Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kemoterapia vastus on suurin syy epäonnistumiseen munasarjasyöpä hoitoon. Yksi mekanismi takana kemiallis-vastus liittyy säätelyä moniresistenssin (MDR) geenit (ABC kuljettajat), joka tehokkaasti kuljettaa (ulosvirtaus) lääkkeet pois syöpäsoluja. Koska yleinen oire vaiheessa III /IV munasarjasyöpä potilaille, askites liittyy syövän etenemisessä. Kuitenkin myös askites asemat monilääkeaineresistenssin in munasarjasyöpäsoluja odottaa selventämiseksi. Tässä osoitamme, että kun viljeltiin askites peräisin munasarjasyöpä kantavien hiirten, hiiren munasarjasyövän solulinja tuli vähemmän herkkiä paklitakseli, ensilinjan kemoterapeuttisen aineen munasarjasyövän hoitoon potilailla. Lisäksi inkubointi hiiren munasarjasyöpäsoluja

in vitro

vesivatsasarkoomalla ajaa ulosvirtaus toiminto näissä soluissa. Toiminnalliset tutkimukset osoittavat askites-odotuksiin ulosvirtaus on suppressible erityisillä estäjiä on kahta ABC kuljettajat [Moniresistenssi Related Protein (MRP1); Breast Cancer Related Protein (BCRP)]. Osoittaakseen merkitystä havainnoistamme munasarjasyöpä potilaille, olemme tutkineet suhteellinen ulosvirtaus ihmisen munasarjasyöpäsoluja saatu joko potilaan vesivatsoista primaarikasvaimen. Kuolemattomia solulinjoja kehitetään ihmisen askites osoittavat lisääntynyt alttius pumpata estäjät (MRP1, BCRP) verrattuna soluun, joka on peräisin ensisijaisesti munasarjasyöpä, mikä viittaa siihen, välisestä assosiaatiosta askites ja ulosvirtaus toiminto ihmisen munasarjasyöpä. Ulosvirtaus askites-johdettu ihmisen munasarjan syöpäsolujen liittyy lisääntynyt ekspressio ABC kuljettajat verrattuna, että primaarisen kasvaimen johdettu ihmisen munasarjasyöpä soluja. Yhdessä meidän havainnot tunnistaa uutta toimintaa askitesta edistämisessä munasarjasyövän monilääkeaineresistenssin.

Citation: Mo L, Pospichalova V, Huang Z, Murphy SK, Payne S, Wang F, et ai. (2015) Askitesta Korotukset Expression /toiminta monilääkeaineresistenssin proteiinit munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 10 (7): e0131579. doi: 10,1371 /journal.pone.0131579

Editor: Irina V. Lebedeva, Columbia University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 05 joulukuu 2014; Hyväksytty: 3 kesäkuu 2015; Julkaistu: 06 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Mo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Kaikki tiedot ovat sisällä paperia.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat CZ.1.07 /02.03.00 /30,0009, Euroopan sosiaalirahasto (VP) (https://ec.europa.eu/esf/home.jsp ), W81XWH-11-1-0469, Department of Defense Munasarjojen Cancer Research Program Award (SKM) (https://cdmrp.army.mil/ocrp/), Gail Parkins Munasarjojen Cancer Research Fund (SKM) (http: //www.ovarianawareness.org), sisäinen vararahasto Department of Pathology, Duke University Medical Center (SVP). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Operatiivinen kasvain debulking suoritetaan pääasiassa vaiheen I /II munasarjasyöpä potilaille. Tämä kirurginen toimenpide pitkälle edennyt sairaus (III-IV) ei ole aina mahdollista, erityisesti naisilla, joiden sairaus on laaja [1]. Siksi, kemoterapia on ensisijainen väline estää levittämiseen syöpäsolujen kun lääkärit potilaiden hoitoon on kehittynyt syöpä vaiheissa. Verrattuna normaaleihin soluihin, aktiivisesti lisääntyvissä syöpäsolut ovat alttiimpia eri sytotoksisten lääkkeiden kohdistaminen eri soluprosessien, mukaan lukien DNA: ta alkyloivat aineet, antimetaboliitit, interkalatoivat aineet ja mitoosi-inhibiittorit [2].

ensilinjan kemoterapian munasarjasyöpä on pysynyt ennallaan viime vuosikymmenen aikana, jossa terapeuttinen selkäranka koostuu platinavalmiste (yleensä karboplatiini) ja taksaania (yleensä paklitakseli) [3]. Toisen linjan kemoterapian pidetään, kun potilaat eivät vastaa ensilinjan lääkkeitä. Useat syöpälääkkeet ovat osoittaneet riittävää biologista aktiivisuutta voidaan katsoa järkevä toisen linjan valintoja, kuten doksorubisiini, etoposidi, gemsitabiini, ifosfamidi, tai syklofosfamidin [4].

