Krooninen sairaus

tiivistelmä

Wogonin on kasvi monoflavonoid joka on raportoitu estävän solukasvua ja /tai apoptoosin indusoimiseksi erilaisissa kasvaimissa. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkittiin apoptoosia indusoivaa aktiivisuutta ja taustalla vaikutusmekanismi wogonin A549-soluissa. Tulokset osoittivat, että wogonin oli voimakas estäjä elinkelpoisuuden A549-soluja. Apoptoottista proteiinia muutokset havaitaan altistumisen jälkeen wogonin mukana väheni XIAP ja Mcl-1 ilmentymisen, lisääntynyt lohkaista-PARP ilmaisun ja lisääntynyt vapautuminen AIF ja cytotchrome C. Western blot-analyysi osoitti, että aktiivisuutta c-Myc /Skp2 ja HDAC1 /HDAC2 kulkuväylillä joka on tärkeä merkitys kasvaimen edistymistä, oli vähentynyt. Kvantitatiivinen PCR tunnistettujen kohonnut c-Myc-mRNA: n ja alentuneet sen proteiinin. Proteiini tasojen Fbw7α, GSK3p ja Thr58-Myc, jotka ovat mukana c-Myc ubikitiinistä riippuvainen hajoamista, analysoitiin myös. Altistumisen jälkeen wogonin, Fbw7α ja ​​GSK3p ilmaisun laski ja Thr58-Myc ilmaisua lisääntynyt. Kuitenkin MG132 ei ole voinut estää c-Myc hajoamista. Esillä olevat tulokset viittaavat siihen, että wogonin on useita syövän liittyviä vaikutuksia hajoamiseen c-Myc, SKP2, HDAC1 ja HDAC2. Sen kyky aiheuttaa apoptoosia riippumatta Fbw7α ehdottaa mahdollista käyttää lääkeaineen vastustuskykyä syövän liittyvät Fbw7 puute. Lisätutkimuksia tarvitaan sen määrittämiseksi, mitkä reitit liittyvät c-Myc ja Fbw7α kääntyminen ja onko Thr58 fosforylaation c-Myc on riippuvainen GSK3p.

Citation: Chen Xm, Bai Y, Zhong Yj, Xie Xl, pitkä Hw, Yang YY, et al. (2013) Wogonin on useita Anti-Cancer Effects säätelemällä c-Myc /SKP2 /Fbw7α ja ​​HDAC1 /HDAC2 Pathways ja aiheuttamaan apoptoosin ihmisen keuhkoadenokarsinooma A549. PLoS ONE 8 (11): e79201. doi: 10,1371 /journal.pone.0079201

Editor: Jian-Xin Gao, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Kiina

vastaanotettu: 23 tammikuu 2013; Hyväksytty: 20 syyskuu 2013; Julkaistu: 12 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat avustuksia tiede ja teknologia Guizhoun maakunnassa Kiinassa ([2012] 7006 ja NY [2011] 3072); Guangzhou Medical College (2012C16); Säätiön nuorten tutkijoiden Guangzhou Educational Committee (2012C118). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Vaikka suuri määrä kliinisiä kokeita, joilla pyritään parantamaan potilaiden eloonjäämisen, keuhkosyöpä on edelleen johtava syy syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti sekä miehiä että naisia. Noin 85% kaikista keuhkosyöpää luokitellaan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joka on tyypillisesti diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa [1]. Keuhkoadenokarsinooma, hallitseva histologinen alatyyppi NSCLC, osuus on 20 30% ensisijainen keuhkosyöpää keskuudessa koehenkilöillä alle 45-vuotiaita, riippumatta tupakointihistoria [2]. Useimmat NSCLC ovat sopimattomia kirurgian ja kemoterapia on edelleen kulmakivi hoitoa edenneen taudin.

histonideasetylaaseja (HDAC: t) ovat entsyymejä, jotka poistavat histoni asetylaatio tuotteita. Tämä prosessi tiivistää rakenteen kromatiinin ja tukahduttaa transkriptio [3]. HDAC laki eri nonhistone proteiinisubstraatteja joka on rooli säätelyssä geenien ilmentymisen, solujen proliferaatiota ja muuttoliike, solukuolemaa ja angiogeneesissä [4]. Tiedot prekliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että luonnossa esiintyviä ja synteettisiä histonideasetylaasi estäjät on voimakas syövän vastaista aktiivisuutta.

