Krooninen sairaus

tiivistelmä

semaforiini signalointi Plexin usein osallistuu kasvainten synnyssä ja pahanlaatuisia etenemistä eri syöpien riskiä. Erityisesti roolia semaforiini signaloinnin haiman adenokarsinooma (PDAC) edelleen tutkimaton, vaikka suuri todennäköisyys etäpesäkkeiden ja kuolleisuutta. Toisin kuin muut epiteelin pahanlaatuisten kasvainten, jotka ilmaisevat usein pieni määrä erityisiä geenien semaforiini /Plexin perhe, viisi tai useampia ilmaistaan ​​usein ihmisen PDAC. Tällainen samanaikainen ekspressio näissä SEMA3 /Plexin perheen jäsenet eivät ole seurausta geenin monistuksen, mutta (ainakin osittain) lisääntyneen geenin transkription aktivoidaan SOX4 de novo ilmaistuna PDAC. Via kromatiinin immunosaostus, lusiferaasi promoottorin aktiivisuuden määritys ja elektroforeesi liikkuvuuden siirtymän määrityksellä, SOX4 on osoitettu sitoutuvan konsensus sivuilla promoottorin kunkin

SEMA3

ja

Plexin

geenin lisäämiseksi transkription aktiivisuutta. Kääntäen, RNAi-knockdovvn SOX4 vuonna PDAC solulinjoissa johtaa vähentynyt ilmentyminen SEMA3 /Plexin perheenjäseniä ja liittyy rajoitetut kasvaimen kasvua sekä

in vitro

ja SCID-hiirissä. Me osoittavat lisäksi, että SOX4 tasot yhdensuuntainen tiivisti ilmaus SEMA3 /Plexin perheenjäsenet (

P

= 0,033,

NPAR

Kruskal-Wallis

yksi

–

tapa

analyysi), joka myös korreloi huono selviytyminen ihmisen PDAC (

P

= 0,0409,

Kaplan-Meier

analyysi). Kiehtovan, miR-129-2 ja miR-335, jotka molemmat tavoite SOX4 hajoamiselle, ovat yhteistyössä tukahdutettu ihmisen PDAC tapauksissa liittyy säädelty SOX4 tilastollisesti merkittävällä tavalla. Lopuksi me esittävät miR-129-2 (miR-335) /SOX4 /semaforiini-Plexin sääntelyä akselia kasvainten synnyssä haimasyövän.

Citation: Huang HY, Cheng YY, Liao WC, Tien YW Yang C-HJ, Hsu SM, et ai. (2012) SOX4 kopiointia Säätelee Useita SEMA3 /Plexin perheenjäseniin ja Edistää tuumorikasvun Haimasyöpä. PLoS ONE 7 (12): e48637. doi: 10,1371 /journal.pone.0048637

Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 08 toukokuu 2012; Hyväksytty: 01 lokakuu 2012; Julkaistu: 12 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Taiwan University Hospital sisäiseen rahastoon myönnetään PH Huang ja HY Huang (NTUH.96-M-037). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, tai valmisteen käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on neljänneksi suurin syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa, ja yksi kymmenestä yleisimmistä syövistä Taiwanissa. Diagnoosi PDAC tapahtuu usein vasta laajaa etäpesäkkeiden. Tämän seurauksena huono ennuste PDAC voidaan katsoa johtuvan sen aggressiivinen biologista käyttäytymistä ja sen kestävyys kemoterapiaa tai sädehoitoa, joka edellyttää yksityiskohtaista mekanistinen tutkimus PDAC terapeuttista suunnittelu [1].

