Krooninen sairaus

tiivistelmä

Up-sääntely apoptoosin-säätelygeenin

Mcl-1

(myeloidisolun leukemia-1) esiintyy eri syöpätyyppejä ja liittyy lääkeaineen vastustuskykyä syövän hoitomuotoja. On hyvin tunnettua, että Mcl-1 pre-mRNA: n läpikäy vaihtoehtoisen silmukoinnin tapahtumia tuottaa kaksi toiminnallisesti erillistä proteiineja, Mcl-1

S (pro-apoptoottinen) ja Mcl-l

L (anti-apoptoottisen); Jälkimmäisessä isoformi on hallitseva eri syöpiä, kuten rinta- ja munasarjasyövän soluja. Tässä tutkimuksessa raportoimme, että RNA-sitovan proteiinin (RBP) ja proto-onkogeenin SRSF1 (seriini ja arginiini-rikas silmukointi tekijä 1) vaikuttaa silmukoinnin Mcl-1 sekä MCF-7 ja MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen ja JAR koriokarsinoomasolut; osoitamme myös, ensimmäistä kertaa, että toinen RBP SRSF5 vaikuttaa silmukoinnin Mcl-1 MCF-7-soluissa. Lisäksi me raportoimme että SRSF1 on mukana muita näkökohtia Mcl-1 sääntely kanssa knockdovvn SRSF1, RNAi, jolloin vähentynyt merkittävästi Mcl-1-proteiinin tasot MCF-7-soluissa, mutta kasvu JAR-soluissa, vastaavasti, jonka saattavat vaikuttaa proteiinin vakauteen ja kääntäminen Mcl-l. Keskeiset tutkimuksen tulokset korostavat matkapuhelinverkon yhteydessä eri syöpäsoluja varten monitoimilaitteiden RBPs kuten SRSF1 ja vaikuttavat hoitomenetelmät palveluksessa kohdistaa Mcl-1.

Citation: Gautrey HL, Tyson -Capper AJ (2012) asetus Mcl-1 SRSF1 ja SRSF5 syöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (12): e51497. doi: 10,1371 /journal.pone.0051497

Editor: Justin L. Mott, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 01 marraskuu 2012; Julkaistu: 17 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Gautrey, Tyson-Capper. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat myönnetty avustus päässä JGW Patterson Foundation ja täydentävän rahoituksen Newcastle Healthcare Charity (RVI /NGH) ja Newcastle Hospitals NHS Charity (FH). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Apoptoosi tai ohjelmoitu solukuolema on tärkeä prosessi mukana normaalin kehityksen ja kudosten homeostaasin, ja sen sääntelyn purkaminen voi aiheuttaa syöpää. Merkittävä osa apoptoosin tekijöiden on osoitettu säätelevän vaihtoehtoisen silmukoinnin; tämä sisältää Bcl-2-proteiinin perheen, joka ohjaa sisäisiä (mitokondrion) solukuolemareittiin [1], [2], kuviossa 1A. Bcl-2-perheen sisältää sekä pro-apoptoottisen ja anti-apoptoottiset proteiinit, ja se on näiden kahden välinen tasapaino, joka määrittää, onko reitti aktivoituu [3], [4]. Bcl-2-perheen voidaan jakaa kolmeen ryhmään niiden rakennetta ja toimintaa. Antiapoptoottista Bcl-2 proteiinit sisältävät useita Bcl-2 homologia (BH) verkkotunnuksia ja niin ovat rakenteeltaan samankaltaisia ​​kuin Bcl-2, joka on myös tämän ryhmän jäsen. Pro-apoptoottinen Bcl-2-proteiinien on jaettu kahteen alaryhmään, ensimmäinen ryhmä ovat myös rakenteeltaan samankaltaisia ​​kuin Bcl-2, jossa on useita BH verkkotunnuksia, ja sisältävät proteiinit Bak ja Bax. Toinen ryhmä proapoptootti- proteiinit sisältävät vain BH3 domain. Apoptosis laukeaa, kun pro-apoptoottisten proteiinien Bak ja Bax aiheuttaa mitokondrion ulkokalvon permeabilisation. Antiapoptoottista Bcl-2-perheen jäseniä estämään tämän sitoutumalla proapoptoottiseen proteiinien Bax ja Bak. BH3: een vain proteiinit voivat aktivoida apoptoosin läpi kaksi reittiä ensinnäkin suoraan aktivoinnin Bak ja Bax, ja toiseksi sitoutumalla antiapoptoottinen proteiineja, jossa vapautettiin Bak ja Bax.

Mcl-1 on jäsen Bcl-2 perheen apoptoosisäätelijät. Yliekspressio Mcl-1 on löydetty laaja valikoima syöpää kudosten [5], [6], [7], sekä syövän solulinjat [8]. Lisäksi lisääntyneen ekspression Mcl-1 on yhteydessä huonoon ennusteeseen rintasyövän [9]. MCL-1 näyttää myös olevan tärkeä tekijä osallisena vastustuskyvyn syövän hoitomuotoja, ja sen downregulation on osoittautunut tehokkaaksi aiheuttamaan apoptoosin [7], [10], [11], [12].

