Krooninen sairaus

tiivistelmä

tyypin I transmembraaniproteiinia epidermaalisen kasvutekijän ja kaksi follistatin motiivien 2 (TMEFF2), ilmentyy pääasiassa aivoissa ja eturauhasen. Expression of TMEFF2 vapautetaan säännöstelystä eturauhassyöpä, mikä viittaa rooli tässä sairaudessa, mutta molekyylitason mekanismi (t) osallistuu tämän vaikutuksen eivät ole selkeitä. Vaikka androgeenien edistää

tmeff2

transkriptio, androgeenireseptorin toimitus kastreenatuille kantavista eläimistä CWR22 ksenografteissa lisää TMEFF2 proteiinin tasoja ilman mRNA muutoksia, mikä viittaa siihen, että

TMEFF2

voi myös olla transkription jälkeen säännelty. Tässä osoitamme, että käännös

TMEFF2

säädellään androgeenien. Lisäksi fysiologisten pitoisuuksien dihydrotestosteroni (DHT) ja eturauhassyövän solulinjoissa lisää kääntäminen endogeenisen

TMEFF2

tai transfektoitu

TMEFF2-Luciferase

fuusioita, ja tämä vaikutus edellyttää läsnäoloa ylävirran avointa lukukehystä ( uORFs) 5′-transloimaton alue (5′-UTR) on

TMEFF2

. Käyttäen kemiallisia ja siRNA inhibitio androgeenireseptorin (AR), me osoitamme, että androgeeni vaikutus

TMEFF2

käännös välittää AR. Tärkeää on, DHT edistää myös fosforylaation α-alayksikön translaation aloituskodonin tekijä 2 (eIF2α) kanssa AR-riippuvaisella tavalla, rinnalle vaikutus

TMEFF2

käännös. Lisäksi Endoplasmakalvosto (ER) stressi olosuhteet, jotka edistävät eIF2α fosforylaatio, myös stimuloivat

TMEFF2

käännös. Nämä tulokset osoittavat, että androgeenien signalointi edistää eIF2α fosforylaation ja myöhempää kääntäminen

TMEFF2

mekanismilla, joka vaatii uORFs 5′-UTR

TMEFF2

.

Citation: Overcash RF, Chappell VA, Green T, Geyer CB, Asch AS, Ruiz-Echevarría MJ (2013) Androgeenien Signaling Edistää käännös

TMEFF2

eturauhassyöpäsoluissa kautta fosforylaation α alayksikköön Translation initiaatiofaktori 2. PLoS ONE 8 (2): e55257. doi: 10,1371 /journal.pone.0055257

Editor: Hari Koul, University of Colorado, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 27 joulukuu 2012; Julkaistu: 06 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Overcash et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta National Cancer Institute (1R15CA155873). Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia kiinnostusta ole.

Johdanto

Androgeenit signalointi kautta AR on keskeinen rooli normaalissa eturauhasessa kehittämiseen ja edistää etenemistä eturauhassyöpää. Sitovat androgeenien AR edistää konformaation muutoksen, joka johtaa lopulta sen translokaatio tumaan ja transkription säätelyyn tietyn joukon androgeenin reagoiva geenejä. Kliiniset ja kokeelliset todisteet viittaavat siihen, että eturauhassyövän etenemistä tapahtuu merkittävissä normaalin androgeenireseptorin signalointi, vähentämällä spesifisyyttä tai määrää AR ligandia tarvitaan proliferaation ja eloonjäämisen [1]. Tärkeää on, viimeaikaiset tulokset viittaavat siihen, että funktio AR on spesifinen taudin vaiheessa, liipaisu eri geenien ilmentyminen ohjelman androgeeniriippuvaisissa verrattuna androgeenista riippumaton eturauhassyöpä [2]. Vaikka rooli AR signaloinnin akselia transkription säätelyyn on hyvin dokumentoitu, tiedetään hyvin vähän koskevat sen roolia translaation aloituksen ehdotettu alussa tutkimuksissa [3], [4].