HDAC1 ja HDAC2 kuuluvat luokan I histonideasetylaasi (HDAC) perhe. In vivo nämä entsyymit muodostavat komplekseja Sin3, Nurd ja Co-REST [5]. HDAC1 ja HDAC2 myös sitoutua suoraan DNA: ta sitovia proteiineja, kuten YY1, Rb sitova proteiini-1 ja Sp1 [5].

c-Myc on transkriptiotekijä, joka on vastuussa säätelemiseksi erilaisia ​​geenien solu proliferaatio, kasvu, apoptoosin ja erilaistumisen [6]. Vapautettiin c-Myc ilmentymistä havaitaan noin 70% kaikista ihmisen kasvaimista [10]. c-Myc ilmentymistä säädellään geenin transkriptiota, ja se on riippuvainen mRNA: n stabiilisuuteen ja posttranslational valvonta proteiinin stabiiliuden [7] – [9].

käännösten jälkeinen säätely c-Myc voidaan välittää Skp2 (S- vaihe kinaasi liittyvä proteiini 2) ja Fbw7 (F-box ja WD toista verkkotunnuksen sisältäviä 7) [11]. Skp2 ja Fbw7 ovat kaksi eri tunnustamista alayksiköt SCF-tyypin E3 ligaasia (SCF, Skp1 /Cullin /F-box-proteiini kompleksit), jotka tunnistavat erityiset substraatteina proteasomaalisten hajoamista. Asetus c-Myc liittyy fosforylaation c-Myc on Thr58, jolloin Fbw7-välitteisen proteasomaalisten hajoamista. Glykogeenisyntaasikinaasi 3β (GSK3p) on ainoa kinaasi tiedetään fosforyloimaan c-Myc on Thr58 [24].

Skp2 on lupaava kohde rajoittaa syövän kantasolujen ja syövän etenemistä [12], se on yli-ilmentyminen on usein havaitaan ihmisen syövän ja se voi näin ollen toimia onkogeeni. Tämän tueksi hypoteesi, Skp2 on osoitettu tunnistavan sykliini-riippuvaisen kinaasin (Cdk) estäjät ja tuumoria tukahduttavan proteiinit, kuten p27 Kip1 (Cyclin-riippuvaisen kinaasin inhibiittori 1 B), p57 Kip2 (Cyclin-riippuvaisen kinaasin inhibiittori 1C), p130 ( 130 kDa retinoblastooma-liittyvä proteiini) ja Tob1 (anturi erbB-2 1), mutta ei c-Myc [13] – [16]. Skp2 välittämää muodostumista ubikitiinin c-Myc tapahtuu riippumatta fosforylaation [25].

Fbw7 puutos uskotaan olevan osallisena lääkeresistenssin ihmisen syövissä [22], [23]. On osoitettu, inaktivoida mutaatiolla, deleetiolla, tai promoottori hypermetylaation rintasyövän [17], [18], paksusuolen syöpä [19], [20], ja leukemia [21]. Fbw7 ilmaistaan ​​kolmella eri isoformeja (nimetty α, β, ja γ) vastaavasti sijaitsevat α-ydin, β-sytoplasma, ja γ-nucleolus [26], [27]. Koska ei ole vasta-aineita näille kolmelle isoformia käytimme parhaiten kuvata ja pisin kolme isoformia Fbw7α, meidän kokeissa wogonin.

Wogonin (5, 7-dihydroksi-8-methoxyflavanon) on luonnossa monoflavonoid uutettu

Scutellaria baicalensis

radix [28], joka on tunnustettu syöpälääkettä ehdokas mahdollisesti alhainen myrkyllisyys [29]. Syövän vastaisen aktiivisuuden wogonin on raportoitu eri ihmisen solulinjojen myeloomasolu RPMI 8226 [30], maksasyövän SK-HEP-1 [31] ja SMMC-7721 [32], gliooma syöpäsolujen [33], nenänielun karsinooma solut [ ,,,0],34], ihmisen rintasyövän solujen [35], [36] ja ihmisen kohdunkaulansyövän HeLa-solujen [37]. Sen toiminta välittyy apoptoosin induktio ja solujen erilaistumista, ja säätelee erilaisten geenien ja proteiinien [38] – [41].

