Krooninen sairaus

tiivistelmä

Podoplanin (PDPN), musiinialue-tyyppinen transmembraanisen glykoproteiinin ominaisia ​​imunestejärjestelmän ilmaistaan ​​erilaisissa ihmisen syövissä, ja pidetään edistävänä tekijänä syövän etenemiseen. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää molekyyli rooli PDPN biologiassa kilpirauhasen syöpäsoluja. PDPN ilmentyminen arvioitiin ensisijainen kilpirauhasen karsinoomat ja kilpirauhasen sinoomasolulinjoja RT-qPCR, Western blotting, IF ja IHC. Jotta voidaan tutkia roolia podoplanin määritettäessä solun pahanlaatuinen potentiaalia (solumigraatiota, invaasio, proliferaatio, adheesio, liikkuvuuteen, apoptoosin), kilpirauhasen syöpä solulinjan vaiennetaan PDPN ilmaisua käytettiin. Havaitsimme, että PDPN on ainoastaan ​​ilmaistu syöpäsoluissa 40% papillaarisen kilpirauhaskarsinoomaa (PTC) kudoksiin. Lisäksi

PDPN

mRNA: ta ja proteiinia ekspressoidaan voimakkaasti PTC-johdettu TPC1 ja BcPAP solulinjoissa, mutta ei ole havaittu follikulaarinen kilpirauhasen syöpä solulinjat.

PDPN

knock-down merkittävästi vähentynyt solujen invaasiota, ja vaatimattomasti vähensi solujen vaeltaminen, kun taas leviäminen ja tarttuvuus ei vaikuttanut. Tuloksemme osoittavat, että PDPN välittää invasiivisia ominaisuuksia peräisin olevien solujen papillaarinen kilpirauhasen karsinoomat, viittaa siihen, että podoplanin voitaisiin edistää PTC etenemistä.

Citation: Rudzińska M, Gaweł D, Sikorska J, Karpińska KM, Kiedrowski M, Stępień T , et ai. (2014) The Role of Podoplanin biologiassa Differentiated kilpirauhassyövän. PLoS ONE 9 (5): e96541. doi: 10,1371 /journal.pone.0096541

Editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Ranska

vastaanotettu: 24 tammikuu 2014; Hyväksytty: 09 huhtikuu 2014; Julkaistu: 05 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Rudzińska et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustus 2012/07 /B /NZ5 /02444 The National Science Center, Puola. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Differentiated kilpirauhaskarsinoomaa (DTC) on yleisin ihmisen hormonitoimintaa maligniteetti. Papillaarinen (PTC) ja follikulaarinen (FTC) kilpirauhasen karsinoomat ovat kaksi suurta DTC variantteja, entisen edustaa yleisin (80% kaikista DTC tapauksista) [1]. Molekyyli patogeneesi kilpirauhassyövän liittyy useita molekyyli- signalointireitteihin ensisijaisesti muuttaa PTC ja FTC. PTC kuljettaa onkogeeninen pistemutaatioiden

B-RAF

ja

RAS

, ja kromosomi uudelleenjärjestelyt johtaen

RET

ja

trkA

kimeerisiä geenejä, jotka kaikki voi aktivoida mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) reitti [2]. Aktivointi

BRAF

V600E pistemutaatio näkyy keskimäärin 45%, kun taas

RET /PTC

uudelleenjärjestelyjä ja

RAS

mutaatioita 10-20% PTC tapauksista [3] [4,]. Vuonna FTCs lisäksi

RAS

mutaatio,

PAX8 /PPARy

uudelleenjärjestelyn ja vapautuminen PI3K /ATK /PTEN (fosfatidyyli-3-kinaasi /ATK /fosfataasi ja tensin homologin poistettu kromosomissa 10) signalointiryöpyn usein havaitaan, jotka liittyvät etenemiseen ja erilaistamattomuuden aktivoimalla PI3K ja AKT ja inaktivaatio tai menetys

PTEN

vaimennin geeniekspressiota [5], [6]. Vaikka PTC katsotaan olevan veltto vaurion suotuisa ennuste, kehittäminen imusolmukemetastaaseja vaikuttaa jopa 50% PTC potilaista ja edelleen kehittämistä etäispesäkkeitä joissakin diagnosoitu syöpien vähentää eloonjäämisaste [7], [8]. Yhteistä kasvain laajeneminen on levittää ensisijainen syöpäsolujen, joita voi esiintyä

kautta

useita reittejä. Kliinis tiedot ovat osoittaneet, että papillaarisen karsinoomat ovat alttiita etäpesäkkeitä alueellisiin imusolmukkeisiin, mikä viittaa siihen, että solut ovat levinneet

kautta

imunestejärjestelmän [9], [10]. Molekyylimekanismeja ja geneettiset tekijät osallistuvat levittämiseen PTC soluja, jotka määritetään metastaattisen potentiaalin papillaarisen kilpirauhassyöpä, pysyvät suurelta osin tuntemattomia.

