Krooninen sairaus

tiivistelmä

Expression imukudosalkuperää tehostajana tekijän 1 (LEF1) on usein muuttunut eri ihmisen syövissä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida LEF1 ilmentymisen paksusuolensyöpä kudoksissa ja tutkia muuttunut fenotyyppejä, geeniekspressioiden, ja mahdollinen mekanismi jälkeen pudotettiin LEF1 ilmentymistä koolonsyöpäsolulinjaa. Yhteensä 106 paksusuolen syövän ja täsmäsi paratumorous normaaleissa kudoksissa arviointiin käytettiin LEF1 ilmaisun käyttäen immunohistokemia ja qRT-PCR: llä. LEF1 lentivirus käytettiin pudotus LEF1 lauseke solujen elinkelpoisuuden arviointi, solusyklin jakautuminen, apoptoosin, ja geeni ilmaisuja. Nude-hiiret ksenografti määritys suoritettiin havaitsemaan vaikutukset LEF1 Knockdown

in vivo

. Tiedot osoittivat, että tasot LEF1 mRNA ja proteiini lisättiin merkittävästi ihmisen paksusuolen syöpä kudoksiin verrattuna Hyväksytty paratumorous normaaleista kudoksista ja liittyi tunkeutuminen syvyys, imusolmuke ja etäispesäkkeitä, kehittyneet TNM (tuumori-solmu-etäpesäke) vaiheet, ja lyhyempi kokonaiselossaolo. Lisäksi LEF1 pudotus vähensi kasvainten solujen elinkykyä, invaasio kapasiteettia, MMP2: n ja MMP-9 ilmentymistä, mutta indusoi apoptoosia. Nude mouse -ksenografti testi osoitti, että LEF1 Knockdown tukahdutti kasvaimen muodostumisen ja kasvun

in vivo

. Lisäksi, ekspression Notch-reittiin liittyvien proteiinien RBP-JK ja Hes1 pienennettiin LEF1 pudotus soluissa. Yhdessä LEF1 proteiinia yli-ilmennetään paksusuolensyöpä kudoksissa ja knockdovvn LEF1 ilmaisun esti paksusuolen syövän kasvua

in vitro

ja

in vivo

. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kohdentamiseen LEF1 ilmentymisen pitäisi arvioida tarkemmin paksusuolen syövän ennaltaehkäisyyn ja hoitoon.

Citation: Wang W-J, Yao Y, Jiang L-L, Hu T-H, Ma J-Q, Liao Z-J, et al. (2013) knockdovvn Lymfaattinen Enhancer tekijä 1 Estää Colon Cancer Progression

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 8 (10): e76596. doi: 10,1371 /journal.pone.0076596

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: toukokuu 31, 2013; Hyväksytty: 03 syyskuu 2013; Julkaistu: 02 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Natural Science Foundation of China (No.81001090) (https://www.nsfc.gov.cn/nsfc/cen/xxgk/slzz.html).The rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu , tietojen kerääminen ja analysointi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tähän tutkimukseen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Colon syöpä on yksi yleisimmistä syöpä sekä miesten että naisten maailmassa, osuus toisen syy syövän kuolemaan Yhdysvalloissa [1,2] ja neljäs Kiinassa [3]. Niinpä paksusuolensyöpä edelleen maailmanlaajuisesti merkittävä kansanterveydellinen ongelma, vaikka on merkittävästi maailmanlaajuinen lasku syöpään liittyvää kuolleisuutta paksusuolen syövän viime vuosikymmeninä johtuen huomattavaa edistystä varhaisen diagnoosin ja tehokkaita hoitoja. Tähän mennessä synnyssä ja molekyylitason mekanismi vastaa paksusuolen syövän kehittymisen on kattavasti tutkittu ja suuri elin tietoa on tuotettu suhteen molekyyli muutoksiin liittyy paksusuolen syövän synnyn, johon liittyy aktivointi onkogeenien ja hiljaisuuden tuumorisuppressorigeeneille [4]. Kuitenkin paljon enemmän tehtävää varten täsmällisesti tietää paksusuolen syövän synnyn ja kehittää uusia strategioita tehokkaasti valvoa tätä tautia.

Tätä varten meidän tutkimus keskittyy imukudoksen tehostajana sitova tekijä-1 (LEF1) , jäsen suuren liikkuvuuden ryhmä (HMG) proteiinin perheen.

