Krooninen sairaus

tiivistelmä

Potilaat, joilla on haimasyöpä tyypillisesti kehittää invaasion ja -metastaasin alkuvaiheessa. Nämä pahanlaatuinen käyttäytyminen saattaa olla peräisin syövän kantasolut (CSCS), mutta vastaava tavoite on vähemmän tiedetään näkymätön CSCS erityisesti eteneminen ja metastaasit. Olemme aiemmin tutkinut proteasomin aktiivisuuden CSCS ja rakennettu reaaliaikainen visualisointi järjestelmä ihmisen haiman CSCS. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että CSCS olivat erittäin metastaattinen ja vallitsevasti paikallistaa hyökkääviä kasvain marginaalit maksan etäpesäke malli. Microarray ja siRNA seulontamäärityksillä osoittivat, että doublecortin kaltainen kinaasi 1 (DCLK1) oli pääasiallisesti ilmaistiin histonimodifikaation haiman CSCS invasiivista ja metastaattinen potentiaali. Yliekspressio DCLK1 johti amoeboid morfologia, joka edistää migraatio haiman syöpäsoluja. Knockdovvn DCLK1 syvästi tukahdutetaan in vivo maksan etäpesäke haiman CSCS. Kliinisesti DCLK1 yliekspressoitui vuonna etäpesäkkeitä potilailla, joilla on haimasyöpä. Tutkimuksemme paljastivat, että DCLK1 on välttämätöntä invasiivisia ja metastaattisen ominaisuudet CSCS ja saattaa olla lupaava epigeneettisellä ja terapeuttinen kohde ihmisen haimasyövän.

Citation: Ito H, Tanaka S, Akiyama Y, Shimada S, Adikrisna R, Matsumura S, et ai. (2016) Dominant ilmentäminen DCLK1 Human Haimasyöpä Kantasolut Nopeuttaa invaasion ja -metastaasin. PLoS ONE 11 (1): e0146564. doi: 10,1371 /journal.pone.0146564

Editor: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institute, Kiina

vastaanotettu: 17 elokuu 2015; Hyväksytty: 18 joulukuu 2015; Julkaistu: 14 tammikuu 2016

Copyright: © 2016 Ito et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Project innovatiivisten Syöpätutkimuskeskus Therapeutics (P-Direct), joka on Grant-in-tuki tieteellisen tutkimuksen innovatiivinen alueet, Scientific Research (A), Haastava kartoittava tutkimus siitä opetus-, kulttuuri-, urheilu-, Science Teknologia Japanin ja Health Labour Sciences Research Grant terveysministeriön Labour Welfare of Japan. Numero: 22130005, 25253081, 15H01484, 15K15491. URL: https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Lyhenteet : CSC, syöpä kantasolujen; ODC, ornitiinidekarboksylaasi; Gdeg, ZsGreen-leimattu degron ODC; H3K4me3 histoni H3 lysiinin 4 tri-metylointi; H3K9me3 histoni H3 lysiinin 9 tri-metylointi; H3K27me3 histoni H3 lysiinin 27 tri-metylointi; FACS, fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu; RT-PCR: käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio; qRT-PCR, kvantitatiivinen RT-PCR; GAPDH, glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin

