Krooninen sairaus

tiivistelmä

tunnistaakseen uusia biomarkkereita esineoplastiset haiman vaurioita (PanINs, IPMNs) ja varhainen haiman adenokarsinooma (PDAC) on ratkaisevan tärkeää, koska sairauksien korkea kuolleisuus, kun myöhässä havaitsemiseen. Ongelman tehtävän käytimme uutta tekniikkaa matriisin laserdesorptio /(MALDI) kuvantaminen massaspektrometriaa (IMS) on geneettisesti hiiren malleissa (GEM) haimasyövän. Erilaisia ​​GEM analysoitiin MALDI IMS tutkia peptidi /proteiini-ekspressiokuviota esiasteleesioita verrattuna normaaliin haiman ja PDAC solun resoluutio. Tilastollinen analyysi paljasti useita erotteleva

m /z

-species normaalin ja sairaan kudoksen. Epiteelinsisäisen neoplasia (Panin) ja intraduktaalisissa papillaarisen mucinous kasvain (IPMN) voitaisiin erottaa normaalista haimakudoksesta ja PDAC 26 merkittävää

m /z

-species. Näistä

m /z

-species tunnistimme Albumiini ja Thymosin-beeta 4 nestekromatografialla ja tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS), jotka edelleen validoitu immunohistokemiallisesti, western blot, kvantitatiivinen RT- PCR ja ELISA sekä hiiren ja ihmisen kudosta. Tymosiini-beta-4 havaittiin huomattavasti hiirten seerumissa, joilla PANIN vaurioita. Voimistunut Panin ilmentyminen albumiinin liittyi lisääntynyt ilmentyminen maksa-rajoitettu geenien viittaa maksan transdifferentiation ohjelma preneoplastista soluja. Lopuksi osoitamme, että GEM endogeenisen PDAC ovat sopiva malli järjestelmä MALDI-IMS ja myöhemmin LC-MS /MS-analyysi, jonka avulla

in situ

analyysi pienten esiasteleesioita ja tunnistaminen differentiaalisesti ilmaisi peptidien ja proteiinien.

Citation: Grüner BM, Hahne H, Mazur PK, Trajkovic-Arsic M, Maier S, Esposito I, et al. (2012) MALDI Imaging massaspektrometria varten

In situ

proteomiikan Analyysi esineoplastiset Vauriot in Haimasyöpä. PLoS ONE 7 (6): e39424. doi: 10,1371 /journal.pone.0039424

Editor: Frank T. Kolligs, University of Munich, Saksa

vastaanotettu: 15 tammikuu 2012; Hyväksytty: 20 toukokuu 2012; Julkaistu: 26 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Grüner et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Saksan Research Foundation (SFB824-C4), Saksan liittovaltion opetus- ja tutkimusministeriö (BMBF; # 01GS08115) ja Association of Cancer Research (AICR; # 07-0543); kaikki JTS. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on neljänneksi suurin syy syövän kuolema länsimaissa [1]. Koska pitkälle diagnoosin ja korkea luontainen vastustuskyky hoidon esiintyvyys PDAC vastaa sen kuolleisuuden kanssa mediaanielossaolosta alle 6 kk ja yleistä 5 vuotta eloonjäämisaste alle 5% [2]. Tunnistaminen proteiinien ilmaistu esineoplastiset vauriot voivat auttaa tunnistamaan taudin preinvasive tilassa, kliinisesti erittäin merkittävä tavoite kuin resektiota edelleen ainoa parantava lähestymistapa usein turhautuvat aikaisin havaitsematta etäpesäkkeiden tai paikallisesti edennyt sairaus [2].

Clinical ja histopatologisia tutkimuksissa on todettu kolme PDAC esiasteleesioita: haiman intraepiteliaalisten neoplasia (Panin), intraduktaalisissa papillaarinen mucinous kasvain (IPMN) ja mucinous kystinen kasvain (MCN). Poikkeusmenettelyä ylivoimaisesti yleisin esiasteet Panin vaurioita, vaikka johtuen parantuneesta kuvantamismodaliteetit kystinen kasvaimet kuten IPMNs ja vähemmässä määrin, MCN yhä diagnosoidaan [3], [4]. Tunnistaminen ja luokittelu PanINs uraauurtavina PDAC [5] on voitu kehittää morfologinen ja geneettinen etenemisen malli (yleiskatsaus [3]). Nämä edistysaskeleet ovat vaikuttaneet myönteisesti kehittyneitä