Mcl-1

geeni sisältää kolme eksonia, ja se koodaa kahta proteiinia, anti-apoptoottisten Mcl-1

L ja pro-apoptoottisten Mcl-1

S [13], [14]. Täyspitkä transkripti, joka sisältää kaikki kolme eksonia koodaa Mcl-1

L, joka sisältää BH1, 2, ja 3 sekä TM verkkotunnuksen. Tämä johtaa anti-apoptoottinen Bcl-2-proteiinia tuotetaan. MCL-1

S on toisen eksonin saumattu ulos joka johtaa alavirran muutos lukukehyksessä jättäen vain BH3 domain jäljellä (kuvio 1 B). Mcl-1

S näyttää käyttää sen pro-apoptoottinen vaikutus samalla tavalla kuin muita BH3 vain proteiineja sitomalla anti-apoptoottisten Bcl-2-proteiinien, ja erityisesti pl-1

S sitoutuu vain Mcl -1

L [13], [15].

kytkin toissijaisesti silmukoinnin MCL-1 on toistaiseksi osoitettu tapahtuvan rinta- ja munasarjasyövän, jossa siellä on kasvuun antiapoptooppinen Mcl-1

L isoformi syövän kudoksissa [16]. Tästä huolimatta hyvin vähän tiedetään mekanismi, joka säätelee kytkin silmukoinnin tai silmukointi tekijä osallistuvien proteiinien sisällyttäminen tai poissulkeminen toisen eksonin. Tähän mennessä vain kaksi jäsentä SR-proteiinin perheen, SRSF1 ja 3, on tunnistettu, jotka vaikuttavat vaihtoehtoisen silmukoinnin Mcl-1 [17]. Jossa merkitystä Tämän tutkimuksen useita erilaisia ​​liitos tekijöitä on osoitettu olevan muuttunut ilmentyminen syövän kudoksissa [18]; näitä ovat SRSF1 [19] ja SRSF3 [20], jotka on ylössäädelty monenlaisia ​​syöpiä ja on todettu proto-onkogeenien, ja SRSF5 joka on yli-ilmentynyt rintasyövän [21].

Tavoitteena tämän työn tarkoituksena oli tutkia, miten Mcl-1 säännellään syöpäsoluissa ja tunnistaa solun RNA sitovia proteiineja (RBPs) mukana edistämässä sisällyttäminen toisen eksonin

Mcl-1

geeni. Tämä saavutettiin käyttämällä geenispesifistä pudotus on erilaisia ​​RBPs seuraa mittaus tasojen jatkoksen-spesifisten isomuotojen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Kaksi eri syöpäsolulinjoissa alun perin valittiin tähän tutkimukseen (kuvio 2), rintasyöpä adenokarsinooma MCF-7-soluja (kuvattu, jolla on alhainen hyökkäyksen fenotyyppi

in-vitro

) ja istukkasyöpä JAR-solut; toinen rintasyöpäsolulinja MDA-MB-231-soluja (kuvattu ottaa invasiivisen fenotyypin

in-vitro

) lisättiin tutkimuksen vertailun (ATCC, LCG). MCF-7 ja MDA-MB-231-soluja ylläpidettiin DMEM (Sigma-Aldrich), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia, L-glutamiinia ja penisilliiniä streptomysiiniä. JAR-solut ylläpidettiin RPMI-1640 (ATCC, LCG), joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia ja penisilliiniä streptomysiiniä. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2. Soluja käsiteltiin 20 nM rapamysiini, 35 ug /ml sykloheksimidiä tai 1 ug /ml proteaasi-inhibiittorin (Sigma-Aldrich), jossa on ilmoitettu.

(A) luontainen (mitokondrion) solukuolemareittiin on ohjattu by Bcl-2-proteiinin perheen, mukaan lukien BH3 vain proteiinit, anti-apoptoottisten Bcl-2-proteiinien, Bax, Bak ja Bid. (B)

Mcl-1

geeni koostuu kolmesta eksonien; antiapoptoottinen Mcl-1

L ja pro-apoptoottinen Mcl-1

S-proteiinin isoformeja johtuvat osallisuutta ja eksonin 2 (avoin laatikko), tässä järjestyksessä.

Top paneeli esittää Mcl liitos isoformien kaupallisesti saatavissa JAR solulysaatti, MCF-7-soluissa ja JAR-soluja. Detektio western blottauksella Mcl-1 silmukointivariantit, SRSF1-6 ja kuormituksen valvonta GAPDH 40 ug kokosolulysaattia MCF-7: n ja JAR-soluissa.