Geenien ilmentyminen ja perimän laajuinen mutaatiotutkimukset tutkimukset osoittavat, että ihmisen haimasyövän johtuu muutoksesta useiden geenien, jotka toimivat läpi ydinjoukko vähintään 12 solusignalointi reitit [2]. Analysoimalla yli 20000 transkriptien, keskimäärin 63 geneettisten muutosten haimasyövän on osoitettu. Mekanismeja poikkeava ekspressio kunkin erityisen geenin haimasyöpä ovat monipuolisia, mukaan lukien pistemutaatio, kehitetyistä kannoista ja vahvistus [2].

poikkeava ilmentyminen luokan 3 semaforiini sekä sukulais reseptorit Plexin (PLXN ) ja Neuropiliini (NRP) erilaisissa ihmisen syövän osoittaa, että SEMA3 säätelemiin Plexin signalointi säätelee syöpäsolun käyttäytymistä [3], [4]. Esimerkiksi yli-ilmentyminen SEMA3C ja SEMA3E välittää kasvaimen etenemisen ja etäpesäkkeiden syövissä, mukaan lukien ihmisen keuhkojen adenokarsinooma, eturauhassyöpä, endomet- syöpä, ja rintarauhasen adenokarsinooma. Sen sijaan

SEMA3F

ja

SEMA3B

geenit ovat usein poistetaan epiteelin maligniteetti, mikä parantaa angiogeneesissä [3]. Sillä PDAC yli-ilmentyminen NRP1 ja SEMA3A on raportoitu korreloivan huonoon ennusteeseen [5]. Kuitenkin molekyyli olevat prosessit kuten ilmaisun aikana PDAC tuumorigeneesin ei ole selvitetty, ja onko muita jäseniä luokan 3 semaforiini tai Plexin osallistua haimasyövän muodostumista tai etenemistä ei vielä tiedetä. Täällä, tutkimme ilmaus SEMA3 ja Plexin /Neuropiliini normaaleissa ihmisen haimassa, PDAC kirurgisista näytteistä, ja PDAC solulinjat. Toisin kuin muut epiteelin maligniteetit, että usein nimenomaan yli-ilmentävät pieni määrä geenien semaforiini perheen kaikkein PDAC tapauksissa yli-ilmentävät enemmän kuin viisi geeniä, jotka liittyvät SEMA3 ja Plexin. Mekanismi taustalla ilmentäminen rinnakkain SEMA3 /Plexin perheenjäsenten PDAC oli siis tutkittu.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

vahvisti, että työ ihmiskudoksella lohkoja ja tuoretta Parilliset kasvain /ei-kasvain näytteet tässä tutkimuksessa hyväksyi Tissue ja eettinen komitea, jossa on kirjallinen tietoon perustuva suostumus on saatu ohjeiden mainitsemat Tissue ja eettisen komitean NTUH.

in vivo

kasvainten synnyssä määritys SCID-hiirissä suoritettiin alle jonka on myöntänyt Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) National Taiwan University College of Medicine ja College of Public Health.

asia valinta

Kuusikymmentä kaksi tapausta haiman adenokarsinooma tunnistettiin kautta etsimään patologisen kirjaa rekisteröity National Taiwan University Hospital (NTUH), Taiwan tammikuusta 1996 joulukuuhun 2006. kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR, kaksikymmentäkolme tapausta pariksi snap-pakastetut haiman ei-kasvain ja kasvain kudokset saatiin. Valitut demografiset tiedot noudettiin sairaalasta syövän rekisteristä yksityiskohtaisesti Täydentävä taulukossa S1.

Soluviljely, RNA-interferenssi, ja valinta vakaan-transfektoitujen solukloonien

PANC-1, MiaPaCa2, ja Capan-1-solut hankittiin ATCC: ltä. Kaikki solut kasvatettiin DMEM-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiinillä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

RNA-interferenssi, kohdistamisen oligonukleotidit, jotka ovat spesifisiä

SOX4

geeni (NM_003107.2: nt.1999-2019 ja nt.1362-1382) tai salattu sekvenssit kloonattiin pSuperGFP /neo-vektoriin. Lentivirusvektorikonstruktit shRNAs kohdistaminen SOX4 kautta rakennetaan oligonukleotidien kohdistuvista nt.4433-4453 ja nt.1101-1121 (NM_003107.2) vastaavasti ostettiin RNAi-laboratorioarvojen Taipei Sinica Academican.