Cre /lox

-pohjainen geneettisesti hiiriä (GEM) endogeenisia PDAC [6]. Hyvin vakiintunut hiirimallissa pääpiirteittäin molekyyli- ja morfologiset vaiheissa inhimillisen PDAC kehitys on

Kras

G12D

malli, jossa onkogeenisiä

Kras

G12D

aktivoituu endogeeninen

Kras

lokuksessa. Hiiret kehittävät paikallisesti invasiivisia ja metastaattinen PDAC kautta määritelty Panin vaurioita etenevien PanIN1 ja PanIN3 [7]. Muita aktivointi EGFR signaali johtaa nopeutetun kehittämisen PDAC kautta Panin ja IPMN vaurioita, jotka ulottuvat kirjo kliinisesti merkittäviä PDAC hiirimalleihin [8]. Koska määrätyn geneettisen taustan ja kokeellisesti osoitteellinen ajankul- esineoplastiset leesioiden kehittymisen ja etenemisen PDAC, me arveltu näiden mallien arvokkaita tutkimuksen välineitä perustamisesta prekliinisissä varhaisen havaitsemisen biomarkkereiden tunnistamiseen lähestymistapaa.

Matrix laserdesorp- desorptio /ionisaatio (MALDI) kuvantaminen massaspektrometriaa (IMS) on kehittynyt uutta tekniikkaa ja lupaava väline biomarkkereiden löytö ja translaation onkologian [9]. Esimerkkejä ovat Parkinsonin [10] ja Alzheimerin [11] tauti sekä useita syöpiä, kuten glioomat [12], [13], [14], [15], munasarjojen [16], eturauhas- [17], rintojen [18] ja paksusuolen syöpä [19]. Tarjoamalla molekyyli

ex vivo

näkymä resektoidun kudoksen, etiketti vapaa seuranta endogeenisen yhdisteet spatiaalinen resoluutio ja molekyylien spesifisyys on käytössä (yleiskatsaus [9], [20]).

tässä tutkimuksessa käytimme MALDI-IMS tutkimaan mahdollisuutta tämän tekniikan tunnistamiseksi mahdollisten uusien biomarkkereiden sisään Panin vaurioita. Olemme tunnettu kaksi Panin-piikit, jotka tunnistettiin ALB1 ja TMSB4X. Olemme edelleen oikeaksi ALB1 ilmaus osana maksan transdifferentiation ohjelma esiasteleesioita ja annettava näyttöä lisääntynyt seerumin TMSB4X hiirillä Panin vaurioita.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

tutkimus hyväksynyt eettinen komitea lääketieteellisen tiedekunnan teknillisen yliopiston Münchenissä. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ennen sisällyttämistä tutkimukseen.

Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti Saksan eläinsuojelulaki Lait ja hyväksynyt Institutional Animal Care ja Käytä komitean teknisen yliopiston Munich .

hiirilajilla

Kras

+ /LSL-G12D, Ptf1a

+ /Cre, Ela-TGFa

ja

Trp53

+ /LSL-R172H

kantoja on kuvattu aiemmin [7], [8], [21], [22], [23]. Hiiret interbred saamiseksi hiiren linjat

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D, Ela-TGFa; Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

ja

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D, Ela-TGFa; Trp53

+ /LSL- R172H

ja oli takaisinristeytettiin C57BL /6J tausta vähintään neljä sukupolvea. C57BL /6J hiiriä toimi kontrollina.

Human Näytteitä

seeruminäytteet saatiin 57 koehenkilöillä, joilla on histologisesti todettu diagnoosin haiman adenokarsinooma (21 naista, 26 miestä, iän mediaani 67,1 vuotta) . Kokoveri kerättiin ennen leikkausta. Ohjaus seeruminäytteet otettiin 10 terveillä koehenkilöillä (2 naista, 8 miestä, iän mediaani 66,2 vuotta) ja 12 potilasta, joilla on krooninen haimatulehdus (3 naista, 9 miestä, iän mediaani 55,8 vuotta).