Chemo-vastus, tunnettu alentunut kyky kemoterapiaa estämään kasvaimen kasvua ajan myötä, on yksi yleisin syy lopettamisen kemoterapiaa. Munasarjojen syövän uusiutumiseen on suora tulos chemo-vastus, esiintyy yli 80% korkealaatuisesta serous munasarjasyöpää sairastavilla potilailla [3, 5]. Taustalla olevia mekanismeja kemiallis-vastus ovat: 1) voimistumista moniresistenssin (MDR) geenejä, jotka tehokkaasti kuljettaa lääkkeitä pois solusta; 2) muuttaminen lääkettä metaboloivia entsyymejä, kuten ne, jotka ovat glutationi-S-transferaasin perhe (GST); 3) paeta apoptoosin ja kohonnut DNA korjaukseen johtuen mutatoidun tuumorisuppressorigeeneille [p53, rintasyöpä 1/2 (BRCA1 /2), ja ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) geenien] [2]; ja 4) heikentyvän sukkularihmaston Checkpoint johtaa vastustuskyvyn mikrotubulusten estäjiä [6].

suuri perhe 50 eri ATP-sitova kasetti (ABC) proteiinit (ABC kuljettajat) on dokumentoitu pumpata sytotoksisia molekyylejä, vähentää solunsisäistä lääkeaineen pitoisuus [7, 8]. Niistä ABC kuljettajat liittyvät kemiallis-vastus munasarjasyövän,

MDR1

geeni, joka koodaa P-glykoproteiinin (P-gp; MDR1, ABCB1), on useimmin tutkittu mekanismi. Muita yleisiä ABC kuljettajat ovat: MDR liittyvä proteiini 1 (MRP1, ABCC1) ja rintasyöpä resistance protein (BCRP, ABCG2) [2]. Lyhytaikainen inkubointi munasarjasyövän solujen solunsalpaajahoitojen (esim doksorubisiini, sisplatiini ja paklitakseli) niiden kliininen pitoisuuksilla [9] lisää MDR1 ekspressiotasoja. Erityisesti toistuvat munasarjasyöpiä, osoittavat huomattavasti MDR1 verrattuna ensisijaisen munasarjasyöpiä, jossa toistuvat saavien potilaiden platina-taksaanin terapiassa mukaisen hoidon jälkeen diagnoosi niiden ensisijainen syöpä [10]. Samanlaisia ​​MDR1, MRP1 havaitaan hoitamattomilla primääri munasarjojen kasvaimia erisuuruisia [11] ja löysi voimistunut jälkeen portaittain induktion sisplatiinin resistenssin munasarjasyövän solulinjoissa

in vitro

[12]. BCRP on indusoitavissa munasarjasyövän solulinjoissa pitkäaikaisilla inkubointi topotekaanilla ja antaa vastustuskyvyn topotekaani ja mitoxanthrone [13, 14].

Askites on yleinen oire vaiheessa III /IV munasarjasyöpä potilaiden ja korreloi huono ennuste [15]. Maligni askites tiedetään ihmisten munasarjasyöpä soluja TRAIL: n indusoiman apoptoosin johtaa lyhyemmän tautivapaan elinajan potilaiden [16, 17]. Kuitenkin vähän tiedetään suhdetta läsnäolo vatsaonteloon sekä Chemo-resistenssi munasarjasyöpään. Tässä tutkimuksessa tutkimme miten askites vaikuttaa munasarjasyöpäsoluja saatujen vastausten paklitakseli ja dosetakseli, johtava taksaanilääkkeet palveluksessa lääkäreitä munasarjasyövän hoidossa [3].

Materiaalit ja menetelmät

Cell line ja reagenssit

ID8, hiiren epiteelin munasarjasyövän solulinja [18], oli ystävällinen lahjoitus tri Kathy Roby Kansas University Medical Center. Mykoplasmakontaminaation seulonta käyttäen Gen-Probe Nukleiinihappohybridisoinnin tehtiin Duke Cancer Institute Cell Culture Facility huhtikuussa 2010. ID8 solut ylläpidettiin DMEM (korkea glukoosi, Gibco-Life Technologies [Gibco] Carlsbad, CA), joka sisälsi 4% sikiön naudan seerumia, penisilliinillä (100 yksikköä /ml) + streptomysiiniä (100 ug /ml) (Invitrogen-Life Technologies [Invitrogen], Carlsbad, CA). HA1 ja HA2 kehitettiin SV40 T-antigeeni-kuolemattomiksi ihmisen munasarjasyöpäsoluja saatu askites [HA1 linja johdettu askites (6116) alkutuotannosta leikkauksen vakavien karsinooma, huonosti eriytetty; HA2 line peräisin askites (OV 186) alkutuotannosta leikkauksen vakavien papillaarinen cystadenocarinoma]. TD-solut kehitettiin SV40 kuolemattomaksi ihmisen munasarjasyövän solujen ensisijainen leikkauksen korkealuokkaisesta vakavien adenokarsinooma kudoksen (ensisijainen vatsakalvon karsinooma) (6114)]. Nämä solulinjat pidettiin DMEM (korkea glukoosi, Gibco), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja 1 x penisilliiniä streptomysiiniä. De tunnistamattomiksi kasvain ja Askites näytteitä käytetään luomaan kuolemattomia solulinjoja kerättiin jälkeen luovuttajan tarjontaa kirjallinen lupa, jonka Duke Gynecologic Oncology Kasvain Bank (Pro00013710) ja käytettiin tässä tutkimuksessa alle Duke IRB protokollaa Pro00027325. Paklitakseli (T7191) ja doketakselin (01885) hankittiin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa ylläpidettiin enintään kaksi kohtaa ennen analyysiä.