Etäpesäke syöpäsolujen on monivaiheinen prosessi ja solujen eri kertoimiin kasvaimet voivat olla mukana. Useat tutkimukset ovat korostaneet merkitystä imusuoniston tekijöitä etenemistä erilaisia ​​kasvaimia ja useita säätelymolekyyleja osallistuvien lymfangiogeneesiä on tunnistettu [11], [12], [13]. Yksi tärkeimmistä imusuoniston molekyylien on podoplanin (PDPN). Ihmisen PDPN, joka tunnetaan myös nimellä T1α -2, PA2.26, gp38 tai aggrus, on 38-kDa: n tyypin I limaa, kuten transmembraanisen sialoglykoproteiinilla koostuu erittäin O-glykosyloitunut solunulkoinen domeeni, yksittäinen membraanin läpäisevä alue ja lyhyt sytoplasminen tail [14]. Normaaleissa ihmisen kudoksissa, podoplanin ilmentyy munuaisissa podosyyteissä, luurankolihaksessa, sydämessä, istukassa, keuhkoissa, ja muualla [15], [16], [17]. PDPN ilmaistaan ​​imusuonten endoteelisoluissa (LEC), mutta ei veressä endoteelisoluissa (BEC), ja edustaa täten spesifinen merkki lymfaattiseen endoteeliin ja imusuonten [11]. Huolimatta spesifisyyden sen ilmentymistä lymfaattiseen endoteeliin, PDPN on myös havaittu eri syövissä [18], [19], [20]. Biologinen toiminta PDPN ei ole täysin määritelty, mutta käytettävissä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että se voi olla tärkeä tehtävä välittäjänä kasvainsolun invaasiota [21]. Yksityiskohtainen mekanismi taustalla leviämisen eriytetty kilpirauhasen kasvainsolujen ja syövän etenemisessä, ja erityisesti osuus pro-imusuoniston molekyylien tämä prosessi on huonosti ymmärretty. Siten Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli luonnehtia ilmentymistä ja toimintaa podoplanin kilpirauhasen kasvaimet biologiassa. PDPN ilmentyminen tutkittiin primaarikasvaimille ja paneelin kilpirauhassyövän johdetut solulinjat papillaarinen (TPC1 ja BcPAP) ja follikulaarinen (FTC133 ja CGTH-W-1) kilpirauhasen karsinoomat. Tutkimme myös roolia PDPN säätelyssä tunnusmerkkejä pahanlaatuisten solujen fenotyyppiin: lisääntymistä, tarttuvuus, eloonjäämisaste, liikkuvuuteen, muuttoliike ja hyökkäystä. Sen määrittämiseksi tehtävä tämä läpäisevä glykoproteiini Metastasoituneessa käyttäytymistä papillaarisen syöpäsoluja, suoritimme RT-qPCR, immunofluoresenssilla ja immunohistokemia, sekä Western-blot-analyysit, ja tutkittiin

PDPN

knock-down viljellyissä soluissa . Saadut tiedot viittaavat vahvasti siihen, että PDPN voidaan pitää pro-metastaattinen vaikuttava tekijä leviämisen PTC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyttiin eettinen komitea Human Studies The Centre of jatko Medical Education. Otettiin kudosnäytteet luvalla vastaavien eettisten komiteoiden (klo Cancer Center ja Institute of Oncology kello Kopernikus Memorial Hospital, ja Centre of jatko Medical Education). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta mukana tässä tutkimuksessa. Ei teollisuus antoi tukea tälle tutkimukselle.

Kilpirauhasen kudosnäytteitä ja solulinjoissa

geeniekspression kokeita, tuore kudoksia yksilöitä papillaarisen kilpirauhaskarsinoomaa (T) ja viereisen normaali kilpirauhasen kudosta kontralateraalista lohko (NT) kerättiin Maria Skłodowska-Curie Memorial Cancer Center ja Institute of Oncology, laitoksella yleisen ja umpieritysrauhasten Surgery, Kopernikuksen Memorial Hospital (Varsova ja Łódź, Puola). Immunohistokemiallista (IHC) analyysi, arkistoitu formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudokset (erilaisia ​​kuin RT-qPCR) potilailta, joille oli tehty koko kilpirauhanen käytettiin.

sarja 173 arkistoidaan kudosten käsitti: 112 papillaarisen kilpirauhasen karsinoomat (94 klassinen PTC kanssa papillaarinen tai seka papillaarinen-follikkelien kasvun malli ja 18 follikulaarisen papillaarinen karsinooma variants- FvPTC), 27 follikulaarinen kilpirauhasen karsinoomat (FTC), 24 follikulaarinen adenoomia (FA) ja 10 normaalia kilpirauhasen kudosten (NT). Otettiin kudosnäytteet luvalla vastaavien eettisten komiteoiden (klo Cancer Center ja Institute of Oncology kello Kopernikus Memorial Hospital, ja Centre of jatko Medical Education).