MALDI-IMS kudosleikkeissä peräisin Mouse haimasta

MALDI-IMS haimoissa resekoitiin ja snap-jäädytettiin nestetypessä ilman esikäsittelyä. 10 um: n jääleikkeet leikattiin ja siirrettiin indium-tina-oksidi (ITO) päällystetty lasilevyille esikäsitelty poly-lysiinillä 1:01 vedessä, jossa on 0,1% NP-40. Leikkeitä kiinnitettiin 70% etanolilla ja 100% etanolia yhden minuutin ajan. Matrix (10 g /l sinapiinihappoa 60% asetonitriiliä ja 0,2% trifluorietikkahappoa) oli tasaisesti kerrostettu dia käyttäen ImagePrep laitetta (Bruker Daltonics). Massaspektrit mitattiin käyttäen MALDI TOF /TOF Analyzer Ultraflex III (Bruker Daltonics), jonka erotuskyky 70 mikrometriä lineaaritilaa. Ioneja havaittiin massa alueella

m /z

2500-25000 joiden näytteenottotaajuus 0,1 GS /s. Valmiin proteiinin standardin (Bruker Daltonics) käytettiin kalibrointiin spektrien, joka tehtiin ulkoisesti saman tavoitteen ennen jokaista mittausta. Mittauksen jälkeen objektilasit pestiin 70% etanolilla poistaa matriisin ja vastavärjättiin hematoksyliinillä /eosiinilla (H 0,001).

Peptidi ja Proteiinitunnistus nestekromatografia ja tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS) B

peptidit ja proteiinit uutettiin suoraan sinapiinihappoa valmistettu kudosleikkeiden. Uuttamiseen, 1 ui 30% asetonitriilillä 0,1% trifluorietikkahapossa levitettiin viipale, poistettiin ja joko sekoitettiin yhtä suureen tilavuuteen α-syano-4-hydroksi-kanelihappo-liuosta (10 mg /ml 30% asetonitriili , 0,1% trifluorietikkahappoa), ruostumattomasta teräksestä valmistettuun MALDI tavoite aluksi MALDI MS mittaus tai laimennettiin 10 ul: aan 0,1%: ista muurahaishappoa myöhempien LC-MS /MS-mittauksia.

saada tarkkoja

m /z

arvot

m /z

lajien edun, matriisin uutteet vierekkäisten osien hiiren haimasta, joilla on korkea intensiteetti vastaavien m /z lajien analysoitiin positiivisten ionien heijastin tilassa MALDI MS. Mittaukset tehtiin koskevasta ultrafleXtreme MALDI-TOF /TOF massaspektrometrillä, jossa on 1 kHz SmartBeam-II laser (Bruker Daltonics). Kukin spektri oli ulkoisesti kalibroida Peptide kalibrointi Standard II (Bruker Daltonics) ja ”kuutio tehostettu” kalibrointitoimintoihin tyypillisesti saadaan massa tarkkuus 20 ppm.

LC-MS /MS-analyysi matriisin uutteet suoritettiin koskevasta LTQ Orbitrap massaspektrometriin (Thermo Fisher Scientific), joka on kytketty nano-HPLC (nanoLC Ultra, Eksigent Technologies). Peptidit erotettiin itse pakattu 75 um x 40 cm käänteisfaasi- kolonnia (Reprosil, Dr. Maisch) käyttäen 25 min lineaarinen gradientti (2-35% asetonitriiliä 0,1% muurahaishappoa, virtausnopeus 300 nl /min). Ehjä massat eluoi- peptidien määritettiin 30000 resoluutio ja kolmen voimakkain piikkiä valittiin edelleen pirstoutumista törmäyksen aiheuttama dissosiaatio (CID) ja hankinta fragmentti spektrien alhainen resoluutio (1000). Yksin varautuneet ionit sekä ionien Tuntematon varaustila hylättiin. Dynaaminen syrjäytyminen oli käytössä ja dynaaminen poissulkemisen kestoa asetettiin 10 sekuntia. Peaklist tiedostot luotiin käyttäen Mascot Distilleriä versio 2.2.1.0 (Matrix Science) ja tietokanta-haut suoritettiin käyttäen Mascot hakukoneen versio 2.02.04 (Matrix Science) vastaan ​​IPI hiiren tietokannan (versio 3.26). Hakutulos tiedostot tuotiin Scaffold (Proteome Software).

Immunofluoresenssi- ja immunohistokemia

Immunofluoresenssikoe tai immunohistokemia suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: ALB1 (Santa Cruz Biotechnology, ja Thermo Fisher Scientific), HepPar1 (DAKO), TMSB4X [24], [25] (Immundiagnostics, Bensheim) ja CK19 (TROMA-III; Kehittämisopinnot Hybridomaviljelmät Bank).

kvantitatiivinen RT-PCR

Real-Time PCR suoritettiin kuten previsouly kuvattu [8]. Syklofiliinistä käytettiin normalisointia.

