Krooninen sairaus

tiivistelmä

KRAS

esikasvaintekijän on keskeinen rooli kehitettäessä monien ihmisten kasvaimia ja yleisesti aktivoidaan somaattisen mutaation tai signalointi erityisillä kasvutekijän reseptoreita. Kuitenkin vuorovaikutus mikro-ympäristö ja K-ras-aktiivisuus ei ole määritelty. Hypoksia poikkeuksetta kehittyy kasvaimia outgrow niiden hapensaantia. Sarja hyvin organisoidusta solu mukauttaminen tapahtuu jotka stimuloivat angiogeneesiä ja pelastamiseksi kasvaimen hypoksinen olosuhteissa. Meidän aikaisemmat tutkimukset osoittivat, että mutantti

KRAS

alleelit voivat olla vuorovaikutuksessa hypoksia aiheuttaa verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) on paksusuolen syöpä. Olemme pyrkineet onko vastaavia hypoksinen vastaukset ovat läsnä myös kasvaimissa ilman

KRAS

mutaatio. Hypoksia jatkuvasti nostivat aktivoitu, GTP-sitoutunut K-ras paksusuolen syövän solulinjoissa villityypin

KRAS

-geenin, ja tämä riippui aktivoinnin c-Src. Esto c-Src by PP2 hoitoon tai siRNA Knockdown estänyt hypoksinen aktivointi K-ras. Tämä aktivointi K-ras ei riipu EGFR ja johti fosforylaation Akt ja induktion VEGF-ilmentymisen. Lisäksi aktivointi K-ras merkittävästi estetty apoptoosin hypoksisissa olosuhteissa. Nämä tutkimukset paljastavat ainutlaatuisen mukautuva mekanismi hypoksia, joka aktivoi K-ras-signaloinnin puuttuessa mutantin

KRAS

onkogeeni.

Citation: Zeng M, Kikuchi H, Pino MS, Chung DC ( 2010) Hypoksia Aktivoi K-Ras esikasvaintekijän stimulointiin Angiogeneesi ja esto apoptoosi koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 5 (6): e10966. doi: 10,1371 /journal.pone.0010966

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 27 huhtikuu 2010; Hyväksytty: 12 toukokuu 2010; Julkaistu 4. kesäkuuta 2010

Copyright: © 2010 Zeng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat National Institutes of Health avustuksen CA92594; Kate J. ja Dorothy L. Clapp Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kehitys kudoshypoksia on luonteenomaisesti havaitaan pahanlaatuisia kasvaimia nopeasti kasvaa kooltaan. Tällaiset hypoksisissa olosuhteissa on selektiivisiä painetta syöpäsoluja, ja kyky kasvainsolujen selviytyä hypoksinen mikroympäristön on liitetty huonoon ennusteeseen ja kestävyys hoito [1]. Yksi kriittinen ja parhaiten karakterisoitu vastauksia hypoksia on induktio verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF), ja hypoksia-indusoituva factor-1 (HIF-1) on vakiintunut välittäjänä tässä prosessissa. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että HIF-riippumattomien mekanismien voi myös aiheuttaa VEGF hypoksia, ja onkogeeninen K-ras avainasemassa tässä prosessissa [2], [3], [4].

K- ras on pieni GTPaasina joka jakson välissä aktiivinen guanosiinidifosfaatti (BKT) -bound ja aktiivinen guanosiinitrifosfaatin (GTP) -bound konformaatioita (Ras-BKT ja Ras-GTP, vastaavasti) [5]. Se toimii signaalinvaihtokytkimen molekyyli, joka parit aktivaatiota erityisten kasvutekijöiden kanssa alavirtavaikuttajainhibiittorit polkuja lukien Ras-MEK-ERK ja fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) -Akt kaskadeja, jotka kontrolloivat useita soluvasteita. Onkogeeninen mutaatiot

