Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

havaitseminen uusia tehokkaita ja hypotoxic syöpälääke on syntymässä uusi strategia syövän kemoterapiaa. Doksisykliini (DC) on eräänlainen antibiootteja, mutta myös estää kasvaimen kehittymisen.

Methods

MTT ja solun invaasiomääritys, virtaussytometria, western-blot-analyysillä ja nude-hiiriä käytettiin vaikutusten tutkimiseksi, ja mekanismit doksisykliinin on epiteelin munasarjasyöpä soluja.

tulokset

doksisykliini inhiboivat ja hyökkäys SKOV3 ja SKOV3 /DDP; aiheuttama kohtalainen apoptoosin SKOV3 /DDP. CXCR4 ilme sekä mRNA ja proteiini tasoilla säädeltiin vähentävästi molemmissa solulinjoissa hoidetuilla doksisykliini. Akt ja ERK1 /2 oli mukana doksisykliini vaikutus solujen proliferaatioon SKOV3 muttei SKOV3 /DDP. Akt ja EKR1 /2 fosforylaation aktivoitiin SDF-1α, joka sitten estettiin doksisykliini SKOV3. Prokaspaasia 3 ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi SKOV3 kuin että SKOV3 /DDP jota voimistunut hoidetuilla doksisykliini. In vivo, doksisykliini esti vatsakalvon -tuumoriksenografti ja laski pahanlaatuinen askites.

Johtopäätös

Doksisykliini ei vain ole estävää vaikutusta munasarjasyöpä, mutta voi myös lisätä herkkyyttä sisplatiinia. SDF-1α /CXCR4-säänneltyjen Akt ja ERK 1/2 aktivoinnit ovat todennäköisesti mukana antituumorivaikutusta doksisykliinin on SKOV3- soluissa, kun taas säätelyä prokaspaasia 3 voi olla tärkein mekanismi mukana SKOV3- /DDP soluja.

Citation: Wu W, Yu Lh, Ma B, Xu Mj (2014) estävää vaikutusta muihin Doksisykliini sisplatiinilla Sensitive ja kestävä epiteelikasvaimet munasarjasyöpä. PLoS ONE 9 (3): e89841. doi: 10,1371 /journal.pone.0089841

Editor: Han-Ming Shen, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

vastaanotettu: 20 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 27 tammikuu 2014; Julkaistu 5 maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Science and Technology komissio Shanghai kunta (nro 10411960100) ja Changhai Hospital (nro CH125510105). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) osuus on yli 90% kaikista munasarjojen maligniteettien ja on ensisijaisesti sairaus postmenopausaalisilla naisilla, esiintyy yleisimmin kuudennessa ja seitsemännessä vuosikymmenen elämän [1]. Se edustaa yleisin kuolinsyy naisten gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia ja yleistä 5 vuoden pysyvyys on vain 30% [2].

Tällä hetkellä tavanomaista hoitoa munasarjasyövän liittyy kasvaimen debulking ja Platinapohjaisen kemoterapiaa [3]. Vastaus tähän järjestelmän on vähintään 70% tapauksista kuitenkin 60-80% ensimmäisinä osallistuvien uusiutumisen 18 kuukauden sisällä, jossa on platina-resistenttejä [4].

Sisplatiini (DDP), joka on noncycle riippuvan sytotoksinen platinan johdannainen, on usein käytetty eri kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien mahalaukun, kivesten, urologic, pää, kaula, ja munasarjasyöpä [5]. Platinum yhdisteet aikaansaavat solumyrkkyvaikutuksessa muodostamalla juosteensisäiseen platina-DNA ristisidosten. Tämä estää DNA: n replikaatiota, ja johtaa lopulta apoptoosiin [6]. Kuitenkin, kuten muutkin syöpälääkkeiden, sisplatiini-vastus on edelleen merkittävä este sen kliinistä menestystä. Useimmat potilaat, joilla on uusiutuva munasarjasyöpä lopulta kehittää platina-resistenttejä [7], mikä kasvainsolut reagoivat huonosti hoitoa. Siksi on välttämätöntä etsiä uusia taloudellisia ja tehokkaita kemoterapiaa huumeita, jotka osoittavat kasvaimen kasvua ehkäisevää toimintaa ja /tai lisätä tuumorin vastainen vastauksia platinapohjaiseen kemoterapiaan.