Toiminnallisista tutkimuksissa käytimme kilpirauhasen sinoomasolulinjoja peräisin papillaarikuvioiden (TPC1 ja BcPAP) ja follikulaarinen (FTC133 ja CGTH-W-1) kilpirauhasen karsinoomat ja SV40 kuolemattomiksi ihmisen kilpirauhasen epiteelisolujen linja Nthy-ori 3-1 (jäljempänä meille NTHY) edustamaan tavanomaista kilpirauhasen solut. Solulinjat saatiin Saksan kerääminen mikro-organismien ja Soluviljelmien (BcPAP ja CGTH-W-1), ja Euroopan Collection of Cell Cultures (FTC 133 ja Nthy-ori 3-1). TPC1 solulinja [22] luovutti ystävällisesti Dr. M. Santoro (University of Napoli Federico II, Italia) [23]. Soluja viljeltiin täydellisessä RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% (v /v) FBS: ää (Roche, Sveitsi), lukuun ottamatta FTC133 soluja, jotka oli kasvatettu täydellisessä DMEM /F-12, jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Life Technologies, Invitrogen, USA). Kaikki solut inkuboitiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä.

RNA: n eristys ja reaaliaikaisen (RT) -qPCR

Kokonais-RNA eristettiin ihmisen kilpirauhasen yksilöt ja kilpirauhassyöpä solulinjoissa käyttäen RNA Mini Kit (A biotekniikan, Puola) mukaan suositellaan protokollaa, ja RNA eheys varmistettiin agaroosigeelielektroforeesilla. Kokonais-RNA (1 ug) käytettiin cDNA-synteesin kanssa High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Applied Biosystems, USA). Ilmentyminen ihmisen

PDPN

ja

18S rRNA

geenien kvantifioitiin RT-qPCR käyttäen cDNA: ta templaattina reaktioissa, jotka sisältävät kaksijuosteisen DNA-spesifisen väriaineen SYBR Green I ja Maxima fluoreskeiini RT -qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Kanada), ja spesifisiä oligonukleotidialukkeita (alla), kuten aiemmin on kuvattu [24].

PDPN

(NM_006474) B

Forward : 5′-CGAAGATGATGTGGTGACTC-3 ’

Reverse: 5′-CGATGCGAATGCCTGTTAC-3′

18S rRNA

(NM_02255) B

Forward: 5 ’ -CCAGTAAGTGCGGGGTCATAAG-3 ’

Reverse: 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′.

Amplification, tiedonkeruu ja tietojen analysointi suoritettiin käyttäen iQ5 Real-Time PCR Detection System ja ohjelmisto (Bio- Rad, USA).

PDPN hiljentämiselle sirna (siRNA) B

TPC1 solut transfektoitiin siRNA (lopullinen pitoisuus 30 nM) kohdistaminen ihmisen

PDPN

, (siPDPN , 5′-CGAAGACCGCUAUAAGUCUTT-3 ’; Life Technologies, Ambion, USA) ja yleinen negatiivinen kontrolli siRNA (Sigma-Aldrich, USA) käyttäen Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Invitrogen, USA) Opti-MEM (Roche, Sveitsi) keskipitkän mukaan suositellaan protokollia. Tehokkuus

PDPN

geeni esto arvioitiin 48 tuntia transfektion jälkeen RT-qPCR, Western blotting ja immunofluoresenssimenetelmällä. Koe toistettiin neljä kertaa.

Western blotting

Kerätyt solut pestiin kahdesti jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja suspendoitiin uudelleen 1% NP-40 hajotuspuskuria (150 mM natriumkloridia; 1,0% NP-40; 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0), jota oli täydennetty 1%: proteaasi-inhibiittorin ja 1% fosfataasinestäjällä cocktailit (Roche, Switzerland). Proteiinit solulysaateista kvantitoitiin ja näytteitä 30 ug erotettiin 8% SDS-PAGE-geeleissä ja elektro-siirrettiin nitroselluloosakalvoille (Bio-Rad, USA). Membraanit blokattiin inkuboimalla 5% rasvatonta maitoa TBS: ssä (0,1% Tween-20) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, sitten niitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa ensisijainen anti-podoplanin hiiren monoklonaalinen vasta-aine (D2-40, laimennettu 1:1000, ABD Serotec, USA). Jälkeen pesemällä voimakkaasti, kalvoja inkuboitiin HRP-konjugoidun affiniteettipuhdistettua vuohen anti-hiiri-vasta-aineella (Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA). Signaalit reaktiivinen bändit tehtiin näkyviksi tehostetulla kemiluminesenssidetektiolla (SuperSignal

