Krooninen sairaus

tiivistelmä

munasarjasyöpä on johtava kuolinsyy kaikista gynekologisiin syöpiin ja tavanomaisten hoitojen, kuten leikkauksen, kemoterapian, ja sädehoito yleensä onnistu hallitsemaan pitkälle edennyt tauti. Näin ollen on kiireellisesti vaihtoehtoisia ja innovatiivisia hoitovaihtoehtoja. Olemme selvää, että syövän geeniterapia käyttäen vektoria, joka kykenee spesifisesti tuottaa entsyymiä koodaavan geenin munasarjasyöpäsoluja mahdollistaa syöpäsolujen aineenvaihdunta vaaraton aihiolääkkeen voimakas sytotoksiiniin, joka johtaa terapeuttisia vaikutuksia. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme käyttö ihmisen papilloomaviruksen (HPV) pseudoviruspartikkeliin toimittaa herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin (HSV-tk) geeni munasarjojen kasvainsoluihin. Olemme havainneet, että HPV-16 pseudoviruspartikkeliin pystyi edullisesti infektoimaan hiiren ja ihmisen munasarja- kasvainsoluissa, kun sitä annetaan vatsakalvonsisäisesti. Lisäksi injektoimalla vatsaonteloon HPV-16 pseudovirions kuljettaa HSV-tk-geenin, jota seuraa käsittely gansikloviirin johti merkittäviä terapeuttisia antituumorivaikutuksia hiiren munasarjasyövän-hiirille. Tuloksemme viittaavat siihen, että HPV pseudoviruspartikkeliin voi toimia mahdollisena kuljetusvehikkelinä munasarjasyöpä geeniterapiassa.

Citation: Hung C-F, Chiang AJ, Tsai H-H, Pomper MG, Kang TH, Roden RR, et al. (2012) munasarjasyöpä Gene Therapy käyttäminen HPV-16 pseudoviruspartikkeliin kantaminen HSV-tk Gene. PLoS ONE 7 (7): e40983. doi: 10,1371 /journal.pone.0040983

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center ja Beckman tutkimuslaitos, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 15 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 17 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Hung et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute Specialized ohjelmat Research Excellence (https://trp.cancer.gov/) kohdunkaulan syövän P50 CA098252, CA118790 (Roden), ja CA122581 (Roden). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on johtava kuolinsyy kaikista gynekologisten syöpien ja kuudenneksi yleisin maligniteetti naisilla Yhdysvalloissa [1], [2]. Vaikka merkittävää edistystä on tapahtunut sekä kirurgisten ja kemoterapeuttiset tekniikoita, yleinen 5-vuoden eloonjäämisluvut kaikkia vaiheita varten munasarjasyövän pysyvät 50% [2], [3]. Nykyinen hoitoja (kirurgia, kemoterapia, ja sädehoidon) yleensä onnistu hallitsemaan pitkälle edennyt tauti. Siksi vaihtoehtoisia hoitomenetelmiä voi toimia tärkeitä menetelmiä ohjaamiseen näiden pitkälle munasarjojen kasvaimia.

Yksi mahdollinen lähestymistapa on käyttää itsemurhan geeniterapian (SGT). Kanssa SGT geeni ulkomaisen entsyymin (eli yksi viruksesta, bakteereista, tai hiiva) on erityisesti toimitetaan syöpäsoluja. Gene toimitus seuraa systeeminen anto myrkytöntä aihiolääkettä. Tartunnan syöpäsolut voivat ilmentää vierasta entsyymi muuntaa esilääkkeen aktiivisen sytotoksiinin, joka pystyy tappamaan infektoituneiden solujen. Yksi etu SGT on tavanomaisiin geeniterapia on sen kyky tappaa naapurisolujen kautta sivustakatsojavaikutus. Aktiivinen lääke voi paeta transdusoidut solut ja kulkeutuvat kuulumattomien naapurimaiden tartunnan saaneiden solujen, jotka johtivat lopulta kuolemaansa samoin. Kuolevat solut voivat myös indusoida luonnollisten tappajasolujen (NK) ja T-solujen indusoimiseksi kaukana sivustakatsojavaikutus. Toivoa tämä lähestymistapa on saada suuri spesifisyys kasvainsolujen, erityisesti syövän kantasoluja. Tämän lähestymistavan pitäisi myös vähentää myrkyllisiä sivuvaikutuksia, jotka liittyvät tavanomaisten syövän hoitomuotoja johtuu lisääntyneestä spesifisyyden sekä toimituksen ja aktivointi Sytotoksiini [4].

eniten tutkittu itsemurhageenille /aihiolääke järjestelmä on yhdistelmä herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin (HSV-tk) kanssa gansikloviirin (GCV) [5]. HSV-tk, joka on suuri affiniteetti gansikloviirin, katalysoi ensimmäinen fosforylaatiota GCV jotka voidaan sitten di- ja fosforyloituu solukinaasien. Trifosfory- GCV voidaan sisällyttää replikoituvaan DNA, joka johtaa polyme- raasi-inhibition ja lopulta apoptoosin [4] – [6]. Tämä järjestelmä on osoittanut jonkin verran menestystä klinikalla, mutta sen käyttökelpoisuus on rajoitettu sen riippuvuus solu-solu-kontakti ja aukkoliitokset varten sivustakatsojavaikutus [4].