transmembraaniproteiiniksi epidermaalisen kasvutekijän ja kaksi follistatin motiivien 2 (TMEFF2) on yhdellä pyyhkäisyllä transmembraaniproteiini. TMEFF2 ilmaistaan ​​alkion [5], [6] ja selektiivisesti aikuisen aivoissa ja eturauhasen [7] – [9]. Rooli varten TMEFF2 eturauhassyövässä ehdotti tutkimukset osoittavat, että TMEFF2 ilmentyminen muuttunut huomattava osa ensisijainen ja metastaattisen eturauhassyövän kasvaimia [5] – [10]. Lisäksi olemme viime aikoina osoittaneet, että TMEFF2 vuorovaikutuksessa sarkosiini dehydrogenaasin (SARDH), vastaava entsyymi muuntamista sarkosiinimetyylieste- glysiiniä [11]. Tärkeää on, sarkosiini tunnistettiin markkeri eturauhassyövän etenemistä laajamittainen näytön aineenvaihduntatuotteiden ihmisen eturauhasessa [12]. Lisääntynyt plasman ja virtsan sarkosiini tasolla erottaa eturauhassyöpä hyvänlaatuisesta eturauhasen kudosta, ja oli edelleen koholla metastaattinen. Lisäksi, sarkosiini aineenvaihduntaa ja entsyymejä, jotka liittyvät siihen (ts SARDH) on osoitettu toimivan säätelijöinä invaasio ja metastaasi [12]. Näin ollen vuorovaikutus TMEFF2 kanssa SARDH ehdottaa lisäksi rooli TMEFF2 eturauhassyövän etenemiseen. Itse asiassa olemme perustaneet että täyspitkää TMEFF2 toimii tuumorisuppressorina ja että tätä roolia korreloi, ainakin osittain, sen kyky olla vuorovaikutuksessa SARDH sekä porrastaa solujen tasot sarkosiinimetyylieste- [11].

tässä tutkimuksessa raportoivat, että käännös

TMEFF2

säätelevät androgeenien, ja tämä vaikutus edellyttää toiminnallista AR. Tuloksia käyttämällä ksenograftimalleissa ja eturauhassyövän solulinjoissa vahvistettiin, että TMEFF2 ilmentyminen muuttuu vasteena androgeenien ja /tai androgeeniriippuvaisen tai sta riippumatonta solujen tila [8], [10]. Kuten käy Gery et al., [8] nämä muutokset johtuvat osittain transkription aktivoitumisen

tmeff2

vastauksena androgeenien. Kuitenkin lisääntynyt TMEFF2 proteiinin tasoja ilman vastaavaa lisäystä mRNA-tasot on havaittu sen jälkeen, kun lisäksi androgeenien kastroitu kantavat eläimet CWR22 ksenografteja, viittaa siihen, että

TMEFF2

voi olla myös transkription jälkeen säädellään [10].

TMEFF2

mRNA on useita mahdollisia ylävirran avointa lukukehystä (uORFs) sen johtaja alueella, ja sekvenssianalyysi viittaa siihen, että ne ovat hyvin säilyneitä nisäkkäitä. Vaikka vain läsnä 5-10% solun mRNA uORFs ovat yleisiä johtaja alueilla koodaavien mRNA onkoproteiineja tai proteiineja valvontaan osallistuvien solujen kasvua ja erilaistumista, ja ne toimivat säätelemällä käännös näiden olennaisten geenien [13]. Oltuaan käännetty, uORFs yleensä estää käännös tärkeimmistä alavirran koodaavan alueen vaikeuttaen käännös uudelleenkäynnistysaktiivisuus tärkeimmissä translaation aloituskodonista. Kuitenkin uORFs voi edistää selektiivisen käännös alavirran koodaavan alueen alle solujen stressiä tai muita sairauksia, jotka lisäävät fosforylaation α-alayksikön eukaryoottisia translaation aloitus- tekijä 2 (eIF2α) [13].

eIF2 sen GTP- sidotussa muodossa tarvitaan valinnassa translaation aloituskodonin. Fosforylaatio α-alayksikön eIF2 at Ser-51 (eIF2α-P) estää vaihto eIF2-bruttokansantuotteestaan ​​eIF2-GTP, estäen tunnustamista Aloituskodoni ja vähentämällä maailmanlaajuinen käännös aloittamista [14]. Kuitenkin, kuten edellä mainittiin, uORF sisältävät mRNA: t ovat aktiivisesti käännetty näissä olosuhteissa. Kaksi mekanismia on ehdotettu selittämään tätä vaikutusta. Ensimmäisessä vaihtoehdossa, esimerkkinä

ATF4

mRNA, joka sisältää kaksi uORFs, käännös uudelleenkäynnistysaktiivisuus on estävä alavirran uORF ohitetaan olosuhteissa eIF2α-P, johtuu siitä, että alhaisempi eIF2-GTP lisäys tarvittava aika skannauksen ribosomien uudelleen hankkia eIF2-GTP ja aloittaa uudelleen käännös [15]. Toisessa yksi, havaittiin mRNA sisältää yhden uORF, skannaus ribosomien ohittaa estävää uORF johtuen pienempi hyötysuhde translaation aloituskodonit on huono Kozak-konsensussekvenssin [16]. Molemmissa tapauksissa uORF ohitus johtaa lisääntynyt määrä ribosomien alkaen translaation aloituskodonin tärkeimmistä koodaavan sekvenssin, mikä lisää synteesi kyseisen proteiinin.