Johdanto

Haimasyöpä on kaikkein vaarallisin yleisin syöpä, koska se diagnosoidaan yleensä edennyt pitkälle ja on vastustuskykyinen hoito [1]. Yleinen eloonjäämisluku 5 vuotta diagnoosin jälkeen on noin 5-6%, mikä on alhaisin syöpä [2]. Huolimatta vastikään kehitetty kirurgisia tekniikoita ja syöpälääkkeiden hoito tehoa haimasyövän ei ole merkittävästi parantunut viime vuosikymmenen aikana johtuen taipumus varhaisen invaasio ja etäpesäkkeiden [3]. Nämä erittäin pahanlaatuinen ominaisuudet johtuvat itseuudistumisen ja erilaistumista pienen alapopulaation syöpäsolujen kara kaltaisia ​​ominaisuuksia, niin sanottuja syövän kantasoluja (CSCS) [4, 5], joita kutsutaan myös metastasoituneen kantasolujen [6, 7]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että kantasolujen kohtalon määritetään epigeneettisiä mukaan luettuina histonimodifikaation joko normaaleissa soluissa [8] tai CSCS [9]. Vielä tärkeämpää on, tunnistaminen molekyylikohteista of CSCS odotetaan kiihtyvän uudenlaisten kohdennettujen hoitomuotojen [10]. Vaikka useat solun pinnan markkereita on tunnistettu ominaisuus haiman CSCS [5, 11], terapeuttiset tavoitteet on invasiivinen ja metastaattinen prosessi on vielä epäselvää, haimasyövän [12, 13]. Arvioidaan hoitostrategioita kohdistaa CSCS on vaikeaa, koska monimutkaisuuden jälleenrakentamista sekapopulaatioissa differentioiduilla jälkeläiset hierarkkisessa tavalla [14, 15]. Perustuva seurantajärjestelmä CSC ominaisia ​​toimintoja voisi olla yksi ratkaisu näihin ongelmiin, ja käytimme alhainen proteasomin aktiivisuus CSCS luoda sellainen järjestelmä. Ihmisen rinta- ja gliooma syöpäsolujen muokattu ilmentämään vakaasti vihreän fluoresenssin fuusioitu degron on ornitiinidekarboksylaasin (Gdeg), mikä johti solunsisäisen kertymisen vihreän fluoresoivan proteiinin Gdeg seurauksena alhainen aktiivisuus 26S-proteasomin [16, 17] . Käyttämällä tätä ominaisuutta, me aiemmin rakennettu reaaliaikainen visualisointi järjestelmä ihmisen maksan CSCS ja osoittaneet korkea metastaattinen kyky kapealla muodostumisen [18]. Meidän visualisointi järjestelmää käytettiin myös selventää erittäin pahanlaatuisten ominaisuudet ihmisen haiman CSCS [19]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme määritelleet doublecortin kaltainen kinaasi 1 (DCLK1), kuten proteiini, joka ekspressoituu pääasiassa invasiivinen ja metastaattinen CSCS. Geeni liittyy epigenetiikka muutoksia, esimerkiksi H3K4me3 ja H3K27me3 histonimodifikaation. DCLK1 on aiemmin raportoitu olevan ehdokas normaali kantasolujen markkeri suolessa [20, 21]. Kuitenkin Nakanishi

et al

. käytetyt sukulinja-jäljittämistä kokeiluja ja osoittivat, että DCLK1 merkitsee kasvain kantasolujen joka jatkuvasti tuottaa kasvaimen jälkeläisten [22]. Lisäksi Westfalenin

et al

. käyttivät samaa strategiaa ja ilmoitetaan suhdetta pitkäikäinen DCLK1-positiivisten solujen ja aloittaminen paksusuolensyöpä [23]. Mukaan äskettäinen raportti Bailey

et al

., Haiman kasvaimet hiirissä, jotka ilmentävät DCLK1 sisältävät morfologisesti ja toiminnallisesti erillisiä -alapopulaatioiksi CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia [24]. Käyttämällä edellä visualisointi järjestelmän ja metastaattinen haiman syövät, meidän tutkimukset paljastivat, että DCLK1 ilmentyy voimakkaasti ihmisen haiman CSCS ja kliinisissä näytteissä, ja se voi edustaa terapeuttinen kohde.

Materiaalit ja menetelmät

Retroviral transduktion n degron reportteri ihmisen haimasyövän soluja

degron sekvenssi ornitiinidekarboksylaasin (ODC) on tunnustettu suoraan proteasomien, mikä johtaa välittömään tuhoutumiseen mukana proteiini [16]. Retroviraalinen ekspressiovektori pQCXIN-ZsGreen-cODC, joka sisältää vihreän fluoresenssin ZsGreen-leimattua degron ODC (Gdeg), oli ystävällisesti toimittanut Dr. Frank Pajonk (UCLA Jonsson Kattava Cancer Center, CA, USA). Vektori transfektoitiin Platinum retroviruksen pakkaavia soluja [25], ja retrovirus kerätty supernatantti käytettiin infektoimaan haimasyövän soluja. Stabiilit transfektantit valittiin G418 (Geneticin, Promega, Madison, WI, USA), ja kertymistä ZsGreen-degronODC proteiinia (Gdeg) seurattiin fluoresenssimikroskopialla ja virtaussytometrialla (FITC-kanava). Voit tarkistaa vakaa transfektion jälkeen solut altistettiin proteasomin estäjä MG-132 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) 12 tuntia. Fluoresenssimikroskopia suoritettiin käyttäen AxioObserver (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa), ja kuvat hankittiin digitaalisesti AxioVision ohjelmistoa (Carl Zeiss).

In vitro Solujen migraation ja invaasion määritykset

Kaksinkertainen -chamber migraatiomääritys suoritettiin käyttämällä transwell chamber [26] (24-kuoppalevylle, 8 um huokosia, BD Biosciences, Canaan, CT, USA). Sillä invaasiomääritys, Matrigel-pinnoitettu (BD Biosciences) siirtoaltaat (0,1 mg /ml) valmistettiin inkuboimalla seerumia 2 tuntia 37 ° C: ssa 24-kuoppalevyllä. Alempi kammio täytettiin 0,8 ml elatusaineeseen ilman antibiootteja. Sitten DCLK1 korkea ekspressio, villityypin, Gdeg

korkea, ja Gdeg

korkean siDCLK1 kasvainsoluja (8 x 10

4 0,3 ml: ssa seerumia) ympättiin ylempään kammioon ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan. Kasvainsolut yläpinnalla suodattimen poistettiin käyttäen pumpulia vanupuikolla. Sitten solut kiinnitettiin 100% metanolilla ja värjättiin Giemsa-liuoksella ja liikkuvien solujen lukumäärä tai tunkeutumaan alapintaan laskettiin kolme satunnaisesti valittua suurentavan kentät (100 x) ja kunkin näytteen. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena.