5-8 viikkoa vanhoja C57BL /6-hiirten altistettiin MOSEC kasvainsolujen (1 x 10

6 solua /hiiri). Yksi viikko myöhemmin, tuumoreita kantavaa hiirtä injektoitiin intraperitoneaalisesti tai ilman HPV-16 /luc pseudovirions (20 ug HPV-16 L1-proteiinin /hiiri, mikä vastaa 120 ng DNA: ta /hiiri). Naiivi infektoidut hiiret kanssa tai ilman HPV-16 /luc pseudovirions toimi kontrollina. Hiiret kuvantaa noninvasiivinen luminesenssikuvantamisessa 1 päivä sen tartunnan. Esitetyt tiedot edustavat 2 kokeita.

Tätä tutkimusta varten, käytämme replikaatiopuutteellisia ihmisen papilloomaviruksen (HPV) pseudovirions toimittaa HSV-tk-geenin munasarjojen kasvainsoluihin. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, DNA-plasmidit voidaan pakata suoraan papilloomaviruksen L1 ja L2-kapsidiproteiineja tuottaa ”pseudoviruspartikkeliin”, joka voi tehokkaasti tuottaa DNA: n useita solulinjoja [7] – [9]. Kapselointi suojaa myös DNA nukleaasien ja tarjoaa kohdennettuja toimitusta vakautta. Monet turvallisuuteen liittyviä ongelmia eläviä virusvektoreita lievittää HPV pseudovirions sisältävät DNA-konstruktin eroaa luonnollisen HPV-viruksen genomiin. Myös yli 100 eri papilloomaviruksen pseudovirions, joka mahdollistaa toistuvaan lisäämiseen käyttämällä erilaisia, koska neutraloivien vasta-aineiden yhtä tyyppiä eivät yleensä ole ristiin reagoiva muiden tyyppien.

Tässä me tutkimme käyttö HPV pseudovirions ja toimittaa markkerigeeni ja itsemurha geenejä sekä hiiren ja ihmisen munasarjojen kasvainsoluja. Olemme havainneet, että vatsaonteloon HPV-16 pseudovirions johti suosivista infektio ektooppinen ja spontaanisti esiintyviä hiiren munasarjojen syöpien hiirillä. Etuoikeutetut infektio tapahtui myös ihmisen munasarjan tuumoriksenografteja kasvaimen kantavien hiirten. Vatsaonteloon HPV-16 pseudovirions kuljettaa HSV-tk-geenin, jota seuraa gansikloviirin johti merkittäviä terapeuttisia antituumorivaikutuksia hiiren-munasarjasyövän-hiirille. Tuloksemme osoittavat proof-of-periaate, jonka mukaan HPV pseudovirions voi olla hyötyä levittäjinä terapeuttisten geenien munasarjojen syöpiä.

5-8 viikkoa vanhoja nude-hiiriin ruiskutettiin intraperitoneaalisesti ES2 ihmisen munasarjojen kasvainsoluja (1 x 10

6 solua /hiiri). Yksi viikko myöhemmin, tuumoreita kantavaa hiirtä injektoitiin intraperitoneaalisesti villityypin (wt) HPV-16 /Luc PSV tai mutantti-L2 (mtL2) HPV-16L1mtL2-Luc pseudovirions (20 ug HPV-16 L1-proteiinin /hiiri, mikä vastaa 120 ng DNA /hiiri). Naiivi hiiret tartunnan paino- tai mt HPV-16 /luc pseudovirions toimivat vertailuryhmänä. Hiiret kuvantaa noninvasiivinen luminesenssikuvantamisessa 1 päivä sen tartunnan. Esitetyt tiedot edustavat 2 kokeita.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suositusten opas Care ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Kaikki toimenpiteet suoritettiin ennakkohyväksyntää Johns Hopkins Animal Care ja Käytä komitea (protokolla MO08M446).

Hiiret

C57BL /6 ja nude (BALB /c nu /nu) hiirten hankittu National Cancer Institute.