Doksisykliini (DC) on eräänlainen toisen sukupolven tetrasykliinit, joka on yleisesti käytetään hoitamaan erilaisia ​​infektioita. Nykyiset tutkimukset ovat osoittaneet, että doksisykliini on pluripotenttien lääke, joka vaikuttaa moniin antikarsinogeenisia toimintoja, mukaan lukien anti-kasvaimen kasvun vaikutuksesta ihmisen suun squamous-cell carcinoma ja esto migraation melanoomasolujen [8] – [9]. Doksisykliini on myös potentiaalia parantaa terapeuttisen aktiivisuuden biologinen syöpähoitojen [10]. Kuitenkin vaikutus doksisykliinin on epiteelin munasarjasyövän solujen ja taustalla olevien mekanismien ole tiedossa.

Siksi meidän kokeessa, pyrimme osoittamaan, että doksisykliini on syövän vastainen aktiivisuus munasarjan epiteelin syöpäsolujen, ja tutkimaan edelleen taustalla olevien mekanismien mukana.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals National Institutes of Health. Kaikki menettelyt tässä tutkimuksessa hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitean Toisen Military Medical University. Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Soluviljely ja reagenssit

Ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa HO8910 saatiin osastolta patofysiologiassa Second Military Medical Yliopisto. SKOV3 ja sen sukulais sisplatiini-resistenttien solujen SKOV3 /DDP saatiin ATCC (American Tissue Culture Collection). SKOV3.ip solut tarjoamia Department of Gynecology and Obstetrics, Shanghai First Kansan sairaalan (saatu ATCC). Soluja ylläpidettiin RPMI-1640-väliaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä. Sisplatiini, doksisykliini, SDF-1α, vasta-aine β-aktiini ostettiin Sigma-Aldrich. Vasta-aineet CXCR4, fosfori-Akt yhteensä Akt, fosfori-ERK yhteensä ERK, MMP-2, MMP-9, kaspaasi-3 ostettiin Cell Signaling Technology. TranswellTM kit hankittiin BD, USA. ELISA kit ostettiin R β-aktiini, 5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 (eteenpäin) ja 5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3 (reverse). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Roottorin Gene 3000 (Corbett Research, Sydney, Australia) on 25-ul reaktioseosta. 2 x Taq PCR Master Mix ja 0,2 mikromol /l kutakin aluketta käytettiin. Reaaliaikainen PCR-olosuhteita mukaan optimoitu alustavissa kokeissa saavuttaa lineaarinen suhde RNA-pitoisuus ja PCR-tuotteita. Spesifisyyden alukkeiden varmistettiin tarkastelemalla sulamiskäyrä sekä myöhemmin sekvensointi reaaliaikaisen RT-PCR-tuotteet. Tislattua vettä sijasta käytettiin cDNA: ta negatiivisena kontrollina. Kaikki näytteet normalisoitiin vastaan ​​sisäisen β-aktiini-ohjaus. Geenien ilmentyminen laskettiin käyttäen vertailevaa kynnysarvon (Ct) menetelmällä.

Western-blot-analyysi

Kuten aikaisemmin on raportoitu [11], solut kerättiin ja homogenisoitiin kylmässä lyysipuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% deoksikoolihappo natriumsuola, 0,1% SDS: ää, ja proteaasi-inhibiittori-seos) käyttäen homogenisaattoria. Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin Bradford-menetelmällä käyttämällä naudan seerumin standardina. Yhtä suuret määrät proteiinit erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja. Sen jälkeen estetty esto- puskurissa, joka koostui 20 mM Tris-HCl, Ph 7.4,137 mM NaCl, 0,1% Tween 20 ja 5% rasvaton maito 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, membraaneja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaarisen vasta-aineen (anti- -β-aktiini 1:1000, anti-CXCR4 1:1000, anti-fosfori-Akt 1:1000, anti-kokonais-Akt 1:1000, anti-fosfori-ERK 1:1000, anti-kokonais-ERK 1:1000 , anti-MMP-2 1:1000, anti-MMP-9 1:1000). Blotteja inkuboitiin sitten HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1:1000, Santa Cruz) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja lopuksi visualisoida ELC liuokseen. 1 min ja valotettiin Kodak elokuva 1-30 min. Valvonnasta oikein geelilatauspuskuria, β-aktiini kvantifiointiin käytettiin. Määrittää Western blot signaaleja, band tiheys mitattiin käyttäen UMAX PowerLook III ja normalisoitu kontrolliin.

ELISA-määrityksessä

määrät SDF-1 väliaine määritettiin käyttämällä sandwich ELISA (herkkyys 15 pg /ml) valmistajan protokollia.