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että

TMEFF2

käännös säädellään androgeenien. Androgeenin sääntely

TMEFF2

käännös vaatii läsnäoloa uORFs in johtaja alueella

TMEFF2

mRNA ja riippuu eIF2α-P. Edelleen, tämä vaikutus välittyy AR, koska sitä ei havaittu, kun AR tasot vähenevät RNAi tai AR-antagonisti bikalutamidi, tai solulinjat, jotka eivät ekspressoi sitä. Nämä tulokset tukevat uutta sääntelymekanismina androgeenin signalointia, jossa uORF sisältävät mRNA: t ovat translatorisesti aktivoituvat vasteena eIF2α-P.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

LNCaP ja 22RV1-solut saatiin American Type Culture Collection ja niitä ylläpidettiin RPMI 1640 (Gibco), jota oli täydennetty joko 10% FBS: ää (Gemini Bio-tuotteet) tai 10% hiilellä erotettua seerumia (Atlanta Biologicals). PC3-solut (ATCC) saatiin Dr. D. Terrian (East Carolina University) ja myös ylläpidettiin RPMI 1640 Hiiren alkion fibroblasti ekspressoivat villityypin ja mutantin (Ser51 Ala) eIF2 saatiin tri R. Kaufman ( Sanford /Burnham Medical Research Institute) ja on kuvattu aiemmin [17]. Nämä solut kasvatettiin DMEM. Dihydrotestosteroni, bikalutamidi, ja aktinomysiini D ostettiin Sigma-Aldrich.

konstruktiot ja Reporter Analyysit

PCR-mutageneesi käytettiin muuntua alkua kodonit uORFs välillä elokuu Gug

TMEFF2

5 ’UTR. Käytetyt alukkeet mutageneesiä varten on lueteltu taulukossa 1. 5 ’UTR insertoitiin ylävirtaan Gaussia

lusiferaasin

geenin pCMV-Gluc-vektoriin (New England Biolabs). TMEFF2-myc-his-fuusion konstrukti on aiemmin kuvattu (11). Sillä uORF analyysit, soluja kasvatettiin 70-90% konfluenssiin 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin 1,5 ug kutakin konstruktia kohti ja sama määrä pSEAP-Control Vector II (BD Biosciences). Solut transfektoitiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seuraten valmistajan protokollaa ja käyttämällä 4 ul /kuoppa Lipofectamine-reagenssia. Solut ja supernatantit kerättiin 24 tuntia transfektion jälkeen, ja lusiferaasiaktiivisuus määritettiin supernatanteista käyttäen BioLux Kit (New England Biolabs). SEAP mitattiin käyttämällä Great Escape SEAP Chemiluminescence Kit 2.0 (Clontech Laboratories). Sekä määrityksissä, luminesenssi havaittiin käyttämällä 20/20

n luminometrillä (Turner Biosystems).

DHT stimuloimaa toimittaja määrityksissä, solut hormoni puutteessa 48 tuntia fenoli red- väliaineessa, joka sisälsi 10% hiilellä erotettua seerumia (CSS) ennen stimulaatiota DHT. Kaksikymmentäneljä tuntia sen jälkeen, kun hormoni poistamisen solut transfektoitiin käyttämällä Fugene HD-transfektioreagenssia (Promega) valmistajan ohjeiden suositusten mukaisesti. Lyhyesti, 10 ug kutakin konstruktia ja 10 ug pSEAP2 laimennettiin seerumittomalla RPMI yhdessä 30 ul: Fugene HD reagenssin kokonaistilavuudessa 500 ui. 100 ui tätä transfektioseos lisättiin kuoppaa kohti 6-kuoppalevylle. Seuraavana päivänä DHT tai etanoli ajoneuvon lisättiin tuoretta CSS-RPMI ja soluja inkuboitiin vielä 48 tuntia ennen sadonkorjuuta soluihin ja supernatantteja. Mitata Gaussia lusiferaasi-mRNA-tasot, RNA eristettiin soluista käyttämällä RNAqueous kittiä (Ambion) jälkeen mukana protokollaa. Sitten cDNA syntetisoitiin käyttäen iScript (BioRad Laboratories), ja lusiferaasin mRNA-tasot mitattiin qRT-PCR: llä käyttämällä IQ SYBR Green Supermix ja IQ5 Real-Time PCR Detection System (BioRad Laboratories). Lusiferaasin mRNA-tasot normalisoitiin S-

aktiini

ja geeniekspressio analysoitiin IQ5 Optical System Software (BioRad Laboratories). Katso taulukko 1 pohjamaaleille käytetään qRT-PCR.