MISIIR-TAG

siirtogeenisiä hiiriä [10] oli ystävällisesti toimittanut Dr. Denise Connolly Fox Chase Cancer Center. Kaikkia eläimiä ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa, ja kaikki toimenpiteet suoritettiin mukaan hyväksyttyjen käytäntöjen ja suositusten mukaisesti oikeasta käytöstä ja hoidosta koe-eläimiä.

C57BL /6-hiirten ja

MISIIR -tagin

hiiret injektoitiin 20 ug: lla HPV-16 /luc PSV injektiona vatsaonteloon 10 viikkoa syntymän jälkeen. Luminenssi kuvat otettiin 1 päivä sen HPV-16 /luv PSV injektio.

Top

edustaja luminenssi kuvia PSV-tartunnan C57BL /6-hiirten tai

MISIIR-TAG

siirtogeenisiä hiiriä (vasemmalla) ja korjattua elimet (oikealla). Huomautus: Valkoinen nuoli osoittaa vain munasarjasyöpä päässä MISRII siirtogeenisiä hiiriä voidaan tartunnan HPV-16 /luc PSV.

Ala,

edustaja bar kaavioita luminesenssikuvantamisessa in MISIIR-TAG siirtogeenisiä hiiriä tai C57BL /6-hiiristä. Data edustaa 2 kokeita.

Solulinjat

293TT solut ystävällisesti J Schiller (National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health (NIH)) [11 ]. MOSEC solulinja (hiiren munasarjasyövän solulinja) oli valmis, kuten aiemmin on kuvattu [12]. ES2 solulinja (ihmisen munasarjasyöpä solulinja) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. MOSEC /lusiferaasi (MOSEC-luc) soluja synnytettiin, kuten aiemmin on kuvattu [13].

MOSEC-Luc-solut infektoitiin HPV16-GFP PSV tai HPV16 /HSV-tk PSV pitoisuutena 1 ug L1-proteiinia /ml 48 tuntia. Tartunta-solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja sitten käsiteltiin 0 ug /ml, 0,1 ug /ml, 1 ug /ml, tai 10 ug /ml Gansikloviiri 72 tuntia. Lusiferaasiekspressiota tutkinut IVIS 200 järjestelmä (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Esitetyt tiedot edustavat 2 kokeita.

Plasmidit

plasmideja, jotka koodaavat HPV16 L1 L2 (pShell16) ystävällisesti Dr. J Schiller (NCI). Pistemutaatio HPV16L1 mtL2 konstruktio on kuvattu edellisessä tutkimuksessa [14]. Sukupolven lusiferaasi-ilmentävien plasmidin (pcDNA3-lusiferaasi), ja GFP-proteiinia ekspressoivien plasmidin (pcDNA3-GFP) on kuvattu aiemmin [15], [16]. Prof-HSVtk plasmidi ostettiin InvivoGen.

HPV pseudoviruspartikkeliin Production

HPV16-GFP, HPV16-Luc (lusiferaasi), HPV16-tk (HSVtk herpes simplex virus tymidiinikinaasi) pseudovirions olivat menetelmiä käyttäen, kuten on kuvattu aiemmin [11]. Lyhyesti, 293TT solut kotransfektoitiin HPV ekspressioplasmideilla pShell16 ja plasmidit valinnan (kuten GFP, lusiferaasi tai HSVtk) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 48 tunnin kuluttua solut otettiin talteen ja pestiin Dulbeccon fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) (Invitrogen), jota oli täydennetty 9,5 mM MgCl

2 ja antibiootti-antimykoottiseosta (DPBS-Mg) (Invitrogen). Solut suspendoitiin DPBS-Mg täydennetty 0,5% Brij58, 0,2% Bentsonaasi (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, USA) ja 0,2% Plasmidi Safe (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) 100 x 10

6 solua /ml ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 h kapsidin kypsymistä. Kypsymisen jälkeen, solulysaatti jäähdytettiin jäillä 10 min ajan. Suolapitoisuus solulysaatin säädettiin 850 mM, ja inkuboitiin jäillä 10 min. Sitten lysaatti kirkastettiin sentrifugoimalla, ja supernatantti kerrostettiin päälle Optiprep kaltevuus. Gradientti pyöritettiin 4,5 h 16 C 40 000 rpm joka SW40 roottoria (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Puhtaus HPV pseudovirions arvioitiin suorittamalla jakeet 4-15% gradientilla natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi. Kapseloitu DNA-plasmidi kvantifioitiin uuttamalla kapseloitu DNA Optiprep ryhmittymien seurasi kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR vertailuja sarjalaimennoksissa paljaan DNA: n. Pitoisuudet plasmideja (GFP, lusiferaasi tai HSVtk) on pseudovirions määritettiin olevan noin 6,2 ng DNA: ta per 1 ug L1-proteiinin.