Tässä tutkimuksessa arvioimme vaikutuksia wogonin solujen elinkelpoisuuden ja apoptoosin ihmisen keuhkon adenokarsinooman epiteelisolujen A549. Me arvioi myös sääntelyn ja toiminta c-Myc /Skp2 /Fbw7α ja ​​HDAC1 /HDAC2 reittejä mukana sen apoptoottinen vaikutus.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta-

Wogonin ostettiin Guangzhou IDC (Kiina) ja MG132 (karbobentsoksi-Leu-Leu-leucinal) saatiin (Beyotime, Kiina). Seuraavia vasta-aineita käytettiin: Fbw7 (Cdc4, H-300) ja p-c-Myc (Thr 58) (Santa Cruz, USA); c-Myc, GSK3p, AIF (apoptoosia indusoivan tekijän, Proteintech Group, Inc., USA); HDAC1, HDAC2, Skp2, surviviinia, Bcl-2 (B-solulymfooma 2), β-aktiini (Boster, Kiina); MCL-1 (myeloidisolun leukemia sarja 1), XIAP (X-kromosomiin liittyvä estäjä apoptoosin proteiinia, BIOSs, Kiina); Cytochome c (Keygen, Kiina); PARP (poly ADP-riboosi-polymeraasi, Sino Biological Inc., Kiina).

Cell Culture

Ihmisen keuhkojen adenokarsinooma A549 saatiin Cell Bank of Animal Experiment Center, North School Region, Sun Yat-Senin yliopistossa. Soluja käytetään kokeissa pidettiin laboratoriossamme RPMI 1640-väliaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Holly lehtiä, Kiina) 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

Methylthiazolyldiphenyl liumbromidi ( MTT) Cell Vaibility määritys

Solut otettiin talteen trypsiinillä ympättiin 96-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

4 kuoppaa kohti. Yön yli inkuboinnin jälkeen elatusaine poistettiin ja soluja inkuboitiin eri konsentraatioita wogonin. Altistuksen jälkeen wogonin 24, 48 tai 72 tunnin kuluttua soluja inkuboitiin MTT 37 ° C: ssa vielä 4 tuntia. Tämä sallittu mitokondrion dehydrogenaasi muuntaa MTT liukenemattomiksi formatsaanikiteet. Viljelyalusta heitettiin pois, ja 100 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO) lisättiin jokaiseen kuoppaan liuottamiseksi formatsaanikiteet. Imeytymistä liukoiseksi formatsaanin mitattiin 490 nm: ssä käyttäen EL340 mikrolevylukijaa (Bio-Tek. Instruments, Winooske, VT).

Nuclear Värjäys

A549-solut värjättiin DAPI (4 ’, 6-diamino-2-fenyyli) -värjäyspakkausta (Keygen, Kiina). Altistuksen jälkeen porrastettu pitoisuudet wogonin 48 tuntia, solut pestiin ja inkuboitiin DAPI työliuosta (1-2 ug /ml) 15 min ajan 37 ° C: ssa. Sitten solut huuhdottiin metanolilla ja puskuria A (60% glyserolia 10 mM fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS, pH 7,6)) lisättiin suspensioon. A549-solut katsottu käyttäen Eclipse Ti Nikon mikroskooppi (Nikon, Japani).

Mitokondrioiden kalvojännite

mitokondrion kalvon potentiaali (Δψm) A549-solujen mitattiin usimg fluoresoiva, lipofiilinen, kationinen koetin, JC-1 (Beyotime, Kiina), mukaisesti valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, solut altistetaan wogonin inkuboitiin 1X JC-1 värjäysliuos 20 min ajan 37 ° C: ssa. Sitten ne huuhdottiin kahdesti JC-1 värjäyspuskurilla ja kuvat otettiin Eclipse Ti Nikon mikroskoopilla (Nikon, Japani).