Hiiren askites valmistelu

Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas Care ja laboratorioeläinten käyttöä National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi Institutional Animal Care Käytä komitea Duken yliopistossa (protokolla numero: A295-12-11). Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen. Naaras 6-8 viikkoa vanhoja C57BL /6-hiiriä (Charles River, Raleigh, NC) käytettiin. ID8 solut (1-10×10

6) injektoitiin hiiren vatsakalvon. Sen jälkeen askites kertymistä, hiiret lopetettiin. Vatsaontelonesteessä kerättiin ja sentrifugoitiin kahdesti 500 x g 5 min erottaa solu- ja soluton jakeet. Soluton jakeet useista hiiristä yhdistettiin ja suodatettiin 0,22 um: steriilin suodattimia. 50% askites käsittelyolosuhteet normalisoitiin normaaliin viljelyolosuhteet osalta FBS, glukoosi ja antibiootti pitoisuuksia.

virtaussytometrianalyysin Green ulosvirtausaika ID Dye

toiminnot monilääkeresistenttisyyden proteiinit MDR1 , MRP ja BCRP analysoitiin eFluxx ID Green monilääkeresistenssiin Assay Kit (ENZ-51029-K100, Enzo Lifesciences, Farmingdale, NY) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, yhden solun suspensioita kerättiin trypsiinillä laskettiin, yhtä suuri määrä soluja (500000 /ehto) suspendoitiin kokonaan väliaineessa, joka sisälsi specificinhibitors tai niiden yhdistelmät (tai DMSO laimennusaineena ohjattu) andincubated 10 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Lähteet /lopulliset pitoisuudet inhibiittorit ovat seuraavat: Verapamiili (MDR1-inhibiittori; Sigma V4629, 40 uM); MK-571 (MRP1 estäjä; Sigma M7571, 100 uM); Novobiosiinin (BCRP estäjä; Sigma N1628, 200 pm). Vihreä väriaine lisättiin sitten ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 40 min. Solut pestiin kerran PBS ennen FACS tiedonkeruu käyttäen Guava Easycyte Plus instrumentti (Millipore, Billerica, MA), 7-AAD käytettiin jättää kuolleita soluja analyysiin. Aineisto analysoitiin FlowJo_V10 ohjelmistoa (Ashland, OR).

laskeminen monilääkeaineresistenssin aktiviteettikertoimensa

monilääkeresistenssiin aktiivisuus tekijä (MAF) varten kukin kuljettaja, laskettiin käyttäen seuraavia kaavoja: joissa F on geometrinen keskiarvo fluoresenssin intensiteetti (GMFI), F

0 – ilman estäjää, F

MDR1 – kanssa MDR1 estäjän, F

MRP – MRP estäjän, F

BCRP – kanssa BCRP estäjän

rodamiini 123 säilyttäminen määritys

lääkevuoto- toiminta määritettiin käsittelemättömän ja askitesta käsiteltyjen ID8 soluissa rodamiini 123 säilyttäminen määrityksiä [18]. ID8 saatuja soluja normaalista kulttuurin, alkaen 7 päivää askites-esikäsittely kulttuurin tai askites

in vivo

ympättiin 40000 solua per kuoppa 6-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Nämä solut inkuboitiin sitten rodamiini 123: ssa 30 minuuttia. Soluja kullekin tilalle pestiin sitten PBS: llä ja inkuboitiin säännöllisesti keski- 2,5 tuntia. Fluoresoivat kuvat otettiin heräte λ = 485 nm ja emissio λ = 530 nm käyttäen BioTek Cytation3 Imager (Winooski, VT) 0 min (kun väriaineen poistamisen ja PBS pesu) ja 2,5 tuntia tunnin kuluttua rodamiini 123 poiston. Kokeet itsenäisesti toistettiin kolme kertaa.