In vitro

Infektio kasvainsolujen HPV16 Pseudovirions

MOSEC tai ES2 solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5000 solua /kuoppa ja kasvatettiin yön yli. Solut infektoitiin HPV-16 /Luc PSV (1 ug L1-proteiinia /ml) 72 tunnin ajan. Lusiferiinin (15 ug /ml) lisättiin ja inkuboitiin 10 min. Integrointiaika 10 sekuntia käytettiin luminesenssi kuva hankinta jonka IVIS 200 järjestelmä (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA).

karakterisointi Kasvain Infektio HPV16 Pseudovirions hiirissä

C57BL /6-hiiret (5 ryhmää kohti) injektoitiin intraperitoneaalisesti 1 x 10

6 MOSEC solua /hiiri. Yksi viikko myöhemmin, tuumoreita kantavaa hiirtä injektoitiin intraperitoneaalisesti HPV-16 /Luc PSV: n annoksella 20 ug HPV-16 L1-proteiinin /hiiri (vastaa 120 ng DNA: ta /hiiri). Luminenssi kuvat tallennettiin seuraavana päivänä HPV-16 /Luc PSV injektio. Integrointiaika 2 min käytettiin luminesenssin kuvan hankinnan.

luonnehdinta infektio ihmisen munasarjan syöpäsolujen HPV-16 /Luc PSV, nude-hiiret altistettiin ES2 ihmisen munasarjatuumori soluihin annoksella 1 x 10

6 solua /hiiri. Yksi viikko myöhemmin, tuumoreita kantavaa hiirtä injektoitiin intraperitoneaalisesti villityypin (wt) HPV-16 /Luc PSV tai mutantti (mt) HPV-16L1mtL2-Luc PSV: n annoksella 20 ug HPV-16 L1-proteiinin /hiiri (yhtä 120 ng DNA: ta /hiiri). Naiivi hiiret ilman kasvaimia tartunnan paino- tai mt HPV-16 /Luc PSV toimivat vertailuryhmänä. Luminenssi kuvat otettiin seuraavana päivänä HPV-16 /Luc PSV injektio. Hiiriin injektoitiin 0,2 ml: lla 15 mg /ml beetle lusiferiinin (kaliumsuola, Promega). 10 minuutin kuluttua hiiret kuvattiin käyttäen IVIS 200-järjestelmän (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Integrointiaika 30 sekuntia käytettiin luminesenssin Image Acquisition.

In vitro

sytotoksisuus Tukena HPV16-TK Pseudovirions ja Gansikloviiri

MOSEC-Luc solut infektoitiin HPV16- GFP PSV tai HPV16-TK PSV (1 ug L1-proteiinia /ml) 48 tuntia. Infektoituja soluja ympättiin 96-kuoppalevyille. Tartunta-soluja käsiteltiin 0 ug /ml, 0,1 ug /ml, 1 ug /ml, tai 10 ug /ml gansikloviirin 72 tunnin ajan, ja lusiferaasin ilmentymistä tutkittiin IVIS 200 järjestelmän (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA ).

In vivo

sytotoksisuus Tukena HPV16-TK Pseudovirions ja Gansikloviiri

Hiiret ruiskutettiin intraperitoneaalisesti 1 x 10

6 MOSEC-Luc solua /hiiri päivänä 1. Lusiferaasiaktiivisuus tutkittiin päivänä 2 osoituksena kasvainten määrä hiiren. Hiiriin injektoitiin 0,2 ml: lla 15 mg /ml beetle lusiferiinin (kaliumsuola, Promega). Kymmenen minuutin kuluttua hiiret kuvattiin käyttäen IVIS 200-järjestelmän (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Integrointi aika 2 min käytettiin luminesenssin Image Acquisition. Hiiriin injektoitiin HPV16-GFP PSV (20 ug L1-proteiini) tai HPV16-TK PSV (20 ug L1-proteiini) 3. päivänä Hiiriä käsiteltiin päivittäin gansikloviirin (50 mg /kg) tai PBS: ää päivästä 5 päivään 18. Hiiret kuvattiin jälleen noninvasiivinen luminesenssikuvantamisessa päivänä 20.

