Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peräsuolen syöpä (CRC) pidetään monimutkainen sairaus, ja siten suurin osa geneettinen alttius ajatellaan olla muodossa alhaisen penetraation variantteja jälkeen polygeenisiä malli perintö. Ehdokas-geeni tutkimuksissa on toistaiseksi ollut yksi perus- lähestymistapojen tunnistaa nämä alttius variantteja. Otetaan johdonmukaisesti mukaan joidenkin signaloinnin reiteille karsinogeneesissä tukenut polku perustuvat tutkimukset luonnollisena strategia valita geenejä, jotka voivat kertyä uutta alttiuslokukset.

Menetelmät /Principal Havainnot

Valitsimme kaksi main syövän synnyn liittyviä reittejä: Wnt ja BMP, jotta seuloa osallisena geenit uuden riskin variantteja. Sitten toteutettiin tapaus-control yhdistys tutkimuksessa 933 CRC tapauksissa ja 969 hallinta perustuu koodaus ja sääntelyn SNP. Olemme myös rs4444235 ja rs9929218, jotka eivät täyttäneet meidän valintaperusteita vaan kuului kaksi geeniä BMP koulutusjakson ja oli johdonmukaisesti liitetty CRC aiemmissa tutkimuksissa. Kumpikaan alleeliset, eikä genotyypin tai haplotypic analyysit osoittivat merkkejä assosiaation 37 seulotaan variantteja ja CRC riski. Oikaisut sukupuolen ja iän sekä ositettu analyysi välillä satunnaista ja kontrolliryhmien ei tuottanut myönteisiä tuloksia myöskään.

Johtopäätökset /merkitys

Huolimatta relevanssia reittejä patogeneesissä sairauden, ja se, että tämä on todellakin ensimmäinen tutkimus, joka pitää nämä reitit ehdokkaaksi-geenin valinta lähestymistapa, meidän tutkimus ei esitä mitään todisteita läsnäolo alhaisen penetraation variantteja valitun merkkiaineiden tahansa katsoi geenien meidän kohortissa .

Citation: Fernández-Rozadilla C, de Castro L, Clofent J, Brea-Fernández A, Bessa X, Abulí A, et al. (2010) yhden nukleotidin polymorfismit Wnt ja BMP Väylät ja peräsuolen syövän riski on espanjalainen Kohortin. PLoS ONE 5 (9): e12673. doi: 10,1371 /journal.pone.0012673

Editor: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: toukokuu 20, 2010; Hyväksytty: 06 elokuu 2010; Julkaistu: 09 syyskuu 2010

Copyright: © 2010 Fernández-Rozadilla et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Fondo de Investigacion Sanitaria /EAKR (05/2031, 08/0024, 08/1276, PS09 /02368), Xunta de Galicia (PGIDIT07PXIB9101209PR, Ministerio de Ciencia e Innovacion (SAF 07-64873), Asociacion Espanola contra el Cancer (Fundacion Científica y Junta de Barcelona), ja Fundación de Investigacion Medica Mutua Madrilena. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi tärkeimmistä syöpäsairauksien, on toiseksi yleisin kasvain molemmilla sukupuolilla ja yksi tärkeimmistä sairastuvuuden syitä länsimaissa [1]. Geneettinen osuus CRC on arvioitu olevan noin 35% laajat kaksostutkimukset [2]. Kuitenkin erittäin penetrant variantteja, jotka aiheuttavat Mendelin taipumus oireyhtymät, osuus on vain korkeintaan 5% taudin tapauksista [3]. Loput geneettinen alttius on ajateltu seurata polygenic malli, jossa vuorovaikutuksesta useita pienen penetrance alleeliset variantit esiintyvät korkealla taajuudella väestössä, ja kukin annetaan vähäinen vaikutus sairauden riskin [4], [5].