Real-Time kvantitatiivinen RT-PCR-

Yhteensä solujen RNA uutettiin käyttäen Qiagen RNeasy Micro mukainen pakkaus valmistajan protokollan (Qiagen, Valencia, CA) ja käsiteltiin RNaasittomalla DNaasi poistamaan kaikki jäljellä genomista DNA: ta. Yksijuosteinen cDNA syntetisoitiin inkuboimalla kokonais-RNA (1 ug) ja RNaasi H-käänteistranskriptaasia (500 U), oligo- (dT) 12-18-aluketta (100 nM), dNTP: tä (1 mM), ja RNaasi-inhibiittoria ( 40 U) 42 ° C: ssa 1 h: n lopullisessa tilavuudessa 20 ui. Transcript First Strand cDNA Synthesis Kit ostettiin Roche Applied Science (Indianapolis, IN). Q-PCR-alukkeita hiiren

Abcc1

,

Abcb1a

,

Abcb1b

ja

beeta-Actin

ostettiin Origene (Rockville, MD). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin vertaamaan ekspressiotasot kutakin kokonais-RNA-näytettä. Reaaliaikainen PCR on Mx3005P QPCR System (Stratagene, La Jolla, CA) suoritettiin, kun läsnä oli 12,5 ui VeriQuest Fast SYBR Green qPCR Master Mix (2 x) (USB, Cleveland, OH) ja 2 ui cDNA: ta, ja H

2O lisättiin lopulliseen tilavuuteen 25 ui. Reaaliaikainen PCR suoritettiin ensimmäinen denaturointivaihetta ollessa 5 minuuttia 95 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä 3 s 95 ° C: ssa, 30 s klo hehkutus lämpötila 60 ° C: ssa. PCR-tuotteet seurattiin reaaliajassa mittaamalla fluoresenssin kasvun aiheuttama sitoutuminen SYBR Green I Dye. Merkitys analysoitiin käyttämällä ohjelmistopaketin MxPro QPCR Software (Stratagene, La Jolla, CA).

Western blotit

Solut kerättiin käyttämällä trypsiini-EDTA ja pestään PBS: llä. Kerätyt solut inkuboitiin yhteensä lyysipuskuria (50 mM Tris, pH 7,5, 1% SDS) plus proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorin cocktail (Halt, Thermo Scientific). Proteiinikonsentraatiot määritettiin BCA-määrityksellä. Yhtä suuret määrät proteiinia tehtiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (PAGE) ja immunoblotattiin. Blotteja inkuboitiin seuraavat ensisijaiset vasta-aineet, ja sen jälkeen sopivaa lajia IRDye-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Life Technologies, Carlsbad, CA): MDR1 (BIOSs; Cat # 1468R); MRP1 (Biorbyt Cat # ORB76148); BCRP (Biorbyt Cat # ORB10178); beeta-aktiini (Sigma Cat # SAB5500001). MDR1, MRP1, BCRP proteiinit todettiin käyttäen Odyssey infrapuna Imaging System (LI-COR, Lincoln, NE). Proteiini kvantitoitiin käyttäen Image J ohjelmisto (NIH, Bethesda, MD), ja suhteellinen suhde kiinnostavan proteiinin beeta-aktiini kuormituksen valvonta on laskettu.

Proliferaatiomääritykset

Solut ympättiin on 2.5×10

3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ja annettiin kasvaa yön yli. Solut pestiin kerran seerumittomalla DMEM. Sitten soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien kanssa paklitakselin tai doketakselin laimennettiin 200 ul: DMEM: ssa 24 tuntia. Askites käsiteltiin ID8 soluja tai ID8 kerättyjä soluja askites sai käsittelyt laimennettu 200 ul: aan 50%: askitessupernatantista. 18 h, 0,5 uCi [

3H] -tymidiinin (Perkin-Elmer, Waltham, MA) lisättiin jokaiseen kuoppaan. 8 tunnin kuluttua väliaine poistettiin ja solut hajotettiin 10X trypsiini-EDTA: ta ja kerättiin käyttäen 12-kanavainen microharvester (Skatron Instruments, Norja). Näytteet laskettiin nestetuikelaskurilla spektrofotometrillä. Kaikki olosuhteet olivat neljänä, ja jokainen koe toistettiin ainakin kaksi kertaa.

7-AAD värjäys

ID8 soluja eri esikäsittely ympättiin 4×10

4 solua per kuoppa ja annetaan kasvaa yön yli 6-kuoppaisilla levyillä. Ne pestiin kerran seerumittomalla DMEM. Sitten soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien kanssa paklitakselin tai doketakselin laimennettiin 2 ml DMEM 4 päivää. Askites käsiteltiin ID8 soluja tai ID8 kerättyjä soluja askites sai hoidot laimennettuna 2 ml 50%: askitessupernatantista. Lopussa hoitoja, solut kerättiin trypsinisaatiolla ja värjättiin 7-AAD (BD Biosciences) mukaan valmistajan protokollan seuraa analyysi on guava Easycyte Plus välineen (Millipore) ja analysoitiin FlowJo_V10 ohjelmisto.

tilastollinen analyysi

Kaavio visualisointi, datan muutosta ja tilastollinen analyysi (kaksisuuntainen paritonta t-testiä tai kaksisuuntainen – ANOVA) suoritettiin käyttäen Prism (versio 5.0, GraphPad Software) ja Microsoft Office Excel (versio 2010 Microsoft ).