tulokset

vatsaonteloon HPV-16 Pseudovirions johtaa Etuuskohteluun Infektio Hiiren munasarjasyöpäsoluja kasvaimia omaavilla hiirillä

aluksi tutkia, mikäli HPV-16 pseudoviruspartikkeliin kuljettavat lusiferaasigeenin (HPV-16 /Luc PSV) kykeni infektoimaan hiiren munasarjasyövän solulinja, MOSEC,

in vitro

. Kuten kuviossa S1, HPV-16 /Luc PSV kykeni infektoimaan MOSEC kasvainsolujen

in vitro

. Sen osoittamiseksi, jos HPV-16 /Luc PSV voi tarttua myös hiiren munasarjasyövän solulinja tuumoria kantavissa hiirissä, ensin intraperitoneaalisesti hiirille, joilla MOSEC kasvainsoluja. Kasvainta kantavia hiiriä intraperitoneaalisesti HPV-16 /Luc PSV viikkoa myöhemmin. Kuten on esitetty kuviossa 1, kun taas hiiret ilman kasvaimia ei ilmennyt lusiferaasiaktiivisuuden, jolla on kasvain intraperitoneaalisesti HPV-16 /Luc PSV osoittanut merkittävää lusiferaasiaktiivisuutta. Nämä tiedot viittaavat siihen, HPV pseudoviruspartikkeliin infektoi ensisijaisesti kasvainsolujen tuumoria kantavissa hiirissä.

vatsaonteloon HPV-16 Pseudovirions Johtaa Preferential Infektio ihmisen munasarjasyövän solut kasvain Nude hiiret

Me tutkittiin lisäksi HPV-16 /Luc PSV pystyi tartuttaa ihmisen munasarjasyövän solulinja ES2. Kuten kuviossa S2, ES2 infektoidut solut HPV-16 /Luc PSV osoittanut lusiferaasiaktiivisuus, mikä viittaa siihen, että HPV-16 /Luc PSV kykeni infektoimaan ihmisen munasarjan syöpäsolujen

in vitro

. Meillä on myös tunnettu siitä,

in vivo

infektiivisyys HPV-16 /luc PSV nude-hiirillä, joilla on ES2 ihmisen munasarjan kasvaimet onko tarttuvuuden HPV pseudovirions on välttämätöntä tehokas geenien toimittaminen munasarjojen kasvainsoluihin HPV pseudovirions. Nyt on selvää, että HPV L2 vähäinen kapsidiproteiini on olennaista tehokkaan infektion solujen HPV pseudovirions [14], [17]. Näin ollen meidän on käyttää HPV-16 /Luc PSV, jossa on yhden aminohapon mutaatio HPV L2 (HPV16L1mtL2-luc PSV), joka poistetaan tarttuvuuden pseudovirions [14]. Kuten on esitetty kuviossa 2, vain nude-hiirissä, joilla on ihmisen munasarjan kasvaimia osoitti merkittävää luminesenssi verrattuna ei-kasvain nude-hiirissä. Lisäksi vain kasvainta kantavien hiirten infektoitu HPV-16 /luc PSV, mutta ei mutantti-HPV-16 /L1mtL2- luc PSV osoittanut merkittävää luminesenssin (Fig. 2). Siten meidän tiedot osoittavat, että HPV-16 pseudovirions voi myös valikoivasti tartuttaa ihmisen munasarjan kasvainsolujen

in vivo

. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että ehjä HPV L2 on välttämätöntä tehokasta antamista kapseloitu geenien munasarjojen kasvainsoluihin HPV pseudovirions.

HPV-16 /luc PSV infektoi ensisijaisesti ovariokasvainten

MISIIR tag

siirtogeeniset Mouse

tutki vielä suosivista infektio munasarjojen kasvainsolujen HPV pseudovirions

MISIIR-tag

siirtogeenisen hiiren, spontaanisti esiintyviä hiiren munasarjakasvain malli. Tämä siirtogeeninen hiiri, joka ilmaisee muuttamassa alue SV40 valvonnassa MUllerin estävä aine tyypin II reseptorin geenin promoottori, on osoitettu kehittää kahdenvälistä munasarjojen kasvaimia. Siksi spontaanit munasarjasyöpä malli

MISIIR-Tag

siirtogeenisiä hiiriä muistuttaa enemmän ihmisen munasarjasyöpä kuin elinsiirtojen mallia kuten MOSEC kasvain malli.

