Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peräsuolen syöpä (CRC) on edelleen yksi tärkeimmistä syövän tyypit ja syöpään liittyvä kuolema maailmanlaajuisesti. Herkät, ei-invasiivisia biomarkkerit, jotka voivat helpottaa sairauden havaitsemista, lavastus ja ennustaminen hoitotulokseen ovat erittäin toivottavaa parantaa eloonjäämisaste ja auttaa määrittämään optimoituja hoitoa CRC. Pieni ei-koodaavat RNA: t, MikroRNA (miRNA), on äskettäin tunnistettu kriittisiksi säätimet erilaisia ​​sairauksia kuten syöpää, ja ne voivat edustaa uutta luokkaa syövän biomarkkereita. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa ja vahvistaa kiertävä MikroRNA ihmisen plasmassa käytettäväksi sellaisenaan biomarkkereita paksusuolen syöpä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käyttämällä kvantitatiivista käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio, huomasimme, että kiertävä miR-141 oli merkitsevästi yhteydessä vaiheen IV paksusuolen syövän kohortin 102 plasmanäytteistä. Vastaanotin toimii (ROC) analyysiä käytettiin arvioimaan herkkyys ja spesifisyys ehdokas plasman microRNA markkereita. Havaitsimme, että yhdistelmä miR-141 ja syöpä -antigeeni (CEA), laajalti käytetty merkkiaine CRC, edelleen parantaa tarkkuutta havaitseminen. Näitä havaintoja validoitu riippumattomalla kohortin 156 plasmaa kerättävien Tianjinissa, Kiinassa. Lisäksi meidän analyysi osoitti, että korkeat plasman miR-141 ennustettu huono selviytymistä sekä kohortteja ja että miR-141 oli itsenäinen ennustetekijä pitkälle paksusuolensyöpä.

Johtopäätökset /merkitys

ehdottavat, että plasma miR-141 voi edustaa uutta biomarkkereiden joka täydentää CEA havaitsemisessa paksusuolensyöpä kaukaisiin etäpesäkkeitä ja että korkea miR-141 plasmassa olivat yhteydessä huonoon ennusteeseen.

Citation: Cheng H, Zhang L , Cogdell DE, Zheng H, SCHETTER AJ, Nykter M, et al. (2011) Circulating plasma- MiR-141 on uusi biomarkkeri metastasoituneen paksusuolen syövän ja ennustaa huono ennuste. PLoS ONE 6 (3): e17745. doi: 10,1371 /journal.pone.0017745

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu 15. lokakuuta, 2010 Hyväksytty: 11 helmikuu 2011; Julkaistu 17. maaliskuuta 2011

Copyright: © 2011 Cheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tukee avustusta National Foundation for Cancer Research (WZ ja SRH) ja Tianjin Cancer Institute ja sairaalan (KC). Hanyin Cheng tukivat Pharmacoinformatic Training Grant apurahan NIH (NIH Grant nro R90 DK071505-05). Tietojen ja Näytekokoelmatodistuksen tukivat M. D. Anderson University Cancer Fund, Center for Clinical and Translational Sciences, University of Texas Health Science Center at Houston, ja NIH Cancer Center Support Grant CA16672. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on maailmanlaajuinen terveysongelma 655000 kuolemantapausta vuodessa [1]. Yhdysvalloissa, CRC on kolmanneksi yleisin syöpä tyyppi ja toiseksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman [2], oli arviolta 51370 kuolemantapausta vuonna 2010 mukaan National Cancer Institute. Kiinassa CRC edelleen viidenneksi yleisin syöpä tyyppi ja neljänneksi yleisin syy syöpään liittyvät kuolemat [3]. Huolimatta varhaisen seulonnan ja uusien kemoterapeuttisten strategioita, CRC eloonjäämisluvut aikana viimeisten 20 vuoden aikana ole merkittävästi parantunut. Lisäksi esiintyvyys CRC kasvaa nopeasti viime vuosina Kiinassa [4]. Uusien biomarkkereiden jotka ovat kliinistä arvoa on siis välttämätöntä parantaa vaatimustenmukaisuusasteisiin. Karsinoembryonaalinen antigeeni (CEA) on käytetty seerumin merkkiaine CRC, vaikka sen herkkyys on vaihdellut eri tutkimuksissa [5], [6]. Äskettäin perheen pieniä sääntely-RNA: iden, MikroRNA, on tullut mahdollista plasma merkkiaineita ihmisen sairauksia kuten syöpää johtuen niiden suhteellisen vakauden verenkierrossa [7].