DHT Stimulation Time-kurssi

Soluja hormoni-nälässä in fenolipunaista jotka sisälsivät 10% CSS yön yli ennen stimulointia 10 nM DHT tai DMSO-kontrollin. Aktinomysiini D: tä käytettiin konsentraationa 5 nM. RNA eristettiin soluista käyttämällä RNeasy Kit (Qiagen), ja cDNA syntetisoitiin käyttäen SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen).

TMEFF2

viesti tasot mitattiin qRT-PCR-monistus käyttäen TaqMan

TMEFF2

alukkeita (Hs00249367_m1, Applied Biosystems), ja normalisoitiin

GAPDH

viesti tasoilla (monistettiin Hs99999905_m1, Applied Biosystems).

androgeenireseptorin knockdown

AR ilmentyminen väheni 22RV1 soluissa käyttämällä oN-TARGET plus SMART allas ihmisen AR (Thermo Scientific). Non-kohdistaminen siRNA sisällytettiin kontrollina. Lyhyesti, 5 ui hiljentäminen RNA: ita ja 7,5 ui DharmaFECT Transfection Reagent (Thermo Scientific) olivat kukin erikseen laimennettiin 300 ui: aan seerumitonta, fenolipunaista RPMI. 5 minuutin kuluttua inkuboinnin liuokset yhdistettiin ja inkuboitiin vielä 20 minuuttia huoneen lämpötilassa, sitten lisätään 85% konfluentin yksisolukerroksen on T-25 pulloon, joka sisälsi 2,4 ml täydellistä, fenolipunaista RPMI.

Immunoblottaus

Solulysaatit valmistettiin radioimmunosaostuskokeella (RIPA) puskuri [25 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Trition X-100, 1% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS] täydennettynä 0,1 mM β-glyserofosfaatti, ja 0,5 mM natriumortovanadaattia ja proteaasiestäjäseostabletit (Sigma). Kaksikymmentä ug lysaatit erotettiin Mini-Protean tgx geelit (BioRad) ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Nämä blokattiin sitten 30 minuuttia 5% NFDM laimennettu TBS-T: n ja inkuboitiin primaarisen vasta-aineen yön yli 4 ° C: ssa. Inkuboinnit, joissa on 1:10,000 laimennosta HRP-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology) oli 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Detection suoritettiin käyttäen SuperSignal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Scientific) 5 min. Joissakin tapauksissa blotit stripattiin Palauta PLUS Western Blot kuoriminen Buffer (Thermo Scientific) noudattaen valmistajan suosituksia. Vasta-aineita TMEFF2, PSA, ja eIF2α-P (Ser51) olivat Abcam, eIF2α ja CREB2 /ATF4 vasta-aineet hankittiin Santa Cruz Biotechnology, ja P-eIF2α (Ser51) vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling Technology.

polysomi Analyysi

yksisoluiset kerrokset pestiin kerran kylmällä 1X PBS: llä ja raaputettiin lyysipuskurilla [100 mmol /l KCI: a, 10 mmol /L HEPES (pH 7,4), 0,5% NP40, 5 mmol /l MgCl

2, 100 ug /ml sykloheksimidiä], ja inkuboitiin jäillä 10 min, jota seurasi 5 min spin 10000 rpm: ssä 4 ° C: solujätteiden pelletoimiseksi. Yhtä suuri kuin proteiinin pitoisuudet sytoplasman uutteet (1,8 mg), sitten päällekkäin päälle lineaarista sakkaroosigradienttia [15-45% (w /v) 10 mmol /L HEPES (pH 7,4), 100 mmol /l KCI, 5 mmol /l MgCl

2] ja sentrifugoitiin 35000 rpm: ssä 2 tunnin ajan 4 ° C: ssa SW41-Ti roottori ilman jarrua. Käyttämällä ISCO UA-6, fraktioita kerättiin jatkuvasti UV seuranta 254 nm. RNA eristettiin fraktioista käyttämällä Trizol-reagenssia (Ambion). Kaksikymmentäviisi ug RNA: ta käytettiin sitten cDNA-synteesi käyttäen iScript (BioRad Laboratories). Näyte 0,1 ug kutakin cDNA: ta valmistetta käytettiin monistamaan

TMEFF2

,

ATF4

, ja

β-aktiini

PCR: llä käyttäen Platinum Taq HiFi DNA Polymerase-järjestelmä ( Invitrogen). Sitten PCR-tuotteet visualisoitiin 1% agaroosigeelillä ja analysoitiin käyttäen julkista NIH Image J ohjelma (kehitetty Yhdysvaltain National Institutes of Health ja Internetissä osoitteessa https://rsb.info.nih.gov/nih- image /).