MISIIR-Tag

siirtogeenisen hiiren on raportoitu spontaanisti kehittyä munasarjasyöpäpotilailla kuluessa 6-13 viikkoa syntymän [10]. Meidän lab, kaikki

MISIIR-Tag

siirtogeenisiä hiiriä (uudelta linja hankittiin Dr. Connolly) kehittyi munasarjojen kasvaimia 4 kuukauden kuluessa syntymästä. Me pistetään HPV-16 /luc PSV 10 viikkoa syntymän jälkeen, ja huomasimme, että HPV-16 /Luc PSV voisi myös valikoivasti tartuttaa spontaanisti esiintyviä munasarjasyövän

MISIIR-Tag

siirtogeenisiä hiiriä (Fig. 3). Lisäksi havaitsimme, että elintärkeitä elimiä, mukaan lukien keuhkot, sydän, vatsa, pernassa ja munuaisissa ei tartunnan. Lisäksi, ei ole lusiferaasiaktiivisuus havaittiin normaalissa munasarjat C57BL /6-hiiriä, joihin injektoitiin HPV-16 /luc pSV. Siten meidän tiedot osoittavat, että HPV-16 pseudovirions voi selektiivisesti tartuttaa munasarjakasvain solujen spontaanisti esiintyvän hiiren munasarjatuumorissa malli.

Infektio HPV-16 Pseudovirions kantaminen HSV-tk Gene seuraa käsittely Gansikloviiri Johtaa

in vitro

sytotoksisuus Infected Cells

etuoikeutettu infektio HPV-16 pseudovirions munasarjasyöpää kasvainsoluissa sallii mahdollisuuden nimenomaisesti kantaa terapeuttisen DNA munasarjojen kasvainsoluihin valvontaa varten munasarjojen kasvaimia. Koska ensimmäisen annon HPV pseudovirions ei ehkä voi tartuttaa kaikki munasarjojen kasvainsoluja, on tärkeää ottaa huomioon strategia, joka mahdollistaa munasarjojen kasvainsoluja ei suoraan tartunnan myös tulla alttiita. Siksi valitsimme HSV-tk /gansikloviirin järjestelmä, koska se on laajimmin tutkittu itsemurha geeniterapian järjestelmän ja yli kahden vuosikymmenen yrittää käyttää järjestelmää kuin syöpähoidolla on osoittanut vaihtelevalla menestyksellä. Osoittaakseen jos HPV-16 /HSV-tk PSV voi tartuttaa munasarjojen kasvainsoluja ja tekevät niistä alttiita tappaminen käsittelemällä gansikloviirin, me tartunnan MOSEC-Luc solujen HPV16-GFP PSV tai HPV16 /HSV-tk PSV 48 tuntia. Tartunnan jälkeen soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla gansikloviirin ja lusiferaasin ilmentymistä infektoituneiden solujen mitattiin käyttämällä IVIS 200 järjestelmään. Kuten on esitetty kuviossa 4, MOSEC-Luc kasvainsoluja HPV-16 /HSV-tk PSV, jota seuraa käsittely gansikloviirin johti solukuoleman infektoituneiden solujen

in vitro.

Tätä ei havaittu infektoiduissa soluissa HPV-16 /GFP. Havaitsimme myös, että korkeammat pitoisuudet gansikloviirin johti enemmän solukuolemaa. Samanlaisia ​​vaikutuksia ei havaittu, kun samanlaiset testit suoritettiin ihmisen munasarjasyövän solulinja ES2 (katso kuva S3).

vatsaonteloon HPV-16 Pseudovirions kantaminen HSV-tk Gene seuraa käsittely Gansikloviiri johtaa huomattaviin kasvaintenvastainen vaikutukset Hiiren Munasarjojen Cancer kantavien hiirten

täsmentyvät jos MOSEC kasvainta kantavien hiirten tartunnan HPV-16 /HSV-tk PSV seuraa käsittely gansikloviirin voisi esiintyä terapeuttisia antituumorivaikutukset. Hiiriin injektoitiin MOSEC-Luc kasvainsoluja ja käsiteltiin sitten HPV-16 /HSV-tk PSV tai HPV-16 /GFP PSV käyttäen hoito-ohjelmaa, kuten on kuvattu kuviossa 5. hiiriä käsiteltiin seuraavaksi gansikloviirin ja kasvaimen kasvua seurattiin käyttämällä luminenssi kuvantamisjärjestelmä. Kuten on esitetty kuviossa 5, kasvain hiirillä, joita hoidettiin HPV-16 /HSV-tk PSV, jota seuraa käsittely gansikloviirin osoitti merkittävästi parempi terapeuttinen antituumorivaikutukset kuin hiirillä, joita hoidettiin HPV-16 /GFP PSV seuraa käsittely gansikloviirin. Nämä tiedot osoittavat, HPV-16 pseudoviruspartikkeliin voidaan käyttää tuloksellisesti HSV-tk-geenin munasarjojen kasvainsolujen tehdä munasarjojen syöpäsolut alttiimmiksi hoidolle gansikloviirin.