MikroRNA ovat pienet ei-koodaavat RNA: t (18- 22 nt pitkiä), jotka säätelevät ilmentymistä kohdegeenien häiritsemällä transkriptio tai estämällä käännös [8]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että MikroRNA ratkaisevassa asemassa lähes kaikissa solu- biologisissa prosesseissa kuten aineenvaihdunta, selviytyminen, erilaistumisen ja apoptoosin. Vapauttaminen erityisiä MikroRNA edistää erilaisia ​​sairauksia, erityisesti kehittymistä ja etenemistä syövän, mukaan lukien CRC. Erityisesti microRNA ilmentymisen profilointi CRC osoitti, että useita MikroRNA, mukaan lukien miR-21, miR-20a ja miR155 ilmentyivät kasvainkudoksissa, ja että suurempi miR-21 on yhteydessä huonoon hoitotulokseen [9], [10]. Mahdollinen kiertävän miRNA plasmassa syöpä biomarkkereita arvioitiin myös muutamissa tutkimuksissa. CRC, tuore tutkimus kertoi, että miR-92-tasot olivat merkittävästi korkeammat Plasmanäytteissä potilaiden kuin myös terveiden ja voi olla mahdollinen merkkiaine CRC havaitsemiseksi [11]. Tutkimus plasmanäytteistä eturauhassyöpään potilaista ilmoitti, että plasma miR-141 tasoja voidaan käyttää seulomaan metastaattisen eturauhassyövän suurella herkkyydellä [12].

Tässä proof-of-periaate, jolla selvitettiin mahdollisia biomarkkereita CRC, tutkimme onko valittu ehdokas MikroRNA voisi toimia ei-invasiivisia, veripohjaisten merkkiaineita CRC analysoimalla suhteellinen taso kolme MikroRNA (miR-21, miR-92, ja miR-141) in kohortin 102 plasman näytteitä terveiltä yksilöiltä ja CRC potilaat on saatu TexGen, yhteistyö- Texas Medical Center toimielimille. Alkuperäistä tulokset osoittivat, että näiden kolmen MikroRNA, plasma miR-141 tasot olivat merkittävästi kohonnut plasman paksusuolen syövän potilaille, joilla on vaiheen IV tauti ja voidaan helposti erottamaan etäpesäkkeiden tapauksia normaaleihin kontrolleihin ja potilailla, joilla on muissa vaiheissa. Yhdistelmä miR-141 CEA oli täydentäviä ja voivat lisätä havaitsemisen tarkkuutta etäpesäkkeiden paksusuolen syöpä. Näitä havaintoja validoitu riippumattomalla kohortin 156 plasmanäytteet saadaan Tianjinissa, Kiinassa. Meidän lisäanalyysejä edellyttäen todisteet siitä, että plasma miR-141 oli mahdollinen ennustetekijä ennustavat huono selviytymisen paksusuolen syöpäpotilaiden. Mielenkiintoista on, toisin kuin plasman, miR-141 ei ilmennetty eri kasvainkudoksissa välillä Vaihe IV ja Stage I-II paksusuolensyöpä potilaiden välillä tai kasvain kudosten ja viereisen ei-kasvain kudosten Vaihe IV potilailla, mikä viittaa siihen, että nousu plasman miR-141 Stage IV potilaat saattavat olla peräisin muista systeemisiä vasteita kuten tulehdusreaktioita näillä potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

sekä plasma ja kudosten perustuvat tutkimukset hyväksyi Institutional Review Board (IRB) at MD Anderson Cancer Center ja eettinen komitea Tianjinin Medical University Cancer Institute ja sairaalan. Kaikki osallistujat antoivat kirjallisen suostumuksen tietonsa tallennetaan sairaalan tietokantaan ja käyttää tutkimustarkoituksiin.