tulokset

askites lisää ID8 solun kemoterapian resistenssin

vaikutus testattiin askites on munasarjasyövän solun resistentiksi paklitakseli, ensilinjan kemoterapeuttisen aineen. Vertailu suoritettiin välillä 1) ID8 soluja kasvatettiin normaalissa elatusaineessa, 2) ID8 solujen vasta eristetty askitesnesteestä syngeenisessä mallissa, ja 3) ID8 soluja käsiteltiin 7 päivää

in vitro

kanssa askitessupernatantista johdettu ID8-hiirille. Kemoterapia annostelu oli optimoitu erilaisia ​​saavuttaa 0-95% solujen kasvun esto, joka mitataan [

3H] -tymidiinin. Sekä ID8 soluja käsiteltiin 7 päivää, jossa askitessupernatantista ja ID8 solujen vasta eristettyä askitesnesteestä olivat resistenttejä paklitakselia kuin ID8 soluja viljeltiin normaalissa väliaineessa, mitattuna [

3H] -tymidiinin määrityksessä (kuvio 1A). Vahvistaa oletusta, että vesivatsakasvainta asemia munasarjasyöpäsolu kemoterapia-vastus, me seuraavaksi tutkittiin vastetta munasarjasyöpäsoluja (+/- Askites hoito) toiseen kemoterapia-reagenssin taksaaniperheen (doketakseli). Erityisesti, ID8 soluja käsiteltiin 7 päivää, jossa askitessupernatantista, sekä ID8 solujen vasta eristetty askitesnesteestä olivat huomattavasti vastustuskykyisempiä doketakselin kuin ID8 soluja normaalista viljelmässä (kuvio 1 B).

Hiiren munasarjan syöpäsolujen ( ID8) kolmesta eri lähteestä tutkittiin: 1) ID8 soluja normaalista viljelyalustaan ​​(Medium), 2) ID8 solujen vasta eristetty askitesnesteestä syngeenisessä mallissa (

in vivo

solut), ja 3) ID8 soluja käsiteltiin 7 päivää

in vitro

kanssa askitessupernatantista (askites käsiteltiin 7 päivää). Kukin näistä solupopulaatioiden altistettiin paklitakseli (A) tai doketakseli (B) osoitettu pitoisuus 24 tuntia ja [

3H] -tymidiinin määritettiin. Kolme riippumatonta kokeet suoritettiin ja edustava tulos esitetään. Virhepalkin edustaa SD nelinkertaisesti jokaisessa kunnossa. * Osoittaa p 0,05, *** p 0,001, kaksisuuntainen ANOVA. A. ID8 solut esikäsiteltiin soluton askites ja 7 päivää (Askites käsiteltiin 7 päivää) tai eristää askites (

in vivo

-solut) on kasvanut vastustuskyky Paklitakseli verrattuna ID8 solujen normaalin väliaineessa. B. ID8 solut esikäsiteltiin soluton askites 7 päivää (Askites käsiteltiin 7 päivää) on kasvanut vastustuskyky doketakselin 2 ja 4 nM verrattuna ID8 soluihin normaalista kulttuuriin. ID8 eristetyt solut askites (

in vivo

soluissa) ovat lisänneet vastus dosetakselille verrattuna ID8 soluihin normaalista keskipitkän (Medium). CD. 7-AAD otto mitattiin virtaussytometrianalyysillä. Prosentuaalinen 7-AAD positiivisten solujen kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty paklitakselin (C) ja doketakseli (D) saaneista soluista. Virhe palkit kuvaavat SD. * Osoittaa p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, kaksisuuntainen ANOVA. ID8 solut esikäsitellään soluton askites 7 päivää (Askites käsiteltiin 7 päivää) ovat vastustuskykyisempiä kemoterapian aiheuttama solukuolema (

i

.

e

., Näyttely vähemmän 7-AAD + solujen ) kuin ID8 soluja normaalista kulttuuriin.

edellä olevat tiedot osoittavat, että askites kasvaa munasarjasyöpäsolujen kemoterapia-resistenssi, kuten arvioitiin käyttäen [

3H] -tymidiinin määritys, joka mittaa soluproliferaation. Me seuraavaksi pyrittiin määrittämään, onko askites suojaa munasarjasyövän soluja kemoterapian aiheuttaman solukuoleman suorittamalla 7-AAD värjäystä. Kuten on esitetty kuviossa 1C ja 1 D, ID8 soluja käsiteltiin 7 päivää, joissa soluvapaat vesivatsa suojattu sekä paclitaxel- ja docetaxel- solukuolema, joka tarjoaa edelleen todisteita siitä, että askitessupernatantista edistää munasarjasyövän kemoterapian resistenssin.