mikrosiruanalyysi

geeniekspressioanalyysiä, 2 x 10

5 tuoreeltaan lajiteltu Gdeg

korkea ja Gdeg

alhainen KLM1 soluja käyttää. Kokonais-RNA uutettiin kustakin solutyypin QIAZOL, RNeasy Micro Kit, ja QIAshredder spin sarakkeet (QIAGEN, Hilden, Saksa). Eheyden RNA saatu arvioitiin kanssa NanoDrop ND-100 spektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA), joka on 2100Bioanalyzer, ja RNA6000Pico Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Mukaan GeneChip®3’IVT Express Kit, P /N702646 Ilm.7 protokollan (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), komplementaarinen DNA valmistettiin 100 ng kokonais-RNA käyttämällä yhden syklin kohde merkintöjä ja ohjaus reagenssipakkauksen (Affymetrix). Hybridisaatio ja signaalin havaitseminen HG-U133 Plus 2.0 paneelit (Affymetrix) suoritettiin. Microarray aineistot on Gdeg

korkea ja Gdeg

alhainen solujen normalisoituivat ja selityksin Expression Console ™ Software (Affymetrix). Arvioitu geeniekspressiotasot saatiin log2-muunnettuja arvoja. Geenit jätettiin analyysin ulkopuolelle, jos tunnistus puhelu oli ”marginaalinen” tai ”poissa” molemmissa Gdeg

korkea ja Gdeg

alhainen soluja.

hiljentäminen ja yli-ilmentyminen

DCLK1

sirna (siRNA) kohdistaminen kandidaattigeeneihin ja salattu siRNA (siScr) ei vastaa mitään ihmisen geenit ostettiin Invitrogen. Juuri järjestetty Gdeg

korkea-soluja (sekä KLM1 ja BxPC3) ympättiin tiheydellä 2,0 x 10

5 solua per kuoppa 6-kuoppalevyille 2 ml: ssa viljelyalustaa. Sen jälkeen, transfektio siRNA suoritettiin käyttäen RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden [27]. Transfektion jälkeen eri pitoisuuksilla (10 nM, 20 nM), soluja inkuboitiin 48 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2-ilmakehässä. Määrä elinkelpoisia ja käyttökelvottomaksi solut laskettiin automaattisella solu laskee koneen avulla trypaanisinivärin syrjäytyminen (CYTORECON; Hirata, Tokio, Japani). Tällä 48-tunnin kohdalla sen jälkeen, kun siRNA transfektiosta solut irrotettiin kunkin levyn käyttää lisäkokeita varten. SiRNA kohdesekvenssejä olivat korkean pitoisuus genominlaajuisten RNAi näytöt [28]. Rakentamiseksi shRNA ekspressiovektorin (pSilencer

TM 2.1-U6 puro; Invitrogen) [29], KLM1-Gdeg soluja (2,0 x 10

5) transfektoitiin 2,5 ug plasmidi Iipofectamine2000 (Invitrogen). Väliaine vaihdettiin joka 2. päivä, ja stabiilit transfektantit eristettiin inkuboimalla elatusaineessa, joka sisälsi 400 ug /ml puromysiiniä. Luominen ohimenevä tuumorisoluissa yli-ilmentävät DCLK1, käytimme pCMV6-AC-GFP (RG217050 TrueORF

TM cDNA-kloonien ja PrecisionShuttle

TM vektorisysteemikittiä, Origene Technologies, Rockville, MD, USA). KLM1 solut transfektoitiin käyttäen Iipofectamine2000 mukaan valmistajan protokollaa. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 48 tuntia, GFP-positiiviset solut lajiteltiin lisäkokeita varten.