LEF1

koodaa 48 kD: n ydin- proteiiniin, joka on yleensä ilmaistu pre-B- ja T-solujen [5,6], ja sillä on tärkeä rooli alkionkehityksen ja syövän kehittymisessä [7]. LEF1 on monitoiminen proteiini, joka vaikuttaa lukuisia solun toimintoja, kuten Wnt signalointia solujen lisääntymistä, apoptoosin, liikkuvuutta, ja geeni transkriptio [8,9]. Muuttunut ilmentyminen LEF1-proteiinin on raportoitu olevan osallisena kasvainten synnyssä ihmisen erilaisten syöpien, mukaan lukien paksusuolen syöpä [10]. Molekyylirakennetta, LEF1 voi välittää ekspressiota Wnt signaloinnin geenien kautta rekrytointi β-kateniinin promoottoriin kohdegeenien [11,12], mutta LEF1 itse puuttuu oma transkriptionaalisen aktivaation mahdollisia soluissa. LEF1 proteiinia sisältävä β-kateniinin sitovat domeenit voivat säädellä solujen lisääntymistä ja invaasiota kasvainsolujen [13]. Useita tekijät voivat vaikuttaa LEF1 ilmaisu, kuten fibroblastikasvutekijä-2, PITX2, ja hepatosyyttikasvutekijä [14-16].

Näin ollen tässä tutkimuksessa olemme ensimmäinen havaittu LEF1 ilmentymisen paksusuolen syövän kudoksissa verrattuna paratumorous paksusuolen kudoksiin ja sitten tutkittiin vaikutuksia LEF1 knockdown säätelyssä paksusuolensyöpä solujen elinkykyä, solusyklin jakelu, apoptoosin, ja geeniekspressio

in vitro

ja paljaan hiiren ksenografteissa. Olemme myös tutkineet vaikutuksia LEF1 Knockdown sääntelystä Notch reitin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyi suorittaminen Human Ethics komitean Ensimmäinen Affiliated sairaala, College of Medicine Xi’an Jiaotong yliopisto. Kirjallinen suostumukset saatiin kaikista potilaista.

Eläin Koejärjestely hyväksynyt Animal Care ja käyttö komitea Medical School of Xi’an Jiaotong yliopisto.

Potilaat ja näytteet

tässä tutkimuksessa olemme takautuvasti palvelukseen 106 paria kirurgisesti toistoleikattiin paksusuolen syövän ja paratumorous normaali kudosnäytteiden (5 cm: n päässä tuumorivaurioon) The First Affiliated sairaala, College of Medicine Xi’an Jiaotong yliopiston välillä tammikuu 2006 ja maaliskuussa 2007. kudosnäytteitä saatiin 60 mies- ja 46 naaras potilailla, joiden keski-ikä oli 55,5 vuotta (vaihteluväli 30-81 vuotta). Kliinis näistä potilaista on esitetty taulukossa 1. patologinen diagnoosi näiden näytteiden itsenäisesti uudelleen vahvistettu kahdella patologia sokkona. Kaikki potilaat ei ole käsitelty millään kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta. Viimeinen potilas seurannat tehtiin toukokuun lopussa 2012 potilasta, jotka olivat menettäneet seuranta tai kuolema muista syistä kuin paksusuolensyöpä pidettiin sensuroitiin tiedot aikana selviytymisen analyysin.

Kliinis muuttujat

N

LEF1 ilmaisun pisteet (keskiarvo ± SD) B

P

arvo

Ikä (v) 60414,87 ± 2.330.502≥60655.21 ± 2.65Tumor differentiationWell504.84 ± 1.940.274Moderate394. 95 ± 2.87Poor175.59 ± 3.02Infiltration depthT

1 + T

2404,12 ± 1.980.002T

3 + T

4665,66 ± 2.56Lymph etäpesäke N

0464,06 ± 2,12 0,001 N

1-3605,85 ± 2.74Distant metastasisM

0864,69 ± 2.040.004M

1206,31 ± 2.77TNM stageI81.39 ± 3,23 0.001II334.14 ± 2.40III455.33 ± 2.25IV207.12 ± 2.69Table 1 . Association of LEF1 ilmaisun kanssa kliinis tekijöiden potilailta.