Gene pudotus RNAi

Kaikki solut käänteisessä transfektoitu Silencer® Select siRNA (Ambion, taulukko 1),

Äänenvaimennin

® Negative Control siRNA (Ambion),

Äänenvaimennin

® Valitse GAPDH Positive Control siRNA (Ambion ) ja SIPORT ™

NeoFX

™ transfektio Agent (Ambion) käyttäen seuraavaa protokollaa optimoitu valmistajan ohjeiden. 5,9 x 10

4 MCF-7-solujen ja 4 x 10

4 JAR-solut maljattiin kuhunkin kuoppaan 24-kuoppalevyllä. JAR-solut transfektoitiin 4 ul /ml ja MCF-7 ja MDA-MB-231-solujen kanssa 2 ul /ml SIPORT ™

NeoFX

™ transfektio agent; kaikki solut transfektoitiin 6 nM siRNA. Solut ja siRNA inkuboitiin yhdessä 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. RNA kerättiin 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen, ja proteiini kerättiin 72 tuntia transfektion jälkeen. Kaikissa kokeissa tasoilla pudotus RNAi arvioitiin RNA ja proteiini tason PCR: llä ja immunoblottauksella, kuten on kuvattu.

Western immunoblottaus

Solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ja sitten kerättiin RIPA-puskurissa (25 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% natriumdeoksikolaatti ja 0,1% SDS) proteiinin määrän, minkä jälkeen lisättiin näytepuskuria ja sitten kuumadenaturoitiin 95 ° C 5 minuutin ajan. Proteiini lysaatit erotettiin käyttämällä 12% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE), geelit ja siirrettiin elektroforeettisesti päälle nitroselluloosakalvoille. Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan PBS: llä, joka sisälsi 10% kuivattua maitojauhetta, ja tutkittiin joko hiiren anti-Mcl-1 (1:500, Santa Cruz), kanin anti-GAPDH (1:1000, Santa Cruz), hiiren anti- SF2 /ASF (1:1000, SRSF1, Zymed), kanin anti-SC35 (1:100, SRSF2, Abgent), hiiren anti-SRp20 (1:1000, SRSF3, Zymed), kanin anti-SRp75 (1:500, SRSF4, Abcam), vuohen anti-SRp40 (1:500, SRSF5, Zymed), kanin anti-SRp55 (1:2000, SRSF6, Aviva Systems Biology) yön yli 4 ° C: ssa. Pesun jälkeen PBS sopiva HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta laimennettu PBS lisättiin. ECL tai Super Signal Femto ECL (Pierce) käytettiin proteiinien havaitsemiseen. Milloin on osoitettu, Densitometrinen analyysi suoritettiin käyttäen UVP geeliä dokumentaatiojärjestelmän ja kvantifiointiin suoritetaan käyttämällä ImageJ ohjelmistoa. Tiedot analysoitiin jälkeenpäin käyttäen yksisuuntaista ANOVA Tukeys ”monivertailutestillä.

RNA: n eristäminen ja Semi-kvantitatiivinen RT-PCR

Yhteensä-RNA uutettiin RNeasy spin pylväät (Qiagen) ja käsiteltiin DNaasi I (Qiagen) seuraavien valmistajien ohjeita. Yksi ug kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen oligo (dT) alukkeita ja Superscript II Reverse Transcriptase (RT) (Invitrogen, Life Technologies). PCR: t suoritettiin cDNA-spesifisiä alukkeita (taulukko 2), ja PCR master mix (Promega). Alukkeet Mcl-1 suunniteltiin joko puolelle eksonin 2, jotta he voisivat osoittaa sekä Mcl-1

S ja Mcl-1

L ja erottaa nämä kaksi isoformia koon. (Kuvio 3A). Negatiiviset kontrollit, josta puuttui RT valmistuksen aikana cDNA otettiin mukaan seurata genomista saastumista. CDNA-tuotteet erotettiin elektroforeesilla 1,5% (w /v) agaroosigeelissä, visualisoitiin UV seuraavat etidiumbromidivärjäyksellä.

MCF-7-solut transfektoitiin SRSF1-6, Tra2β, SREK1, GAPDH (G ) ja negatiivinen kontrolli (NC) siRNA: t, tai vehikkeliä (lipidejä) vain (V), tai jätettiin hoitamatta (UT). (A) Semi-kvantitatiivinen RT-PCR osoittaa sekä Mcl-1 saumattu variantteja. (B) Semi-kvantitatiivinen RT-PCR osoittaa knockdovvn RNA sitovia proteiineja 48 tunnin kuluttua transfektion siRNA. (C) Semi-kvantitatiivinen RT-PCR osoittaa tasot Mcl-1 liitos isoformit (Mcl-1

L ja Mcl-1

S) ja lastaus valvonta GAPDH 72 tunnin kuluttua transfektion siRNA. (D) Mcl-1

L tasot mitattiin reaaliaikaisella PCR samasta näytteestä on esitetty (B). (E) Mcl-1

S tasot mitattiin reaaliaikaisella PCR samasta näytteestä on esitetty (B). (F Mcl-1

S tasot näytteessä replikaatissa mitattuna reaaliaikainen PCR (keskiarvo (n = 3) ± SEM). ** P≤0.01; * P≤0.01.