Cell invaasiomääritys

SKOV3 ja SKOV3 /DDP solu invasions arvioitiin käyttäen 24-kuoppaista siirtokuoppaan soluviljelmässä kammiot 8,0 um huokoskoko polykarbonaatti suodatin insertit. Suodattimet ensin päällystetty BD matrigeeliä. Kantaliuos matrigeeliä laimennettiin käyttäen seerumittomassa RPMI-1640-alustassa (01:01). Tietty määrä laimennettua Matrigel maalattiin kuhunkin suodatinpanos ja jäi huoneenlämmössä 10-15 minuuttia kuivua. Sitten viljellyt solut trypsinoitiin ja suspendoitiin seerumivapaassa RPMI-1640-alustassa pitoisuutena 2 x 10

5 ml. Yhteensä 500 ui 10% FBS /RPMI-1640-alustassa tai 500 ui 50 ng /ml SDF-1 lisättiin alempaan kammioon ja 100 ui solususpensiota levitettiin päällystettyä insertin suodattimia. Kammio inkuboitiin 3 h, jotta solut voivat kiinnittyä sitten soluja käsiteltiin doksisykliini. Kammio inkuboitiin 36 tuntia, jotta soluinvaasiota; insertti kiinnitettiin sitten dehydratoidaan alkoholin 15 minuutin ajan, ja sitten värjättiin 0,1% kristallivioletilla 15 minuutin ajan ja pestiin 1 x PBS: llä. Tarpeettomat solujen ylä- tai alapuoli suodattimen kaavittiin. Kalvo asennettiin dia ja sitten tutkitaan mikroskoopilla käyttäen 20-kertainen suurennus. Invasion kvantifioitiin mittaamalla värjättyjen solujen kolme sattumanvaraisesti alueilla per kalvo.

virtaussytometrinen analyysi apoptoosin

Solut kerättiin ja kaksinkertainen värjättiin fykoerytriinikonjugoidulla anneksiini V: n ja PE mukaan valmistajan ohjeita. Anneksiini V-positiivisten solujen katsottiin olevan apoptoottisia, ja niiden prosentuaalinen osuus solujen lukumäärä laskettiin. Kymmenentuhatta tapahtumaa kerättiin jokaisesta näytteestä käyttäen Becton Dickinson FACScan (virtaussytometria Facility, Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY), ja tiedot analysoitiin käyttäen Winlist ohjelmaa (VeritySoftware House, Topsham, ME).

siRNA transinfected teknologia

kohdesekvenssejä ERK olivat 5’GUGCUCUGCUUAUGAUAAUTT-3 ’(sense) ja 5′-AUUAUCAUAAGCAGAGCACTT -3’ (antisense). AKT siRNA olivat: 5- GACGGGCACAUUAAGAUCATT-3 (sense) ja 5- UGAUCUUAAUGUGCCCGUCTT -3 (antisense). Sekoituskoodin siRNA-dupleksit on suunniteltu (5- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ja 5- ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3) negatiivisena kontrollina (NC). Solut transfektoitiin 25 nM kohde siRNA tai ohjata siRNA avulla Xfect Transfektio mukainen aine valmistajan ohjeiden ja transfektio suoritettiin 24 tunnin ajan (varten AKT ja ERK). Tämän jälkeen elatusaine korvattiin 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää. 48 tunnin kuluttua MTT-testit suoritettiin arvioida solun elinkykyä.

Peritoneaalisille -tuumoriksenografti nude-hiirissä

Nude (BALB /c-nu) hiirissä (4 viikkoa, 18-20 g, edellyttäen, Kiinan Academy of Science, Beijing) jaettiin kolmeen ryhmään: kontrolliryhmään, kasvain ryhmä ja doksisykliini-kasvaimen ryhmässä. Kasvaimeen ryhmä, me ruiskutetaan SKOV3.ip solut hiirten vatsakalvon onteloon, jonka tiheys on noin 8 x 10

6 /ml. Solut suspendoitiin uudelleen 400 ui seerumitonta RPMI-1640-elatusaineessa ja sitten injektoitiin. Jotta doksisykliini-kasvaimen ryhmässä sen jälkeen, kun injektoitiin kasvainsoluja ja 14 päivää, doksisykliini (3 mg /hiiri) oli i.p. pistetään jokapäiväistä tukahduttaa kasvaimen kasvua. Kontrolliryhmän hiiret käsiteltiin yhtä suurella tilavuudella PBS: ää. Kaikki hiiret tapettiin 21. päivänä ensimmäisen injektion jälkeen. Hiiret, paino, kasvaimen kokoa ja askites arvioitiin kaikissa kolmessa ryhmässä.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tulokset on esitetty keskiarvona ± S.E.M. Kokeet itsenäisesti suoritettava kolme kertaa. Paritonta Opiskelijan testiä käytettiin kahden ryhmän tietoja. Yksisuuntainen ANOVA käytettiin monilukuisten vertailujen (SPSS-ohjelmiston version 16.0), P-arvot 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

Doksisykliini inhiboi proliferaatiota munasarjan epiteelin syöpäsolujen

48 tunnin kuluttua sisplatiini ja doksisykliini eri pitoisuuksissa, solujen elinkelpoisuus väheni annoksesta riippuvalla tavalla HO8910 (Fig. S1A, B), SKOV3 (Fig. 1A, C) ja SKOV3 /DDP (Fig. 1B, D). IC

50 Doksisykliinin SKOV3 verrattiin että SKOV3 /DDP. Tulokset osoittivat, että IC

50 oli 16,33 ug /ml SKOV3 (Fig. 1 C) ja 8,53 ug /ml SKOV3 /DDP (Fig. 1 D) vastaavasti, joka osoitti, että SKOV3- /DDP solut olivat herkempiä doksisykliini kohtelun kuin SKOV3- soluja.

