37,2% soluista oli apoptoottisia, ja 24,9% ja ja soluja nekroottinen (kuvio 4A). Solut käsiteltiin 50 ui PBS: ää ja käsittelemättömistä soluista ei osoittanut huomattavaa lisäystä joko apoptoottisten tai nekroottisen arvot (kuvio 4C-D). Lisäksi kasvua apoptoottisten DNA: n fragmentoituminen havaittiin GB-käsiteltyjen BJAB tutkittiin tarkemmin samoissa olosuhteissa, joita sovellettiin solusyklin analyysi.