P

arvot laskettiin kanssa Wilcoxonin testi. Seuraavia alukkeita käytettiin:

syklofilliini-F /R ATGGTCAACCCCACCGTGT /TTCTGCTGTCTTTGGAACTTTGTC

Tmsb4x-F /R CCTCTGCCTTCAAAAGAAACA /GGGCAGCACAGTCATTTAAAC

Alb1-F /R TTGGTCTCATCTGTCCGTCA /GGCAGCACTCCTTGTTGACT

Transferrin-F /R ATCAAGGCCATTTCTGCAAGT /GGTTCAGCTGGAAGTCTGTTCC

Alpha-Fetoproteiini-F /R GGAGGCTATGCATCACCAGT /CATGGTCTGTAGGGCTTTGC

apolipoproteiini A4-F /R AGAGCCTGAGGGAGAAGGTC /AGGTGTCTGCTGCTGTGATG

ELISA -Enzyme immunosorbenttimääritys

ELISA kit määrittämiseksi kvantitatiivisesti TMSB4X pitoisuudet seerumissa saatiin Immundiagnostics (Bensheim). ELISA suoritettiin valmistajan protokollan.

Western Blot

Western Blot analyysi suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti vasta-aineilla ALB1 (Santa Cruz Biotechnology) ja HSP90 (Cell Signaling).

tulokset

MALDI-IMS esiuudiskasvuisissa vauriot ja PDAC GEM mallit

tunnistaa uusia biomarkkereita kaksi yleisintä preneoplastinen haiman vaurioita, Panin ja IPMN, me resektoitiin haimoissa vakiintuneista GEM of PDAC: 13

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

, 8

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D, Ela-TGFa

ja 5

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D, Ela-TGFa; Trp53

+ /LSL-R172H

hiirillä on eri-ikäisiä (3-18 kuukautta, genotyypistä riippuen). Nämä hiiret kehittävät Panin ja IPMN vaurioita etenee invasiivisia ja metastaattisen PDAC eri puhkeamista ja aggressiivisuus [7], [8], [23]. Neljä C57BL /6J hiirtä toimi villityypin ohjaus. Kaikki haimoissa mitattiin käytettäessä Ultraflex III MALDI TOF /TOF Analyzer joiden erotuskyky 70 pm. MALDI-IMS työnkulku on esitetty kuviossa 1A. Testaamiseksi menetelmän tarkkuus ensin uudelleen visualisoivat jo tiedossa molekyyli-ioni insuliinin [M + H

+] at 5808 annetun haimoissa villityypin hiirillä. Insuliinin signaali, joka annetaan lämpöä kartta kuva (jossa sininen merkitsee alinta ja punainen korkein suhteellinen intensiteetti), hienosti yhteistyössä paikallistaa Langerhansin saarekkeiden (kuvio 1 B), jotka osoittavat oikean korrelaatio mitatun

m /z

-species morfologisten ominaisuuksien MALDI-IMS.

(A) Kohteen MALDI-IMS työnkulun. (B) uudelleen visualisointi molekyyli-ionin insuliinin [M + H

+] at 5808 (punainen palkki) keskimääräisen spektrin haiman -osio C57BL /6 hiiri mitattuna MALDI-IMS. Voimakkuus mitatun signaalin väreillä, jossa punainen väri tarkoittaa korkein intensiteetti suhteen kantaa osassa. Huippu insuliinin lokalisoituu haiman saarekkeiden (suurennettuna ote). (C) määrittely ROI on H Kras

+ /G12D

(

CK

) ja

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D, TGFa

(

CKT

) hiiri. Mustat viivat ympyrä eksokriinisessä kudos, vihreät viivat PanIN1, keltaiset viivat PanIN2, oranssi linjat PanIN3, siniset viivat IPMN ja punaiset viivat PDAC diagnosoitu alueita vastaavassa osassa. Mittakaava on 1 cm. Alempi paneeli: esimerkkejä erilaisista morfologisten ROI kuten alla. Mittaviivat edustaa 50 um.