SKOV3 (A, C) ja SKOV3 /DDP (B, D) solujen elinkelpoisuus inhiboi annoksesta riippuvaisella tavalla käsittelemällä sisplatiinin ja doksisykliini. E, F osoitti, että yhteistyössä sisplatiinihoidolle (1,5 ug /ml ja 2,5 ug /ml) ja doksisykliini (10 ug /ml) oli merkittävä kasvu eston SKOV3- soluissa verrattuna sisplatiinin tai doksisykliini käsitelty yksin. G, H osoitti, että kun yhdistetään doksisykliini (2,5 ja 5 ug /ml) eri sisplatiinin, IC

50 sisplatiinin SKOV3- /DDP soluja oli 3,36 ja 2,66 ng /ml vastaavasti. n = 9 *,

p

0,05; **,

p

0,01.

Doksisykliini herkistää munasarjasyöpäsoluja sisplatiiniin

kokeita, joilla on samanaikainen soveltaminen sisplatiinin ja doksisykliini. Ensinnäkin valitsimme kaksi pieniä annoksia (1,0 ja 1,5 ug /ml) kanssa sisplatiinia ja yhdistettynä ne pieniannoksiseen doksisykliini (0-10 ug /ml) vastaavasti. In HO8910 solulinjassa, huomattavaa solujen kasvun esto havaittiin 48 tunnin kuluttua yhteistyötä soveltamisen 1,0 ug /ml (kuvio. S1C) tai 1,5 ug /ml (kuvio. S1D) sisplatiinia 7,5 tai 10 ug /ml doksisykliiniä, kun taas sisplatiinia saivat pelkkää puuttui vaikutus. Samanlaisia ​​Tulokset on esitetty SKOV3-solulinja, joilla on merkittävä solujen kasvun esto, kun yhdistetään 1,5 ug /ml (Fig. 1 E) tai 2,5 ug /ml (Fig. 1 F) sisplatiinia 10 ug /ml doksisykliiniä. Seuraavaksi valitaan kaksi annosta (2,5 ja 5 ug /ml) doksisykliinin ja yhdistettiin ne eri sisplatiinin (0-100 ug /ml), vastaavasti. IC

50 sisplatiinin läsnä ollessa doksisykliiniä (2,5 ja 5 ug /ml) oli 3,36 ug /ml ja 2,66 ug /ml, vastaavasti (Fig. 1 G, H), joka oli paljon pienempi kuin sisplatiinilla yksinään (Fig. 1 C, IC

50 = 10,14 ug /ml).

sisplatiini ja doksisykliini estää hyökkäys kyky munasarjan epiteelin syöpäsolujen

vaikutus sisplatiinin ja doksisykliini on invaasio kyky kasvainsolujen tutkittiin hyökkäystä määrityksellä. Ensinnäkin valitaan 1,5 ug /ml ja 5 ug /ml sisplatiinia hoitoon SKOV3 ja SKOV3 /DDP-soluissa. Kuva. S2A, B edusti kasvainsolun invaasiota kyky läsnä (c) ei (d) sisplatiinin sekä SKOV3 ja SKOV3- /DDP soluja. Olemme havainneet, että sisplatiini oli estävä vaikutus munasarjan soluihin hyökkäystä kyky. Sitten, valitsimme 10 ug /ml doksisykliiniä hoitoon SKOV3- soluja ja 5 ug /ml doksisykliiniä hoitoon SKOV3- /DDP soluja. Kuvio 2A, B edustaa tuumorisolujen invaasion kyky läsnäollessa (c) tai ilman sitä (d) doksisykliinin sekä SKOV3 (Fig. 2A) ja SKOV3 /DDP (Fig. 2B) soluissa. Ensimmäistä kertaa olemme huomanneet, että doksisykliini voi estää hyökkäys kyky sekä SKOV3 ja SKOV3- /DDP soluja.