Real-Time PCR

Reaaliaikainen PCR suoritettiin cDNA käyttämällä inventaarioluettelossa TaqMan® määrityksiä (Applied Biosystems) ja TaqMan® Universal Master Mix II (Applied Biosystems). Taqman valittiin jotka olivat spesifisiä kukin silmukointivarianteista MCL-1, kun alukkeet suunniteltiin ulottumaan eksonin rajoja kunkin silmukointivariantti (Mcl-1

S – eksonin raja 1-3, Mcl-1

L – eksoni raja 1- 2), ja Taqman GAPDH määritys valittiin endogeeninen kontrolli. määritys suoritettiin quadruplet ja PCR-monistus suoritettiin käyttäen OneStepPlus reaaliaikainen PCR-järjestelmää (Applied Biosystems). Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena vähintään kolme itsenäisen kokeen.

miRNA eristäminen ja Reaaliaikainen PCR

Yhteensä-RNA uutettiin TRIzol®, saostettiin 100% etanolia ja sen jälkeen puhdistettiin RNeasy spin pylväät (Qiagen) käyttäen vain puskurin RPE. Kokonais-RNA eluoitiin pylväistä RNaasi vapaata vettä. Käänteiskopiointireaktio suoritettiin 10 ng kokonais-RNA käyttäen TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), ja sekvenssin, erityisten RT alukkeita TaqMan® Small RNA-määritykset (Applied Biosystems) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Erillinen käänteistranskriptio-reaktiot suoritettiin kunkin TaqMan® Small RNA Pitoisuus joka RNA-näytettä. Reaaliaikainen PCR suoritettiin cDNA käyttämällä inventaarioluettelossa TaqMan® Pieni RNA-määritykset ja TaqMan® Universal Master Mix II (Applied Biosystems). Määritys suoritettiin kolmena kappaleena ja PCR-monistus suoritettiin käyttäen OneStepPlus reaaliaikainen PCR-järjestelmää (Applied Biosystems).

Apoptosis Assay

MCF-7-solut käänteinen transfektoitiin siRNA 96 kuoppalevyille, ja sitten inkuboitiin 48 tuntia. MCF-7-solut käsiteltiin sitten topoisomeraasin inhibiittori, etoposidi, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, soluja inkuboitiin seerumin nälkiinnyttämisalustassa (1% FCS), 18 tunnin ajan, jota seuraa käsittely 200 uM Etoposidi (Sigma Aldrich) 6 tunnin ajan [22]. Kaspaasi-tasot mitattiin sitten käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 määritystä (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti yhtä suuret tilavuudet kaspaasi-Glo 3/7 reagenssia lisättiin kuoppiin ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 1 tunti ja sitten luminesenssi mitattiin luminometrillä (BMG).

Tulokset

Mcl -1 Splice isoformit ja SR proteiinit solulinjoissa

RBPs valvontaan osallistuvien vaihtoehtoisen silmukoinnin tapahtuma Mcl-1 tutkittiin sekä JAR ja MCF-7-soluissa. Perusteet käyttää näitä kahta solulinjaa perustui oletukseen, että ne ovat eri ilmaisua profiilit Mcl-1

L ja Mcl-1

S. JAR solut tuottavat sekä Mcl-1

L ja Mcl-1

S, kun taas MCF-7-solut vain tuottavat suuria määriä Mcl-1

L (kuvio 2, yläpaneeli). Solulysaatteja samasta solulinjoissa (kuvio 2), arvioitiin myös ilmentymisen valikoima RBPs (SR proteiineja, SRSF1-6), tiedetään olevan osallisena silmu- valinta ja ennustetaan olevan otaksutun RNA-sitoutumiskohtien eksonin 2 on

Mcl-1

geeni (https://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder). Vertailuja ekspressiotasoja näiden SR proteiinien MCF-7 ja JAR solulinjat osoittivat vain lievää SRSF2, 3 ja 6, MCF-7-solut. Huolimatta siitä, että vastaavia ekspressiotasoja, nämä SR proteiinit voivat silti olla mukana vaihtoehtoisen silmukoinnin MCL-1, koska toiminta SR proteiinien ohjataan niiden yhteenlaskettu ydin- keskittyminen ja aktivoinnin valtioiden lisäksi niiden yleistä proteiinin tasot.

mRNA tasot Mcl-1 Splice isoformien jälkeen knockdovvn RNA sitojaproteiinit

tunnistamiseksi RBPs mukana sisällyttäminen toisen eksonin Mcl-1, siRNA käytettiin pudotus ehdokas proteiineihin MCF -7-soluja. RBPs SRSF1, 2, 5, 6 ja SR säätelyproteiinin SREK1 (SFRS12) oli kaksi eri siRNA, joka oli suunnattu niiden järjestys ottaa SRSF3, 4 ja Tra2β oli yksi siRNA. Tärkeä seikka oli ensin tarkistaa, että knockdown yksittäisten SRSFs RNAi ei vaikuttanut ilmaus muiden perheenjäsenten (kuva S1). Kuvio 3B osoittaa pudotus on RBPs MCF7-soluissa 48 tuntia transfektion jälkeen, ja osoittaa, että mRNA kunkin RBP väheni vähintään yksi siRNA. Ensimmäinen näyttö vaikutuksesta siRNA-välitteisen knockdovvn sekä puolikvantitatiivinen PCR (kuvio 3C) ja reaaliaikainen PCR (Kuva 3D ja 3E) osoitti, että 72 tuntia transfektion tasoja Mcl-1