Jos haluat vertailla spektrien eri morfologiset alueita, kiinnostavat alueet (ROI) Panin IPMN, PDAC, ja normaali exocrine kudos määritelmänä käytettiin asiantuntija haiman patologia on haimasta käyttämällä FlexImaging ohjelmistoa ja käytettiin vertailun spektrien vastaavat alueita sama poikkileikkaus sekä muista osista toisiaan. Kuvio 1C annetaan esimerkkejä alueiden määritelmästä mitattujen osissa (kuvio 1C yläpaneeli) ja erillisten morfologiset ominaisuudet (kuvio 1 C, alempi paneeli). Yksittäinen spektrit Näiden ROI vietiin ClinProTools analyysin ohjelmisto. Ensimmäisenä ohjaus kokeilu vertasimme spektrejä normaalin haiman kudoksen (acini ja kanavat) villin tyypin (WT) hiirillä, joilla fenotyypiltään normaalien näkymisen acinar ja ductal kudosta

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

hiiret kätkeminen onkogeenisel-

Kras

G12D

mutaatio. Mitään eroja spektrit näiden kahden ryhmän välillä olivat havaittavissa, siis varmistaa, ettei ole havaittavissa varianssit spektrit WT ja GEM (taulukko 1). Lisäanalyysiä, fenotyypiltään normaali ROI molemmista genotyypit luokitellaan ”normaali”.

seuraava analysoitu spektriä normaalista kudoksesta C57BL /6J ja

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

hiiriä (n = 11) vastaan ​​spektriä esineoplastiset vauriot

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

ja

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D, Ela-TGFa

hiiriä (PanINs ja IPMNs, n = 24). Nämä kaksi ryhmää voitaisiin erottaa 76 tilastollisesti merkittäviä piikkejä (Wilcoxonin-summa testi,

p

arvot Benjamini-Hochberg korjattu), joista 26 oli leesiokohtainen erityinen (eli spesifinen IPMNs ja PanINs) ja 50 normalisointi kohtainen

p

arvojen 0.000001 ja 0,05. Sillä PanINs löysimme 25 (

p

= 0,000001

p

= 0,05) ja IPMNs 18 (

p

= 0,03

p

= 0,05 ) erityiset

m /z

-species vastaavasti, joka voisi syrjiä niitä normaalista kudoksesta. Myös IPMNs ja PanINs voitaisiin syrjiä toisistaan ​​6 Panin-piikit (

p

= 0,02

p

= 0,05, n = 19 vs. 13 hiirtä). Verrattaessa esineoplastiset vaurioita PDAC (n = 24 vs. 10 hiirtä) havaitsimme 57 vaurion ke- ja 11 PDAC erityisiä massat (

p

= 0,00169 osoitteeseen

p

= 0,038). Taulukossa 1 esitetään yleiskatsaus kaikista verrattuna ryhmien määrä erotteleva

m /z

-species, vastaava

p

arvoja ja käytettyjen eläinten määrästä. Täydentävä Taulukko S1 yksityiskohtaisia ​​tietoja kaikista merkittävästi tunnistettu

m /z

-species tärkeimmistä vertailuissa.

m /z

-species 2790, 2812 ja 2829 ovat erityisesti Löytyy Panin Vauriot

Kun tarkastellaan lähemmin Panin-piikit paljasti, että

m /z

-species 2790, 2812 ja 2829 olivat erotteleva PanINs normaalista kudoksesta (kuvio 2A). Overlay keskimääräisen spektrejä PanINs ja normaalin haiman kudos osoitti, että jälkimmäisessä huiput olivat lähes ei ollut havaittavissa (kuvio 2A). Edelleen tilastollinen tarkastelu näiden huippujen (Wilcoxonin testi, Bonferronin korjaus) paljasti

p

arvoilla alle 0,00001. Jakauma Rasiakuvaaja ja pääkomponenttianalyysi (PCA) sekä PanINs ja exocrine kudos kuvataan selvä syrjintää näiden kahden ryhmän välillä (kuvio 2B + C).