Soluja viljeltiin transwell kanssa osoitetulla doksisykliini 36 /DDP soluissa 4 ja 2 kippaa vastaavasti. a: 100 ui seerumitonta solususpensiota (jälkeen solut liitteenä) doksysykliinillä saaneilla (10 ug /ml) päällystettyjen insertin suodattimet; 500 ui seerumitonta RPMI-1640-väliaineessa doksisykliiniä (10 ug /ml) alakammioissa, kuvat kuvattiin yläpuolelta kalvojen. b: 100 ui seerumitonta solususpensiota päällystetty insert suodattimien; 500 ui seerumitonta RPMI-1640-alustassa alakammioissa, kuvat kuvattiin yläpuolelta kalvojen. c: 100 ui seerumitonta solususpensiota (jälkeen solut liitteenä) doksysykliinillä saaneilla (10 ug /ml) päällystettyjen insertin suodattimet; 500 ui 10% FBS /RPMI-1640-alustassa alakammioissa, kuvat kuvattiin alapuolelta kalvojen. d: 100 ui seerumitonta solususpensiota päällystetty insert suodattimien; 500 ui 10% FBS /RPMI-1640-alustassa alakammioissa, kuvat kuvattiin alapuolelta kalvojen. c /a on suhde solujen tulossa vaikka kalvo suodattimen sisäosa doksisykliinikäsittely. d /b edustaa suhdetta solujen tulossa vaikka kalvo suodatinpanos ilman doksisykliini. C, D osoitti, että doksisykliini estää SDF-1α aiheuttama invaasio molemmissa solulinjoissa ja maltillinen indusoiman apoptoosin doksisykliini SKOV3- /DDP soluja ja inhibition doksisykliini on SDF-1α eritystä SKOV3- soluissa. C: SDF-1α lisäsi invaasio SKOV3- solujen 9 poimuja, jotka estyi doksisykliiniä (10 ug /ml). D: SDF-1α kasvoi vain hyökkäyksen SKOV3- /DDP solujen 1,5 poimuja, jotka estyi doksisykliini (5 ug /ml). n = 3, *,

p

0,05, **,

p

0,01.

Doksisykliini estää SDF-1α aiheuttama kasvainsolun invaasiota munasarjan syöpäsolujen

SDF-1α kuuluu kemokiinien ja sillä on tärkeä rooli etäpesäke munasarjasyöpä [12]. Sen tutkimiseksi, onko SDF-1α voisi edistää invasiivinen kyky munasarjasyöpäsoluja, me sitten muuttaa indusoitua-tekijä (10% FBS) ja SDF-1α (50 ng /ml). Kuten on esitetty kuviossa. 2C, SDF-1α lisäsi hyökkäys SKOV3- solujen 9 taittuu, joka voitaisiin merkittävästi inhiboida doksisykliini. Vaikka SKOV3- /DDP soluja, SDF-1α samalla annoksella vain lisäsi hyökkäys kyky 1,5 kertaa, mikä voisi estää myös doksisykliini (Fig. 2D).

Doksisykliini indusoi apoptoosia SKOV3 /DDP mutta ole SKOV3- solujen

apoptoottiset suhde testattiin kahdessa solulinjassa hoidon jälkeen 5, 10 ja 20 ug /ml doksisykliiniä 12 tuntia. Kuten kuviossa 3A on esitetty, doksisykliini (20 ug /ml) lisäsi apoptoosia SKOV3- /DDP soluja 13 taittuu, kun taas ei ollut mitään vaikutusta SKOV

3-soluja.

: Virtaussytometrinen analyysi osoittaa solun apoptoosin käsittelyn jälkeen eri doksisykliinipitoisuudet 6 tuntia. 20 ug /ml doksisykliiniä lisäsi apoptoosia SKOV3- /DDP soluja 13 taittuu. B: ELISA-analyysi osoittaa doksisykliini (10 ug /ml) esti eritystä SDF-1α in SKOV3- solujen ajasta riippuva tavalla. Reaaliaikainen PCR ja Western blot-analyysi osoittaa vaikutusten doksisykliini on CXCR4 ilmentymistä sekä mRNA ja proteiini tasoilla SKOV3- soluissa (C, E) ja SKOV3- /DDP soluja (D, F). Hoidon jälkeen doksisykliinin on osoitettu pitoisuudet 48 tuntia, CXCR4 ilmentymistä sekä mRNA: n ja proteiinin tasot olivat esti merkittävästi kahdessa solulinjassa. n = 3. *,

p

0,05, **,

p

0,01.

Doksisykliini estää SDF-1α erityksen SKOV3- soluissa, mutta ei SKOV3- /DDP soluja

SDF-1α ja sen reseptori CXCR4 tärkeä rooli prosessissa invaasion ja -metastaasin [13], me sitten suorittaa ELISA-määritystä, onko doksisykliini voi estää eritystä SDF-1α kahdessa solulinjoissa. Tulokset osoittivat, että SKOV3, SDF-1α eritys väheni huomattavasti käsittelemällä doksisykliini on ajasta riippuva tavalla, jossa minimaalinen tasolla havaittu 180 min (Fig. 3B). Kuitenkin eritystä SDF-1α ei havaittu SKOV3 /DDP.