Immunoflourescence

solut maljattiin tiheydellä 10000 solua /kuoppa Lab-Tek 8 hyvin chambered kalvot (Nalge Nunc International) ja inkuboitiin yön yli kostutetussa 37 ° C: ssa inkubaattorissa 5% CO

2. Solut pestiin PBS: ssä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan, pestiin PBS: ssä ja tehtiin läpäiseviksi 0,1% Triton-X100 PBS: ssä ja blokattiin 5% normaalia vuohen seerumia 0,1% PBST: llä. Näytteitä inkuboitiin 1 tunnin ajan, jossa on valittu primaaristen vasta-aineiden. Vastaavat sekundaariset vasta-aineet lisättiin yhdellä 1:500 laimennus 5% vuohen seerumia PBS-T: (0,1% Tween 20): vuohen anti-kani-IgG-AF488 (Invitrogen) ja vuohen anti-hiiri-IgG-AF488 (Invitrogen). Solut pestiin 3 kertaa PBS-T: n (0,1% Tween 20). Leikkeitä kuivattiin ilmassa ja asennettu alustassa, joka sisältää DAPI.

Solunosafraktiointi

otteet kasvatettujen solujen läsnä ollessa 10 nM DHT, tai DMSO: ta kontrollina, fraktioitiin sytosolin, kalvo, ydin- ja solun tukirangan jakeet käyttäen Subsellulaariset Proteome Extraction kit (Calbiochem).

tilastollinen analyysi

Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Erot analysoitiin käyttämällä pariksi, kaksitahoiset t-testejä. P-arvot ≤0.05 (*) tai ≤0.01 (**) pidettiin merkittävinä.

Tulokset

TMEFF2

5′-UTR sisältää useita uORFs että Block käännös TMEFF2 Protein

5 ’UTR

TMEFF2

mRNA sisältää useita mahdollisia uORFs (kuvio 1A), että jos käännetty saattaisi estää käännös

TMEFF2

tärkein koodaus järjestyksessä, ja edistää siten sääntelyyn

TMEFF2

ilme. Tutkia roolia uORFs säätelyssä TMEFF2 proteiinin ekspression, kysyimme estää käännös uORFs vaikuttaisi käännös TMEFF2 proteiinin ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa. TMEFF2-Gaussia lusiferaasiksi (Gluc) toimittaja oli luotu tähän tarkoitukseen kloonaamalla

TMEFF2

5′-UTR, joista neljä uORFs, ylävirtaan gluc sekvenssit (pTM1234-Gluc; kuvio 1 B).

TMEFF2

-Gluc fuusio asetettiin valvonnan CMV-promoottorin. Sääntely panos uORFs on

TMEFF2

käännös arvioitiin muta- aloituskodoneja (AUGs) neljästä mahdollisten uORFs (elokuu on GUG, kuvio 1 B) ja määritetään niiden vaikutus gluc ilmaisun androgeeniriippuvaisissa eturauhassyöpä LNCaP ja sen luu etäpesäkkeitä, androgeeni-riippumaton johdannainen C4-2B solulinjassa. Kuusi- seitsemän-kertainen Lusiferaasiekspressiota havaittu, kun AUGs kaikista neljästä uORFs mutatoitiin (pTMXXXX-Gluc, kuvio 1C). Yhden mutaatioiden AUGs toisen, kolmannen tai neljännen uORFs edistänyt 3-4 kertainen lisäys gluc ilmaisu, kun taas mutatoimalla AUG ensimmäisen uORF oli hyvin pieni vaikutus, mikä viittaa siihen, vähäinen merkitys, jos sellainen on, säätelyyn TMEFF2 ilmaisu. Näin ollen yhdistetty mutaatiot uORFs 2, 3, ja 4 johti viidestä kuuteen-kertainen Lusiferaasiekspressiota reportteri, samanlainen kuin havaittiin, kun kaikki neljä uORFs mutatoitiin (kuvio 1C). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin muiden androgeenien reagoiva (22Rv1) ja riippumattaman (PC3) eturauhassyövän solulinjoissa. Mutaatio uORFs lisännyt Lusiferaasiekspressiota on gluc reportteri, joskin vaihteleva kertainen induktio (kuvio 1 D). Konstrukteissa, joita käytetään näissä kokeissa, fuusio-geenin ohjasi CMV-promoottori, ja lusiferaasin aktiivisuus normalisoitiin mRNA-tasoja. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että uORFs 5′- UTR

TMEFF2

mRNA toiminto synergisesti tukahduttaa käännös tärkeimmistä alavirran ORF.