S lisääntynyt kun solut köyhdytetty SRSF1 (1 ja 2) ja SRSF5 (1); kasvoi hieman Mcl-1

S havaittiin myös, kun Tra2β tasot alenivat siRNA. Vaikka toinen siRNA että kohdennetut SRSF5 (2) eivät tuottaneet vastaavaa lisäystä Mcl-1

S: n knockdovvn SRSF5 ei ollut yhtä tehokas kuin SRSF5 (1) siRNA. Tasot Mcl-1

L RNA mitattiin myös (kuvio 3C ja 3D), mutta koska ekspressiotasot Mcl-1

L-mRNA oli niin korkea pieniä muutoksia tuottama kytkintä liittämiseen ei havaittu yleistä mRNA ilmaisun. Kun ensimmäinen näyttö siRNA: iden knockdowns toistettiin SRSF1 (1 ja 2) ja SRSF5 (1) siRNA (n = 3), ja kuvio 2F esittää merkittäviä säätely ylöspäin Mcl-1

S mRNA 72 tuntia transfektion jälkeen näiden siRNA osaksi MCF-7 solulinja.

arvioimiseksi, jotka RBPs ovat mukana tässä vaihtoehtoisen silmukoinnin tapahtuma JAR soluissa, sama paneeli siRNA: iden käytettiin pudotus RBPs näissä soluissa. Kuvio 4A esittää knockdown saavuttaa näillä siRNA JAR soluissa 48 tuntia transfektion jälkeen. Kytkin silmukoinnin arvioitiin mittaamalla mRNA-tasot ja Mcl-1 semi-kvantitatiivisen PCR: (kuvio 4B) ja reaaliaikainen PCR (kuvio 4C ja 4D), 72 tunnin jälkeen. Tulokset osoittavat suuren kasvun tason Mcl-1

S jälkeen SRSF1 olivat tippuu alas joko SRSF1 (1) tai SRSF1 (2). MCL-1

L tasot mitattiin myös valkokankaalle, mutta kuten MCF-7-solujen ei havaittu mitään muutosta, koska korkeat MCL-1

L-mRNA läsnä. Tulosten validointiin alkuperäisen kuvaruudun knockdowns kanssa SRSF1 (1 ja 2) toistettiin (n = 3) ja kasvoi merkittävästi tasojen Mcl-1

S mRNA jälkeen knockdovvn SRSF1 (kuvio 4E).

JAR-solut transfektoitiin SRSF1-6, Tra2β, SREK1, GAPDH (G) ja negatiivinen kontrolli (NC) siRNA: t, tai vehikkeliä (lipidi) vain (V), tai jätettiin käsittelemättä (UT) . (A) Semi-kvantitatiivinen RT-PCR osoittaa knockdovvn RNA sitovia proteiineja 48 tunnin kuluttua transfektion siRNA. (B) Semi-kvantitatiivinen RT-PCR osoittaa tasot Mcl-1 liitos isoformit (Mcl-1

L ja Mcl-1

S) ja lastaus valvonta GAPDH 72 tunnin kuluttua transfektion siRNA. (C) Mcl-1

L tasot mitattiin reaaliaikaisella PCR samasta näytteestä on esitetty (B). (D) Mcl-1

S tasot mitattiin reaaliaikaisella PCR samasta näytteestä on esitetty (B). (E) Mcl-1

S tasot näytteessä replikaatissa mitattuna reaaliaikainen PCR (keskiarvo (n = 3) ± SEM). * P≤0.01.

Protein tasot Mcl-1 Splice isoformien jälkeen knockdovvn RNA sitojaproteiinit

onko kytkin silmukoinnin havaittiin mRNA käännettiin proteiineja, immunoblottauksella käytettiin määrittämään ekspressiokuviota Mcl-1

L ja Mcl-1

S MCF-7 ja JAR soluja. On syytä huomata, että tasojen Mcl-1

S ja Mcl-1

L-proteiineja ei voida visualisoida, kvantifiointiin tarkoituksiin, samaan valotusajan (kuva S4) johtuen alhainen endogeenisen Mcl- 1

S. Knockdovvn SRSF1 ja SRSF5 MCF-7-solut on esitetty kuviossa 5A yhdessä tuloksena tuotannon pieniä määriä Mcl-1

S, jäljitellä havainnot MCL-1

S mRNA (kuvio 3B ja 3D). Proteiini tasojen Mcl-1

L on myös esitetty jälkeen knockdown. Tasot Mcl-1

L hoidon jälkeen SRSF5 siRNA eivät muutu merkittävästi valvontaa, mikä on sopusoinnussa mRNA tasot Mcl-1