Apoptosis Assay

Soluja leimattiin FITC-leimattua anneksiini V ja propidiumjodidilla (PI) käyttämällä anneksiini V-FITC apoptoosin havaitseminen kit (Keygen Biotech, Kiina), mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, sen jälkeen 48 h altistuksen eri pitoisuuksia wogonin, solut pestiin kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 1 x sitomispuskurissa. Alikvootit 10

5-solut sekoitettiin 5 ui anneksiini V-FITC ja 5 ui PI 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Fluoresenssi (530 nm) havaittiin virtaussytometrialla (FACS Aria, BD Biosciences, USA) 1 tunnin kuluessa.

Reaaliaikainen PCR-analyysi

Kvantitatiivinen RT-PCR tehtiin käyttämällä SYBR Green reportteri. A549-solut altistettiin wogonin pestiin PBS: llä ja kokonais-RNA puhdistettiin käyttämällä RNAiso Plus (TAKARA, Japani). Saatu RNA ensin käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen PrimeScript® RT Master Mix Kit (TAKARA, Japani). Gene-alukkeet yhdistettiin SYBR® Esiseos Ex Taq ™ (TAKARA, Japani) ja monistettiin käyttäen ABI 7500 reaaliaikainen PCR-laite (Applied Biosystems, USA). Kaikki qPCR reaktiot suoritettiin itsenäisesti viisi näytettä. Suhteellinen mRNA-ekspressio laskettiin käyttämällä 2

-ΔΔCt menetelmällä. Alukesekvenssit käytetään, on lueteltu taulukossa 1.

Western blot -analyysi

Solut pestiin PBS: llä lyysattiin RIPA (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, natriumortovanadaatti, natriumfluoridi, EDTA ja leupeptiiniä, (Beyotime, Kiina), johon oli lisätty proteaasi-inhibiittori PMSF: ää (Beyotime, Kiina). sytoplasmisia proteiinit uutettiin käyttäen Nuclear ja sytoplasmaproteiinin Extraction Kit (Keygen Biotech, Kiina).

liukoinen proteiinipitoisuus määritettiin BCA proteiinin määritys kit (Beyotime, Kiina). solulysaatit keitettiin 5 min latauspuskuria ja erotettiin SDS PAGE-geelissä. elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin PVDF-kalvolle (Millipore, USA). kalvot blokattiin rasvaton maito, tutkittiin erilaisten primaaristen vasta-aineiden ja HRP-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita, ja visualisoitiin parannetun kemiluminesenssin (ECL) detektioreagensseja (Beyotime, Kiina).

tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS versio 17.0 ohjelmisto. Tulokset ilmaistaan ​​avulla ja keskivirheet (keskiarvo ± SEM) vähintään kolmen itsenäisen kokeen. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin määrittämään tilastollista merkitystä ryhmien välillä. Arvot P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Wogonin Estää elinkykyyn ja indusoi solukuoleman

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen MTT-määritystä yhdessä DAPI värjäys ja virtaussytometria analyysi altistumisen jälkeen eri pitoisuuksia wogonin. MTT-analyysi osoitti, että wogonin esti solujen elävyys annoksesta riippuva ja aika-riippuvaisella tavalla (kuvio. 1 B). Tämän vahvisti tulokset virtaussytometrianalyysin käyttäen anneksiiniV-PI (Fig. 1 C).

(A) kemiallinen rakenne wogonin (C

16H

12o

5, MW: 284,27 ). (B) Solujen elinkelpoisuus analysoitiin käyttämällä MTT-määritystä. Soluja inkuboitiin wogonin 24 h, 48 h tai 72 h. Tangot ovat keskiarvoja ± SEM (n = 3). (C) Apoptoosin arvioi anneksiini V /PI-värjäyksen A549-soluja. Soluja inkuboitiin wogonin pitoisuuksina 0, 15, 25, 35 ug /ml, 24 h, 48 h ja 72 h. (D) Nuclei värjätään DAPI ja noudatettava fluoresenssimikroskooppiin. Apoptoottisten solujen on osoitettu nuolilla. *

P

0,05 kontrolliryhmään verrattuna, **

P

0,01 kontrolliryhmään verrattuna.

verrattuna kontrolliryhmään, korko sekä aikaisin ja myöhäisessä vaiheessa apoptoosin kasvoi altistuksen jälkeen kaikki pitoisuudet wogonin. Kokonaismäärä apoptoosin korko ylitti 50% vuonna 35 mikrog /ml ryhmässä.