In vivo -tutkimukset kasvaimien ja etäpesäkkeiden

nainen NOD.CB17-PRkdcScid /J-hiiret, iältään 5-6 viikkoa, hankittiin Charles River Laboratory (Kanagawa, Japani). Leikkaus suoritettiin nukutuksessa tarjoamia isofluraanin nenä-kartio hengitettynä. Eri määriä lajitellut solut (1 x 10

2: 1 x 10

5 Gdeg

korkean KLM1 ja Gdeg

matalan KLM1; 1 x 10

2: 1 x 10

4 Gdeg

korkean BxPC3 ja Gdeg

matalan BxPC3) sekoitettiin matrigeelin, ja 100 ui ihonalaisesti molempiin kylkiin hiiristä. Kasvaimen muodostumisen jälkeen seurattiin joka 4. päivä jopa 10 viikkoa. Kasvaimen tilavuus arvioitiin käyttäen seuraavaa yhtälöä: tilavuus = (pituus) x (leveys)

2/2. Kukin ryhmä koostui 4-6 hiirillä. Maksan etäpesäke analyysiä, vatsan ihon ja lihaksen, noin 5 mm pitkä, oli viiltää aivan keskiviivan. Perna exteriorized viillon kautta soveltamalla lempeä veto, ja lajitellut solut (Gdeg

korkean KLM1, Gdeg

matalan KLM1 ja Gdeg

korkean KLM1-shDCLK1, Gdeg

high-BxPC3 ja Gdeg

matalan BxPC3; n = 6), keskeytettiin 1 x 10

6 solua 100 ui PBS: ää, ruiskutettiin vajaat kapselin alemman tangon käyttämällä tuberkuliiniruiskuun 30-neula . Hemostasis saatiin soveltamalla kevyesti (jossa on vanulla moppi) pistoskohtaan. Perna palautettiin sitten vatsaonteloon, ja vatsa suljettiin käyttämällä kahta 6-0 silkkisutuuraa läpi sekä ihon ja lihasten samanaikaisesti [30, 31]. Havaitsimme nämä hiiret 8 viikon ajan, ja sitten tutkitaan, onko etäpesäkkeitä oli tapahtunut [32]. Kaikki in vivo menettelyjä tässä tutkimuksessa oli hyväksynyt Animal Care komitean Tokion Lääketieteen ja hammaslääketieteen University (lupa No.0150044A).

Potilaat ja näytteet

otettiin potilaita, joille tehtiin primaarinen ja metastaattinen (maksa ja keuhko) kasvaimen resektio haiman adenokarsinooma Tokion Lääketieteen ja hammaslääketieteen yliopistollisen sairaalan välillä 2005 ja 2013 Paired näytteitä käytettiin immunohistokemiallisia analyysejä. Resektoitiin kudos fiksoitiin 10% formaldehydiliuosta ja parafiiniin histopatologista analyysiä mukaan yleisten sääntöjen varten kliiniset ja patologiset Study of Primary Haimasyöpä. Tutkimus hyväksyi eettinen komitea Tokion Lääketieteen ja hammaslääketieteen University (Permission No.1080) ja kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Tilastollinen

Kaikki arvot esitetään keskiarvona ± SD, ellei toisin mainita. Kahden pyrstö Studentin t-testiä (ryhmien väliseen vertailuun) tai yksisuuntainen varianssianalyysi (vertailun kolme tai useampia ryhmiä) seurasi Dunnettin

post-hoc

testejä käytettiin tilastollisiin analyyseihin. SPSS ohjelmistoversio 21,0 (SPSS, Chicago, IL) käytettiin. Tilastollinen merkittävyys määritettiin p 0,05.

Tulokset

visualisoidaan haiman CSCS ovat erityisen kykenevät maksan etäpesäke

Stable transfektoimalla Gdeg reportteri kahteen ihmisen haimasyövän solu linjat eri onkogeenisia potentiaalit etäpesäke; KLM1 korkean kyky solujen KRAS, ja BxPC3 matalan kyky solujen villin tyypin KRAS [33-35]. CSCS leimattu toimittaja osoittaneet Gdeg

korkea väestön osuus oli noin 1,0% koko solun numero (S1 Kuva). Vuonna määrityksessä pallo muodostumisen [36], pallojen lukumäärä ( 50 pm halkaisijaltaan) johdettu Gdeg

korkea soluja oli huomattavasti korkeampi kuin Gdeg

pieni soluja (p 0,01, kuvio 1A ja 1B). Lisääntynyt kasvaimen kasvu in vivo on myös käytetty pala kriittisen todisteita olemassaolosta CSCS [4]. Siten lajiteltu populaatio Gdeg

korkea tai Gdeg

alhainen solujen ihonalaisesti NOD /SCID-hiiriin. Sillä Gdeg

korkea-soluja, jotka ovat peräisin sekä KLM1 ja BxPC3 solulinjat, olemme vahvistaneet erittäin pahanlaatuisten potentiaali (S2 kuvassa). Sekä KLM1 ja BxPC3 solulinjoissa, Gdeg

korkea soluilla oli merkittävästi suurempi kyky siirtää ja hyökätä kuin Gdeg

alhainen solujen kaksinkertaisen kammion määritys (p 0,01, kuvio 1C ja 1D). Tutkia, onko Gdeg solut välittävät etäpesäke in vivo, Gdeg