C57BL /6-hiiret (5 ryhmää kohti) oli intraperitoneaalisesti 1 x 10

6 MOSEC-Luc solut oli 1. päivänä Lusiferaasiaktiivisuutta tutkittiin päivänä 2 siinä mainitaan useita kasvaimia hiirissä. Hiiret injektoitiin HPV16-GFP PSV (L1-proteiinin 20 ug) tai HPV16 /HSV-tk PSV annoksena L1-proteiinin (20 ng /hiiri) päivänä 3 Hiiriä hoidettiin päivittäin gansikloviirin annoksella 50 mg /kg tai PBS päivästä 5 päivään 18. Hiiret kuvantaa noninvasiivisten luminesenssikuvantamisessa tekniikoita päivänä 20. Esitetyt tiedot edustavat 2 kokeita.

keskustelu

onnistunut työhön HSV-tk-geenin munasarjasyöpä geeniterapiaa käyttäen HPV pseudovirions viittaa siihen, että muita sopivia kandidaattigeenit voidaan myös toimittaa HPV pseudoviruspartikkeliin munasarjojen kasvaimia munasarjasyöpä geeniterapiassa. Useita kandidaattigeenit entsyymi-aihiolääke yhdistelmiä itsemurha geeniterapiaa on raportoitu myös sytosiinideaminaasi- [18], [19], nitroreduktaasi [20], karboksyyliesteraasin [21], P450 [22] ja puriininukleosidifosforylaasientsyymejä [23]. Kuten HSV-tk, entsyymit koodaama nämä geenit voivat muuntaa myrkyttömiä aihiolääkkeitä lääkkeitä, jotka kykenevät estämään DNA-synteesin, mikä johtaa lopulta solukuolemaan sekä naapurisoluvaikutusten tappamaan muita lähialueiden syöpäsoluja.

Kliinisiä käännös, se on tärkeää tarkastella turvallisuusongelmia sekä HSV-tk /GCV järjestelmän ja toimituksen ajoneuvoon. Kuitenkin syövän geeniterapia käyttäen HSV-tk on käytetty laajalti. Monet kliinisissä tutkimuksissa tätä lähestymistapaa on tehty potilailla, joilla gliooma eikä vakavia haittatapahtumia (katsausta varten katso [24], [25]). Toisaalta, tuotanto HPV pseudoviruspartikkeliin DNA pakettiautoa todennäköisesti vaatii edelleen kehitystä parantamaan turvallisuusprofiili. Nykyinen solulinjaa tuottamiseen käytettyjen pseudovirions sisältää SV40: n suuren T-antigeenin, joka on onkoproteiinia, ja siksi herättää joitakin mahdollisia turvallisuusongelmia. Vaihtoehtoinen lähestymistapa hiivaa käyttäen tuottaa pseudovirions on kuvattu [26]. Massatuotantoon HPV pseudovirions myös todennäköisesti vaatii tehokasta standardoituja protokollia tuottaa suuria tiittereitä tarttuvaa HPV pseudovirions kliinisten käännös.

Nykyisessä tutkimuksessa osoitimme etuoikeutetut infektion hiiren ja ihmisen munasarjan kasvaimet HPV-16 pseudoviruspartikkeliin. Meidän tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten Roberts et al. käyttämällä nude hiirimallissa vatsakalvon levittämiseen ihmisen munasarjasyövän solulinja, SHIN3 [27]. He totesivat myös, että HPV pseudoviruspartikkeliin vatsaonteloon tartunnan munasarjakasvain kudoksista korkealla spesifisyys jättäen samalla normaalia vatsakalvon kudospintoja. Kuitenkin eri HPV-tyypit pseudoviruspartikkeliin voi osoittaa eri kasvaimen ja /tai kudostropismeja. Esimerkiksi, Cerio et ai, ovat osoittaneet, että HPV-16, mutta ei HPV-45, pseudovirus voisi tartuttaa SWA-G ihmisen munasarjojen kasvainsolujen

in vitro

[28]. Niiden tietojen mukaan pseudovirus infektio ihmisen kasvaimissa voi olla HPV tyyppi- ja kasvainspesifisiä. Näin ollen, on tärkeää edelleen tunnistaa oikean HPV pseudoviruspartikkeliin tulevia syövän geeniterapiassa.