L jälkeen SRSF5 taintumisen (kuvio 3B ja 3C). Mielenkiintoista, tasot Mcl-1

L merkittävästi vähentää, kun SRSF1 pudotettiin kontrolleihin verrattuna MCF-7-soluissa. Tämä vähennys havaittu proteiinin tasojen ei havaittu Mcl-1

L-mRNA (kuvio 3B ja 3C), joten väheneminen SRSF1 voidaan vaikuttaa käännöksen tai vakautta Mcl-1 sekä vaihtoehtoisen silmukoinnin tapahtuma. Alustavat tiedot immuunisaostuskokeissa ehdottaa SRSF1 voi sitoutua Mcl-1-mRNA MCF-7-solut (kuva S3 ja menetelmät S1); Tämä havainto on sopusoinnussa aiempien todisteita siitä, että SRSF1 proteiini: Mcl-1-RNA-kompleksit on olemassa [17].

(A) MCF-7-solut transfektoitiin SRSF1 (1 ja 2), SRSF5 (1 ja 2 ), GAPDH (G) ja negatiivinen kontrolli (NC) siRNA: t, tai vehikkeliä (lipidejä) vain (V), tai olivat käsittelemättömiä (UT). SRSF1, 5, Mcl-1 ja GAPDH-proteiinin tasot määritettiin immunoblottauksella 72 tuntia transfektion jälkeen kanssa siRNA: t, käyttämällä 30 ug kokosolulysaattia. Histogrammit osoittavat densitometristä analyysi Mcl-1

L ja Mcl-1

S-proteiinin ilmentymisen. Data on esitetty keskiarvona ± SEM. ** Osoittaa P≤0.01; * Tarkoittaa P 0,05. (B) JAR-solut transfektoitiin SRSF1 (1 ja 2), GAPDH (G) ja negatiivinen kontrolli (NC) siRNA: t, tai vehikkeliä (lipidi) vain (V), tai oli käsittelemätön (UT). SRSF1, Mcl-1 ja GAPDH-proteiinin tasot määritettiin immunoblottauksella 72 tuntia transfektion jälkeen kanssa siRNA: t, käyttäen 30 ug kokonais-solulysaattia. (C) Kun transfektio SRSF1 (1) ja NC siRNA MCF-7-soluja käsiteltiin 200 pM etoposidin tai DMSO-kontrollin 6 tuntia. Apoptoosin induktio määritettiin mittaamalla caspase3 /7-aktiivisuus. * Tarkoittaa P 0,05.

Kuvio 5B esittää vaikutusta proteiinin tasot Mcl-1-hoidon jälkeen SRSF1 siRNA JAR-soluissa. Yhdenmukainen mRNA tuloksiin, vähennykset SRSF1 tasoilla johti kasvuun proteiinin taso Mcl-1

S. Sen sijaan, Mcl-1

L-proteiinin tasot nousivat hoidon jälkeen SRSF1 siRNA, kun vastaava mRNA tulokset eivät osoittaneet mitään muutosta tason jälkeen pudotus (kuvio 4B ja 4C). Näin ollen, toisin kuin MCF-7 solulinja, Mcl-1

L-proteiinin tasot nousivat vastauksena SRSF1 siRNA vähentämisen sijaan, tämä lisäys ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 4B). Nämä havainnot osoittavat, että SRSF1 voi olla mukana muita näkökohtia Mcl-1 sääntelyä kuten translaation valvontaa tai proteiini vakautta JAR soluissa. Proteiini tasojen Mcl-1

L ja Mcl-1

S kun niitä oli pudotus muiden RBPs käytetty RNA näytön sekä MCF-7: n ja JAR-soluissa, mutta ei todettu mitään muutoksia (tietoja ei esitetty).

tutkimme seuraavaksi knockdovvn SRSF1, mikä johti näin dramaattisen muutoksen Mcl-1

L ja Mcl-1

S-proteiinin suhdeluvut MCF-7-solut, voi vaikuttaa apoptoosin induktioon. Ensin suoritettiin MTT-määritys sulkea pois mahdollisuutta, että solujen lisääntymistä ja solujen elinkelpoisuus voi vaikuttaa knockdovvn SRSF1 MCF-7-solut (kuva S2 ja menetelmät S2). Apoptoosi indusoitiin sekä negatiivisen kontrollin ja SRSF1 (1) siRNA käsitellyissä soluissa käsittelemällä etoposidin (200 uM), ja mitataan arvioimalla tuloksena kaspaasi 3/7 aktiivisuutta (kuvio 5C). Prosentuaalinen kasvu kaspaasi 3/7 aktiivisuus oli hieman korkeampi, kun knockdovvn SRSF1 osoittavat suurempaa apoptoosin induktion.