Kliiniset näytteet

Kaksi toisistaan ​​riippumatonta plasmanäytteistä käytettiin. Kaikkiaan 102 plasmanäytteistä peräisin iän ja sukupuolen Hyväksytty terveille henkilöille ja CRC potilaat (vaihe I-IV) saatiin TexGen vuosien 2002 ja 2008 yhteistyötä Texas Medical Center laitokset, joka tarjoaa biologisia näytteitä sekä epidemiologiset ja kliiniset data (TexGen näytteet, katso taulukko S1). Riippumaton kohortti 156 plasmanäytteistä peräisin iän ja sukupuolen Hyväksytty terveiden luovuttajien ja paksusuolen syöpäpotilaiden (vaihe I-IV) saatiin Tianjinin Medical University Cancer Institute ja sairaalan, Tianjin, Kiina (TCH näytettä) vuosien 2007 ja 2009 ( Katso taulukko S2). Patologinen luokittelu taudin kaikille potilaille tehtiin seuraavat International Union Against Cancer (UICC) ja Amerikan sekakomitea Cancer (AJCC) TNM pysähdyspaikan järjestelmä paksusuolensyöpä perustettiin vuonna 2003. verinäytteet kerättiin kaikilta potilailta ennen käyttöä ja hoitoa. CEA tasot sekä TexGen ja TCH plasmanäytteet mitattiin standardin entsyymi-immuno- osana rutiinia kliinisiä kokeita ja hankittiin kliinisestä tietokannasta kussakin instituutissa. Follow-up tiedot kaikista palvelukseen paksusuolen syöpäpotilaiden sekä TexGen ja TCH hankittiin ja elinaika laskettiin jona diagnoosista kuolinpäivästä tai viime seurannasta kesäkuussa 2010. Kaikki potilaat rekrytoitu tämä tutkimus ei saaneet kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen veren tasapeliä. Väestörakenteen tietoa kaksi näytesarjaa on esitetty täydentävien materiaali.

kudokseen perustuva analyysi tuumorikudoksista 21 paksusuolen syöpäpotilaiden kaukaisiin etäpesäkkeitä (vaihe IV) ja 24 paksusuolensyöpä, joilla on ei -metastatic sairaus (vaihe I ja II) kerättiin vuosien 2007 ja 2009 Tianjin Medical University Cancer Institute ja sairaalan samasta potilaat, joiden plasman näytteitä käytettiin.

RNA: n eristys ja kvantitatiivinen RT-PCR

Pienet RNA rikastettiin kaikista plasmanäytteistä käyttäen Mirvana PARIS RNA eristyspakkausta (Ambion, Austin, TX). Lyhyesti, 250 ui plasmaa sulatettiin jäällä ja sentrifugoitiin 14000 rpm: ssä 10 minuutin ajan, solujäänteiden poistamiseksi ja muut soluelinten. Seuraavaksi 150 ui supernatanttia hajotettiin yhtä suureen tilavuuteen 2x denaturointiliuos. Sillä normalisoituminen näytteen ja näytteen vaihtelun RNA eristysmenettelyin, 25 fmol synteettisten

C. elegans

miRNA cel-miR-39 lisättiin kuhunkin denaturoituun näytteen. Pieniä RNA: t sitten rikastettu ja puhdistettiin seuraavasti valmistajan protokollaa, paitsi että rikastettu pienen RNA: t eluoitiin 45 ui esilämmitettyä nukleaasitonta vettä. Standard TRIZOL menetelmä (Invitrogen) käytettiin eristämään kokonais-RNA paksusuolen kudoksiin.