Doksisykliini vähentää CXCR4 mRNA ja proteiini tasoilla SKOV3 ja SKOV3- /DDP soluja

CXCR4 voitaisiin aktivoida SDF-1α ja on vain yksi 14 kemokiinireseptoreiden ilmaistuna osajoukko kasvainsolujen munasarjojen kasvainten ja primääri munasarjojen kasvaimia [14]. Meidän kokeissa soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla doksisykliinin 48 tuntia, sitten CXCR4 mRNA: ta ja proteiinia tasot tutkittiin Reaaliaikainen PCR: llä ja western blot -analyysillä. Huomasimme, että doksisykliini esti CXCR4 ilmaisua sekä mRNA (Fig. 3C. D) ja proteiini tasoilla (kuvio. 3E, F) sekä SKOV3 ja SKOV3 /DDP solulinjoilla.

Sisplatiini ja Doksisykliinillä estävät solujen elinkelpoisuus kautta Akt ja ERK reittejä SKOV3 mutta ei SKOV3- /DDP soluja

on raportoitu, että sisplatiini resistenssin ihmisen munasarjasyövän liittyy aktivoituminen PI3K /Akt ja ERK1 /2 signalointireittien [15] – [16 ], me jälkeen määritetään mahdollisuudet edistää näiden kahden reitin sisplatiinin ja doksisykliini vaikutukset munasarjasyövän solujen lisääntymisen. Sen jälkeen heikentävien Akt ja ERK siRNA (Fig. 4A, B), MTT tulokset osoittivat, että vähentäminen Akt ja ERK ilmaisun voisi vaimentaa estävä vaikutus proliferaatioon kun sisplatiinia ja doksisykliini 48 h SKOV3 (Fig. 4C, D , G, H), mutta ei ollut vaikutusta proliferaatioon SKOV3- /DDP soluja (kuvio. 4E, F, I, J).

vähentäminen Akt ja ERK ilmentyminen Akt ja ERK siRNA voisi vaimentaa inhiboiva vaikutus proliferaatioon kun sisplatiinia ja doksisykliini 48 (C, D, G, H), mutta ei ollut vaikutusta leviämisen SKOV3- /DDP soluja (E, F, I, J) *,

p

**,

p

0,01.

Doksisykliini estää SDF-1α aiheuttama aktivointi Akt tai ERK in SKOV3 mutta ei SKOV3 /DDP

ymmärtääkseen, SDF-1α aiheuttama Akt ja /tai ERK-fosforylaation kaksi solulinjaa voidaan estää doksisykliini, suoritimme sarjan kokeita, joissa esikäsittelyä. Ensinnäkin, tutkimme fosforylaatiota Akt ja ERK on SKOV3 jälkeen SDF-1α hoidon (50 ng /ml) eri aikaan (0, 2, 5, 10, 20, 40 min). Kuten on esitetty kuviossa. 5A, B, SDF-1α stimuloi Akt ja ERK: n fosforylaatiota ajasta riippuva tavalla. Akt ja ERK olivat merkittävästi fosforyloidun ja saavutti maksimin 10 tai 20 minuutin kuluttua SDF-1α hoitoa. Samanlainen Kokeet suoritettiin sitten SKOV3 /DDP. Erityisesti, ei ollut aktivointi Akt ja ERK käsittelyn jälkeen SDF-1α (tuloksia ei ole esitetty). Edelleen, me lyhentää käsittelyaika alle 10 minuuttia. Emme vieläkään ei löytänyt aktivoitumista Akt (Fig. 5C), kun taas ERK aktivointi nostettiin 0,5 min ja saavutti maksimin 1 min (Kuva. 5D). Seuraavaksi SKOV3- soluja esi-doksisykliinillä (0, 5, 10 ug /ml) 3 tuntia, ja sitten levitettiin SDF-1α (50 ng /ml) 10 min. Esto fosfori-Akt ja fosfori-ERK tasot havaittiin soveltamisen jälkeen 10 ug /ml doksisykliiniä (Fig. 5E, F). Sovellus Doksisykliinin yksinään ei ollut vaikutusta. Vastaavasti, SKOV3- /DDP soluja esi-käsiteltiin samalla annoksella doksisykliinin 3 tuntia, ja sitten käsiteltiin SDF-1α (50 ng /ml) 1 minuutin ajan. Doksisykliini ei ollut vaikutusta Akt aktivointia (Fig. 5G). SDF-1α-indusoidun ERK-fosforylaation ei voitu estää doksisykliini annoksena 5 tai 10 ug /ml. (Fig. 5H).