(A) Päällekkäin ote keskimääräisestä spektriä ROI -ryhmä ”Panin” (sininen) ja ROI-ryhmä ”WT” (vaaleanpunainen). Leviäminen yhden spektrien intensiteetin ilmoitetaan baaria; A.U. (Mielivaltaisina yksikköinä). (B) Dot Plot voimakkuuden-jakauma

m /z

-species 2829 in PanINs (sininen) ja WT (vaaleanpunainen) kunkin yksittäisen spektrin. (C) PCA Based erilaistumista exocrine (vaaleanpunainen) ja Panin (sininen) kudosta. (D) uudelleen visualisointi merkittäviä piikkejä.

m /z

-species 2829 selvästi uudelleen visualisoi on Panin leesioita (ylempi paneeli, suurennettuna ote), kun taas piikki 6645 on spesifinen exocrine osastoon haiman (alempi paneeli, suurennettu oikealla puoli). Alla on keskimääräinen spektri mitattujen osassa.

Seuraava visualisoida

m /z

2829 annetun kudosleikkeiden osoittavat spesifisyyttä tämän piikin varten Panin alueille lämpöä kartta kuva ( kuvassa 2D yläpaneeli), kun taas piikin

m /z

6645, joka oli ainutlaatuinen normaalia kudosta nimenomaan uudelleen visualisoitu alueilla, joilla on morfologisesti normaali haimakudoksesta (kuvio 2D, alapaneeli).

validointi Merkittävät Diskriminointiaika Peaks riippumattomalla Näytteet Aseta

validoimiseksi merkitys

m /z

laji 2790 ja 2829 riippumattomalla vedostulostus teimme Receiver Operating Ominaisuudet (ROC ) analyysin näiden huippujen määrittää optimaalisen erotteleva kynnysarvot. Näiden kynnysarvojen voitiin erottaa kudoksen 10 riippumatonta hiiren haimasta (4

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

ja 6 villin tyypin samasta poikueesta iässä 6 kk), joilla tarkkuus 100% (Fisher testi,

p

0,001).

proteiini tunnistetiedot kolmen tärkeimmän lajin LC-MS /MS

proteiinin tunnistaminen syrjivää Panin erityisiä merkittäviä

m /z

lajeja, peptidejä suoraan uutettu MALDI-IMS dioja ja aluksi analysoitiin heijastin tilassa MALDI MS saada tarkkoja massat ( 20 ppm) ja MALDI IMS laji ennen LC-MS /MS-analyysit. Sequence tietokanta etsimään LC-MS /MS tuloksia käyttäen Mascot hakukoneen auttanut tuomaan esiin kolme erittäin merkittävä

m /z

laji osoittaa kaksi eri proteiinia.

m /z

2790 lajien tunnistettiin peptidi edustaa aminopäätä kypsän muodon seerumin albumiinin (ALB1), kun taas molemmat,

m /z

2812 ja

m /z

2829 lajien edustaa kahta eri peptidejä, jotka kuuluvat karboksi-terminuksessa Thymosin beta-4 (TMSB4X). Tunnistaminen TMSB4X edelleen tuettu tunnistamisen lisäksi neljä eri peptidien proteiinin karboksipään alue,. Manuaalisesti todentaa peptidi tunnistettujen ALB1 ja TMSB4X ja vastaavat MS /MS-spektrit on lueteltu taulukossa 2 ja saatavilla Supplemental Material (kuva S1).

tarkempaa tutkimusta ja validointi Kartoitettujen ehdokkaiden

Sen tutkimiseksi, ALB1 ja TMSB4X ovat myös läsnä transkription tasolla tuumorigeenisia haimoissa me eristetty kokonais haiman RNA: ta 8

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

ja 6 villin tyypin pentuesisarukset at eri-ikäisiä välillä 4,5 ja 9 kuukautta suoritetaan kvantitatiivinen RT-PCR-analyysiä varten nämä kaksi ehdokasta. Ilmaisu on molemmat kopiot oli merkittävästi yläreguloituja

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

verrattuna villityypin hiiriin (

p

≤0.05, kuvio 3B ja 4A).

(A) immunohistokemiallinen analyysi ALB1 osoittaa erityistä värjäytymisen Panin vauriot

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

(

CK

) hiirillä, mutta ei ductal soluja (n = 10 hiirtä). Immunofluoresenssivärjäystä ALB1 ja tiehyen markkeri CK19 osoittaa kolokalisaation kahden proteiinin. Kaikki mittakaavan palkit kuvaavat 50 pm. (B) mRNA