microRNA perustuu RT-PCR-määritykset, 2,5 ui rikastetun pieniä RNA: ita plasmanäytteet käänteistranskriptio käyttäen TaqMan MicroRNA Käänteistranskriptio Kit ( Applied Biosystems, San Diego, CA) valmistajan ohjeiden on reaktion kokonaistilavuus 7,5 ui. Laimennetaan 1:20 RT tuotteita käytettiin templaattina PCR-vaiheessa. PCR-reaktio suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttäen TaqMan 2x Universal PCR Master Mix olosuhteissa kuten aiemmin on kuvattu [13]. Ei-templaattikontrollien sekä RT askel ja PCR-vaiheessa olivat mukana varmistamaan kohde monistamisen. 7900 Sequence Detection System 2.3 (Applied Biosystems) -ohjelmassa oletusarvo käytettiin laskea suhteellista muutosta RNA ilmentymisen 2

-ΔΔCt menetelmällä 95%: n luottamusväli. Määrityksissä TexGen näytteet tehtiin MD Anderson ja määritykset TCH näytteet tehtiin Tianjin Medical University Cancer Institute ja sairaalan.

MicroRNA profilointi

MicroRNA mikrosirujen profiloinnin suoritettiin RNA eristettiin Marylandin kohortti käyttäen Ohio State microRNA microarray version 2.0 kuten aikaisemmin on kuvattu [9]. Microarray data (mukaan lukien raaka ja käsitellyt tiedot) on talletettu National Center for Biotechnology Informationin (NCBI: n) Gene Expression Omnibus (NCBIGEO GSE7828).

Tilastollinen

Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttämällä Wilcoxonin allekirjoitettu-rank testejä ryhmien välillä. Vastaanotin toimii (ROC) dikäyrät arvioida diagnostinen tarkkuus kunkin parametrin, ja herkkyys ja spesifisyys optimaalisen rajakohta määriteltiin ne arvot, jotka maksimoitu pinta-ala ROC-käyrän (AUC). Suhteellisten tasojen mikroRNA kvantitoitiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmällä, ja tiedot analysoitiin log

10 suhteellisen määrän kohde microRNA. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä ohjelmistopaketteja SPSS versio 16.0 (WPSS Ltd., Surrey, Yhdistynyt kuningaskunta) ja kuvaajat luotiin käyttäen Graphpad Prism 5.0 (Graphpad Software Inc, Kalifornia). Spearman Korrelaatio analyysi tehtiin paljastaa korrelaatiota plasman miR-141 ilmaisu ja CRC vaiheissa. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia, ja

P

arvoa 0,05 pidettiin merkittävänä. Korrelaatio eloonjäämiseen ja plasma miR-141 analysoitiin Kaplan-Meier menetelmä ja Log-rank-testi. Coxin suhteellisen vaarat regressioanalyysiä käytettiin sen arvioimiseksi, plasma miR-141 oli itsenäinen ennustetekijä paksusuolen syövän.

Tulokset

Plasma miR-141 tasot korreloivat kliinisten vaiheissa paksusuolensyöpä

kolme MikroRNA (miR-21, miR-92 ja miR-141) valittiin tutkimuksissamme tutkimaan niiden mahdollisuuksia toimia biomarkkereita paksusuolensyöpä. Nämä ehdokas miRNA valittiin, koska 1) miR-21 on havaittu olevan yliaktiivista CRC tuumorikudoksissa [9], [10], [14]; 2) miR-92 on viime aikoina raportoitu olevan plasman markkeri paksusuolen syöpä [11]; ja 3) miR-141: n on osoitettu olevan mahdollinen plasman markkeri metastaattisen eturauhassyövän [12]. Kvantitatiivinen RT-PCR-tekniikkaan perustuva microRNA määrityksiä näiden kolmen miRNA tehtiin. Ensin tarkasteltiin korrelaatio näiden kolmen miRNA ja paksusuolen syövän kliinistä vaihetta. Stage I ja vaihe II tapausta ryhmitelty analyysimme koska vain rajoitettu ensimmäisen vaiheen tapaukset olivat saatavilla. Heat-kartta osoitti, että miR-141 tasoa ryhmiteltiin eri vaiheissa (kuvio 1, A). Spearmanin korrelaatio analyysi osoitti, että plasman miR-141 tasot korreloivat voimakkaasti paksusuolen syöpä vaiheiden (r = 0,605, P = 1,17 x 10