® West Dura, Pierce Chemical, USA) aikaisemmin kuvatulla [25]. Latauskontrollina, kalvoja inkuboitiin monoklonaalisen anti-β-aktiini-vasta-ainetta (laimennettu 1:5000; Sigma-Aldrich, USA) identtisellä tavalla.

immunofluoresenssivärjäyksellä

Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille kiinnitettiin jääkylmällä metanolilla, blokattiin 2% vuohen seerumia /2% BSA: ta, ja inkuboitiin sitten ensisijaisesti anti-podoplanin D2-40 hiiren monoklonaalinen vasta-aine (01:50, ABD Serotec, USA). Usean pesun jälkeen, soluja inkuboitiin DyLight

TM549-konjugoidun anti-hiiri-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA). Solut vastavärjättiin ydin- väriainetta DAPI ja visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla (AxioObserver D1, Zeiss, Saksa) käyttäen 100x öljy-upotus linssi.

immunohistokemia (IHC) B

immunohistokemiallinen värjäys analyysi suoritettiin 4-um osat arkistoitu formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kilpirauhasen kudoksia: PTC (112 tapausta), FTC (27 tapausta), FA (24 tapausta), ja NT (10 tapausta). Leikkeitä deparaffinised ja lämmön aiheuttamaa antigeeni haku suoritettiin kohde hakea ratkaisua (TRS, pH 9,0; DAKO, Tanska), kuumentaen 20 minuutin ajan painekattila. Levyjä inkuboitiin sitten anti-podoplanin D2-40-vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Pesun jälkeen Envision + vasta-aine-reagenssi sovellettu (DAKO, Tanska). Reaktiot kehitettiin käyttäen diaminobentsidiiniä (DAB) kuten kromogeenista substraattia. Leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä, asennettu ja tutkittiin valomikroskoopilla. Negatiiviset kontrollit valmistettiin noudattamalla samaa menettelyä, mutta jättämällä pois inkubaatio primaarisen vasta-aineen. IHC värjäytyminen arvioitiin kaksi riippumatonta tarkkailijaa (MK ja BC) ja pisteytettiin ”negatiivinen” tai ”positiivinen” mukaan suhteellinen intensiteetti PDPN värjäystä. Immuunihistokemialliset tiedot tehtiin tilastollinen analyysi.

Solun maahanmuutto- ja invaasion määritykset

Solun maahanmuutto- ja invaasion aktiivisuus määritettiin käyttämällä Boyden aseta kammio (8-um huokoskoko, BD Falcon ™ Cell Culture insertit, USA) ja BD BioCoat matrigeelin Invasion Chamber 8 um (BD Bioscience, USA), tässä järjestyksessä. Solut kerättiin ja suspendoitiin seerumittomassa väliaineessa, sitten laskettiin EVA Automatic solulaskuri (Nano ENTEK, Korea). Yhteensä 2 x 105 solua suspendoitiin uudelleen RPMI 1640 väliaineessa (sekä maahanmuuttoa ja invaasion määritykset) lisättiin kammioihin ja inkuboitiin 24 tuntia 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO2 ilmakehässä. RPMI 10% FBS: ää käytettiin kemoatrak-. Solut, jotka olivat vaeltaneet tai tunkeutuneet kalvon läpi kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen Diff-Quik Kit (Medion Diagnostics, Sveitsi), kuvaamisen at 40x suurennos Olympus BX41 mikroskoopilla, ja laskettiin. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa.

In vitro

haavojen liikkuvuuden määritys

Naarmut vastaavan kokoisella tehtiin konfluentteja yksisolukerrosten (kasvatettu 6- kuoppalevyille) käyttäen steriiliä 200 ui pipetin kärki. Yksisolukerrokset pestiin sitten PBS: llä poistamaan irrallaan solujen ja roskat, ja sitten täytettiin uudelleen elatusainetta ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. Levyt havaittiin ja valokuvattiin valomikroskoopilla (10x, AxioObserver D1, Zeiss, ja 20x Nikon Diaphot 300) välein 3 tuntia määrittää nopeuden haavan. Leveys haavat kussakin aikapisteessä mitattiin 5 riippumaton kenttiin ImageJ ohjelmistoa (www.rsbweb.nih.gov). Solun vaellusetäisyydet määritettiin mittaamalla leveys haavan jaettuna kahdella ja vähentämällä tämä arvo alkuperäisen puoli-haavan laajuudessa [26]. Etäisyys kvantifioitiin seuraavasti: kanssa 10x objektiivi, 1 pikseli = 1,026 m; kanssa 20x objektiivi, 1pixel = 0,43 um.