PLXNA2

siRNA plasmidit kaupalliselta (Santa Cruz). Stabiilisti plasmidin-transfektoidut kloonit valittiin G418: aa (Sigma). RNAi-pudotus kunkin molekyylin varmistettiin RT-PCR: llä ja Western blot.

Vasta-aineet, immunohistokemia, ja Western blot

käytetyt vasta-aineet sisältyvät anti-ihmisen NRP1 (R = tai = 2-kertainen muutos) havaittiin noin

SEMA3A

,

3C

,

3D

,

3E

ja

PLXNA4

geenilokukset (merkitty vihreäsävyisenä suorakulmio ja nuoli). (C) SOX4 ilmentyy PDAC solulinjoissa. Solulysaatit immunosaostettiin käyttäen anti-SOX4-vasta-aineen ja immunoblotattu SOX4 tai kontrolli-IgG-vasta-ainetta. (D) immunohistokemialla SOX4 ja E2F1 ihmisen PDAC tapauksissa. SOX4 ja E2F1 molemmat havaittiin Panin eri laatuja ja invasiivisia adenokarsinooma, mutta ei normaalissa duktaalisessa ja acinar epiteelin tai krooninen haimatulehdus. Asteikko bar = 100 pm. (E) Rank summa värjäytymisen intensiteetti SEMA3 /Plexin /NRP1 korreloi SOX4 ilmaisun PDAC tapauksissa. Värjäytyminen kunkin osan pisteytettiin 1-3 listalla sen voimakkuus heikko, keskipitkällä tai vahva. Kymmeniä kaikki SEMA3 /Plexin /NRP1 immuunivärjäykseen tapauskohtaisesti laskettiin yhteen ja korreloivat SOX4 ilme (NPAR Kruskal-Wallisin yksisuuntaisen). Mediaani (viiva laatikossa), minimi- ja maksimiarvot (ylä- ja alarajan laatikon ulkopuolella, vastaavasti) kullekin näkyvät boxplot.

Toinen yleinen muutos syöpäsoluissa on hiljentäminen kasvainten synnyssä, jonka hypermetylaation [8]. Vaikka SEMA3F ja SEMA3B pidetään yleensä tuumorisuppressoreilla ja metyloitu

SEMA3F

on raportoitu keuhkosyövässä [9], se on neo-ilmaisun sijasta tukahduttaminen SEMA3 /Plexin lauseke, joka yleensä havaitaan PDACs (katso Pöytä 1). Lisäksi CpG-rikas saarilla metylaation muutos ei aina löydy ennustettu promoottorialueet SEMA3 /Plexin perhe geenejä (kuten ennustettiin EMBOSS CpGPlot Program). Tämän seurauksena, tutkimme seuraavaksi sen mahdollisuuden, että co-ilmentyminen SEMA3 /Plexin /NRP perheenjäsenten PDACs johtuu neo-kuvaamaan joitakin pääohjausväline geeni (t) ratkaisevan kasvaimien synnyn ja PDAC, mahdollisesti transkriptiotekijä (s) joka voi vuorovaikutuksessa konsensus-DNA-sitova motiivi on läsnä promoottori kunkin SEMA3 /Plexin /NRP-geenin. Useat ehdokkaat, kuten E2F1, GATA6, ja Sox2, saatiin kautta kirjallisuushaun. E2F1 transkriptiotekijä voisi aktivoida