korkea tai Gdeg

alhainen solut ruiskutetaan pernat NOD /SCID-hiirten (n = 6). 8 viikon kuluttua, me visuaalisesti varmisti kasvaimia pernassa ja lasketaan määrä maksametastaaseja. Löysimme huomattavasti maksassa etäpesäkkeitä on Gdeg

korkean ryhmässä kuin Gdeg

pieni ryhmä (p 0,05; Gdeg

korkean KLM1 soluja, 5,3 ± 3,4 kasvaimia versus Gdeg

matala- KLM1 solut, 0 ± 0 kasvaimia, p 0,01; Gdeg

korkean BxPC3 soluja, 13,6 ± 5,1 kasvaimia vastaan ​​Gdeg

alhaisen BxPC3 soluissa, 2,2 ± 2,8 kasvaimia) (kuvio 2A ja 2B, 2F ja 2G ). Havaitsimme myös joitakin mikro-etäpesäkkeitä maksaan Gdeg

korkea ryhmät (kuvio 2C ja 2 H), mutta toteamme, että mitään etäpesäkkeitä havaittiin hiirillä ruiskutetaan Gdeg

matalan KLM1 soluissa. Immunofluoresenssianalyysi selvästi paljasti Gdeg

korkea soluja, jotka olivat paikallisia marginaaliin kasvain (kuvio 2D ja 2I). Osuus Gdeg

korkea solujen kasvaimen raja-alueella (MA; 200 pm) oli huomattavasti korkeampi kuin kasvain keskialueella (CA) (Gdeg

high-KLM1 kasvain; 26,1 ± 4,2% vs. 4,1 ± 2,5%, Gdeg

korkean BxPC3 kasvain, 21,0 ± 1,9% vs. 4,1 ± 0,2%, p 0,01) (kuvio 2E ja 2J). Kuten aiemmassa tutkimuksessa [11], tuloksemme ehdotti, että CSCS taipumus hyökätä edelleen ulkopuolella kasvain.

(A) edustaja mikroskooppisia kuvia pallojen näkyvät. Gdeg

korkean KLM1 ja Gdeg

korkean BxPC3 solut muodostivat täydellisen palloja, mutta Gdeg

matalan KLM1 ja Gdeg

matalan BxPC3 solut eivät. Mittakaava, 50 pm. (B) määrä palloja ( 50 pm halkaisijaltaan) havaittiin kussakin kuopassa (n = 6). Tiedot ovat keskiarvo ± SD. ** P 0,01 verrattuna Gdeg

korkea. Kaksipuolinen Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan kahden riippumattoman ryhmiä. (C ja D) Cell muuttoliike ja invaasio analysoitiin kaksinkertaisen kammion määritys käyttäen Gdeg

korkean KLM1, Gdeg

matalan KLM1, Gdeg

korkean BxPC3, ja Gdeg

matala-BxPC3 solut. Edustavia mikroskooppiset kuvat näkyvät. Kvantifiointi maahanmuutto- ja invaasion esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. ** P 0,01 verrattuna Gdeg

korkea soluja.

(A ja F) edustaja maksan etäpesäkkeitä näkyvät hiirillä 8 viikkoa injektion jälkeen. (B ja G) Histogrammi esittää keskimäärin kasvaimia maksassa (n = 6; keskiarvo ± SD). Molempien solulinjojen, löysimme merkittävä ero Gdeg

korkea ja Gdeg

alhainen soluja. * P 0,05 (B) ja ** p 0,01 (G). (C ja H) mikroskooppinen kuvia maksat, joita resekoitiin, leikkeiksi, ja värjättiin H keskiarvo ± SD). ** P 0,01. Laskimme kolmella eri aloilla kullekin alueelle.

yli-ilmentyminen DCLK1 yhdessä histonimodifikaation vastaa invasiivisia potentiaalin haiman CSCS

Täsmennetään invasiivisen ja metastaattisen merkkiaineita haiman CSCS vertasimme geeniekspressiomalleja välillä Gdeg

korkea solujen ja Gdeg

alhainen solujen microarray hybridisaatiolla (S1 Data). Scatterplot analyysi 25572 koettimien jolle havaitsemiseen puhelu oli ”läsnä” osoitti, että 483-geenit voimistunut ja 1138 geenit vaimentua yli 2-kertaisesti Gdeg

korkean KLM1 soluissa verrattuna Gdeg

matala-KLM1 solut. Perustuu kertainen muutos sijoitusta Gdeg

korkea soluja (taulukko 1), siRNA seulonta kandidaattigeenit arvioitiin mukaisesti estävät vaikutukset Gdeg

korkea solumigraatioon ja invaasion noudatettu kahden kammion määrityksessä. Näin ollen ainoastaan ​​siRNA vastaan ​​DCLK1 vähentynyt merkittävästi solumigraatiota ja invaasio kontrolleihin verrattuna sekä KLM1 ja BxPC3 Gdeg