hoidon jälkeen SDF-1α (50 ng /ml) ja 0, 2, 5, 10, 20, 40 minuuttia, AKT (A) ja ERK (B): n fosforylaatiota SKOV3 solut täydennetty. Kun käsitellään SKOV3 /DDP samalla annoksella SDF-1α 0, 0,5, 1, 2, 5, 10 minuuttia, AKT-fosforylaation (C) ei muuttunut, kun taas ERK-fosforylaation (D) täydennettiin merkittävästi. Sitten solut esikäsiteltiin 0, 5, 10 ug /ml doksisykliiniä 3 tuntia, sitten käsiteltiin SDF-1α (50 ng /ml) 10 min (SKOV3) tai 1 min (SKOV3 /DDP), SDF-1α- aiheuttama AKT (E) ja ERK (F) fosforylaation SKOV3- soluissa oli vain estyy kun samanaikaisesti sovellus doksisykliini annoksena 10 ug /ml. Vuonna SKOV3- /DDP soluja, SDF-1α ei aiheuttanut AKT fosforylaatio (G) ja tehostetun ERK fosforylaatio (H) ei voida estää doksisykliini annoksena 5 tai 10 ug /ml. n = 3. *,

p

0,05, **,

p

0,01, SDF-1α-hoidetuilla ryhmillä

vs

kontrolliryhmään. #,

p

0,01, SDF-1α plus doksisykliini co-hoidetuilla ryhmillä

vs

SDF-1: llä käsitellyissä ryhmissä.

Doksisykliini ylössäätelee pro-caspase- 3 ekspressio SKOV3 /DDP mutta ei SKOV3

kaspaasi-3 on tärkeä välittäjä apoptoosin ja se voi myös liittyä chemoresistance ihmisen munasarjasyöpä [17]. Sitten havaittiin muutoksia sen ilmentymistä kahdessa solulinjassa jälkeen doksisykliinikäsittely. Ensinnäkin verrattuna Akt, ERK-fosforylaation, CXCR4 ja pro-kaspaasi-3: n ekspressio kahden solulinjat. Tulokset osoittivat, että ei ollut merkitsevää eroa Akt-fosforylaation (kuvio. 6A). ERK-fosforylaation, CXCR4 ja prokaspaasia 3 ilmentymisen SKOV3 /DDP olivat kaikki alhaisempia kuin SKOV3- soluissa, vastaavasti (kuvio. 6B, C, D). Sitten me käsiteltiin kaksi solulinjaa, jossa 10 ug /ml doksisykliiniä eri aikaan (0, 0,5, 1, 2, 6, 12 h). Kuten on esitetty kuviossa. 6E, prokaspaasia 3 ekspressio lisääntyi merkitsevästi SKOV3 /DDP, vaikka ei muutu SKOV3.

Comparison of Akt, ERK, CXCR4 ja prokaspaasia 3 ilmentymisen kahdessa solulinjassa. Ei ollut merkittävää eroa Akt (A) fosforylaatio kahdessa solulinjassa. ERK fosforylaatio (B), CXCR4 (C) ja pro-kaspaasi-3 (D) ilmentyminen SKOV3- /DDP soluja olivat kaikki alhaisempia kuin SKOV3- soluissa, vastaavasti. Prokaspaasia 3 ekspressio lisääntyi merkittävästi doksisykliini käsittely SKOV3- /DDP soluja, vaikka eivät muuttuneet SKOV3- soluissa (E). n = 3. *,

p

0,05, **,

p

0,01.

Doksisykliini estää -tuumoriksenografti

yrityksenä sen määrittämiseksi, doksisykliini edistää kasvaimen inhibitiota in vivo, käytimme SKOV3.ip ksenograftimallissa nude-hiirissä (BALB /c-nu). Neljätoista päivää injektion jälkeen kasvainsolujen, doksisykliini (i.p. injektio) jälkeen ylläpitäjä (3 mg /d /per hiiriä), seuraavan 7 päivää. Kasvain halkaisijat, hiiret painon ja askitesta tasolla kasvaimen ryhmässä ja doksisykliini-käsitellyssä ryhmässä analysoitiin. Verrattuna kasvaimen ryhmässä, kasvaimen halkaisija ja volyymi vesivatsa väheni merkittävästi doksisykliini-hoidetussa ryhmässä (kuvio. 7B, C, F, G). Aggregaatioaste kasvainsolujen doksisykliini-hoidetussa ryhmässä (kuvio. 7E) oli pienempi kuin kasvaimen ryhmässä (Kuva. 7D). Lisäksi painon doksisykliini-hoidetussa ryhmässä oli lähestymistapa, että kontrolliryhmään (Fig. 7H).