A) Kaavamainen esitys 394 nt ylävirtaan

TMEFF2

tärkein koodaavan alueen ja suhteellinen lokalisointi neljä mahdollista uORFs (aa = aminohappo) sisällä 5′-UTR. B) Kaaviokuva TMEFF2-Gaussia lusiferaasireporttiterilla ja mutantti konstruktioita. X osoittaa mutaatio AUG on GUG että se estää mutatoidun uORFs. Yhden ja useita mutaatioita otettiin käyttöön. C) lusiferaasiaktiivisuus osoituksena pTM1234-Gluc ja eri mutantti konstruktioita LNCaP ja C4-2 soluja. D) Lusiferaasiaktiivisuutta osoituksena pTM1234-Gluc ja konstrukti kaikki uORFs mutatoitunut (pTMXXXX-Gluc) PC3 ja 22Rv1 soluja. C) ja D) lusiferaasiaktiivisuus mitattiin supernatantissa ja lasketaan ensin normalisointia ja mRNA-tasot kutakin konstruktia ja sitten lusiferaasiaktiivisuus osoittaa pTM1234-Gluc reportteri-konstrukti, joka ei ole mutaatioiden uORFs, pidetään mielivaltaisesti kuten 1. tiedot on esitetty ovat keskiarvo ± SD vähintään kahden itsenäisen kokeen useita rinnakkaista. *,

p

0,05, ja **,

p

0,01.

Käännös on TMEFF2-Luciferase Reporter säätelee Androgeenit kautta mekanismi, joka edellyttää läsnäoloa ja uORFs mRNA Leader alueen

transkriptio

tmeff2

geeni säätelee androgeenien [8]. Kuitenkin on ehdotettu, että androgeenien myös vaikuttaa

TMEFF2

ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla [10], kannustavat myös tutkia

TMEFF2

käännös vaikuttivat androgeenien. 22Rv1 solut valittiin näissä kokeissa, koska: i) niiden on osoitettu olevan hyödyllinen malli AR-välitteistä reportterigeenin määritykset [18], ii) he osoittivat korkeimman kertainen nousu lusiferaasireporttiterilla geenin ilmentymisen, kun uORFs mutatoitiin ( katso kuva 1 D), ja iii) ne ilmentävät havaittavia määriä endogeenista TMEFF2 proteiinia. 22Rv1 solut transfektoitiin pTM1234-Gluc reportteri, kasvatettiin fenolipunaista alusta täydennettynä hiilellä erotettua (CS) FBS – poistamiseksi steroidi hormones- ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla dihydrotestosteroni (DHT). Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin supernatanteista ja normalisoitiin mRNA-tasoja. Lisäksi DHT kasvoi Lusiferaasiekspressiota annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2A), mikä osoittaa, että androgeenien stimuloivat käännös pääasiassa ORF. Tärkeää on, tämä vaikutus havaittiin DHT pitoisuuksilla, fysiologiset tasot löydetty ihmisen seerumissa [19]. Lusiferaasin aktiivisuus kantavien solujen pTMXXXX-Gluc reportteri-konstrukti, jossa AUGs kaikista neljästä uORFs mutatoitiin, ei muutu vasteena DHT, vaikka, kuten odotettua, oli paljon suurempi (kuvio 2A). Nämä tulokset osoittavat, että käännös tärkeimmät ORF alavirtaan

TMEFF2

5′- UTR säädellään androgeenien käytettäessä uORF riippuvaisella tavalla.

A) Lusiferaasiaktiivisuutta osoituksena pTM1234-Gluc ja pTMXXXX-Gluc mutantti-rakenteen 22Rv1 soluissa, kun läsnä on eri pitoisuuksia DHT. B) Lusiferaasiaktiivisuus osoittaa pTM1234-Gluc-rakenteen 22Rv1 soluissa, kun läsnä on eri pitoisuuksia DHT ja DHT +20 uM bikalutamidi (BIC), AR-agonisti. C) Lusiferaasiaktiivisuus osoittaa pTM1234-Gluc rakentaa PC3-soluissa, kun läsnä on eri pitoisuuksia DHT. Kaikkien näiden kokeiden soluja hormonin puutteessa fenolipunaista vapaata väliainetta, joka sisälsi puuhiilellä puhdistettua seerumia. Lusiferaasiaktiivisuus normalisoitiin mRNA-tasot kutakin konstruktia ja sitten lusiferaasiaktiivisuus osoitettiin kukin rakenteiden ilmentää soluissa kasvatettu ilman DHT, joka oli asetettu 1. Tiedot on esitetty ovat keskiarvo ± S.D. vähintään kolmen itsenäisen kokeen useita rinnakkaista. *,

p

0,05, ja **,

p

0,01.