CSV Lataa CSV

histopatologia ja immunohistokemia

Parafiini upotettujen leikkeiden (5 pm) poistettiin parafiini ja rehydratoitiin läpi sarjan porrastettu alkoholeja. Immunohistokemiaa, ensisijainen vasta-aine LEF1 (C12A5, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) käytettiin laimennoksena 1: 100, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Leikkeet inkuboitiin isotyyppiyhteensopivan kontrollivasta-ainetta negatiivisena kontrollina. Seuraavaksi leikkeet värjättiin biotiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen, ja väri kehitettiin käyttämällä 0,05% 3 ’, 3’-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla seurasi counterstaining hematoksyliinillä. Leikkeitä lopuksi tarkistettava ja sai alle Olympus mikroskooppi (BX41, Tokio, Japani), mukaan aiemman tutkimuksen avulla kertomalla intensiteetti pisteet ja laajuus värjäyksen tulos [17]. Värjäytymisintensiteettiä pisteytettiin 0 (ei värjäystä), 1 (heikko värjäytyminen), 2 (medium värjäytyminen) tai 3 (voimakas värjäytyminen). Laajuus värjäytyminen arvioitiin määrittämällä näytteiden tulokset perustuvat prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen seuraavasti: 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) ja 4 (76-100%). Positiivisten solujen arvioitiin laskemalla 10 random kentät × 400 suurennus. Lopullinen pistemäärä on vaihtelivat 0 12. pisteet 0-2 määriteltiin negatiivinen ilmaus, tulokset 3-5 nimellä ”heikko ilmaus”, tulokset 6-9 ”kohtalaisiksi ilmaisu” ja tulokset 10-12 kuin ”vahva ilmaus ”. Varten tarkempaa analysointia näytteet, joiden pisteet 0-5 määriteltiin lyhensi värjäystä tai menetys LEF1 ilmaisun, kun taas näytteet pistein 6-12 ryhmiteltiin ja määritellään positiiviset ilme.

Reaaliaikainen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio

solun kokonais-RNA eristettiin kudoksista ja solulinjoissa käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Nämä RNA-näytteet sitten käänteisesti cDNArksi käyttäen RT-PCR (Takara, Dalian, Kiina). Reaaliaikainen PCR suoritetaan sitten iQ5 Monivärinen Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) käyttämällä SYBR Esisekoite Ex Taq TM II (Takara). Alukesekvenssit monistamiseen LEF1 olivat: 5′-AGCGAATGTCGTTGCTGAGTGTA-3 ’ja 5′-CTCTTGCAGACCAGCCTGGATAA-3’. Taloudenhoito geeni GAPDH käytettiin sisäisen valvonnan ja alukesekvenssit olivat 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ’ja 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’. Tiedot hankittiin kynnykseksi sykli (ACk

t) arvo. ACk

t arvot määritettiin vähentämällä keskimääräinen sisäinen taloudenhoito geeni C

t arvon keskimääräinen kohdegeenin C

t arvo. Koska monistuksen tehokkuus kohdegeenien ja sisäisen valvonnan geeni oli sama suhteellinen geenin ilmentyminen laskettiin käyttämällä 2

-ΔΔCt menetelmällä. Kukin mittaus suoritettiin kolmena kappaleena.

rakentaminen lentivirus vector kuljettaa LEF1 shRNA

LEF1 shRNA lentiviruksen vektori (U6-vshRNA-CMV-PUR-GFP-GV248-shLEF1) suunniteltiin, syntetisoitiin ja rakennettu Genechem Co. (Shanghai, Kiina). Seuraavat kohdesekvenssien ihmisen LEF1 geeni valittiin, eli kohde 1, GCTGACATCAAGTCTTCCTTG; tavoite 2, GTGAAGAGCAGGCTAAATATT; kohdistaa 3, GCTGGTCTGCAAGAGACAATT; ja kohdistaa 4, GCTCA TTCCCAACGTGCAAAG. Tavoite 3 valittiin myöhemmissä kokeissa. Lentivirus vector U6-vshRNA-shNC, joka koodaa satunnaisia ​​RNAi-sekvenssi, käytettiin negatiivisena kontrollina.

Solulinjat, kulttuurin, geenin transfektio ja hoitoja

Ihmisen paksusuolen syövän solulinjat, Caco

2, Colo205, HCT116, HT29, ja Lovo saatiin Cell Resource Center, Shanghai Institutes for Biological Sciences (Shanghai, Kiina) ja Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM) (HyClone, Logan, UT, USA) jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Invitrogen), penisilliiniä (100 IU /ml), ja streptomysiinillä (0,1 mg /ml), 5% CO

2 37 ° C: ssa. Ihmisen paksusuolen syövän solulinja SW480 viljeltiin RPMI1640 (HyClone, Logan, UT, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, penisilliiniä (100 IU /ml), ja streptomysiinillä (0,1 mg /ml), 5% CO

2 37 ° C: ssa, kun taas toisen ihmisen paksusuolen syövän solulinja, SW620, viljeltiin L-15-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, penisilliiniä (100 IU /ml), ja streptomysiinillä (0,1 mg /ml) 5 % CO

2 37 ° C: ssa. SW480 ja SW620-solut infektoitiin lentivirusvektoreita on infektiokertoimella (MOI) 10 ja 100, vastaavasti, ja sitten valitaan puromysiiniä sisältävään kasvualustaan. Jälkeen 7 päivää viljelyn puromysiiniresistenttiä pesäkkeet poimittiin, kehittyä ja analysoitiin erikseen.