NRP1

transkriptio hiiren aivokuoren alla iskeeminen muutos [10]. Hiiri

SEMA3C

ja

PLXNA2

ovat kohdistu suoraa GATA6 aikana sydämen kehityksen [11]. Lopuksi,

SEMA3C

ja

NRP1

raportoitiin olevan suora kohdegeenien SOX4 [12]. Niinpä yritimme paikantaa SOX4-konsensus sitoutumiskohta [(A /T) (T /A) CAA (A /T) G] mukaisesti GATA6-sitoutumiskohta [(A /T /C) GAT (A /T ) (A)], ja E2F1-sitoutumiskohta [TTT (C /G) (C /G) CGC] in ennustettu promoottorit kullekin SEMA3 ja Plexin geeni [12] – [15]. Luetellut Täydentävä taulukossa S3, kaikki SEMA3, Plexin, ja NRP-geenit omaavat vähintään yhden oletetun SOX4 sitoutumiskohta ja yksi E2F1 sitoutumiskohta on ennustettu promoottorialueilla.

läsnäolo oletetun SOX4 ja E2F1 sitoutumiskohdat promoottorissa kunkin sema ja Plexin geenin sai meidät tutkimaan SOX4 ja E2F1 ilmentymisestä ihmisen PDAC kudoksissa ja solulinjoissa. Immunoblottaus osoitti SOX4 ilmentymistä PANC-1 ja MiaPaCa2 soluja (Fig. 2C). Ihmisille PDAC näytteitä, immunohistokemia paljasti, että 76,4% ihmisen PDAC ilmaisi SOX4, ja 87,9% ilmaistuna E2F1 (Fig. 2D). Sen sijaan acinar ja ductal epiteelisolujen normaalin haiman ja krooninen haimatulehdus eivät olleet immunoreaktiivisia sen SOX4 tai E2F1. Lisäksi SOX4 ja E2F1 jo havaittu PANIN eri laatuja (Fig. 2D), viittaa siihen, että SOX4 ja E2F1 ovat de novo ilmaistuna alussa prosessien PDAC kasvaimien syntyyn.

tutkia suhdetta ilmentymisen SOX4 tai E2F1 ja että SEMA3 /Plexin /NRP1 potilailla, joilla PDAC, me sijoittui värjäytymisen intensiteetti kunkin SEMA3 ja Plexin numerona 0-3 (0, negatiivinen, 1, heikko, 2, kohtalainen, 3, vahva) ja analysoidaan kunkin potilaan listalla summa vs. SOX4 tai E2F1 ilme.

NPAR

Kruskal-Wallis

yksi

–

tapa

analyysit osoittivat merkittäviä eroja sijoitus summa SEMA3, Plexins ja NRP1 värjäys välillä SOX4-positiivisten ja SOX4-negatiivinen tapauksissa (

P

= 0,046) (Kuva. 2E). Kuitenkin mitään eroa ei havaittu, kun E2F1 ilmaisua pidettiin muuttuja (

P

= 0,9121). Erittäin korreloi ilmaus SOX4 kanssa SEMA3 /Plexin /NRP1 perheenjäsenet ihmisen Panin ja PDAC ehdottaa, että SOX4 voisi toimia master transkriptiotekijä ajamaan ilmentymistä SEMA3 ja Plexin geenien haimasyövän muodostumiseen.

SOX4 aktivoi transkription SEMA3 ja Plexin geenit

sen osoittamiseksi, että SOX4 voisi säädellä transkription aktiivisuutta SEMA3 ja Plexin geenien PDAC, ensin tutki, SOX4 voisivat sitoutua ennustettu edistäjä kunkin SEMA3 ja Plexin geeni. Kromatiinin immunosaostus suoritettiin PANC-1-solut osoittivat, että SOX4 todellakin sidottu promoottori kunkin SEMA3 ja Plexin geenin (Fig. 3A ja 3B). Merkittävät taitettava kasvaa lusiferaasiaktiivisuudessa havaittiin konstrukti ohjaa promoottori on peräisin SEMA3 ja Plexin geenin, kun transfektoitu SOX4 ilmentäviä HeLa-soluja. Lisäksi, co-transfektion SOX4-ilmentävällä vektorilla entisestään promoottorin aktiivisuutta (Fig. 3C, P 0,001), joka oli heikennetty, kun SOX4-konsensus sitoutumiskohtia mutatoitiin (AACAATG on AACAAAA ja TACAATG on TACAAAA mutaatioita) ( kuva 3D). Samoin elektroforeesi liikkuvuuden siirtymän testi osoitti, että proteiini uutettu SOX4 sisältävien ytimien hidasti migraatio radioleimatun DNA-koetin koostuu