askites ajaa ulosvirtaus ID8 soluissa

tutkimme seuraavaksi ulosvirtaus toiminto vesivatsanes- saaneilla munasarjasyöpäsoluja kahdella lääkevuoto- määritykset (ulosvirtaus ID vihreä väriaine ja rodamiini 123) [18]. Ulosvirtausta ID vihreä määrityksessä mitataan fluoresenssin intensiteetti inkuboinnin jälkeen solut fluoresoivalla. Kuvio 2A esittää alentunut fluoresenssin voimakkuutta sekä askites esikäsitellyt ID8 solut ja ID8 solut eristettiin askites (syngeneeisissä hiirimallissa) verrattuna fluoresenssi-intensiteetti käsittelemättömissä soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että askites edistää ulosvirtaus toiminto munasarjasyöpäsoluja. Seuraavaksi me mitataan säilyttäminen rodamiini 123 väriaineen ID8 soluissa (+/- askites hoito). Kuten on esitetty kuviossa 2B ja 2C, 2,5 tunnin jälkeen rodamiini poistamisen, käsittelemättömät ID8 solut säilyttivät väriainetta. Sen sijaan vähensi merkitsevästi tasot väriaineen havaittiin askites-esi-inkuboitu ID8 soluja, joiden perusteella voidaan päätellä, että askites-kasvaimen soluilla kasvoi ulosvirtausta. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että askites ajaa munasarjasyöpä ulosvirtausmekanismit.

(A). Ulosvirtaus toiminto mitattiin ulosvirtaus ID Green väriaine määrityksessä. ID8 solut eristettiin normaalista kulttuurin jälkeen saatu 7 päivää askites hoito, tai se voidaan eristää askites (

in vivo

soluja) inkuboitiin ulosvirtaus ID Green väriaine 40 min, jolloin solujen omaksumisen ja pumpata tämän väriaineen. ID8 solut esikäsiteltiin askites säilyy vähemmän väriainetta kuin ID8 soluja normaalista kulttuurin, mikä on osoitus kasvaneesta ulosvirtausta toiminto. (B). Ulosvirtaus toiminto mitattiin rodamiini 123 määrityksen. ID8 saatuja soluja normaalista kulttuurissa 7 päivää askites esikäsittely kulttuurin tai askites

in vivo

inkuboitiin rodamiini 123 30 min. Sitten solut kustakin kunnossa pestiin PBS: llä ja inkuboitiin säännöllisesti keski- 2,5 tuntia. Fluoresoivat kuvat otettiin 0 min (kun väriaineen poistamisen ja PBS pesu) ja 2,5 tuntia tunnin kuluttua rodamiini 123 poiston. Kvantifiointi fluoresenssi-intensiteetin (miinus tausta) kussakin ryhmässä on esitetty (C). Kolme riippumatonta kokeet suoritettiin ja edustava Tulos näkyy. Virhepalkin edustaa SD fluoresenssin voimakkuus mitataan kunkin solun kussakin kuvassa. * Osoittaa p 0,05, Studentin t-testi.

Askites hoito kasvattaa ilmentymisen monilääkeaineresistenssin liittyvien kuljettajat

Tutkimme ilmaisua kolmen ABC transporter geenejä (MDR1, MRP1 ja BCRP), jotka ovat yleisesti osallisina syövän kemoterapia-vastus. Suoritimme kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (q-PCR) RNA talteen ID8 solujen ja ID8 soluja esikäsiteltiin askites. Käsittelemättömät ID8 solut ilmensivät sekä MRP1 ja BCRP mRNA (kuvio 3A). Käsittelyn jälkeen askites

in vitro

ja 7 päivää, ID8 solut osoittivat merkitsevästi lisääntynyt ilmentyminen MDR1a (118- kertaisesti), MDR1b (75-kertainen), ja BCRP (17-kertainen) (kuvio 3A ja 3B) .

Yhteensä-RNA kerättiin ID8 soluista normaalissa kulttuurin samoin kuin ID8 soluista esikäsitelty askites 7 päivää. Ekspressiotasot osoitettujen geenien (suhteessa beta-aktiini) määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä (A). Kertainen nousu geenien ilmentyminen (askites käsiteltiin ID8 soluissa normaaleihin ID8 solut) esitetään B. kolme itsenäistä suoritettiin kokeita ja virhepalkin edustaa SD. * Osoittaa p 0,05 ja *** p 0,001, Studentin t-testi.