(A) Ulkoapäin ulkonäkö, vatsan kasvaimen ryhmä pullistumia ilmeisesti (b) kuin yksi kontrolliryhmä (a) ja yksi doksisykliini-hoidetussa ryhmässä (c). Doksisykliini inhiboi kasvua -tuumoriksenografti (B, F), ja tilavuus pahanlaatuinen askites (C, G) merkittävästi doksisykliini-kasvaimen hiirissä verrattiin kasvaimen hiirillä. (D) HE värjäys osoitti, että ryhmittämisen kasvainsolujen doksisykliini-hoidetussa ryhmässä (E) oli paljon pienempi kuin kasvaimen ryhmässä. (H) Kehon paino kasvain ryhmässä oli merkittävästi alhaisempi kuin joko kontrolliryhmää tai doksisykliini-hoidetussa ryhmässä. n = 6. **,

p

0,01.

Keskustelu

Sisplatiini on kemoterapeuttinen lääke munasarjasyöpä. Lisäksi vakavia sivuvaikutuksia, sisplatiini-vastus on myös suuri este. Yhdistelmä joidenkin harmiton komponentteja kemoterapiaa huumeita on syntymässä uusi strategia syövän kemoterapiaan edelleen parantamaan tehokkuutta ja minimoimaan sivuvaikutuksia. Doksisykliini hyväksytään laajasti antibiootti. Meidän kokeissa olemme osoittaneet, että doksisykliini paitsi on estävä vaikutus munasarjasyöpä, mutta voi myös dramaattisesti parantaa kemosensitiivisyys sisplatiinia.

kuitenkin taustalla olevaa mekanismia ei vielä tunneta. Jotkut tutkijat ovat raportoineet, että antituumorivaikutusta doksisykliinin liittyy eri p53 maksasolukarsinoomassa [18]. Toinen tutkimus osoittaa, että doksisykliini voi indusoida apoptoosin ihmisen haiman ja paksusuolen syövän soluihin kaspaasiriippuvaisen tavalla [19] – [20]. Tutkimuksemme ensimmäistä kertaa, osoitti, että doksisykliini esti eritystä SDF-1α in SKOV3, kun taas samanlainen ilmiö ei havaittu SKOV3- /DDP soluja. Edelleen tutkimus osoitti, että doksisykliini esti ilmentyminen CXCR4 sekä mRNA ja proteiini tasoilla, mikä viittaa sen vaikutus saattaa olla transkriptio tasolla. Western-blot-analyysi osoitti myös, että CXCR4 ilmaisun SKOV3 /DDP oli 20% pienempi kuin vuonna SKOV3. Nämä tulokset viittaavat siihen, SDF-1α /CXCR4 akseli voi olla erilaisia ​​rooleja doksisykliini vaikutuksia kahdessa solulinjassa. Useat selvitykset voivat edistää tätä ilmiötä: 1) Aktivoinnin, CXCR4 voi välittää kasvaimen etäpesäke. Kasvain solut tulevat verta tai imunestejärjestelmään siirtyvät ja noudattaa alueilla, joilla on korkea ilmentymisen SDF-1α. Rintasyöpä solujen noudattaa tätä kaavaa etäpesäkkeiden [21]. Ohessa kuvataan että SKOV3- solut voivat salainen SDF-1α ja sillä on suurempi ilmaisua CXCR4. Lisäksi SDF-1α edistää hyökkäys SKOV3 yhdeksän-kertaiseksi. Näiden tietojen perusteella, me arveltu SDF-1 /CXCR4 akseli oli ratkaiseva rooli etäpesäkkeiden SKOV3- solujen lisäämällä tarttumista kykyä syöpäsolujen, mutta SKOV3 /DDP ei. 2) Eräät muut tutkimukset osoittivat, että epigeneettiset mekanismit negatiiviseen säätelyyn SDF-1α tai CXCR4 ilmentyminen voi olla tarpeen kasvainmetastaasit. Tyypillisiä muutoksia SDF-1α tai CXCR4, kuten DNA: n metylaatio liittyy inaktivoitumista tuumorisuppressoreilla. On näyttöä siitä, että metylaatio on SDF-1α-promoottorin paksusuolen epiteelin edistää etäpesäkkeiden kasvainten paksusuolessa [22]. Lisäksi, haimasyöpä, CXCR4 promoottori on havaittu säänneltävä DNA: n metylaatio, mikä alentaa CXCR4 mRNA ja proteiini tasoilla [23].

p

0.01.

doi:10.1371/journal.pone.0089841.s002

(TIF)

Acknowledgments

All