korkea soluja (p 0,01, kuvio 3A ja 3B). DCLK1 tunnistettiin kohdemolekyylin, joka yli-ilmentyy Gdeg

korkea solujen muuttoliikkeeseen ja invasiivisen kyvyn verrattuna Gdeg

alhainen soluja. QRT-PCR ja Western blottauksella analyysit paljastivat, että DCLK1 mRNA ja proteiini yli-ilmentynyt Gdeg

korkea soluissa, mutta ei Gdeg

pieni soluja (S3 kuvassa). Immunosytokemiallisessa analyysi osoitti DCLK1 proteiini pääasiassa sijaitsi sytoplasmassa (kuvio 4A ja 4B), ja vähentää ilmentymistä DCLK1 varmistettiin käyttämällä siRNA (S3 kuvio, kuvio 4C ja 4D). Seuraavaksi tutkimme epigeneettiset näkökohtia

DCLK1

ilmaisu suorittamalla kromatiinin immunosaostuksella (chip) analyysi kolme keskeistä histoni metylaatio markkereita, H3K4me3, H3k9me3, ja H3K27me3, molemmissa Gdeg solulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa 4E, Gdeg

korkea solut ilmensivät korkeampia tasoja H3K4me3, joka liittyy aktiivisen promoottorit, kuin H3K27me3, joka liittyy äänieristys promoottorit. Gdeg

alhainen solut olivat lähes kaksivalenssinen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että

DCLK1

ilmentyminen Gdeg solulinjoissa säädeltiin histonimodifikaation of H3K4 ja H3K27. Löysimme eroa H3K9me3 tasojen Gdeg

korkea ja Gdeg

alhainen näissä solulinjoissa.

(A) Double-kammio määritys muuttoliikkeen ja invaasion sekä Gdeg

korkea solulinjoja hoidon jälkeen. Edustavia mikroskooppiset kuvat näkyvät. (B) määrä muuttavien ja valtaavat solujen kontrolliin verrattuna oli silmiinpistävän tukahdutettiin molemmissa Gdeg

korkean siDCLK1 solulinjoissa. #not huomattava, ** p 0,01, yksisuuntaisella varianssianalyysillä seurasi Dunnettin useita vertailutestejä.

(A ja B) immunosytokemi- analyysit DCLK1 molemmissa solulinjoissa (alkuperäinen suurennos × 200) näytetään. Gdeg

korkea solut ilmaisivat DCLK1 proteiinia, joka sijaitsi sytoplasmassa, mutta Gdeg

alhainen solut osoittivat vain heikko ilme. Asteikko bar, 10 mikrometriä. (C ja D) Immunosytokemialliset analyysi käsiteltyjen solujen

DCLK1

erityisiä siRNA esitetään (alkuperäinen suurennos x 200). DCLK1 proteiinin ilmentyminen aleni Gdeg

korkea solujen transfektion jälkeen siDCLK1. Mittakaava, 20 um. (E) pelimerkin analyysi näytetään. Molemmat Gdeg

korkea solulinjat voimakkaasti rikastettiin H3K4me3 verrattuna H3K27me3 klo

DCLK1

promoottorialueen. Histoni H3 ja IgG käytettiin positiivisina ja negatiivisina kontrolleina siru analyysiin, vastaavasti.

DCLK1 edistää morfologisia muutoksia, muuttoliike, ja hyökkäys ihmisen haimasyövän soluja

roolin tutkimiseksi DCLK1 ihmisen haimasyövän soluja, hyväksyimme voitto-of-function strategiaa käyttämällä KLM1 soluja, jotka ohimenevästi yliekspressoidaan GFP-merkitty DCLK1. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin hermosolujen solulinjojen, immunofluoresenssimenetelmällä analyysi KLM1-DCLK1-GFP osoittivat päällekkäisiä malleja DCLK1 ilmaisun mikrotubulusten kanssa käyttämällä α-tubuliinin aineella [37] (Kuva 5A). Funktio DCLK1 ihmisen haimasyövän soluja voi siis olla hallitse toimintaa mikrotubulushaarojen. Liike ja morfologisia muutoksia, kuten venyttämällä valejalka oli selvästi havaittavissa aikaintervallitallennuksessa mikroskooppisia kuvia (kuvio 5B). Aikana 15 tunnin tarkkailujakson aikana, siirtyminen etäisyys KLM1-DCLK1-GFP-soluissa oli pidempi kuin villityypin KLM1 solut (p 0,01, kuvio 5C). Vuonna kaksinkertaisen kammion määrityksessä määrä vaeltavia ja hyökkääviä KLM1-DCLK1-GFP-soluissa oli korkeampi kuin villityypin KLM1 solut (p 0,01, kuvio 5D). Lisäksi KLM1-DCLK1-GFP-solujen trans- sijaitsee kautta nopeasti vuorotellen sykliä morfologisten laajeneminen ja supistuminen nimeltään amoeboid muuttoliike (S1 Video) [38].