Alb1

ja maksan geenien

Alfa-Fetoproteiini (AFP) B,

apolipoproteiini A4 (ApoA4) B ja

Transferrin (Tfn)

ovat kaikki merkittävästi yläreguloituja haimasta peräisin

CK

hiirillä verrattuna villin tyypin kontrolli (

p

= 0,04

Alb1

,

p

= 0,008 for

AFP

,

p

= 0,04

ApoA4

,

p

= 0,004 varten

Tfn

, n = 7 vs. 5 hiirtä). Ekspressiotasot on normalisoitu näytteitä villityypin hiirillä. Kaikki virhe palkit osoittavat keskihajonnat normalisoitu keskiarvo villityypin. (C) Western Blot varten ALB1 kokonaisina haiman lysaatit villityypin ja

CK

hiiriä (n = 3). ALB1 ilmentyminen esineoplastiset kudos voimakkaasti kasvanut verrattaessa normaaliin haima. (D) immunohistokemiallinen analyysi maksan merkki HepPar1 ihmisen PanIN3 vaurio.

(A) TMSB4X mRNA lisääntyy merkittävästi

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D (CK) B-hiirillä verrattuna villin tyypin kontrolli (

p

= 0,01, n = 8 vs. 6 hiirtä). Ekspressiotasot normalisoidaan villityyppiin. Virhejanat osoittavat keskihajonnat normalisoitu keskiarvo villityypin. (B) Värjäys varten TMSB4X on kudosnäytteitä 10-30 viikkoa vanha

CK

hiiriä (n = 10) osoittaa ekspressiota PanINs (nuolenkärki), mutta ei acinar (tähti) soluja (i). Korkeatasoinen mPanIN3 express TMSB4X (ii). Expression ihmisen PanIN3 (iii) ja ihmisen PDAC (iv) on myös havaittavissa. Mittaviivat edustaa 50 um. (C) ELISA TMSB4X seeruminäytteistä villityypin ja

CK

-hiiriä (n = 7 vs. 14 hiirtä). Seerumin TMSB4X merkittävästi yliaktiivista

CK

hiiriä (

p

= 0,043, Wilcoxonin testi). (D) ELISA TMSB4X verinäytteistä PDAC ja CP potilaiden sekä terveiden luovuttajien. Mediaanit on merkitty punaisella linjat.

Validoida oikea ALB1 tunnistaminen immunohistologisilla värjäys ja Western Blot analyysi ALB1 tehtiin. ALB1 ilme osastoja

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

hiirten havaittiin Panin vaurioita, mutta ei normaalissa haiman kanavat ja tiehytsoluja (n = 10). Myös immunofluoresenssianalyysillä varten ALB1 ja tiehyen merkki CK19 on kryoleikkeet alkaen

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

ja

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D, Ela-TGFa

hiiret osoittivat, co-localization kahden proteiinien PANIN leesioita (kuvio 3A). Tärkeää on, että

m /z

laji 2790 ei uudelleen visualisoida pieniä ja suuria aluksia MALDI-IMS mitataan kohdat (kuva S2). Myös Western Blot analyysi koko haiman lysaatit paljasti lisääntynyt ALB1 proteiinin ilmentymistä

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

ja

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

hiirillä verrattuna villin tyypin kontrolleihin (kuvio 3C).

aiemmin raportoitu, että haiman eksokriinisia solut voivat transdifferentiate maksasoluihin ja että maksan pesäkkeitä löytyy aikuisten haimassa ja PDAC [26], [27], [28], [29]. Siksi olimme kiintoisaa tietää erittäin lisääntynyt ALB1 signaali tunnistetaan MALDI-IMS voisi johtua maksan transdifferentiation prosessi

Kras

G12D

aktivoitujen haiman soluja. Tämän hypoteesin testaamiseksi me eristetty RNA kokonaisista haimasta on

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

ja villityypin hiirien välillä 4,5 ja 9 kk ja suoritetaan kvantitatiivinen RT-PCR maksasta spesifisten

Transferrin

(TFN),

Alfa fetoproteiinigeenin

(AFP) ja

apolipoproteiini A4

(ApoA4). Ilmaisu taso Näiden merkkiaineiden lisättiin merkittävästi

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

verrattuna villin tyypin hiiriin viittaa mahdolliseen transdifferentiation prosessi esiintyvät PanINs (

p

≤0.05, kuvio 3B). Lisäksi teimme immunohistokemiallista analyysiä varten maksan markkeri HepPar1 14. PanIN1, 4 PanIN2 ja 4 PanIN3 vaurioita. Kaksi PanIN3 leesiot positiivisesti värjättiin HepPar1 (kuva 3D), mikä osoittaa, maksan solujen ominaisuuksia korkealaatuisesta PanINs.