solunelinkykyisyysmääritys

arvioimiseksi soluproliferaation määrä elinkelpoisia soluja, 24 ja 48 h transfektion jälkeen siRNA määritettiin käyttämällä 2, 3-bis- (2-metoksi-4-nitro-5-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium-5-karboksanilidi (XTT) tetrazolium soluproliferaatiota kit (EZ4U, Biomedica GmbH, Itävalta). Lyhyesti, kuoppiin 96-ympättiin 8 x 10

3-solut (5 toistoa). Sitten 25 ui XTT seosta reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan ja absorbanssi kokeen aallonpituus (450 nm mitataan formatsaanin tuotannon) ja vertailutiedot aallonpituus (620 nm) mitattiin eri ajankohtina käyttäen Labsystems Multiscan RC mikrolevynlukijaa (Thermo Fisher Scientific, USA).

apoptoosimäärityksessä

Apoptoosi arvioitiin käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (Abcam, UK) seuraavissa suositeltu protokollaa. Lyhyesti, talteen otettuja soluja pestiin PBS: llä, inkuboitiin FITC-anneksiini V: n ja propidiumjodidin 5 min huoneen lämpötilassa ja sitten tutkittiin virtaussytometrialla (FACSCantoII, BD Biosciences, USA). Koe suoritettiin kolme kertaa.

Data-analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen epäparametrisia U-testi ja pariksi t-testiä (GraphPad, Prizm, USA).

P

arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Monimuuttuja logistinen regressiomalli käytettiin tutkimaan yhdistyksen riippumattomien covariates ja podoplanin tumorous ilme.

Tulokset

PDPN proteiinin ilmentymistä ja solusijaintipaikan

ilmentymistä podoplanin ensin arvioitiin arkistomuistiin kilpirauhasen kasvain kudosnäytteitä. Immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin sarja 173 parafinoidut kudoksissa (112 PTC, 27 FTC, 24 FA ja 10 NT) käyttäen anti-podoplanin monoklonaalinen vasta-aine D2-40. Normaalissa kilpirauhaskudokseen PDPN värjäytyminen oli poissa follikulaarinen soluissa ja anti-PDPN vasta-leimattu yksinomaan ja voimakkaasti vain imusuonten endoteelisolujen lukuisissa imusuonten, joka toimi hyvän sisäisen valvonnan (kuvio 1A, a). Kaikkien analysoitujen FTC ja FA näytteet olivat negatiivisia PDPN immunoreaktiivisuus (Fig. 1A, b, c). Suurin osa tutkituista PTC olivat myös negatiivisia PDPN merkintöjä (Fig. 1A, d). Kuitenkin 40% (45 112) PTC myönteisesti immuunivärjäykseen podoplanin (Fig. 1A, e-l). Eri intensiteetti PDPN merkintöjä (kohtalaisen voimakas) havaittiin sytoplasmassa kasvainsolujen ja useimmissa tapauksissa värjäys jaettiin tasaisesti syöpä. Sen sijaan peritumoraalista kudoksen soluja (pidetään ”normaali kilpirauhasen kudos”) olivat täysin PDPN negatiivisia (ks. 1A; e, j, k, l). Näissä kasvaimettomina normaali kilpirauhaskudokseen marginaalit, D2-40 vasta-leimattu yksinomaan ja voimakkaasti imusuonitulehdus eri kokoisia ja muotoisia. Yhdistys PDPN ilmaisun kasvain kudosnäytteiden kanssa kliinis tietojen arvioitiin monimuuttuja logistista regressiomallia ja yhteenveto taulukossa 1. Sytoplasmiset PDPN ilme ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa potilailla, joilla on suurempi tai pienempi kasvaimen kokoa (pT) tai histologisia (FvPTC

vs

klassinen PTC) alatyyppi. Vaikka oli eniten tapauksia (9 kasvaimia joukossa 17 testattu) kanssa indusoi podoplanin sytoplasmista ekspressiota pT3 ryhmässä ja intensiteetti värjäytymisen oli vahvaa kaikilla kasvaimia, tapausten määrä ryhmässä oli liian pieni ollakseen analysoida tilastollisesti. Kuitenkin podoplanin proteiinin ekspressio korreloi merkitsevästi potilaan iästä. Vanhemmat PTC potilasta (≥45) osoitti useammin (69%

vs

31%) PDPN neoexpression sitten nuoremmat ( 45), (oikaistu riskisuhde 4, 95%: n luottamusväli 1,76-9,2,

P

0,001).