DAPI värjäytymistä (Fig. 1 D) tunnistettu kondensoidaan ja halkaistut ytimien altistuneiden solujen 35 mikrog /ml wogonin, kun taas vain selkeä ytimet vaaleansinisellä värjäytyminen havaittiin verrokkiryhmässä.

Kuten kuviossa. 2A, Wogonin liittyi annoksesta riippuva väheneminen mitokondrioissa potentiaali (Δψm), jotka alensivat punaisen fluoresenssin (JC-1 polymeeri) ja lisääntynyt vihreän fluoresenssin (JC-1 monomeeri). Tämä saattaa kuitenkin liittyä alas-säätely Mcl-1, koska ei ollut selvää laskua Bcl-2 tasoa. Wogonin edistetään myös vapautumista AIF ja sytokromi C sytoplasmaan antaa lisänäyttöä mitokondriovaurioita (Fig. 2C). Down-regulation XIAP surviviiniperäiset, ja pilkkoa fragmentit PARP osoitti, että prosessi apoptoosin jatkui mitokondrioita vaurioita (Fig. 2B).

(A) analyysi mitokondrion kalvon potentiaali (ΔΨm) käyttäen JC -1 värjäys altistuksen jälkeen wogonin 48 tuntia. Fluoresenssimikroskooppia käytettiin visualisoimaan tuloksia. Mitokondrioiden Depolarisaatio oli merkitty vihreän fluoresenssin lisäys ja lasku punaisen fluoresenssin intensiteettiä. (B) Proteiinin tasot Bcl-2, Mcl-1, XIAP, surviviini ja PARP analysoitiin western blot. (C) sytoplasmisia proteiinit uutettiin western blot-analyysi julkaistiin Sytokromi c ja AIF. Näissä kokeissa solut altistettiin wogonin 0, 15, 25, 35 ug /ml 48 tuntia. *

P

0,05 kontrolliryhmään verrattuna, **

P

0,01 kontrolliryhmään verrattuna.

Wogonin Down-regulation HDAC1 ja HDAC2 sekä mRNA ja Protein tasot

Protein tasot HDAC1 ja HDAC2 oli alassäädetty annoksesta riippuvalla tavalla, kun ne altistetaan eri pitoisuuksia wogonin 48 h (Fig. 3B). Tämä tulos on yhdenmukainen alas-säätely mRNA havaitaan qPCR osoittamalla, että HDAC1 pieneni 0,69-kertaiseksi ja HDAC2 0,73-kertaiseksi, (liittyvä epävarmuus fold-muutokset olivat 2) (Fig. 3A). Nämä muutokset voivat johtaa suhteellinen kasvu histoni asetylaatio ja edistää ilmentymistä kasvain ehkäisevästä proteiineja.

(A) Suhteellinen mRNA tasot HDAC1 ja HDAC2 todettiin käyttäen reaaliaikaista PCR GAPDH sisäisenä kontrollina. Tulokset on ilmaistu keskiarvona ± SEM viidestä riippumattomasta kokeesta.

#

P

0,01 kontrolliryhmään verrattuna. (B) Protein tasot HDAC1 ja HDAC2 analysoitiin western blot. Näissä kokeissa solut altistettiin wogonin 0, 15, 25 ja 35 ug /ml 48 tuntia. *

P

0,05 kontrolliryhmään verrattuna, **

P

0,01 kontrolliryhmään verrattuna.

Wogonin Down-regulation c-Myc ja Skp2 at Protein Level, ja lisää mRNA taso c-Myc

sekä c-Myc ja Skp2 olivat alassäädetty proteiinitasolla altistumisen jälkeen wogonin (0, 15, 25, 35 ug /ml) 48 h, (Fig. 4B). Kuten on esitetty kuviossa. 4A, mRNA taso Skp2 pieneni 0,81-kertaiseksi, kun taas mRNA-tasolla c-Myc kasvoi noin 1,6-kertainen (liittyvä epävarmuus fold-muutoksia sekä 2). Nämä havainnot osoittavat, että proteasomaalisten hajoamisen reitti voi olla mukana sääntelyn c-Myc ja Skp2. Kuitenkin, kuten wogonin alensivat proteiinin ilmentymisen Skp2, lisäkokeita keskittyi proteasomin tunnustamista alayksikkö, Fbw7α, joka kohdistuu c-Myc.