-8). Sen sijaan, miR-21 ja miR-92 olivat vähemmän korreloi kliinisten vaiheiden (kuvio 1, A).

(A) Kukin rivi vastaa plasman miRNA ja kukin sarake vastaa kunkin näytteen. Ekspressiotasot kutakin miRNA normalisoidaan poikki näytteet ja tummennetut värit niin, että punainen tarkoittaa voimakkaaseen ilmentymiseen ja vihreinä heikkoa ilmentymistä. Spearmanin korrelaatio osoittaa, että miR-141 korreloi osuuksilla (r = 0,605, P = 1,17 x 10

-8). (B-G) suhteellinen taso on valittu plasman MikroRNA normalisoitiin piikki-hallinnassa cel-miR-39 ja esitetään log10 suhteellisen määrän (RQ). Wilcoxonin kahden otoksen suoritettiin tutkia eroa valittujen plasman MikroRNA normaalin valvonnan ja paksusuolen syövän potilaille (B-D), tai välillä normaaleihin kontrolleihin ja /tai paksusuolen syövän potilaille, joilla on erilaiset kliiniset vaiheet (E-G).

seuraava analysoidaan oliko ehdokas MikroRNA voitaisiin käyttää kiertävän paksusuolensyöpä markkereita vertaamalla niiden pitoisuuksia plasmassa välillä syöpäpotilaita ja normaalit kontrollit. Yllättäen toisin kuin edellinen raportti, joka ylössäätely plasma miR-92 oli paksusuolensyöpä biomarkkereiden, Wilcoxonin kahden otoksen testi osoitti, että näiden kolmen MikroRNA, plasma miR-92 oli merkittävästi vähentynyt TexGen kohortissa paksusuolen syöpäpotilaiden (

p

= 0,03) (kuvio 1, D). Kuitenkin vähentää plasman miR-92 havaittiin ainoastaan ​​vaiheen I-II ja vaiheen III ja taso nousi samalle tasolle kuin terveillä vaiheessa IV paksusuolensyöpä (kuva 1, G). Plasman miR-21 ja miR-141 eivät osoittaneet merkitsevää eroa valvonnan ja syöpäpotilailla (kuvio 1, B 0,05 pidetään merkittävänä. (B) MIR-141 ilmentyminen mitattiin käyttämällä microRNA profilointi tietojen Maryland kohortin CRC näytteitä. Wilcoxonin parittaista suoritettiin vertaamaan miR-141: n välillä kasvain kudosten ja viereisten normaaleista kudoksista näillä CRC potilailla.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa, otimme ajatteluun ja tutkittiin kolme ehdokasta MikroRNA niiden mahdollisesti arvoa plasma biomarkkereita paksusuolensyöpä. Tulokset Texas Tutkimus osoitti, että plasma miR-141 oli herkkä leima ja täydentää CEA havaitsemiseksi vaiheen IV paksusuolensyöpä. Tämä tulos itsenäisesti validoitu käyttäen kohortti näytteitä paksusuolen syöpäpotilaiden Tianjinissa, Kiinassa. Siten tämän yhteistoimintaan suorittamassa tutkimuksessa kaksi riippumatonta tutkijaryhmää kahdella eri kohtiin eri etnisten potilasryhmissä tarjoaa vahvaa näyttöä siitä, että miR-141 on voimassa oleva plasma merkki, joka täydentää CEA määritettäessä vaiheessa IV paksusuolensyöpä.