SEMA3

tai

Plexin

promoottorijaksoihin pitoisuudesta riippuvalla tavalla . Tämä vaikutus on erityisesti lievittää kylmä-leimattu koetin, joka koostuu SOX4-konsensus sitovia sekvenssejä, ja niitä voidaan supershifted lisäämällä SOX4 vasta-aineita (kuvio. 3E). Toisaalta, RNAi-välitteinen väheneminen SOX4 in PANC1 soluissa (66% ja 78%: n vähennys SOX4 proteiinin siSOX4 # 1 ja siSOX4 # 2, tässä järjestyksessä, Fig. 3F) johti samanaikainen lasku mRNA ja proteiini tasoilla useimmissa SEMA3 /Plexin perheenjäsenet ja NRP1 (Fig. 3G ja 3H). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että SOX4 voisi toimia master tekijä aktivoimaan transkription SEMA3 ja Plexin geenien samanaikaisesti, mikä ilmaus useita SEMA3 ja Plexin perheenjäsenten haiman syöpäsoluissa.

(A) edustaja päätepiste PCR kromatiinin immunosaos- (ChIP) käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​SOX4 in PANC-1-soluissa. Genomi-DNA: t monistettiin alukesarjat jälkeen sitoutuneet proteiinit digestoitiin proteinaasi K: ChIP tulokset osoittivat sitoutumisen SOX4 genomisen alueen kätkeminen SOX4 sitoutumiskohdat ennustettu promoottori useimpien

SEMA3

ja

Plexin

geenejä. (B) määrällisesti siru tuloksia (A), n = 3. Kukin kaista kuviossa 3A sai arvon mitattuna densitometrian ja normalisoitu, jonka arvo on IgG. ChIP tehokkuus määritellään prosenttiosuutena johdettu arvo PCR SOX4-immuunisaostumassa suhteessa, että koko genomista tulo.

Virhepylväät

, keskihajonta (SD) vähintään kolmena kappaleena. (C) lisääntynyt lusiferaasiaktiivisuus konstrukteja, jotka sisältävät

SEMA3

– tai

Plexin

– promoottori puuttuessa (valkoiset pylväät) tai läsnä ollessa (harmaat pylväät) ja koekspressoidusta SOX4 verrattuna promoottoriton pGL3-Basic ohjaus. Konstruktit kätkeminen SOX4-konsensus sitoutumiskohta transfektoitiin transientisti SOX4 sisältävät HeLa-soluissa. On esitetty suhteet tulikärpäsen lusiferaasi ilmentymisen Renilla lusiferaasin ilmentymistä (ilmaistuna kotransfektoiduista plasmidi), mitattuna 48 tuntia transfektion jälkeen, normalisoitu keskimääräinen suhde on pGL3-Basic. Virhe palkit osoittavat SD, n = 4. Opiskelijan

t

-testi, *,

P

0,01; **,

P

0,001. Läsnäollessa kotransfektoitiin SOX4, lusiferaasiaktiivisuutta vetämänä jokaisen

SEMA3

– tai

Plexin

– promoottori on lisäksi täydennetty (harmaat palkit) verrattuna valetransfektoidun (valkoiset pylväät) ja valvonta . (D) transkriptionaalista aktiivisuutta

PLXNA2

promoottori ohjaa SOX4 vaimenee kun konsensus SOX4-sitoutumiskohdat mutatoitunut. Boxed DNA-sekvenssi, konsensus SOX4-sitoutumiskohta; Alleviivaus varjo kirjaimin, mutatoitunut SOX4 sitovaa kohtaa. Pylväsdiagrammi osoittaa, että mutaatio joko SOX4-sitoutumiskohdan aiheutti merkittäviä lusiferaasiaktiivisuuden pienenemiseen ohjaavat