(A) Suhteellinen mRNA-tasot c-Myc ja Skp2 havaittiin käyttämällä reaaliaikainen PCR GAPDH sisäisenä kontrollina. Tulokset on ilmaistu keskiarvona ± SEM viidestä riippumattomasta kokeesta.

#

P

0,01 kontrolliryhmään verrattuna. (B) Proteiinin tasot c-Myc ja Skp2 analysoitiin western blot. Näissä kokeissa solut altistettiin wogonin 0, 15, 25 ja 35 ug /ml 48 tuntia. *

P

0,05 kontrolliryhmään verrattuna, **

P

0,01 kontrolliryhmään verrattuna.

Wogonin Vähentynyt Fbw7α ja ​​GSK3p, ja Lisääntynyt Thr58- myc proteiinitasolla

Protein tasoilla Fbw7α laski altistumisen jälkeen wogonin, (Fig. 5B), mutta ei ollut vastaavaa laskua mRNA: n ilmentymisen (Fig. 5A). Thr58 fosforylaatiossa c-Myc kasvoi (kuvio. 5B). Thr58 fosforylaatiossa c-Myc on pakollinen osa sen hajoamisen ja välittää GSK3p: n. Kuitenkin GSK3p ilmentyminen väheni sekä mRNA: ta (0,78-kertainen 35 ug /ml) (Fig. 5A), ja proteiinin taso (kuvio. 5B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että fosforylaatiossa c-Myc on Thr58 voi tapahtua itsenäisesti GSK3p. Tämä vaatii kuitenkin lisätutkimuksia.

(A) Suhteellinen mRNA tasot Fbw7α ja ​​GSK3p todettiin käyttäen reaaliaikaista PCR GAPDH sisäisenä kontrollina. Tulokset on ilmaistu keskiarvona ± SEM viidestä riippumattomasta kokeesta.

#

P

0,01 kontrolliryhmään verrattuna. (B) Proteiini tasojen Fbw7α, Thr58-Myc ja GSK3p analysoitiin western blot. (C) proteiini tasot c-Myc analysoitiin western blot. Näissä kokeissa, 1 uM MG132 lisättiin inkuboitiin kanssa tai ilman 25 ug /ml wogonin 48 tuntia. *

P

0,05 kontrolliryhmään verrattuna, **

P

0,01 kontrolliryhmään verrattuna.

Kokeet suoritettiin proteasomin estäjä MG132 edelleen ymmärtää proteasomaalisten hajoamisreitit säätelyyn osallistuvan c-Myc. Tulokset on esitetty. 5C osoittavat, että MG132 voinut kääntää c-Myc hajoamisen indusoiman 25 ug /ml wogonin. Lisätutkimuksia tarvitaan siis määritellä tarkasti reitin mukana c-Myc hajoamista.

Keskustelu

Wogonin on luonnossa esiintyvä monoflavonoid uutettu

Scutellaria baicalensis

Radix [28] . Sen on raportoitu olevan antineoplastista aktiivisuutta eri syöpätyyppejä, että apoptoosin induktio ja solujen erilaistumisen [30] – [37], ja säätää eri geenien ja proteiinien [38] – [41]. On tunnettua, että c-Myc /Skp2 /Fbw7α ja ​​HDAC1 /HDAC2 reittejä, jotka liittyvät syövän etenemiseen. Täällä tutkimme niiden merkitys syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on wogonin in NSCLC A549-solut.

arvioitiin ensin anti-elinkelpoisuus ja apoptoottisia vaikutuksia wogonin käyttäen MTT ja anneksiini V-PI kaksinkertainen värjäys määrityksiä. Tuloksemme osoittivat, että wogonin aiheutti annoksesta riippuvan ja ajasta riippuvaa inhibitiota solujen elävyyden (IC

50 35 mikrog /ml 48 h). Varhainen apoptoosin lisääntyminen kurssi vastauksena wogonin tapahtui samanaikaisesti, anneksiini V-positiivisten solujen vähitellen anneksiini-V negatiivinen.