. Immunohistokemia havaitseminen podoplanin suorittivat parafinoidut kudosleikkeiden. Edustaja immunovärjäys saadut tulokset anti-PDPN monoklonaalinen vasta-aine D2-40. (A) yksinomainen ja vahva värjäytyminen imusuonten normaalissa kilpirauhaskudokseen; (B) follikulaarinen adenooma (FA) kudos negatiivinen podoplanin; (C) follikulaarinen kilpirauhasen karsinooma (FTC) kudos negatiivinen podoplanin; (D) papillaarinen kilpirauhassyövän (PTC) tapauksessa negatiivinen podoplanin; (E-l) voimakas sytoplasmista värjäytymistä PDPN PTC soluissa. Sähköisessä, j ja i voimakas värjäytyminen PDPN kasvainsoluissa, jossa peritumoraalista marginaali negatiivinen podoplanin ja vahva värjäytyminen imusuonten sisäisenä positiivisena kontrollina. Alkuperäinen suurennus: a-100x, a-inset -100x; b-200x, b-inset -100x; c-200x; d-200x, e-100x, f-100x, g-200x; h-200x, i-100x, j-200x, k-200x, L-400x. 112 PTC tapauksissa, 45 (40%) näytetään ektooppinen podoplanin ilmentymistä syöpäsoluissa. B. Suhteellinen PDPN mRNA: n ekspression 21 PTC (T) ja pariksi normaaleissa kudoksissa (NT) analysoitiin RT-qPCR. PDPN ja 18S rRNA transkripti tasojen määrä ja podoplanin ilmaisun normalisoitu vastaan ​​kuin taloudenhoito geeni (18S rRNA). Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM, **

P

0,001.

analyysi laajennettiin tutkinta

PDPN

geeni ilmaisun sarjassa kirurgisesti poistettu PTC /NT pariksi kudosten käyttäen RT-qPCR. 14 ja 21 analysoitiin PTC /NT tapauksissa merkittävästi suurempi (

P

0,001) taso

PDPN

kopio todettiin PTC näytteissä verrattuna vastaavassa normaalissa kilpirauhasessa kudoksissa (kuvio . 1 B). Jäljellä 7 PTC /NT paria, taso

PDPN

mRNA PTC kudoksissa oli yhtä suuri tai jopa pienempi kuin, että pariksi normaaleissa kudoksissa.

Expression ja sijainti solun PDPN kilpirauhassyövän hoitoon solulinjoissa

tutkimiseksi toiminnallista roolia podoplanin kilpirauhasen solubiologian tutkimme normaali kilpirauhasen solulinja (NTHY), ja paneelin papillaarisen (TPC1 ja BcPAP) ja follikulaarinen (FTC133 ja CGTH- W-1) kilpirauhassyöpä solulinjat. Taso

PDPN

mRNA oli hyvin alhainen kuolemattomaksi NTHY solut (Fig. 2A). Kilpirauhasen syöpä soluja, huomattavia eroja suhteellisissa

PDPN

transkriptio taso solujen välillä peräisin PTC ja FTC havaittiin. TPC1 ja BcPAP solut osoittivat korkeinta

PDPN

mRNA: n ilmentymisen kaikista testatuista kilpirauhaskarsinoomaa solulinjat. Sen sijaan,

PDPN

transkripti, ei ole havaittu FTC133 ja CGTH-W-1 follikulaarinen karsinooma-solulinjat (Fig. 2A). Keskimäärin taso

PDPN

mRNA PTC solulinjoissa oli yli 3 kertaa suurempi kuin vastaava NTHY kontrolli solut.

. PDPN mRNA: n ekspression ihmisen kilpirauhasen syöpäsolulinjoissa. RT-qPCR arvioimiseksi käytettiin tasoilla transkriptin, joka koodaa podoplanin in valmistetun kokonais-RNA NTHY kontrollisoluja, PTC-johdettu TPC1 ja BcPAP solulinjat, ja FTC-johdetut FTC133 ja CGTH-W-1-solulinjat. Data neljästä itsenäisestä kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM, **

P

0,001. B. Podoplanin proteiini tasoilla ihmisen kilpirauhassyöpä solulinjoissa. Proteiini uutteet (30 ug) tehtiin Western blot -analyysi anti-PDPN monoklonaalinen vasta-aine D2-40 ja β-aktiini-vasta-aine latauskontrollina. C. Immunofluoresenssianalyysi on podoplanin ilmaisun TPC1, BcPAP, FTC133 ja CGTH-W-1 kilpirauhassyöpä solulinjoissa. PDPN visualisoitiin värjäämällä anti-PDPN monoklonaalinen vasta-aine D2-40, jota seuraa DyLight549-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (punainen), ja tumat vastavärjättiin DAPI (sininen). Suurennos 1000x.