vaikutus SRSF1 Knockdown vakaus- ja kääntäminen Mcl-1

L

Mcl-1 sisältää useita tähteiden N-terminaalinen alue, joka voi läpikäydä translaation jälkeinen modifikaatio, kuten ubikinaation ja fosforylaatio [23]. Nämä muutokset voivat vaikuttaa vakauteen Mcl-1-proteiini. Näin ollen, olemme meni arvioida vakautta Mcl-1-proteiini, kun pudotus on SRSF1 kahden solulinjoissa. Sykloheksimidikäsittelylle käytettiin estämään proteiinin translaation ja Mcl-1

L-proteiinin tasot arvioitiin seuraavien 7 tuntia. Kuvio 6A esittää hyvin samankaltainen häviämistä Mcl-1

L MCF-7-solujen käsittelyn jälkeen SRSF1 siRNA verrattuna negatiiviseen kontrolliin siRNA. Tämä viittaa siihen, ettei muutosta vakautta Mcl-1

L jälkeen knockdovvn SRSF1 MCF-7-solut. Sitä vastoin käsittely JAR solujen sykloheksimi- (kuvio 6B) johti hieman hitaammin menetyksen Mcl-1

L jälkeen knockdovvn SRSF1, mikä osoittaa, että voi olla hieman lisääntynyt Mcl-1

L proteiinin stabiiliuden.

(A) MCF-7 ja (B) JAR-solut transfektoitiin SRSF1 (1 ja 2) ja negatiivinen kontrolli (NC) siRNA. Kolme päivää transfektion jälkeen soluja käsiteltiin 35 ug /ml sykloheksimidiä ja proteiini kerättiin sen jälkeen, kun 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 5 ja 7 tuntia arvioimaan proteiinin stabiilisuuteen. MCL-1

L-proteiinin tasot mitattiin sitten immunoblottauksella. (C) MCF-7-solut transfektoitiin SRSF1 (1 ja 2), GAPDH (G) ja negatiivinen kontrolli (NC) siRNA, tai vehikkeliä (lipidi) vain (V), tai oli käsittelemätön (UT). 48 tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin 20 nM rapamysiinin vielä 24 tuntia. Western blotting käytettiin sitten arvioida proteiinin tasot SRSF1, Mcl-1

L ja GAPDH. (D) mir-29b tasot mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä JAR ja MCF-7 solulinjoissa (keskiarvo (n = 3) ± SEM), ** P≤0.01. Knockdovvn SRSF1 MCF-7-soluissa (E): n ja JAR-solujen (F) määritettiin semi-kvantitatiivinen RT-PCR-menetelmällä SRSF1 (1) ja negatiivinen kontrolli (NC) siRNA (ylempi paneeli). Tasot mir-29b mitattiin reaaliaikaisella PCR SRSF1 (1) ja negatiivinen kontrolli (NC) siRNA käsiteltiin MCF-7-solut (E) ja JAR soluja (F) yhdessä GAPDH (G) siRNA, ajoneuvo ( lipidi) vain (V), ja käsittelemättömän (UT) soluja (alempi paneeli) (keskiarvo (n = 3) ± SEM).

Kuten lasku tasot Mcl-1

L MCF-7-soluissa sen jälkeen, kun SRSF1 pudotus ei näytä olevan vaikuttavat proteiinin stabiilisuutta, se voi olla translaation vaikutus. SRSF1 on jo osoitettu olevan osallisena mTOR translaation aloituksen, joissa sen läsnäolo RNA tulosten tehostettu rekrytointi mTOR kompleksin mRNA [24], [25], [26], [27], [28]. Lisäksi, Mcl-1 on myös osoitettu olevan translaation ohjataan mTOR ja mTOR signalointireitin [24], [25], [26], [27], [28]. Tutkia tätä, MCF-7-soluja käsiteltiin mTOR-estäjä rapamysiini. Kuva 6C vahvistaa väheneminen Mcl-1

L hoidon jälkeen rapamysiinin ja näyttää tämän väheneminen Mcl-1

L olevan samanlaisia ​​kuin jälkeen SRSF1 knockdown. Lisäksi lisätään rapamysiinin että SRSF1 pudotus solut eivät aiheuta enempää lasku tasot Mcl-1

L.