PLXNA2

promoottorin läsnä ollessa yli-ilmentynyt SOX4. Virhepalkkien, SD, n = 5. Opiskelijan

t

-testi, *,

P

0,01; **,

P

0,001. (E) EMSA osoittaa, että migraatio radioleimattua DNA-fragmentti on peräisin

PLXNA2

promoottori hidastetaan SOX4 sisältäviä HeLa raakaa tumaekstrakti pitoisuudesta riippuvaisella tavalla. Signaali proteiiniin sitoutuvien jälkeenjäänyt band (nuolenpäät) oli nimenomaan väheni kylmä koettimilla, jotka sisältävät SOX4 sitova konsensussekvenssejä ja oli super-siirtynyt anti-SOX4 vasta-ainetta (tyhjä nuolenkärki). Tähdellä, ei-spesifinen sitoutuminen signaalit; nuoli, un-Sitoutunut radioaktiivisesti leimattu koetin. (F) tehokas RNAi knockdovvn endogeenisen SOX4 in PANC-1-soluissa näkyy SOX4 immunoblottauksella. Ilmoitettu arvo on normalisoitu suhteellinen intensiteetti mitattiin densitometria (suhde SOX4 /Tubulin Sekoitetuille-siRNA solujen määritellään 1.). Kaksi vakaa siSOX4 kloonien merkitty siSOX4 # 1 ja siSOX4 # 2 rakennettiin kanssa kohdistamista oligonukleotidin suunnattu erilaisia ​​nukleotidisekvenssejä

SOX4

geeni (siSOX4 # 1, nt.1999-2019 NM_003107.2; siSOX4 # 2 , nt.1362-1382 NM_003107.2). (G) Immunoblottaus in SOX4-köyhdytettyä soluissa osoittaa samanaikainen väheneminen proteiini määrää NRP1, SEMA3- ja Plexin- perheenjäseniä. Tubuliinia käytettiin standardina normalisointia kvantifiointiin kunkin kaistan mitattuna densitometria. Suhde osoitti oli normalisoitu arvo siSOX4 soluissa suhteessa normalisoitua arvoa salattu-siRNA soluissa. (H) Reaaliaikainen PCR määrittämään mRNA: n ilmentymisen

SEMA3

ja

PLXN

geenien SOX4-köyhdytettyä solujen suhteen SOX4 runsas salatun-siRNA-soluja (esitetty kertamuutosta). Opiskelijan

t

-testi, *,

P

0,01; **,

P

0,001.

RNAi-välitteinen väheneminen SOX4 estää kasvaimen kasvua

in vitro

ja

in vivo

tutkia miten SOX4 vaikuttaa tuumorigeneesiä PDAC soluissa, vaikutus SOX4 knockdown soluproliferaatioon ja solusyklin etenemisen tutkittiin ensin. Se osoitti, että kokonaismäärä elävien solujen oli merkittävästi vähentynyt SOX4-knockdown-soluja viljeltiin

in vitro

kolme päivää (Fig. 4A). Solusyklin etenemisen ja apoptoosin verrattiin kvantitatiivisesti välillä SOX4 tukahdutetaan ja -competent soluja, ja mitään merkittävää eroa ei havaittu virtaussytometrialla tai TUNEL-määrityksessä haastaa genotoksinen (Fig. 4B ja 4C). Sen sijaan, leviämisen SOX4 tukahdutetaan (siSOX4 # 1 ja siSOX4 # 2) solut oli ilmeisesti väheni, vähemmän Ki-67 immunoreaktiivisuus ja paljon vähemmän BrdU-merkintöjä havaittiin siSOX4 soluissa (Fig. 4D), mikä osoittaa, että solujen määrä syöttämällä solusyklin pienenee, kun SOX4 on tyhjentynyt. Tämä havainto viittaa siihen, että SOX4 voisi toimia helpottamaan solujen proliferaatiota, kun ilmaistaan ​​haiman syöpäsoluissa.