estäjät monilääkeaineresistenssin liittyvien kuljettajat vähentää ulosvirtaus tehokkuutta askites liittyvien munasarjasyöpäsoluja

sen jälkeen osoitetaan ilmen- tymisen lisääntymisen MDR liittyvät ABC kuljettajat vesivatsanes- käsitelty munasarjasyöpäsoluja, me vieressä pyrittiin määrittämään, onko tietty estäjät nämä kuljettajat estää ulosvirtaus näissä soluissa. Tutkimme kolme MDR transporter estäjät: verapamiili (MDR1 estäjä), MK-571 (MRP1 /2-estäjä), ja Novobiosiinin (BCRP estäjä). Ensinnäkin estäjän vaikutuksia ulosvirtaus toiminnon ID8 viljeltyjen solujen normaalin väliaineessa arvioitiin. Inhibiittorit lisättiin soluihin 10 minuuttia ennen kuin lisättiin ulosvirtausta ID vihreä väriaine. Kuten on esitetty kuviossa 4A ja 4B, vain MRP1-inhibiittori lisäsi fluoresenssin voimakkuus ulosvirtaus ID kasvihuone- merkitty ID8 soluja. Nämä tulokset osoittavat, että käsittelemättömät ID8 munasarjasyöpäsoluja tukea MRP1 riippuvainen ulosvirtausta, mutta ei MDR1 tai BCRP riippuva ulosvirtaus. Seuraavaksi tutkittiin vaikutuksia näillä estäjien ulosvirtaus toiminto sekä askites käsiteltiin ID8 soluissa ja ID8 soluissa eristää suoraan askites (

in vivo

soluissa). MDR1 estäjä ei kasvanut fluoresenssi ID8 soluissa esi-inkuboitiin Askites 7 päivän

in vitro

. Kuitenkin MDR1 estäjä teki lisääntyminen fluoresenssin ID8 eristetyt solut askites

in vivo

(kuvio 4A ja 4B). Lisäämällä joko MRP1 estäjän tai BCRP estäjä huomattavasti fluoresenssi (MAF) sekä askites-käsiteltyjen ID8 soluissa ja askites soluissa (

in vivo

) (kuvio 4B). Osoitimme myös, että näiden yhdistelmät estäjien ei lisännyt fluoresenssin voimakkuus ulosvirtaus ID vihreällä merkitystä ID8 soluja tai askites-käsiteltyjä soluja yli fluoresenssin voimakkuutta saadaan yhdellä estäjiä, mikä viittaa siihen, että aktiivisuus nämä yksittäiset kuljettajat ei kompensoida muilla kuljettajat ( dataa ei esitetty). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että askites edistää MRP1 ja BCRP riippuvainen ulosvirtaus ID8 munasarjasyöpäsoluja.

(A). ID8 soluja normaalista kulttuuri, askites esikäsittelyä kulttuuri, tai askites (

in vivo

solua) käsiteltiin kanssa tai ilman estäjien kohdistaminen MDR1, MRP1 tai BCRP 10 minuuttia ja sitten inkuboitiin ulosvirtaus ID vihreä väriaine 30 min. fluoresenssi-intensiteetti kunkin ehdon mitattiin virtaussytometrialla. Monilääkeresistenssiin aktiivisuus tekijä (MAF) laskettiin kullekin näytteelle, ja keskimääräinen MAF (+/- SD maasta triplikaattinäytteet) esitetään kunkin ehdon B. MAF arvojen laskemiseen alle tausta on merkitty harmaalla rajan. Tilastollisesti merkitsevä MAF välillä askites-käsiteltyjen ja

in vivo

askites soluja (käsittelemättömiin soluihin verrattuna) on osoitettu. Virhe pylväät edustavat SDS kolmesta itsenäisestä kokeesta. * Osoittaa p 0,05, Studentin t-testi.

Ihmisen munasarjasyövän saatujen solujen askites, mutta ei kasvainperäinen munasarjasyöpäsoluja, osoittavat ulosvirtauksen toiminto

Seuraavaksi haetaan laajentaa havaintoja ihmisen munasarjasyöpä soluja. Tutkimme ihmisen immortalisoitu munasarjasyövän peräisin olevia soluja potilaan askites (HA1, HA2-solut) tai ensisijaisen kasvaimen (TD-solut). Käyttämällä ulosvirtaus ID vihreä määrityksessä, osoitimme, että HA1 ja HA2 solut oli korkeampi ulosvirtaus kuin TD-solut (kuvio 5A ja 5B), tukemalla meidän löytää että askites ajaa ulosvirtaus funktio munasarjasyöpä soluja. Western blottaus suoritettiin tutkimaan ulosvirtausta proteiinin ilmentymistä näissä kasvain- ja askitesta johdettu ihmisen munasarjasyöpä soluja. Kuten on esitetty kuviossa 5C, ilmaus MDR1, MRP1 ja BCRP oli merkitsevästi korkeampi askites-johdettu tuumorisolulinjoja (HA1, HA2) kuin ensisijainen kasvain- solulinja (TD). Sen määrittämiseksi, mitkä ulosvirtaus proteiinit olivat toiminnallisia näissä soluissa, tutkimme seuraavaksi vaikutuksia MDR-inhibiittoreiden vaikutusta ulosvirtaus kasvain- ja askites-johdettu ihmisen munasarjasyöpä soluja. MRP1 ja BCRP-estäjien, mutta ei MDR1 estäjä, tukahdutti väriaine ulosvirtaus HA1 ja HA2 solujen merkittävästi. Sen sijaan inhibiittorit MDR1, MRP1 ja BCRP ei vaikuttanut värjäykseen kertyminen TD-soluissa (kuvio 5D ja 5E). Olemme osoittaneet, että näiden yhdistelmiä estäjien ei lisätä fluoresenssin voimakkuus TD-soluja (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että aktiivisuus yksittäisten kuljettajat ei kompensoida muilla kuljettajat. Nämä havainnot osoittavat, askites johdettu ihmisen munasarjasyöpäsoluja, mutta ei primäärikasvain peräisin olevia soluja, tukemaan ABC transporter riippuva ulosvirtaus.