γ-sekretaasin estäjä DAPT (100 uM, Sigma-Aldrich, USA) käytettiin farmakologisen inhibition määritykset, jotka voidaan tehokkaasti lohko Notch solunsisäinen domeeni (NICD) toteuttamasta solun tumaan. Lyhyesti, nämä solut ympättiin kuuden kuopan levyille ja käsiteltiin 2 ml: ssa alustaa, joka sisälsi 1% FBS: ää ja DAPT. Ohjaus soluja käsiteltiin yhtä suuret määrät dimetyylisulfoksidia (DMSO). 48 h jälkeen inkuboinnin solu-uutteet valmistettiin Western blot kuten alla on kuvattu.

Proteiinin uuttaminen ja Western blot

Proteiini uutettiin kudosten ja solujen, ja nämä proteiini lysaatit erotettiin 6% -12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi; Erotetut proteiinit olivat sitten sähköisesti blotattiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore, Danvers, MA). Membraanit blokattiin sitten ja sen jälkeen inkuboitiin seuraavat ensisijaiset vasta-aineet: anti-LEF1-vasta-ainetta (1: 800; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-MMP2 (1: 500; Cell Signalling Technology, Danvers, MA), anti- -MMP7 (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-MMP-9 (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-NICD (1: 800; Cell Signalling Technology), anti- RBP-JK (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-Hes1 (1:50; Santa Cruz Biotechnology), tai anti-β-aktiini vasta-ainetta (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology). Vihdoin blotit visualisoitiin ECL-detektiojärjestelmässä (Millipore), jossa on piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Santa Cruz Biotechnology). Western blotit toistettiin kolme kertaa kullekin proteiinin näytteen.

Solujen elinkelpoisuus MTT-määritystä

Solut (5 x 10

3 per kuoppa) ympättiin 200 ui kasvualustaa 96 kuoppaiset levy ja kasvatetaan korkeintaan 7 vuorokautta. Lopussa kokeiden, 3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-difenyyli-tetratsoliumbromidia (MTT, 0,5 mg /ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) oli lisättiin kuhunkin kuoppaan. Soluja viljeltiin sitten 37 ° C: ssa 4 tuntia, ja 150 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sekoitettiin ravistamalla huoneenlämpötilassa 10 min. Tämän jälkeen imeytyminen mitattiin aallonpituudella 490 nm käyttäen spektrofotometriä. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

Virtaussytometria solusyklin ja apoptoosin määrityksiä

solusyklin analyysiä varten solut (5 x 10

5) kasvatettiin ja talteen, pestiin kaksi kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolilla 24 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Kiinnitetyt solut värjättiin 150 ul: propidiumjodidilla ja 150 ui: aan RNase A: ta (Sigma-Aldrich) peräkkäin. Kun on inkuboitu 30 min 37 ° C: ssa, näytteet tutkittiin virtaussytometrillä (FACS-Caliber, Franklin Lakes, NJ), ja Cell Quest ohjelmaa käytettiin analysointiin. Jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa.

apoptoosin analyysiä varten solut (5 x 10

5 kuoppaa kohti) viljeltiin kuuden kuoppalevyillä, kerättiin ja pestiin kaksi kertaa jääkylmällä PBS: llä. Seuraavaksi 500 ui sitomispuskuria, 5 ui anneksiini V-APC, ja 5 ui 7-AAD (KEYGEN Biotech, Nanjing, Kiina) lisättiin peräkkäin näytteitä. Kun oli sekoitettu ja inkuboitu 15 minuuttia 37 ° C: ssa, näytteet ajettiin virtaussytometrillä välittömästi. Jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa.

Kasvainsolulinja Matrigel invaasiomääritys

hyökkäys kapasiteetti koolonkarsinoomasoluissa arvioitiin käyttämällä Millicell invaasiota kammio (Millipore, Billerica, MA, USA) . 8 um huokosia insertit päällystettiin matrigeelin (Becton ja Dickinson Company, Franklin Lakes, NJ, USA). -Soluja (5 x 10

4) suspendoitiin uudelleen 200 ul: lla seerumia, jossa 5 ug /ml mitomysiini C (Sigma-Aldrich) ylempään kammioon, ja alaosaan oli täynnä normaalissa elatusaineessa. Kun oli inkuboitu 24 h, ei-tunkeutuvat soluihin yläpinnan poistettiin pumpulipuikolla moppi ja tunkeutuvat solut alapinnalle suodatin kiinnitettiin metanolilla, värjättiin 0,1% kristallivioletilla ja laskettiin mikroskoopilla käyttäen 10 satunnaisesti valittua kenttiä suurennos 200x.

nude hiiren kasvainsolun ksenografti määrityksessä

Male BALB /c-nude-hiiriin (iät välillä 4 ja 6 viikon; Shanghai Experimental Animal Center, Shanghai, Kiina) inokuloitiin subkutaanisesti 1 x 10

7 solua ja sijaitsevat patogeenittomassa laitoksen Animal Center of Xi’an Jiaotong yliopisto. Kasvaimen tilavuus määritettiin pituus (L) ja leveys (W), joka on mitattu liukuva tulkki ja lasketaan L x W

2 x 0,5. Hiiret lopetettiin 45 päivää sen jälkeen, kun ihon alle syöpäsoluja. Kasvain laakeri nude-hiirissä havaittiin by IVIS kuvantamisjärjestelmä (IVIS spektri, Xenogen, CA, USA) ennen uhrataan.