Candidate-geeni tutkimukset ovat olleet yksi yleisimmin käytetyt työkalut seulonnassa uusien varianttien vaikuttavia CRC riski. Gene valinta näissä tutkimuksissa perustuu pääosin toiminnallista mahdolliset seuraukset yhdistys, ja näin valituista geeneistä on joko valittu, koska edellisen on muita korkean /alhaisen riskin alleelien [6], tai niiden osallistuminen polku osallinen sairauden patogeneesiin [7]. Ehdokas-geeni tutkimuksia voidaan suorittaa joko suoraan lähestymistapoja, joissa variantit genotyyppi oletetaan olevan perimmäinen syy taudin niiden sijainnin vuoksi (variantit eksoni tai säätelyalueita) tai välillinen lähestymistavat, joissa tag SNP hyödyntää sidoksen epätasapaino ominaisuuksia ihmisen genomin yrittää seuloa useimmat vaihtelu tietyssä geenissä.

Tämä jälkimmäinen lähestymistapa on myös mahdollistanut yhdessä kehittämään suurikapasiteettisia tekniikoita, täytäntöönpano uuden hypoteesin vapaata lähestymistavat (sotii hypoteesin-pohjainen ehdokas-geeni lähestymistavat), joka kattaa suurimman osan genomin (genomin laajuinen yhdistys tutkimukset tai GWAS). Tämä toteutus on menestyksekkäästi johtanut määriteltiin joitakin uusia alttiuslokukset [8] – [14], mukaan lukien rs4444235 ja rs9929218, jotka kuuluvat matkan kahden geenin kuuluvan BMP polku. Kuitenkin nämä on havaittu ennustaa vain pieni osa taudin alttius, ja loput vielä löydetty [15].

siten, jonka tarkoituksena löytää tällainen alttius variantteja kautta ehdokas-geeni lähestymistapaa seulomalla valittu määrä variantteja kahden solureiteillä jotka ovat toistuvasti liitetty CRC tuumorigeneesissä: Wnt ja BMP signalointireitteihin [16], [17].

Wnt polku sisältää geenejä, jotka ovat jo kauan tiedetty vastaa noin perinnöllinen CRC oireyhtymät, kuten

APC

ja familiaalinen adenomatoottisen polypoosin [18]. Lisäksi somaattiset muutokset

APC

esiintyy lähes 80%: n satunnaista paksusuolen syövän ja Wnt aktivaatiota osallistuu paras osa satunnaista peräsuolen karsinoomien [19]. Toisaalta, BMP-reitti toimii positiivisena säätelijänä joitakin Wnt-proteiinien [17], ja tuumoria tukahduttavan rooli tämän signalointireitin patogeneesissä CRC ja muiden syöpien on vakiintunut [20], [21]. Lisäksi mutaatiot kaksi sen geeneistä,

Smad4

ja

BMPR1A

, vastaavat juveniili polypoosi, toinen perinnöllinen CRC kunnossa [22]. Tarkastelee kaikkia näitä tietoja, ajattelimme, että olisi mielenkiintoista seuloa joitakin geneettinen vaihtelu Näitä reittejä todistusaineistoa uusien CRC oleva variantit, jotka voivat selittää ainakin osan puuttuvan perinnöllisyyden. Meidän lähestymistapamme on pääosin toimiva, vain SNP sisällä eksoni tai

cis

sääntelyvälineitä sekvenssit (5 ’ja 3’ unstranslated alueet) valittiin analysoimaan suhdetta CRC herkkyys.

Tulokset ja keskustelu

Sen jälkeen meidän pathway -pohjainen ehdokas-geenin valintatapa, suoritimme tutkimuksemme on yhteensä 45 SNP, jotka olivat joko eksoni tai säätelyalueita, kokonaisilmaantuvuus 21 geenejä sekä Wnt ja BMP polkuja. Tiedot SNP ominaisuuksia ja yhdistyksen arvot 37 SNP että läpäisseet laadunvalvontakriteerit esitetään taulukossa 1. Mitään seulotaan SNP liittyi merkittävästi muuttunut riski CRC, ottaen huomioon kertoimet-suhteet ja niihin liittyvät p-arvot alleelisia ja genotyypin testit (kehitys, hallitseva ja väistyvä). Logistinen regressio iän ja sukupuolen säätö suoritettiin, vaikka se ei paranna s arvoa tuloksia. Haplotyyppianalyysissä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​sekä Unphased ja Haploview, eikä osoittanut merkkejä positiivisia mielleyhtymiä joko jokin 8 geenejä, joille tämä analyysi suoritettiin (