onko DHT vaikutus käännös välittyy AR , edellä kuvattujen kokeiden toistettiin läsnä bikalutamidin estää AR aktivointia. Lisäksi tämän lääkkeen vähensi DHT-välitteisen induktion pTM1234-Gluc toimittaja Lusiferaasiekspressiota lähes perustason tasolle, vaikka pieni kaksi- kolminkertaiseksi induktio voitiin havaita 10 nM DHT (kuvio 2B). Nämä tulokset osoittavat, että vaikutus DHT käännökset reportterikonstruktio vaatii AR signalointia. Suostumuksella Näiden tulosten emme noudata DHT aiheuttama käännös pTM1234-Gluc reportteri PC3 eturauhassyövän solut, jotka eivät ilmennä AR (kuvio 2C). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että DHT-indusoitua käännös

TMEFF2

vaatii aktivoinnin AR ja välittyy uORFs leader-alueella mRNA: n.

käännös Endogeenisen TMEFF2 Proteiini on säätelee androgeenit

muutokset ilmaus endogeenisen TMEFF2 proteiini vastauksena androgeenien analysoitiin myös. Tätä tarkoitusta varten 22Rv1 soluja kasvatettiin fenolipunaista alusta täydennettynä CS-FBS käsiteltiin eri pitoisuuksilla DHT, ja lysaatit analysoitiin TMEFF2 ilmentyminen western-blottauksella. Puuttuessa androgeenien, ilmentymisen TMEFF2 oli tuskin havaittavissa. Kuitenkin, lisäksi DHT lisääntynyt TMEFF2 ilmentymistä (kuvio 3A), ja tuloksena korkeimman tason alueella fysiologisten DHT pitoisuuksia. DHT-indusoitua ekspressiota endogeenisen TMEFF2 havaittiin myös androgeenin reagoiva eturauhassyöpä LNCaP-soluja (kuvio 3A). Ekspressiota eturauhasen androgeenin (PSA), AR kohde käytettiin kontrollina androgen transkriptionaalisen aktiivisuuden, on parannettu lisäämällä DHT (kuvio 3A). Solujen käsittelyä bikalutamidi erityisesti esti DHT aiheuttamaa TMEFF2 ja PSA lausekkeen, joka todettiin vain korkeimmat pitoisuudet DHT (kuvio 3A). Esto DHT-indusoitua TMEFF2 ilmentyminen saavutettiin myös, kun kaatamalla ilmentymisen AR käyttäen siRNA (kuvio 3B). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että ekspressio endogeenisen TMEFF2 proteiini säätelee AR signalointi.

A) tyypillisen western blotit osoittavat kasvua TMEFF2 ilmentyminen vasteena DHT lisäys 22Rv1 ja LNCaP-soluja (α = vasta-aine ). Samanaikainen lisäys 20 uM bikalutamidin ja 22Rv1 soluihin (keskimmäinen paneeli) esti kasvu TMEFF2 ilmaisun havaittu fysiologista pitoisuutta DHT. PSA: ta käytettiin positiivisena kontrollina, koska sen ilmentyminen indusoi androgeenin AR-riippuvaisella tavalla. β-tubuliinia käytettiin latauskontrollina. B) Western blot osoittaa tehokas kaataa kahden muotojen AR 22Rv1 soluissa käyttämällä siRNA (oikealla). Tyypillinen Western blot osoittaa, että lisäämällä DHT ei ole vaikutusta ekspression TMEFF2 soluissa, joissa AR-pitoisuus laski RNAi. PSA käytettiin kontrollina ja odotetusti sen ilmentymistä eivät vaikuttaneet DHT AR-siRNA käsiteltyihin soluihin. β-tubuliinia käytettiin latauskontrollina. C) Muutokset

TMEFF2

mRNA-tasoja LNCaP ja 22Rv1 solulinjoja vastauksena DHT mitattuna qRT-PCR. Arvot normalisoitiin p-tubuliinia mRNA. Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa ja, että edustavat kuvat esitetään, kalvot irrotettiin ja uudelleen tutkittiin eri vasta-aineilla tai samat näytteet ajaa uudelleen eri geelissä. β-tubuliinia käytettiin latauskontrollina joka kerta, kun näytteet ajettiin.