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 17.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, IL). Tarkempi tieto analysoitiin Pearsonin khiin neliö -testi (kaksipuolinen). Mittaustietoja analysoitiin Studentin

t

-testin tai varianssianalyysillä (ANOVA).

P

arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

LEF1 ilmentymistä ihmisen paksusuolen syövän kudoksissa ja solulinjoissa

Tässä tutkimuksessa , ensin määritetään ilmentymistä LEF1 proteiinin ihmisen paksusuolen syövän kudoksissa ja solulinjoissa käyttäen immunohistokemia. Tulokset osoittivat, että 71 106 paksusuolen kudoksiin ja 23 106 paratumours normaalin paksusuolen kudoksiin ilmaisi LEF1 proteiinia, joka osoittaa, että paksusuolen syövän kudokset ilmaistuna korkeamman tason LEF1 kuin ne, jotka paratumours normaalissa paksusuolen kudokset (

P

0,05; kuvio 1A). On selvää, LEF1 ilmentyminen havaittiin tumien paksusuolensyöpä kudosten ja paratumours normaalin paksusuolen kudoksiin (kuvio 1A). Lisäksi ilmentyminen LEF1 proteiinin liittyi tunkeutuminen syvyys, imusolmuke ja etäinen etäpesäkkeitä, ja kehittyneet TNM (tuumori-solmu-etäpesäke) vaiheissa paksusuolensyöpä (

P

0,01, taulukko 1). Selviytyminen analyysi (5-vuoden seuranta 106 paksusuolensyöpä potilasta) osoittivat, että mediaani eloonjäämisaste potilaiden kanssa LEF1 ilmaisi kasvain oli 48,5 kuukautta, mikä oli merkittävästi huonompi kuin ne, joilla LEF1-syöpäkasvain (yli 60 kuukautta) (

P

0,05; kuvio 1 B).

(A) immunohistokemia värjäys LEF1 on paratumorous paksusuolen kudokset (a) ja paksusuolen syöpä kudoksiin (bd) (asteikko bar, 25 pm): ( a) negatiivinen ilmaus, (b) heikko ilmaisu, (c) kohtalainen lauseke, (d) voimakas ilme. (B) Kaplan-Meier käyrä assosiaatiojärjestely LEF1 proteiinin ilmentymisen kanssa eloonjäämisaste potilaiden. (C) qRT-PCR: ää käytettiin havaitsemaan suhteellisen ekspressiotasot LEF1 mRNA (cc kudokset: paksusuolensyöpä kudosten normaaleissa kudoksissa: paratumorous paksusuolen kudokset). Pylväät, keskiarvo (n = 106); baaria, SD; ***

P

0,001 verrattuna paratumorous paksusuolen kudoksiin.

P

määritettiin Studentin

t

-testi. (D) Western blot analyysi LEF1 ilmaisun seitsemässä peräsuolen syövän soluja (Caco

2, Colo205, HCT116, HT29, Lovo, SW480 ja SW620). β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina.

Vastaavasti reaaliaikaisen PCR-analyysi osoitti, että tasot LEF1 mRNA lisääntyi merkittävästi näillä 106 paria paksusuolen syöpä kudoksiin verrattuna paratumours normaalin paksusuolen kudoksiin (

P

0,05; kuvio 1 C). Lisäksi LEF1 ilmentyminen oli hyvin ilmaistu koolonsyöpäsolulinjoissa SW480 ja SW620 (kuvio 1 D). Niinpä valitsimme nämä kaksi solulinjat pudotus LEF1 ilmaisun jatkotutkimuksiin.

Stable knockdovvn LEF1 ilmentymisen koolonkarsinoomasoluissa

Tutkiakseen roolin LEF1 paksusuolen syöpäsoluissa, käytimme lentiviruksesta kuljettaa LEF1 shRNA tartuttaa SW480 ja SW620 varten knockdovvn LEF1 ilmaisua. Tavoite 3 käytettiin luomaan vakaa LEF1 pudotus solulinjoja. Olemme onnistuneesti saatu vakaa LEF1 Knockdown soluja kutsutaan shLEF1 ja shNC (negatiivinen kontrolli vektori). Reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että ekspressio LEF1 mRNA inhiboitui jopa 70%: shLEF1 soluissa verrattuna shNC solut (

P

0,05; kuvio 2A). Samoin tasot LEF1 proteiinin myös tippuu alas merkittävästi shLEF1 soluissa kuin shNC soluissa (kuvio 2B).