AXIN1

,

HDAC9

,

BMP4

,

DACT1

,

CDH3

,

CDH1

,

BTRC

, ja

APC) B, (Kuva S1). Kerrostuminen analyysillä vertaamalla Satunnaista ja perinnöllistä tapauksissa oli myös toteutettu, mutta se ei esittänyt mitään näyttöä eroista alttiuden ryhmien välillä, jotka voivat olla merkki minkään tietyn yhdistystä jompaakumpaa ryhmistä (taulukko 2).

Näin meidän strategia ei ole onnistunut havaitsemaan uusia alttiuslokukset CRC riskin.

Pathway-pohjainen odotukset ovat osoittautuneet varsin masentavaa kirjallisuudessa hyvin, vahva ehdokas kulkuväylillä kuten DNA-korjaus niitä yllättäen epäonnistuneet liian tunnistamaan uusia riskejä variantteja [7], [23] – [24]. Tämän lisäksi useimmat geneettiset variantit, jotka on havaittu liittyvän sairauden sijaitsevat intergeenisessä alueilla, joilla on potentiaalisia toimintoja, jotka ovat toistaiseksi tuntemattomia.

Still, kun otetaan huomioon viime löytöjä, jotka seurattu analyysi genominlaajuisten data, sekä Wnt ja BMP ovat ansainneet uudistetun mainetta. Alttius lokus löytyy 8q24 (rs6983267) on yhdistetty parannettu Wnt signalointia sen vuorovaikutusta TCF4 [25], [26], ja meta-analyysi useisiin GWAS tietojen onnistunut yhdistämään kaksi versiota on

BMP4

ja

CDH1

geenialueisiin tautiin (rs4444235 ja rs9929218, vastaavasti) [8].

vaikka tämä on oikeastaan ​​ensimmäinen yhdistys tutkimus, jossa otetaan huomioon reittejä kuin koko geenien valintaan, jotkut geenit mukana meidän analyysi (ts

APC, CCND1

,

CDH1

ja

TCF7

) oli jo seulottava riskin alleelien [ ,,,0],6], [27] – [30]. On varsin merkillistä, että on ollut kasvava keskustelu joitakin näistä lokusten, erityisesti p.V1822D muunnos

APC

(rs459552). Tämä missense muutos on laajalti dokumentoitu kirjallisuudessa, joidenkin tutkimusten puolustamisen neutraaleina (tämä tutkimus ja muut) [31], ja jotkut antavat sen vähäinen alleeli suojaava vaikutus [6], [28]. Puute asianmukainen tutkimus vallan, tuloksena riittämättömän näytteiden määrä on ollut suuri ongelma monissa näistä tutkimuksista ja siten useimmat niistä eivät ole säädetty kovin vakuuttavia tuloksia [32].

Vaikka tutkimuksemme oli yli 80% voima havaita tai jopa 1,21 vähäisin alleelifrekvenssit 0,30 (57% meidän SNP), ja 1,24 varten MAFs alas 0,2 (78%: n SNP), olettaen log-lisäaine malli ja α = 0,05, olimme pysty havaitsemaan mitään myönteisiä yhdistysten, jotka viittaavat uusia CRC alttius variantteja. Siitä huolimatta se on varsin merkillistä, että vaikka meidän epäonnistuminen jäljitellä yhdistysten

BMP4

ja

CDH1

SNP, tämä on ensimmäinen tutkimus, joka tutkii jotakin ns 10 uutta GWAS -discovered alttiuslokukset Southern-Euroopan väestöstä.