havaittu kasvu

TMEFF2

mRNA-tasot vasteena DHT mitattuna qRT-PCR: llä ( Kuva 3C), yhdenmukaisia ​​aiemman raportin osoittaa, että androgeenien stimuloivat

tmeff2

transkriptio [8]. Kuitenkin vähäinen nousu mRNA ei todennäköisesti selittää havaitun DHT välittämää kasvu proteiiniekspressiossa. Sulkea pois sitä mahdollisuutta, että nousu endogeenisen TMEFF2 proteiinin havaittiin vasteena DHT oli pelkästään lisääntyneen transkription, käytimme aktinomysiini D estää transkription ja arvioidaan tasot TMEFF2 proteiinia ja mRNA: n 22Rv1 solut eri aikapisteissä lisäyksen jälkeen DHT, aiheuttaa

tmeff2

ilmentymisen, ja /tai aktinomysiini D. TMEFF2 proteiinin tasot nousivat dramaattisesti 60-120 min lisäyksen jälkeen DHT, mutta ei DMSO: hon, ajoneuvon ohjaus (kuvio 4A). Tärkeää on, kun läsnä on aktinomysiini D, lisäämällä DHT edelleen edistää kasvua TMEFF2 proteiinin ekspressiota, joskin alhaisemmalla tasolla kuin havaittiin ilman transkription estäjänä. Kuten analyysillä

TMEFF2

-mRNA-tasojen qRT-PCR: llä, lisäämällä aktinomysiini D: inhiboi pohjapinta ja DHT-indusoitua

tmeff2

transkription (kuvio 4B). Lisäksi DHT yksin edistänyt hieman kasvaa aluksi transkriptio (1,2-kertainen jälkeen 20 min), joka vähitellen laski perustasoille jälkeen 60 min hoidon (ei esitetty). Näin ollen, nämä tulokset osoittavat, että androgeenien säätelevät ei ainoastaan ​​transkriptio

tmeff2

geenin, vaan myös käännös endogeenisen

TMEFF2

mRNA, joka tukee edellä esitetyt tulokset käyttäen TMEFF2-lusiferaasireporttiterilla.

A) tyypillisen western blot osoittaa TMEFF2 proteiinin osoitetuissa aikapisteissä lisäyksen jälkeen 10 nM DHT: n läsnä tai poissa ollessa 5 nM aktinomysiini D (Act D) estää transkription. Joko DMSO tai DHT ja aktinomysiini D lisättiin samanaikaisesti. Kvantitointi blotit on esitetty alla Western blot. Bändi intensiteetit käsitellyt näytteet DHT normalisoitiin ensin p-tubuliinia ja sitten arvoihin, jotka saatiin DMSO näytteitä vastaavan ajankohtina. B) Muutokset

TMEFF2

mRNA tasot 22Rv1 soluissa vasteena DHT tai DMSO ja aktinomysiini D hoito mitattuna qRT-PCR. Arvot normalisoitiin

GAPDH

. Esitetyt tiedot edustavat kahta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

Muut proteiinit, mukaan lukien β-kateniinin ja occludin tumaan tai alueiden solujen kosketuksiin jälkeen androgen hoidon. Kuitenkin meidän tulokset osoittivat, että androgeenien hoitoon eivät muuttaneet solunosasijaintia TMEFF2 (kuva S1).

Androgeenien Signaling Edistää eIF2α fosforylaatiomääritys

fosforylaatio eIF2α vähentää maailmanlaajuista käännös vaan myös tarjoaa mekanismin, joka selektiivisesti tehostaa käännös uORF sisältävien mRNA: iden [13], [20]. Siksi arveltu, että DHT edistää endogeenista

TMEFF2

käännös kautta fosforylaation eIF2α. Vaikutus DHT eIF2α fosforylaation tutkittiin Western blot -analyysillä eturauhassyövässä 22Rv1 ja PC3-soluja kasvatettiin fenolipunaista alusta täydennettynä CS-FBS: ää ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla DHT. Kohonnut eIF2α-P havaittiin selvästi, annoksesta riippuvalla tavalla, ja lysaatit DHT-käsiteltyjen 22Rv1 soluissa, mutta ei lysaateissa DHT-käsiteltyjen AR-null PC3-soluja (kuvio 5A), mikä osoittaa, että androgeenien edistää eIF2α-P ja että tämä vaikutus on riippuvainen läsnä funktionaalista AR. Kanssa nämä tulokset, esikäsittely 22Rv1 solujen kanssa AR-antagonistin bikalutamidi estää DHT-välitteisen nousu eIF2α fosforylaatiota (kuvio 5B). DHT lisäksi myös edistää kasvua ilmentymisen ATF4 proteiinin, transkriptiotekijä säätelee eIF2α fosforylaation (kuvio 5A).

A) tyypillisen western blotit osoittavat kasvua eIF2α-P vasteena DHT lisäys 22Rv1 soluja. Tämä vaikutus kumottiin PC3-soluissa, jotka eivät ilmennä AR (oikealla). ATF4 proteiinin tasot mitattiin positiivisena kontrollina, sillä se indusoi eIF2α-P. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. B) lisääminen 20 uM bikalutamidin ja 22Rv1 soluihin esti kasvua eIF2α-P havaittu lisäyksen jälkeen DHT.