Tuoreessa raportissa on myös ehdottanut toista mekanismia, jolla SRSF1 voi ohjata käännös kautta käsittely miRNA [29]. Yksi miRNA tunnistaa näiden voimistunut jälkeen yliekspressio SRSF1 oli mir-29b. Tämä miRNA on jo osoitettu olevan osallisena translationaalinen eston Mcl-1 [30]. Tässä valossa me hypoteesi havaittua kasvua Mcl-1

L-proteiinin tasot JAR solut voivat osittain johtua alentuneesta mir-29b. Koska knockdovvn SRSF1 MCF-7-solut eivät osoittaneet samanlaista tasojen nousu MCL-1

L-proteiinia, mutta itse asiassa se laski, emme odota mir-29b olla mukana säätelyssä Mcl -1

L MCF-7-soluissa. Tämän seurauksena ensimmäisen tason mir-29b voidaan olettaa olevan suurempi JAR-soluissa verrattuna MCF-7-soluissa. Tämän tutkimiseksi mir-29b mitattiin käsittelemättömän JAR ja MCF-7-solujen reaaliaikaisella PCR (kuvio 6D). Tämä osoitti, vastoin odotuksia, että tasot mir-29b olivat merkitsevästi korkeammat MCF-7-soluissa verrattuna JAR soluihin. Sen arvioimiseksi, onko knockdovvn SRSF1 vaikutti tasoja mir-29b, kuten yli-ilmentyminen on aiemmin osoitettu tehdä tätä [29], siRNA käytettiin pudotus SRSF1 MCF-7-solut (kuvio 6E) ja JAR-solut (kuvio 6F). Knockdown alun perin suoritettiin MCF-7-solut, koska ne osoittivat korkeinta alkuperäistä tasoa mir-29b (kuvio 6D). Vaikka hoito transfektioreagenssi yksinään tuntui johtaa vähenemiseen mir-29b MCF-7-solut, knockdovvn SRSF1 oli vain vähän vaikutusta tasot mir-29b molemmissa solutyypeissä verrattuna negatiivisen kontrollin siRNA transfektoidut solut ( Kuvio 6E ja 6F).

asetus MCL-1 SRSF1 ja 5 tutkittiin myös toisessa rintasyövän solulinjaa käyttämällä MDA-MB-231-solujen, kuvataan olevan invasiivisen fenotyyppi

in vitro

. Endogeeninen Mcl-1-proteiinin tasot arvioitiin western blottauksella (kuvio 7A), mikä osoittaa, että MDA-MB-231-solut ilmentävät pääasiassa Mcl-1

L-proteiinia isoformin, mutta paljon matalammalla tasolla kuin MCF-7-soluissa. Sen määrittämiseksi, onko sama RBPs ovat mukana silmukoinnin Mcl-1 MDA-MB-231-solujen siRNA vastaan ​​SRSF1 ja 5 käytettiin heikentävistä soluihin näiden kahden proteiinin. Kuvio 7B esittää vähentää RNA-tasot SRSF1 ja 5 48 tunnin kuluttua, ja myöhemmin tasojen nousu ja Mcl-1

S mRNA 72 tunnin jälkeen. Reaaliaikainen PCR-analyysi toistettiin transfektioista osoitettiin myös merkittävää voimistumista Mcl-1

S mRNA 72 tuntia transfektion jälkeen sekä SRSF1 ja 5 siRNA. Proteiini tasot mitattiin myös immunoblottauksella jälkeen knockdovvn SRSF1 ja 5. Kuvio 7C esittää kaataa of SRSF1 ja 5 proteiinit 72 tuntia transfektion jälkeen. Koska alhainen Mcl-1

L ja Mcl-1

S MDA-MB-231-solulinja Super Signal Femto ECL havaitsemiseen käytettiin kahta isoformia, mutta tämä ei havaittu merkitsevää muutosta kahdessa isoformia jälkeen knockdovvn SRSF1 tai 5, joka tosin on vähentynyt hieman Mcl-1 proteiinia jälkeen knockdown sekä SR proteiineista (kuvio 7C). Koska mTOR reitti näyttää olevan tärkeä säätelyssä Mcl-1 MCF-7-solut tämä tutkittiin myös MDA-MB-231-soluja. Rapamysiini käytettiin estämään mTOR reitin tässä solulinjassa, mutta dramaattinen väheneminen, joka havaittiin MCF-7-solujen rapamysiinin hoitoon ja SRSF1 knockdown ollut yhtä ilmeistä kanssa MDA-MB-231-soluja.

(A) Detection of Mcl-1 silmukoitumisvariantit ja GADPH proteiinien MCF-7 ja MDA-MB-231 käyttämällä 40 ug kokosolulysaattia molemmista solutyypeistä. Histogrammit osoittavat densitometristä analyysi Mcl-1

L ja Mcl-1

S-proteiinin ilmentymisen. Data on esitetty keskiarvona ± SEM. (B) Semi-kvantitatiivinen RT-PCR osoittaa knockdovvn RNA sitovia proteiineja 48 tunnin kuluttua transfektion siRNA. MDA-MB-231-solut transfektoitiin SRSF1, GAPDH (G) ja negatiivinen kontrolli (NC) siRNA: t, tai vehikkeliä (lipidi) vain (V), tai jätettiin käsittelemättä (UT). Semi-kvantitatiivinen RT-PCR osoittaa tasot Mcl-1 liitos isoformit (Mcl-1

L ja Mcl-1

S) ja lastaus valvonta GAPDH 72 tunnin kuluttua transfektion siRNA. MCL-1

S tasot näytteessä replikaatissa mitattuna reaaliaikainen PCR (keskiarvo (n = 3) ± SEM).