(A) immunosytokemi- analyysi osoitti, että DCLK1 oli pääasiassa yhteis- paikallistaa α-tubuliinin in KLM1-DCLK1-GFP-soluissa. Mittakaava, 20 um. Suurennettu kuvia laatikkoon alueet on esitetty toisella rivillä. Asteikko bar, 10 mikrometriä. (B) Neljä KLM1-DCLK1-GFP-solujen havaittiin Ajastettu kuvaus 15 tuntia. Ne antoi amoeboid morfologia kuin ne siirretään. Mittakaava, 20 um. Suurennettu kuva boxed alueiden näkyy kulmassa. Valkoinen Arrows merkki venyttämällä valejalka. Asteikko bar, 10 mikrometriä. Kappaleet (esitetty punaisella pisteviivat) mitattiin. (C) Histogrammi esittää keskimääräistä etäisyyttä muuttoliikkeen villityypin KLM1 solut (kontrolli solut) ja KLM1-DCLK1-GFP-solujen (n = 4 kussakin, keskiarvo ± SD). KLM1-DCLK1-GFP vaeltaneet solut merkittävästi pidempiä kuin kontrollisolut. ** P 0,01. (D) määrä muuttavien ja hyökkääviä KLM1-DCLK1-GFP-soluissa oli myös korkeampi kuin kontrolli soluja. ** P 0,01.

DCLK1 knockdown johtaa vähenemiseen metastaattisen kyvyn Haiman CSCS

Vahvista in vivo menettämisestä funktioanalyysivalikon, vakaa knockdovvn DCLK1 arvioitiin Gdeg-KLM1 soluihin käyttämällä

DCLK1

shRNA. Laatu transfektio varmistettiin qRT-PCR, Western blotting ja immunosolukemiallisten analyysit (kuvio 6A-6C). Väestöstä shDCLK1-Gdeg

korkean KLM1 soluja oli vähemmän kuin 0,5% koko solun numero (S1 Kuva). Me pistetään juuri järjestetty shDCLK1-Gdeg

korkean KLM1 solujen pernat NOD /SCID-hiirten (n = 6). Merkittäviä maksametastaaseista havaittiin injektion jälkeen ohjaus Gdeg

korkea soluja, mutta kiinnostavaa, ei etäpesäkeleesioita havaittu injektion jälkeen shDCLK1-Gdeg

korkea soluihin, määritettynä makroskooppinen ja mikroskooppinen tutkimus (kuvio 6D). Nämä tulokset ymmärtää, että DCLK1 olennainen rooli maksan etäpesäke ihmisen haimasyövän.

(A ja B)

DCLK1

erityisiä shRNA (shDCLK1) laski merkittävästi DCLK1 mRNA ja proteiini ilmaisun Gdeg

korkean KLM1 soluissa. ** P 0,01. (C) vähentyneen merkittävästi DCLK1 immunoreaktiivisuus havaittiin seuraavat transfektion shDCLK1 verrattuna Gdeg

korkea (kontrolli). Mittakaava, 20 um. (D) Eräät kasvaimet reunaa pitkin maksan näkyivät Gdeg

korkean KLM1 ryhmä, mutta ei kasvaimia nähtiin shDCLK1-Gdeg

korkea ryhmä. Keskimäärin kasvaimia maksassa (n = 6 hiirtä) esitetään (keskiarvo ± SD). Havaitsimme merkittävää eroa kontrolliryhmän ja shDCLK1 ryhmä. * P 0,05.

Hallitseva ilmentymä DCLK1 vuonna etäpesäkkeitä on kliinisesti tunnustettu potilailla, joilla haimasyöpä

Niistä 135 haimasyövän potilaat, joille tehtiin kirurginen resektio 2005-2013 vuonna meidän sairaalassa, kuusi etäpesäkkeitä resekoitiin synkronoidusti tai metachronously. Nämä kuusi paria ensisijaisen ja etäpesäkkeitä arvioitiin ilmentymisen DCLK1. Ensisijainen ja etäpesäkkeitä resekoitiin synkronoidusti kolmessa tapauksessa, ja ensisijainen kasvaimia ja metachronous kaukaisia ​​etäpesäkkeitä oli erikseen resekoitu muissa kolmessa tapauksessa (taulukko 2). Mielenkiintoista, syöpäsolut positiivisesti värjättiin DCLK1 proteiinia havaitaan harvoin primäärikasvaimissa, mutta selvästi havaittu etäpesäkkeitä (kuvio 7A-7F), ja kaikissa tapauksissa, värjäytyminen pistemäärä oli suurempi etäpesäkkeitä kuin primaarikasvaimia (kuvio 7G). Tapauksissa, 5 ja 6 ja erityisesti ensisijaisen kasvaimet täysin resekoitiin eikä paikallisen uusiutumisen tapahtunut. Vaikka näitä potilaita hoidettiin adjuvanttihoitoa, kaukainen etäpesäke ilmestyi. Näissä kahdessa tapauksessa, DCLK1 ekspressio oli paljon suurempi etäpesäketuumorikudoksen kuin primaarikasvaimen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että etäpesäkkeitä ovat resistenttejä tavanomaisille kemoterapiaa ja että DCLK1 on merkki etäispesäkekasval-.