(A) qRT-PCR-analyysi LEF1 ekspression infektion jälkeen eri LEF1 shRNA ilmaisu lentivirusvektoreita, *

P

0,05 verrattuna alkuperäiseen soluun. (B) Western blot-analyysi LEF1 proteiinin ilmentymisen. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. 1-4 (eri kohdepaikkaan vektorit) ja shNC (negatiivinen kontrolli). Tavoite 3 käytettiin luomaan vakaa LEF1 pudotus solulinjoissa.

knockdovvn LEF1 ilmaisun esti elinkelpoisuuden koolonkarsinoomasoluissa

in vitro

ja kasvainten muodostumisen ja kasvun

in vivo

Stable LEF1 shRNA transfektantteja ympättiin ja niitä kasvatettiin puromysiinin sisältävään kasvualustaan, että solujen elinkelpoisuuden arviointi. Tuloksemme osoittivat, että SW480-shLEF1 solujen ja SW620-shLEF1 solut kasvoivat paljon hitaammin kuin SW480-shNC solujen ja SW620-shNC soluissa, vastaavasti (

P

0,01, kuvio 3A). Solusyklin jakelu havaitaan virtaussytometrillä osoitti pitkittyneen ja näkyvä viiveellä G0 /G1 vaiheeseen eteneminen S vaiheeseen shLEF1 soluissa verrattuna shNC solut (

P

0,01, kuvio 3B ja 3C). Lisäksi olemme edelleen analysoinut, vähensi kasvainten solujen elinkelpoisuuden johtuu apoptoosin induktion ja totesi, että SW480 ja SW620-solujen stabiilia LEF1 shRNA transfektio oli merkitsevästi enemmän apoptoosin kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 3D ja 3E).

(A) MTT-määritys. **

P

0,01 verrattuna vastaaviin shNC soluja. (B ja C) Virtaussytometrinen solusyklin jakautuminen. Pylväät, keskiarvo (n = 3); baaria, SD; **

P

0,01 verrattuna vastaaviin shNC soluja. (D ja E) Virtaussytometrinen apoptoosimäärityksessä. Solujen spontaani apoptoosi arvioitiin virtaussytometrialla. Pylväät, keskiarvo (n = 3); baaria, SD; ***

P

0,001 kontrolliin verrattuna shNC soluja.

Lisäksi teimme nude hiiren ksenografti määrityksessä arvioimaan rooliin LEF1 Knockdown

in vivo

. Neljäkymmentä viisi päivää kasvainsolujen injektion LEF1 pudotus-ksenograftien vähensi kasvaimen kasvun verrattuna kontrolliin-shNC tuumoriksenograftien. Lisäksi

in vivo

kuvantamisen osoitti, että molemmat hiiret eivät ole havaittavissa kasvainetäispesäkkeiden kaukaisten elimiin (kuvio 4A). Keskimääräinen määriä kasvaimen massan peräisin SW480-shLEF1 solujen ja SW620-shLEF1 solut olivat paljon pienempiä kuin ne, tuumoriksenograftien peräisin SW480-shNC solujen ja SW620-shNC soluja, vastaavasti (

P

0,001 ; kuvio 4B). Kasvaimen paino osoitti myös, että pudotus on LEF1 ilmentyminen esti kasvua paksusuolen syövän soluja nude-hiirissä (kuvio 4C), koska paino kasvainten massa SW480 ja SW620-solut ilmentävät shLEF1 oli huomattavasti kevyempi kuin kontrollihiirissä. Nämä havainnot ehdottivat, että LEF1 Knockdown esti muodostumista ja kasvua tuumoriksenograftien in vivo.

(A)

vivo

kuvantaminen analyysi. Kasvainten kasvua muodostaman shLEF1 solut ja ohjaus shNC soluja nude-hiirissä kuvausaikaisilla IVIS. (B) Kasvaimen tilavuus mitattiin 3 päivän välein päivästä 9 siirrostuksen jälkeen mittaamalla kasvaimen pituus ja leveys. Pylväät, keskiarvo (n = 6); baaria, SD; ***

P

0,001 kontrolliin verrattuna shNC soluja. (C) Kasvaimen paino verrattiin päivänä 45 tuumorisolujen inokulaation jälkeen. Pylväät, keskiarvo (n = 6); baaria, SD; ***

P

0,001 kontrolliin verrattuna shNC.