A ja B. Immortalized ihmisen munasarjasyöpäsoluja peräisin potilaasta askites (HA1 ja HA2 solujen ) tai primaarikasvaimen sivusto (TD soluja) inkuboitiin ulosvirtaus ID vihreä väriaine 40 min. Fluoresenssi-intensiteetti kullekin tilalle mitattiin virtaussytometrialla. Histogrammi kunkin tasyöpäsolulinja peräisin potilaasta askites (HA1 tai HA2; sininen) peitetään histogrammi primaarikasvaimen johdetun linja (TD; punainen)). B. Mean fluoresenssin intensiteetti (MFI) laskettiin kullekin linjan kolmesta itsenäisestä kokeesta. Kertainen lasku geometrinen keskiarvo fluoresenssi-intensiteetin (GMFI) (suhteessa kasvain- line) laskettiin kustakin solulinjasta kolmessa riippumattomassa kokeessa. Tulokset on ilmoitettu keskiarvona kertainen pieneneminen kolmesta itsenäisestä tutkimuksissa käsiteltiin (+/- SD). C. Yhteensä solu-uutteet saatiin ensisijainen kasvain- ihmisen munasarjasyövän solulinja (TD) ja kunkin kahden askites-johdettu ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa (HA1, HA2). Vastaavat määrät uutettiin proteiinien SDS-PAGE: lla ja immunblotted spesifisillä vasta-aineilla MDR1, MRP1, BCRP, tai beta-aktiini, jonka jälkeen sopivaa lajia IRdye-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen. Proteiinivyöhykkeet havaittiin Odyssey infrapuna kuvantaminen. Proteiini kvantitoitiin käyttäen Image J ohjelmisto (NIH). Suhteet ilmoitettu proteiinin beeta aktiini näkyvät. D ja E. Ascites-johdettu ja tuumorista peräisin ihmisen solulinjoja inkuboitiin kanssa tai ilman estäjien kohdistaminen MDR1, MRP tai BCRP 10 min ja inkuboitiin sitten ulosvirtaus ID Green dye 30 min. Näytteet analysoitiin virtaussytometrialla. Histogrammit (+ estäjä vs – estäjä) peitettiin jokaiselle riville (D). E. monilääkeresistenssiin aktiivisuuden tekijä (MAF) laskettiin kullekin näytteelle, ja keskimääräinen MAF (+/- SD) kolmesta itsenäisestä kokeesta esitetään kunkin ehdon E. MAF arvojen laskemiseen alle tausta on merkitty harmaalla. Tilastollisesti merkitsevä MAF välillä askites-käsiteltyjen ja

in vivo

askites soluja (käsittelemättömiin soluihin verrattuna) on osoitettu. * Osoittaa p 0,05. ** Osoittaa p 0,01, Studentin t-testi.

Keskustelu

munasarjasyöpäsoluja resistenteiksi kemoterapian jälkeen lyhyen aikavälin [7] tai pitkäaikainen [12, 14] kemoterapeuttisen lääkeaineiden. Molemmat maligni askites [15] ja Chemo-vastus [19] on liittynyt alentunut selviytymisen munasarjasyöpä potilaille. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että hiiren munasarjan syöpäsolujen (ID8) osoittavat kasvanut taksaanin kemoterapian resistenssin, kun se altistetaan askites

in vitro

tai

in vivo

(verrattuna ID8 soluja viljeltiin normaalissa väliaineessa ). Tietääksemme, työmme on ensimmäinen suoraan osoittaa indusoituva kemiallis-vastarintaa askitessupernatantista.

Tähän mennessä yksikään tutkimus on tutkinut yhdistyksen välillä läsnäolo askites [15] ja MDR liikenne [20-22 ], vaikka jokainen on itsenäinen riskitekijä ennustettaessa huono ennuste for munasarjasyöpä potilaille. Tutkimukset ovat leimanneet ilmentymistason MDR kuljettajan on ensisijainen tai toistuvia munasarjasyöpä kudoksissa [10] tai MDR1 polymorfia ja munasarjasyövän etenemisessä tai elinajassa [23]. Tutkimuksemme on romaani viittaa siihen, että Askites on pystyy kuljettamaan ilmentymistä ja toimintaa MDR kuljettajat.