(A, C, ja E) Kun ensisijainen leesiot, muutaman syöpäsolut olivat positiivisia DCLK1, ja värjäys intensiteetti oli heikko (vasemmalla, 100 ×, oikea, 400 x). (B, D, ja F) In etäpesäkeleesioita (maksaan tai keuhkoihin), määrä DCLK1 ilmentävien solujen oli suurempi kuin ensisijainen kasvaimia, ja värjäytymisintensiteettiä oli vahvempi (vasemmalla, 100 ×, oikea, 400 x). (G) Vertailu immunovärjäyksen tulokset välillä ensisijainen vaurioista ja etäpesäkeleesioita. Kaikki kuusi kliinistä näytettä, DCLK1 on enemmän ilmentyy suuresti metastaattisen vaurion kuin ensisijainen vaurio.

Keskustelu

DCLK1 koostuu N-pään, joka on 65 % samanlainen doublecortin (DCX) koko pituudelta DCX, mutta DCLK1 sisältää myös ylimääräinen 360 aminohapon C-terminaalinen domeeni, joka luo oletetun Ca

2 + /kalmoduliinista riippuvan proteiinikinaasi.

DCLK1

sijaitsee kromosomin alueen 13q13.3 [37].

DCX

geeni, joka sijaitsee kromosomissa alueen Xq23, on mikrotubuluksiin liittyvää proteiinia tarvitaan migraation hermoesiastesolut aivokuori.

Mutaatiot DCX lukemiin aivokuoren laminointi vikoja kehittyvien aivojen, joita kutsutaan subkortikaalinen bändi heterotopia naisilla ja klassisen lissencephalies miehillä [39]. Aikaisempi hiiri tutkimus, jossa DCLK1 ja /tai DCX pudotettiin paljastui, että molemmat proteiinit ovat geneettisesti korvaava rooleja hermosolujen muuttoliike; eli

DCLK1

geeni toimii osittain tarpeeton polkuun DCX muodostumista aksonaalisten ulokkeiden poikki keskiviivan ja kulkeutumista aivokuoren neuronien [40]. Olemme havainneet, että yli-ilmentynyt DCLK1 edistää muuttoliikkeen ja invaasion solulinjoissa, ja knockdown tukahduttaa näitä kykyjä. Olemme huolellisesti kuinka tuloksemme koskien DCLK1 sovi ohi tuloksia koskien hermosolujen rooli DCLK1. Jonkin verran näyttöä on olemassa mahdollinen osallistuminen aksoniohjauksen geenien haiman syövän synnyn [41], ja nämä tulokset ovat johdonmukaisia ​​sen havainnon, että erittäin ilmaistu DCLK1 liittyy läheisesti ja metastaasit haimasyövän. Epigeneettiset geenien toiminnan säätelystä on suuri merkitys solukohtalon määrittämiseen. Erityisesti korkeamman asteen kromatiinirakenteeseen on nousemassa tärkeä säätelijä kantasolujen erilaistumista [8], mukaan lukien jopa haiman kehitys [42]. Indusoitumisen aikana pluripotenttisuuden, tarvittaessa kromatiinin remodeling tarvitaan ekspressioon kantasolujen-geenit. Lisäksi useat tutkimukset aivokasvainten, maksasyövän ja rintasyövän syöpiä ovat osoittaneet, että histonimodifikaation on vastuussa hierarkkinen rakenne, joka käsittää syövän kantasoluja kärkeen [43-45]. Rheinbay

et al

. raportoitiin menetys H3K27me3 aktivoi signalointireitin tarvitaan huoltoa ja tuumorigeenisyyden glioblastooma CSCS [43]. Knockdovvn H3K20 metyylitransferaasi PR-set7 maksanvärisillä aiheuttama spontaani kehittämiseen maksasyövän syövän kantasolujen ominaisuuksia [44]. Westcott

et al

. raportoitu epigeneettiseltä selvä alipopulaatio rintasyöpäsoluja laajennetussa kyky kollektiivisesti hyökätä [45]. Tässä tutkimuksessa, siru analyysi paljasti että

DCLK1

transkription aloituskohdasta sekä Gdeg

korkea solulinjoihin voimakkaammin merkitty histonimodifikaation geenin aktivointia (H3K4me3) kuin tukahduttamisen (H3K27me3).