(A) Solujen lisääntyminen vaikutetaan PANC-1-solujen RNAi-tukahduttaminen SOX4. 30000 solua siirrostettiin kuhunkin kuoppaan 12-kuoppalevyllä. 24, 48 tai 72 tuntia ymppäyksen jälkeen solut kerättiin ja laskettiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä.

Virheviivat

, SD kuudesta itsenäisestä kokeesta, Opiskelijan

t

-testi. (B) edustaja virtaussytometrillä siSOX4 soluja värjättiin propidiumjodidilla ei ole merkittävästi vaihtelu salattu-siRNA solujen apoptoosin (kuvattu osa-G1) tai solusyklin etenemisen. Solujen prosenttiosuus Saharan G1, G0 /G1, S ja G2 /M vaiheessa osoitettiin oikeassa alaspäin kulmassa kullekin lohkolle. (C) edustava TUNEL-merkitseminen solujen kiistäneet genotoksinen sisplatiinia (10 ug /ml, 12-h). Erot apoptoosin ei havaittu SOX4-taintumisen (siSOX4 # 1 ja siSOX4 # 2) ja ohjaus (scrambled-siRNA) soluissa. (D) pienempi solujen lisääntymisen määrä ja vähentynyt määrä soluja Valitsemalla M vaihe siSOX4 soluissa. siSOX4 ja salattu-siRNA solut maljattiin peitinlaseilla ja inkuboitiin 48 tunnin ajan. Ennen sadonkorjuuta ja kiinnittäminen paraformaldehydillä, soluja inkuboitiin 10 uM BrdU: ssa 3 tuntia, ja sitten altistettiin anti-Ki-67 tai anti-BrdU immunofluoresenssivärjäyksellä. Kaksikymmentä satunnaisesti valittu HPF (X400) laskettiin tilastollista analyysia (Opiskelijan

t

-testi). (E) -tuumoriksenografti on siSOX4 /PANC-1-soluja kasvaa pienempi kuin kontrollisolujen (salattu-siRNA) on SCID hiiri. Hiiret lopetettiin 30 päivää sen jälkeen, kun ihon alle siirrostuksen kontrollisoluihin vasemmalla ja siSOX4 solujen oikealla puolella kyljen. (F) Pienemmät ja kevyemmät tuumoriksenografteissa of siSOX4 solujen verrattiin kontrolli (n = 9, Opiskelijan

t

-testi). (G) edustaja H & E, Ki-67, PHH3 immunostain, ja TUNEL merkintöjä kudososat tuumoriksenograftien. Mittaviivat = 50 pm. (H, I ja J) kvantifiointiin lisääntymistä (Ki-67 merkintä), apoptoosin (TUNEL tahra) ja mitoosin (PHH3-immunostain). Kahdeksantoista satunnaisesti valitut kentät (x200) kussakin Ki-67-värjättyä jakso ja solujen kaksikymmentäseitsemän satunnaisesti valitun kentät (X400) varten TUNEL merkinnät tai PHH3 immunostain laskettiin kussakin ksenograftin kasvain. Lisääntyvä indeksi ja mitoosi laskee siSOX4 kasvaimen solut ovat huomattavasti alhaisemmat kuin kontrollisolut, kun taas prosenttiosuus apoptoottisten solujen ei eronnut (Studentin

t

-testi). n, kokonaismäärä solujen laskettiin.

Käyttäen

in vivo

tuumorigeneesiin määritys, olemme myös osoittaneet, että kasvaimet kasvavat SOX4 tukahdutetaan solut olivat paljon pienempiä ja paino verrattuna kanssa kasvanut ohjaus SOX4-kompetentteja soluja (Kuva. 4E ja 4F). Kuten on esitetty kuviossa.