Mitä tulee toiseen tunnistettu proteiini, me validoitu TMSB4X ilmentymistä hiiren ja ihmisen Panin vaurioita ja PDAC muttei acinar, duktaalinen ja saarekesolujen (Fig. 4B). Kvantifioinnin me värjätyt leikkeet 10

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

hiirten PanINs ja löysi ne kaikki positiiviseksi TMSB4X. Huomattavaa on, että ilmaisu oli korkea jo heikompilaatuisen PanINs ja jäi pahanlaatuinen vaurioita, tukevat tulokset meidän MALID-IMS lähestymistapa tunnistamiseen esineoplastiset vaurion markkereita, jotka ovat edelleen läsnä PDAC. Koska TMSB4X on pieni molekyyli, ja sitä on havaittu kehon nesteissä aiemmin, tutkimme seuraavaksi, onko se voi olla havaittavissa ELISA seeruminäytteistä hiirten PANIN vaurioita. Mielenkiintoista, löysimme merkittävästi yliaktiivista Veren

Ptf1a

+ /Cre; Kras

+ /G12D

vertailuryhmän WT hiiret, tukee pääasiallinen arvo esitetään merkki havaitsemisstrategiaa (Fig. 4C ). Kun kuitenkin suoritetaan analyysi käyttämällä erilaisia ​​ihmisen näytteitä luovuttajilta ja potilailla, joilla on krooninen haimatulehdus ja PDAC, mitään merkittävää eroa ollut merkittävä näiden ryhmien välillä (Kuva. 4D).

Keskustelu

koska jatkuvan epäonnistumisen hoitomenetelmiä parantaa selviytymisen PDAC potilailla, varhainen havaitseminen on ratkaiseva merkitys parempaan tulokseen tässä muuten kuolemaan johtava sairaus. Tässä tutkimuksessa käytimme MALDI Imaging spektrometria (MALDI-IMS) ja alueellinen resoluutio

in situ

proteomiikka analyysi esineoplastiset vauriot haima GEM endogeenisen PDAC. Me käsiteltiin erikseen, onko mahdollista tunnistaa proteiineja tai peptidejä, jotka voivat syrjiä morfologisesti normaali haimakudoksesta, Panin /IPMN esiasteleesioita ja PDAC.

Vaikka tarve varhaiseen toteamiseen PDAC, mieluiten joka preinvasive tila, on ilmeinen merkitys, proteomiikka analyysi ihmiseen haittasivat luontainen yksilöiden välinen ja kasvaimensisäisenä geneettisiä variaatioita sekä häiritsevien tekijöiden kuten ympäristö- ja ravitsemukselliset olosuhteissa. Lisäksi saaminen haiman kudoksen esiuudiskasvuisen Panin tai IPMN vaurioita ei ole mahdollista ilmeisistä syistä. Siten GEM pääpiirteittäin ihmisen haiman syövän synnyn tarjoavat erinomaisen tutkimuksen alusta ja on hyödynnetty havaitsemiseksi seerumin biomarkkereita käyttäen SELDI-TOF-analyysi [7]. Toisessa tutkimuksessa,

Pdx1-Cre; Kras

+ /G12D; INK4a /Arf

lox /lox

hiiriä käytettiin plasman proteomiikka analyysiä ja ehdokkaita validoitu veressä sairastavien potilaiden PDAC [ ,,,0],30]. Tuoreessa tutkimuksessa Taguchi ja työtovereiden verrattuna plasman proteiiniprofiileja neljän hiiren mallia keuhkosyövän profiileihin malleja haiman, munasarjan, paksusuolen, eturauhasen, ja rintasyövän sekä kaksi mallia tulehduksen. He osoittivat merkitystä ihmisen keuhkosyöpä proteiinin allekirjoitusten tunnistettu pohjalta hiirimalleissa [31]. Siksi arveltu nämä GEM sopivana alustana biomarkkereiden tunnistamiseen käyttäen MALDI-IMS.

MALDI-IMS on nopeasti kehittyvä lähestymistapa Molekyylien kudoksen analyysiin, jossa on mahdollisuus kliinisesti merkittäviä kysymyksiä kuten tunnistaminen biomarkkereiden kasvain luokittelu , hoito-valvonta ja huumeiden kuvantamisen [14], [16], [32], [33], [34], [35], [36].