knockdovvn LEF1 ilmentymisen pienentynyt invaasion koolonkarsinoomasoluissa ja MMP-2 ja MMP-9

sen jälkeen meidän määritti LEF1 knockdown sääntelystä paksusuolen syöpäsoluinvaasiota käyttäen Matrigel invaasiomääritys. Käsittelimme soluja mitomysiini C vaikutuksen eliminoimiseksi lisääntyneen proliferaation. Tulokset osoittivat, että numerot hyökkäävän SW480-shLEF1 solujen ja SW620-shLEF1 solut olivat paljon pienempiä kuin SW480-shNC solujen ja SW620-shNC solut (

P

0,01, kuvio 5A ja 5B). Lisäksi knockdovvn LEF1 ilmaisun voisi merkittävästi vähentää MMP-2 ja MMP-9-proteiinia, mutta ei MMP-7-proteiinin shLEF1 soluissa verrattuna shNC paksusuolen syövän soluja (kuvio 5C).

( A ja B) Kasvainsolulinja invaasiomääritys. Edustavia värjäys kuvia, × 200. Kvantitatiivinen analyysi tunkeutuneet kasvainsolujen välillä LEF1 Knockdown ja ohjaus soluja. Pylväät, keskiarvo (n = 3); baaria, SD; **

P

0,01 kontrolliin verrattuna shNC soluja. (C) Western blot analyysi MMP2, MMP-7: n ja MMP-9-proteiinia. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina.

knockdovvn LEF1 ilmaisun esti RBP-JK-aktiivisuuden

Toistaiseksi useat tutkimukset ovat raportoineet, että Wnt ja Notch polku yhteistoiminnallisesti kontrolloida soluproliferaatiota ja kasvainten synnyssä suolistossa [18]. Paljastaa mahdolliset yhteneviä pistettä ja selkeyttää mahdollisten mekanismi, jonka LEF1 säätelee lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen, havaitsimme ilmaus Notch intrasellulaarisen domeenin (NICD) /RBP-JK /Hes1 reitin geenit näissä koolonkarsinoomasoluissa. Emme löytäneet mitään merkittävää eroa tasojen NICD ilmentymisen koolonkarsinoomasoluissa eri hoitoja; kuitenkin, tasot RBP-JK ja Hes1 proteiinit vähennetään SW480-shLEF1 solujen ja SW620-shLEF1 soluissa verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 6A).

(A) Western blot -analyysi NICD, RBP-JK- ja Hes1 ilme. (B) Western blot-analyysi LEF1 ilmaisun jälkeen, kun hoidetaan Notch estäjä DAPT (100 uM). β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina.

julkaisemattomat tiedot osoittivat lisääntynyttä aktiivisuutta täyspitkän LEF1 promoottorin yhteydessä kotransfektoimalla NICD cDNA SW480, HepG2, HEK293, A549, ja HeLa-solut ; Näin, käytimme DAPT, estäjä Notch koulutusjakson estää NICD ilmaisun SW480 ja SW620-soluissa. Tuloksemme osoittivat, että NICD downregulation vaikuttaa ilmaus Hes1 ja LEF1 proteiineja (kuvio 6B), mikä viittaa vastavuoroinen sääntelyn välillä LEF1 ja Notch polku.

Keskustelu

Nykyisessä tutkimuksessa, ensin analysoineet ilmaus LEF1 mRNA ja proteiini paksusuolensyöpä kudosnäytteet ja sitten tutkittiin vaikutuksia LEF1 knockdown sääntelystä muuttuneita kasvainsolujen elinkelpoisuuden solusyklin jakelu, apoptoosin, ja geeniekspressioiden

in vitro

ja paljaan hiiren ksenografteja . Huomasimme, että tasot LEF1 mRNA ja proteiini lisättiin merkittävästi paksusuolensyöpä kudoksissa ja liittyy tunkeutumisen syvyys, imusolmuke ja kaukana etäpesäkkeitä ja lyhyempiä kokonaiselossaolo. LEF1 pudotus vähensi kasvainten solujen elinkykyä, invaasio kapasiteettia, ja ekspressio MMP2 ja MMP-9, mutta indusoi apoptoosia paksusuolen syöpäsoluissa. LEF1 Knockdown tukahdutti kasvaimen muodostumisen ja kasvun nude-hiirissä. Lisäksi ilmaus RBP-JK ja Hes1 pienennettiin LEF1 pudotus soluissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että LEF1 voitaisiin arvioida kohteena paksusuolen syövän ehkäisyyn ja hoitoon.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmentyminen ja aktivointi LEF1 proteiinin vaikutti syövän kehittymisen [10,13,19]. Itse asiassa nykyinen Tutkimuksessa analysoitiin ilmaus LEF1 mRNA ja proteiini paksusuolensyöpä ja paratumorous paksusuolen kudoksiin ja totesi, että LEF1 yliekspressoitui paksusuolen syövän kudoksissa. Tasot LEF1 ilmaisun liittyi tunkeutuminen syvyys, imusolmuke, ja etäinen etäpesäkkeitä, ja kehittyneet TNM vaiheissa paksusuolen syövät sekä huono yleistä eloonjäämisaste potilailla, joilla on paksusuolen syöpä. Jälkimmäinen tiedot olivat erilaisia ​​kuin ilmoittamien tietojen Kriegl, L et al [20], mutta olivat samanlaisia ​​toiseen Edellisessä tutkimuksessa [21]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että LEF1 saattaa olla hyödyllinen markkeri ennustamisessa paksusuolen syövän etenemisessä.