huolimatta negatiivisia tuloksia, meidän on harkittava, että emme lainkaan kattavasti kaikkia mahdollisia alhaisen penetraation variantteja valitun geenit. Tämä johtuu pääasiassa siitä, että strategiamme oli puhtaasti toiminnallinen, valitsemalla variantteja, jotka olivat

a priori

hyviä ehdokkaita liittyvän suoraan tautiin. Tämä todellakin voi muodostaa rajoituksen tutkimuksessa, useimpien geneettinen vaihtelu sisällä loci ei tutkittu. Näin uskomme lisätoimia olisi seulomaan monipuolisempia loci näissä reittejä, erityisesti kun otetaan huomioon edellisen myönteisen yhdistysten kuvattu tähän mennessä sekä Wnt ja BMP liittyviä geenejä.

pohtiminen potentiaalia kertoimella suhteet variantit on kuvattu tähän mennessä (1,11, CI 1,08-1,15 ja 0,91, CI 0,89-0,94 varten rs4444235 ja rs9929218, vastaavasti), oletamme suurempia ryhminä voidaan tarvita havaitsemaan tällaisia ​​vähäisempiä vaikutuksia. Toisaalta, kun otetaan huomioon ehdokas-geeni lähestymistapoja, olisi myös hyödyllistä meta-analysoida aikaisempien tutkimusten ja vedä tiedot poikki niistä kokonaan huomiotta etsimään todisteita mahdollisista uusista polkuja liittyvät sairauden patogeneesiin.

Materiaalit ja menetelmät

tutkimus väestön

Oppiaineet olivat 933 CRC potilasta ja 969 valvontaa, joka kuului EPICOLON hanke, prospektiivinen monikeskustutkimus, väestöpohjainen epidemiologian jossa selvitetään esiintymistä ja piirteitä familiaalinen ja satunnaista CRC Espanjan väestöstä [33]. Tapaukset on valittu yli 11 sairaaloissa Espanjassa kaikille potilaille, joiden

de novo

histologisesti diagnosoitu paksusuolen adenokarsinooma ja jotka osallistuivat 11 yhteisön sairaaloissa kaikkialla Espanjassa marraskuusta 2006 joulukuussa 2007. Potilaat, joilla CRC kehitettyjä yhteydessä familiaalinen adenomatoottisen polypoosin tai tulehduksellinen suolistosairaus, ja tapaukset, joissa potilaat tai perheen kieltäytyi osallistua tutkimukseen jätettiin pois. Väestörakenteen, kliininen ja kasvaimeen liittyvien ominaisuuksien probands sekä yksityiskohtainen suvussa saatiin käyttämällä ennalta laadittujen kyselylomake, ja rekisteröity yhteen tietokantaan. Näistä 592 (63%) oli miehiä ja 341 (37%) naisia. Mediaani-ikä tapauksia oli 73 (vaihteluväli 26-95), kun taas tarkoittaa oli 71 (SD ± 10,7). Sairaala perustuvan valvonnan rekrytoitiin yhdessä tapauksista ja vahvistettiin olevan mitään syöpää tai aiemmin ollut kasvain, eikä suvussa CRC. Kaikki säätimet valittiin satunnaisesti ja sovitettu kotelot sukupuolen ja iän (± 5 vuotta) on 01:01 suhteessa. Molemmat tapaukset ja valvonta olivat Euroopan syntyperä ja Espanjasta.

Ethics selvitys

Tutkimus hyväksynyt ”Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia”, ja kukin institutionaalisten tarkastuslautakunta of sairaalat jossa näytteet kerättiin ( ”eettinen komitea Hospital Clinic-Barcelona”, ”eettinen komitea sairaalan del Mar-Barcelona”, ”eettinen komitea sairaalan Saksan Trias i Pujol-Barcelona”, ”eettinen komitea Hospital Sant Pau-Barcelona ”,” eettinen komitea sairaalan Universitari Arnau de Vilanova-Lleida ”,” eettinen komitea sairaalan General-Alicante ”,” eettinen komitea Hospital de Donosti ”,” eettinen komitea Hospital General de Asturias -Oviedo ”,” eettinen komitea sairaalan kliinis-Zaragoza ”,” eettinen komitea Hospital de Calahorra-La Rioja ”,” eettinen komitea sairaalan Meixoeiro-Vigon ”). Kaikki näytteet saatiin kirjallinen lupa tarkistaa eettisiä hallituksen vastaavan sairaalan.