mekanismit ensisijaisen infektio munasarjojen kasvainsolujen HPV pseudovirions jää epäselväksi. Tutkimuksessamme olemme osoittaneet, että ehjän L2 on välttämätöntä tarttuvuuden HPV-16 pseudoviruspartikkeliin munasarjojen kasvaimia (katso kuvio 2). HPV pääsy kohdesoluihin on osoitettu aloittaa ensin hepariiniin sitoutumisesta sulfonoitu proteoglykaanin (HSPG) solun pinnan kiinnityksen tekijät. HPV viruspartikkelit läpikäyvät sitten konformaation muutoksen, joka altistaa N-pää L2 vähäinen kapsidiproteiini ja furiinilohkaisu- [29], [30]. Proteo- L2 paljastaa aiemmin tukittiin pinta L1, joka sitoutuu toistaiseksi määrittelemätöntä solupintareseptorin soluissa, jonka uskotaan olevan vastuussa hiukkasten sisäistämisen (katsausta varten katso [31]). On myös osoitettu, että useimmat munasarjasyövän solulinjoissa ylössäätävät furiinin ilmaisun [32]. Näin ollen, on mahdollista, että säätely on furiinin ilmentyminen voi myötävaikuttaa suosivista infektio munasarjakasvain HPV pseudovirions. Voimme myös sulkea pois mahdollisuutta, että etuoikeutettu infektio on artefakti viemällä tuumorisoluja

in vitro

jälkeen suosivista infektio havaittiin spontaanisti esiintyviä munasarjakasvain malli (katso kuva 3). On tärkeää edelleen luonnehtia mekanismeja suosituimmuusjärjestelyihin infektio munasarjojen kasvainsolujen HPV pseudovirions. Tällaiset tiedot ovat hyödyllisiä parantamaan tietyn toimituksen kiinnostavan geenin munasarjojen kasvainsoluista HPV pseudovirions.

Yhteenvetona, olemme huomanneet, että vatsaonteloon HPV-16 pseudovirions johtaa suosivista infektion hiiren ja ihmisen munasarja- syöpäsolut tuumoria kantavissa hiirissä. Lisäksi syövän geeniterapia käyttäen HPV pseudovirions kuljettavat HSV-tk kykeni spesifisesti kohdistettu munasarjakasvainten, tuloksena voimakkaita terapeuttisia antituumorivaikutukset vastaan ​​munasarjojen kasvaimia. On tärkeää edelleen sopivimmat geeniterapiaan ehdokkaita ja hoito-tulevia tutkimuksia kohti kliinisen käännös.

tukeminen Information

Kuva S1.

karakterisointi infektion MOSEC kasvainsolujen HPV-16 pseudovirions

in vitro

. MOSEC solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5000 solua /kuoppa yön ennen infektiota. Siemennetyn MOSEC solut infektoitiin sitten HPV-16 /Luc PSV (1 ug L1-proteiinia /ml) 72 tunnin ajan, ja lusiferaasin ilmentymistä tutkittiin jonka IVIS 200-järjestelmän (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Luminenssi kuvia MOSEC munasarjasyövän solulinja (ylhäällä). Pylväsdiagrammi, joka esittää koko fotoni laskee kullekin kuopalle (alhaalla). Huomautus: HPV-16 pseudovirions voi tehokkaasti tartuttaa MOSEC hiiren munasarjasyövän

in vitro

. Esitetyt tiedot edustavat 2 kokeita.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0040983.s001

(TIF) B Kuva S2.

karakterisointi tartunnan ES2 ihmisen munasarjan syöpäsolujen HPV-16 pseudovirions

in vitro

. ES2 ihmisen munasarjatuumori solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5000 solua /kuoppa yön ennen infektiota. Siemennetyn ES2 solut infektoitiin sitten HPV-16 /Luc PSV (1 ug L1-proteiinia /ml) 72 tunnin ajan, ja lusiferaasin ilmentymistä tutkittiin IVIS 200 järjestelmän (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Luminenssi kuvia ES2 munasarjasyövän solulinja (ylhäällä). Pylväsdiagrammi, joka esittää koko fotoni laskee kullekin kuopalle (alhaalla). Huomautus: HPV-16 pseudovirions voi tehokkaasti infektoida ES2 ihmisen munasarjasyövän in vitro. Esitetyt tiedot edustavat 2 kokeita.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0040983.s002

(TIF) B Kuva S3.

In vitro

sytotoksisuus välittyy HPV16-tk pseudovirions ja gansikloviiri. ES2-Luc-solut infektoitiin HPV16-GFP PSV tai HPV16 /HSV-tk PSV pitoisuutena 1 ug L1-proteiinia /ml 48 tuntia. Tartunta-solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja sitten käsiteltiin 0 ug /ml, 0,1 ug /ml, 1 ug /ml, tai 10 ug /ml Gansikloviiri 72 tuntia. Lusiferaasiekspressiota tutkinut IVIS 200 järjestelmä (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Esitetyt tiedot edustavat 2 kokeita.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0040983.s003

(TIF) B

Kiitokset

Haluamme kiittää Katherine Liu ( JHMI) valmistamiseksi käsikirjoituksen.