Tällä IC

50 (35 ug /ml) solujen ilmeni merkkejä merkittävä apoptoosin, sopusoinnussa ydin- morfologian muutokset nähdään DAPI-värjäyksellä.

ilmentyminen apoptoosin liittyvät proteiinit, kuten Bcl-2, Mcl-1, PARP, XIAP, surviviinia, sytokromi c: ja AIF arvioitiin edelleen tunnistaa apoptoottiset vaikutukset wogonin proteiinitasolla. Tulokset osoittavat, että wogonin voi vaikuttaa mitokondrion kalvon vakautta ja vähentää mitokondrioiden kalvojännite (Δψm). Tästä oli osoituksena JC-1 värjäystä, vähentynyt MCL-1 ilmentymisen ja vapauttamaan sytokromi C ja AIF sytoplasmaan. Halkaistut PARP ja laski XIAP ja surviviinin ilme on myös saattanut osaltaan etenemistä apoptoosin.

HDAC1 ja HDAC2 ovat luokan I HDAC että deasetyloida histoni ja ei-histoniproteiineista [5]. He tukahduttaa geenien ilmentyminen, ja muokata kasvaimen spesifisten proteiinien mukana etenemisessä [4]. Tuloksemme osoittavat, että mRNA: n ja proteiinin tasot HDAC1 ja HDAC2 olivat molemmat laski läsnä wogonin, mikä osoittaa, että asetyloitu histoni proteiini voi edistää ilmentymistä tuumoria tukahduttavan proteiinien ja siten estää kasvaimen etenemistä.

välinen suhde välillä c-Myc ja Skp2 niin että c-Myc edistää Skp2 ilmaisun, ja Skp2 tavoitteet c-Myc varten ubikitiinistä riippuvainen hajoamista [11], [12], [24], [25]. Meidän kokeissa wogonin alassäädetty c-Myc ja Skp2 proteiinitasolla, mutta mRNA ilmaisu c-Myc kasvoi 1,6-kertaiseksi. Nämä havainnot viittaavat siihen, että proteasomaalisten hajoamisen reitti voi liittyä käänteinen c-Myc. Kuitenkin, koska Skp2 ilmentyminen väheni, fokusoimme edelleen kokeita Fbw7α toinen proteasomin tunnustamista alayksikkö, joka kohdistuu c-Myc.

Thr58 fosforylaatiossa c-Myc tarvitaan Fbw7α välittämän c-Myc hajoaminen [24]. Kuten Thr58 on phophorylated mukaan GSK3p, arvioimme ekspressiotasot Fbw7α, Thr58 c-Myc ja GSK3p. Näissä kokeissa Fbw7α ilmentyminen väheni proteiinin tasolla, mutta ei mRNA-tasolla. Thr58 fosforylaatiossa c-Myc kasvoi jonkin verran ja GSK3p-ilmentymisen sekä mRNA: ta ja proteiinia aleni. Nämä tulokset highlight virheen välillä Fbw7α mRNA: ta ja proteiinia tasoilla, vähentynyt ilmentyminen GSK3p, ja lisääntynyt fosforylaatiossa c-Myc on Thr58.

edellinen tutkimus osoitti, että fosforylaatio Thr58 A549-soluissa tapahtui riippumatta GSK3p [42]. Kuitenkin GSK3p on ainoa tunnettu kinaasi fosforyloi c-Myc on Thr58. Meidän tutkimuksissa proteasomin estäjä MG132 ei ole voinut estää hajoamisen c-Myc viittaa siihen, että vähentynyt Fbw7α ja ​​Skp2 saattaa olla mukana tässä prosessissa. Kuitenkin tarkka mekanismi mukana vaatii lisätutkimuksia.

Yhdessä meidän havainnot viittaavat siihen, että kyky wogonin vaikuttaa eri biokemiallisia reittejä saattaa selittää sen aktiivisuutta erilaisia ​​syöpiä. Tuloksemme saattaa myös osittain selittää, miksi jotkut geeni vajaiden solujen (esimerkiksi ne, joilla on Fbw7α puutos) ovat resistenttejä wogonin.