edelleen ymmärtää rooli LEF-1 paksusuolen syövän, me pudotti LEF1 ilmentymistä kahdessa koolonsyöpäsolulinjaa, SW480 ja SW620. Olemme edelleen tutkia roolia LEF1 kasvuun paksusuolensyöpä. Solusyklin disorganization määriteltiin induktorina jotka johtavat hallitsemattomaan soluproliferaatioon ja syövän etenemistä seurasi tumorigeneesin esimerkiksi Shtutman ym tunnistettu että sykliini D1 oli yksi β-kateniinin /LEF1 kompleksi kohdegeenien [22], joka oli vastuussa for kasvainsoluproliferaation ja syövän etenemiseen. Tämän mukaisesti tutkimuksessa, nykyinen tiedot osoittivat, että downregulation LEF1 esti merkittävästi paksusuolensyöpä soluproliferaatiota

in vitro

lisäämällä osa-G1 apoptoottisia väestö, pitkittää G0 /G1 vaiheeseen, ja vähentämällä G2 /S vaihe LEF1-tippuu alas SW480 ja SW620-solujen

in vitro

ja nude mouse ksenografteissa, mikä vahvisti kaksi muuta aiemmissa tutkimuksissa ihmisen kohdun limakalvon ja paksusuolen syöpiin [9,23].

Lisäksi nykyinen tutkimus osoitti, että LEF1 yli-ilmentymisen ensisijaisen CRC kudoksissa liittyy etäpesäkkeiden CRC potilaiden, joka on yhdenmukainen useiden aiempien tutkimusten joka osoittaa, että LEF1 luonnehdittiin biomarkkerina paksusuolen syövän etäpesäkkeitä maksaan [21]. Itse asiassa nykyinen

in vitro

tiedot vahvistivat, että knockdovvn LEF1 ilmaisun esti hyökkäyksen kykyä SW480 ja SW620-soluissa verrattuna ohjaus shRNA-transfektoiduissa soluissa. Molekyylitasolla, MMP2, MMP7 ja MMP-9 liittyy solujen vaeltamiseen prosessi, vaikuttamalla syövän kehittymisen ja etenemisen [24,25]. Olemme havainneet, että pudotus on LEF1 ilmaisun tukahdutetaan MMP2 ja MMP-9: ilmaisu, mutta ei MMP-7, joka osoittaa, että selektiivinen modulaatio MMP mukaan LEF1 voi olla biologinen merkitys paksusuolen syövän etenemisessä. Sen sijaan LEF1 pystyi säätelemään MMP-7 ilmentymisen ja aktiivisuuden rintasyövän soluissa [26], kun taas toinen edellinen tutkimus osoitti, että liikkeessä olevat MMP-2 ja MMP-9 voitaisiin käyttää mahdollisesti luokitella potilaita alhainen riski, korkea riski, hyvänlaatuinen sairaus, ja rintasyövän [24]. Kuitenkin myös nude-hiiren ksenografti-määritys ei ilmennyt mitään kasvaimen etäpesäke sekä LEF-1 pudotus ja valvonta tuumoriksenograftien; Näin ollen lisätutkimuksia tarvitaan selvästi.

Lisäksi Notch reitti on usein aktivoidaan eri ihmisen syöpien, kuten aivo-, maitorauhaset, kohdunkaula, keuhkojen, pään ja kaulan, paksusuolen, munuaisten, haima, ja akuuttia myelooista [27,28]. Esto Notch reitin aiheuttamaa syöpäsolujen apoptoosin ja vähentää kasvainsoluproliferaation kolorektaalisyövässä [29]. Tuore julkaisu osoitti, että Wnt polku pystyi säätelemään Notch polku [30]. Ylikuulumisongelman välillä Notch ja Wnt reitit voidaan osittain välittyy erityissääntelyä GSK-3β-riippuvainen Notch fosforylaatiota. Fosforylaatio Notch proteiinien on epäsuorasti korreloi Notch aktivointi ja tumaansiirtymiseen sekä solujen transformaatio. Lisäksi, Jagged1, yksi Notch ligandeja, voidaan aktivoida p-kateniinin aikana ektooppisen karvatupen muodostumista aikuisten orvaskeden [31].