DNA: n eristämiseksi

DNA saatiin jäädytetty ääreisverenkierron; uuttaminen suoritettiin CHEMAGEN robotti (Chemagen Biopolymer-Technologie AG, Baesweiler, Saksa) noudattaen valmistajan ohjeiden kello Galician Public Fundation geneettisen lääketieteen Santiago de Compostelassa. Tapausten ja kontrollien uutettiin sekoitettu erissä välttää kaikenlaista puolueellisuudesta.

Candidate-geenin valinta

Sekä Wnt ja BMP polkuja valittiin alun perin jälkeen havainnot Nishanian et al. [34], jotka osoittivat vuorovaikutusta näiden kahden reittejä. Molemmat polut olivat tutkitaan perusteellisesti läpi Cancer Genome Anatomy Project sivustolla [35], mutta emme onnistuneet löytämään mitään tietoja BMP väylän joko tässä tai muissa selaimissa. Tästä syystä Wnt geenit valittiin selaamalla reitin kautta BioCarta [36], kun taas BMP geenit oli tiukasti valitaan edellisestä kirjallisuudesta [17], [34]. Neljäkymmentä yksi geeneistä valittiin lopulta sisällytetään analyysiin.

SNP valinta ja genotyypityksen

SNP valintakriteerejä vain harkita toiminnallinen merkkiaineiden vähäisin alleeli taajuuksilla yli 0,05 ja vähintään kaksi riippumatonta validointikriteerit vahvistetusta dbSNP [37]. Tämä sisältää kaikki eksoni muunnokset valitaan Pupasuite [38] ja geeni-sääntelyä alueilla

cis

(5’or 3 ’UTR päät), määrittelemän FESD verkkoselaimen [39]. 5’UTR- variantit mukaan vain silloin, kun ne noudattaneet edellä mainittujen kriteerien ja oletettiin olevan mahdollisia sitoutumiskohdan tunnetun transctiptional sitova tekijä. 3 ’UTR variantit olivat mukana, koska ne saattavat suhde miRNA sitovat alueet [40]. Koska osa valitun geenien ollut SNP tällaisten tällaisia ​​missään kolmesta selaimet aikaan SNP valinnan, he lopulta oli pudonnut pois tutkimuksesta. Lopuksi 43 SNP valittiin kuluessa 21 geenien seulottava mahdollisina suoraan määritteet CRC alttius (taulukko 3).

rs4444235 ja rs9929218 ovat kaksi vaihtoehtoa makaa läheisiin ja introni alueet

BMP4

ja

CDH1

vastaavasti, jotka on äskettäin raportoitu liittyvän sairauden kanssa [8]. Ottaen huomioon, että SNP että olisimme valinneet näiden kahden geenin eivät olleet hyviä taggers näiden kahden vaihtoehdon (r-squared arvot olivat 0,6 varten SNP

BMP4

, ja 0,02 niille

CHD1

) (Kuva 1), päätimme sisällyttää ne Tutkimuksemme samoin, vaikka ne eivät täyttäneet meidän valintaperusteita, jolloin kokonaismäärä kuulusteli SNP nousevan 45.

R-potenssiin suhteita SNP paria: A. rs4444235-rs17563 in

BMP4

ja B. rs9929218-rs1801552 in

CDH1

.

Genotyping suoritettiin MassARRAY (Sequenom Inc., San Diego, USA) tekniikka on Santiago de Compostelan solmu Espanjan genotyypin Centerin. Calling genotyyppien tehtiin Sequenom typer v4.0 -ohjelmisto kaikki tiedot tutkimuksesta samanaikaisesti.