Podoplanin proteiinin ilmentymisen ja solusijaintipaikan kilpirauhassyövän hoitoon solulinjoissa

vahvistavan RT-qPCR tuloksia, teimme Western blotting ja immunfluorescence joka arvioi PDPN proteiiniekspression ja määrittää sen sijainti solun sisään kilpirauhassyöpä solulinjoissa. Podoplanin proteiini estimoidut immunoblottauksella olleet täysin RT-qPCR tuloksia. PDPN proteiini oli voimakkaasti indusoitunut TPC1 ja BcPAP solulinjoissa, mutta sitä ei havaittu FTC-peräisin soluja (Fig. 2B). Immunofluoresenssianalyysi vahvisti korkeita PDPN vuonna TPC1 ja BcPAP soluja. Proteiini paikallistettiin pääasiassa solukalvojen ja sytoplasmisen osaston PTC-peräisin solulinjoissa (Fig. 2C). FTC133 ja CGTH-W-1 rivit olivat negatiivisia PDPN Immuunivärjäystä jälleen validoida RT-qPCR data.

vaikutus PDPN on syöpäsolujen fenotyyppi

valossa sen pro-invasiivisia ominaisuudet raportoitu muunlaisia ​​ihmisen kasvaimista ja korkea havaittu PTC näytteissä, tutkimme seuraavaksi PDPN on mukana muuttoliikkeen ja invaasion kilpirauhasen syöpäsoluja. TPC1-solut transfektoitiin siRNA: lla kohdistus

PDPN

(TPC1 /siPDPN), ja kontrolli yleinen negatiivinen siRNA (TPC1 /siNEG). Kaikki myöhemmät alas-säätely podoplanin arvioitiin käyttämällä RT-qPCR, Western blotting ja immunofluoresenssimenetelmällä menetelmiä. Vain -15% alkuperäisestä

PDPN

transkriptin tasolla havaittiin TPC1 /siPDPN soluja 48 h transfektion jälkeen, joka vahvistaa, että erityiset siRNA tuotetaan tehokas vaimentaminen

PDPN

(Fig. 3A). Western blotting ja immunfluorescence analyysit osoittivat knock-alas podoplanin geenin ilmentymisen näissä soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 3B ja 3C PDPN proteiini havaittiin vain TPC1 transfektoitujen solujen negatiivisen kontrollin siRNA. Soluproliferaatiota, tarttuvuus ja selviytyminen arvioitiin sitten varten TPC1 transfektoitujen solujen

PDPN

erityisiä ja ohjaus siRNA. Ei nousu leviämisen nopeus solujen vaiennettu

PDPN

todettiin kontrolliin verrattuna soluihin (Fig. 3d, vasen paneeli). Myös ei havainnut mitään eroja tarttuvuus ominaisuudet

PDPN

-silenced ja ohjaus soluja (Fig.3E). Lisäksi ei ollut eroja elinvoimaisten ( 90%), apoptoottisten ja nekroottisten solujen välillä erityisiä ja ei-spesifistä siRNA-käsiteltyjen TPC1 solut (Fig. 3d, oikea paneeli), mikä viittaa siihen, että ekspression PDPN ei lisätä alttiutta näiden solujen apoptoosin.

. RT-qPCR analyysi PDPN mRNA tasojen TPC1 kilpirauhasen syöpäsoluja 48 h transfektion jälkeen 30 nM siRNA spesifinen PDPN (siPDPN) tai negatiivinen kontrolli siRNA (siNEG). Tulokset normalisoitiin 18S rRNA tasolla ja pylväät edustavat keskimääräistä kertainen muutos PDPN transkriptio runsaasti soluissa, jotka on transfektoitu siPDPN verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu siNEG. Tulokset ovat tyypillisiä neljästä itsenäisestä kokeesta. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM, **