Tilastolliset analyysit

Laadunvalvonta suoritettiin ensin jättämällä molemmat SNP ja näytteiden genotyypin menestys hinnat alle 95%, joiden avulla on genotyypin Data Filter (GDF) [41]. Genotyyppisen jakaumat kaikille SNP tarkastukset olivat yhdenmukaisia ​​Hardy-Weinberg tasapaino arvioituna käyttämällä X

2 testiä (1

df). Kaikki p-arvot, jotka saatiin olivat ≥0.05, mikä sulkee pois mahdollisuuden genotyypin esineitä (tuloksia ei ole esitetty). Väestön kerrostuminen arvioitiin Struktuuripastaa v2.2 [42]. Lyhyesti, posibility erilaisten skenaarioiden testattiin olettaen eri määrän taustalla populaatioiden (k väliltä 1 4), joka sallii suuren iteraatioiden (25 K burn-in aikana seurasi 500 K toistoja). Keskimääräinen log todennäköisyys arvioitiin datalle tietylle k (kutsutaan L (K)) kussakin aikavälillä. Olemme myös suorittaa useita ajoja kutakin k arvo laskemaan yleinen keskimääräinen L (K) ja sen keskihajonta. Kaikki tulokset näyttivät olevan yhtäpitävä alkuperäisen oletus yhden olemassa olevan populaation. Lisäksi ylimääräisiä menettelyjä paremmin sekoittavia muuttujan visualisointi tehtiin avulla pääkomponenttianalyysiin (PCA) käyttäen EIGENSOFT työkalu

smartpca

[43], vaikka määrä markkereita oli hyvin alhainen. Eroja ei havaittu väestön kerrostuminen tapausten ja kontrollien välillä joko RAKENNE tai ensimmäinen 10 osat PCA-analyysi (kuva S2). Sen jälkeen laadunvalvonta 1746 näytettä (854 tapausta ja 892 valvontaa) ja 37 SNP pysyi jatkotutkimuksiin.

Association testit suoritettiin khiin neliö testit jokaisen SNP ja haplotyyppien mahdollisuuksien sekä Haploview v4.0 [ ,,,0],44] ja Unphased [45]. Lyhyesti, LD suuntauksista geenien jossa useampi kuin yksi SNP genotyyppi tarkastettiin Haploview ja testattiin yhdistyksen käyttämällä Unphased (tarkistaa missä tahansa haplotyyppien liitettiin) ja Haploview (nähdä mitkä haplotyyppien liitettiin). Genotyyppiyhteyttä testit, regressioanalyysimme sukupuolen ja iän säätö, ja ositettu analyysi välillä satunnaista ja familiaalinen ryhmät arvioitiin Plink 1.03 [46]. OR ja 95%: n luottamusväli laskettiin jokaisen tilaston, ja käsitellä useita-testaus, permutaatio testejä ja Bonferronin korjausta käytettiin. Tutkimus teho arvioitiin CATS ohjelmistojen [47].

tukeminen Information

Kuva S1.

Haplotyyppifrekvenssianalyysi rakenne ja analyysi 8 geenien jossa useampi kuin yksi SNP genotyyppi. Taulukossa on esitetty yhdistyksen arvot kullekin SNP tuottaman Haploview.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0012673.s001

(3,40 MB TIF) B Kuva S2.

Pääkomponenttianalyysi juoni ensimmäistä vs. toisen komponentin, verrataan meidän tapauksessamme ja kontrollipopulaatioissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0012673.s002

(0,96 MB TIF) B Huom S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0012673.s003

(0,03 MB DOC) B

Kiitokset

Olemme vilpittömästi kiitollisia kaikille potilaille osallistuvat tähän tutkimukseen, jotka rekrytoitiin 11 Espanjan sairaaloissa osana EPICOLON projektin. Kiitämme Maria Magdalena-Castro (MMC), Olga Lortes (OL) ja Eva Fernández (EF) erinomaisesta teknisestä avusta.