P

0,001. B. Western blot-analyysi podoplanin ja β-aktiini proteiinien TPC1 soluissa ennen (0 h) ja 48 h transfektion jälkeen siPDPN ja hallita siNEG. C. immunofluoresenssi podoplanin proteiinin TPC1 transfektoiduissa soluissa siPDPN ja hallita siNEG. Solut värjättiin anti-PDPN monoklonaalinen vasta-aine D2-40, jota seuraa DyLight549-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (punainen), ja vastavärjättiin DAPI (sininen). Suurennus 1000x. D. vaikutus PDPN solujen elinkelpoisuuden. D, vasen paneeli. Proliferaatio mitattiin 24 ja 48 tuntia transfektion jälkeen TPC1 solujen siPDPN tai kontrolloida siNEG. Solut ympättiin 96-kuoppalevyille käsiteltiin XTT-seokseen reagenssin ja formatsaanin muodostumisen mitattiin 450 nm: ssä määrittämiseksi elävien solujen lukumäärään. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen suoritettiin viitenä. D, oikea paneeli. Apoptoosi mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen TPC1 solujen siPDPN tai kontrolloida siNEG. Solut kerättiin ja värjättiin FITC anneksiini V ja propidiumjodidilla, ja sen jälkeen virtaussytometrialla. Edustavia mittaustuloksia prosenttiosuus anneksiini V + solut on esitetty. Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen, jotka suoritettiin nelinkertaisina. E. toiminta podoplanin solun tarttumiseen. TPC1 transfektoiduissa soluissa siPDPN näyttö tarttuvuus kapasiteettia verrattavissa siNEG-transfektoitujen solujen. Lyhyesti, 8000 transfektoituja soluja siirrostettiin kuoppiin 96-kuoppaisilla levyillä. Kun oli inkuboitu 24 tai 48 h, yksisolukerrokset pestiin, kiinnitettiin 4% formaldehydiä 15 minuutin ajan ja värjättiin kristallivioletilla (Merck, USA). Värjätyt solut hajotettiin käsittelemällä 2% SDS, sitten intensiteetti vapautetaan tahra kvantitoitiin spektrofotometrillä 550 nm: ssä käyttäen Labsystems Multiscan RC mikrolevylukijalla (Thermo Fisher Scientific, Kanada). Data edustaa kolmea erillistä koetta.

Muuttoliike ja invaasio

analysoida, miten heikentynyt PDPN ilme vaikuttaa migrative potentiaalia TPC1 soluja, teimme

in vitro

tyhjästä haavan paranemista soluilla, jotka oli transfektoitu siPDPN tai ohjaus siNEG. Naarmu tehtiin yksikerroksiset kylvetään solujen ja mahdolliset erot haavan paranemista tarkkailtiin. Kolmessa riippumattomassa kokeessa, paranemista lisääntynyt solun liikkuvuus havaittiin olevan nopeampi valvonnan soluja kuin

PDPN

-silenced solut (Fig. 4A). Motiliteettia transfektoiduista soluista arvioitiin sitten käyttäen kammion migraatiokokeessa. Kuten odotettua, solujen migraatiota alentunut

PDPN

oli selvästi muuttunut (Fig. 4B, vasen paneeli), joka on keskimäärin 2 kertaa pienempi kuin kontrollisolujen. Sitten tutkimme vaikutus

PDPN

knock-alas invasiivisia potentiaalia soluihin käyttäen Matrigel invaasiomääritys. Hiljentäminen

PDPN

geenin syvästi heikentynyt invasiivista kapasiteetti TPC1 soluja (Fig. 4B, oikea paneeli). Kunkin suoritettu kokeellinen rinnakkaisia, havaitsimme johdonmukaisesti ja voimakkaasti vähentäminen invasiivisuus on

PDPN

-silenced soluissa kontrolleihin verrattuna tai vanhempien TPC1 soluja (tietoja ei esitetty).

A. Scratch haavan paranemista määrityksessä. Edustaja valomikroskooppia kuvat osoittavat haavojen paranemiseen on yksikerroksiset TPC1 transfektoitujen solujen siPDPN tai valvoa siNEG, 0 ja 24% FBS: ää, kuten kemoattraktantti ja sen jälkeen 24 h, solut, jotka olivat vaeltaneet kautta 8-um huokoskoko värjättiin ja valokuvattiin klo 40x suurennus. Osuus vaeltavien solujen esitetään graafisessa muodossa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM vähintään kolme erillistä koetta, **

P

0,001. B, oikea paneeli. Invasiivisuus on TPC1 transfektoitujen solujen siPDPN tai kontrolli siNEG analysoitiin lisäämällä solujen BD BioCoat Matrigel Invasion jaosto, 8 um. Alempaan säiliöön täytettiin 10% FBS: ää, kuten kemoattraktantti ja 24 tunnin kuluttua solut, jotka oli siirretty läpi Matrigel alapintaan kalvon kiinnitettiin, värjättiin ja valokuvattiin 40x suurennuksella. Osuus invasiiviset solut esitetään graafisessa muodossa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM vähintään kolme erillistä koetta, ***

P

0,0001.

Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että podoplanin toimii proinvasive