KRAS

heikentää kykyä K-Ras hydrolysoitua sidottua GTP vuonna kasvutekijä-riippumattomalla tavalla, ja perustava signalointi näiden efek- reittejä tuloksia. Kasvaimen mikroympäris- voi olla syvällinen vaikutus solujen käyttäytymiseen, ja hypoksia on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa monien onkogeenista signalointireittejä. Erityisesti, hypoksinen aktivointi PI3K-Akt, MEK-ERK, NF-KB: n, ja hypoksia-indusoituva tekijä (HIF) signalointireiteissä on kuvattu [6], [7]. Vaikka K-ras on keskeinen säädin kaikissa näissä reittejä, ei tiedetä, K-ras itse nimenomaan aktivoidaan hypoksia. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet voimakkaan synergistisen vuorovaikutuksen hypoksia ja mutantti K-ras säätelyyn useiden kohdegeenien lukien verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), IL-8, ja osteopontiinissa [2], [8], [9]. Kuitenkin alle 50% paksusuolen kasvaimista satama

KRAS

mutaatioita, ja suhde Ras signalointi ja hypoksia kasvaimissa villiin

KRAS

määrittelemätön.

pyrittiin määrittämään roolia K-ras on hypoksinen mikro-ympäristö paksusuolensyöpä, kasvain tyyppi, joka usein satamat

KRAS

mutaatioita. Villityypin K-ras voimakkaasti aktivoitu hypoksia, ja c-Src oli välttämätöntä tämän hypoksinen aktivaation K-ras. Tämä johti fosforylaation Akt ja induktion VEGF-ilmentymisen. Lisäksi, hypoksinen aktivaatio villityypin K-ras estetty apoptoosin. Yhdessä nämä havainnot korostavat uuden mekanismin hypoksia aktivointia onkogeenisten eloonjäämisreittejä puuttuessa onkogeenisessä mutaation.

Tulokset

Hypoxic aktivointi K-Ras in koolonkarsinoomasoluissa

Voit selvittää hypoksia aktivoi Ras mittasimme GTP-sidottu Ras in normoxic ja hypoksinen olosuhteet paneelia koolonsyöpäsolulinjaa. Tasot GTP-sitoutuneen Ras olivat tuskin havaittavissa Caco2, HT29, Colo320DM ja Colo205 soluja normoxic olosuhteissa (Fig. 1A). Kaikki nämä linjat ovat villin tyypin

KRAS

geeni. Kuitenkin, kun näitä soluja inkuboitiin hypoksisissa olosuhteissa (1% O

2), oli dramaattinen kasvu (3-6,8 kertainen) tasot aktivoitua Ras (Fig. 1A). Sen sijaan, pohjapinta toimintaa Ras DLD1, HCT116 (molemmat heterotsygoottinen

KRAS

D13

mutaatio), ja SW480 (homotsygoottinen

KRAS

V12

mutaatio) solut normoksia olivat korkeat, ja ei ollut lisääntyminen myöhemmin hypoksian (Fig. 1A, oikea paneeli). SW480-solut oli vahvin tasot Ras aktivoinnin normoxic olosuhteissa. Hypoksia on siten voimakas aktivaattori Ras paksusuolen syöpäsoluja, mutta tämä induktio havaittiin vain niissä soluissa, joissa on villityypin

KRAS

geenin.

tasot GTP: hen sitoutuneen Ras ( A) ja GTP-sidottu K-ras (B) arvioitiin villityypin (vasen paneeli) ja mutantti (oikea paneeli)

KRAS

solulinjoja kasvatetaan joko normoxic (N) tai hypoksinen (H) olosuhteet 4 tuntia. Kaksi milligrammaa solu-uutteita käytettiin Ras aktivaatiomääritys, jota seurasi Western-blottaus, jossa mainituilla vasta-aineilla. Densitometria arvot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna kontrolliarvoihin normalisoitu 1. C, Caco2-soluja viljeltiin DMEM: ssä, jonka pH säädettiin arvoon 7,5 tai 6,5: ssa 4 tuntia. Solulysaatit käytetä Ras aktivaatiomääritys seurasi Western-blottaus, jossa on Ras-GTP spesifistä vasta-ainetta. Densitometria arvot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna kontrolliarvoihin normalisoitu 1.

Jos haluat varmistaa, että K-ras-isoformin aktivoitiin hypoksia, K-ras spesifistä vasta-ainetta käytettiin. Kuten kuvassa 1B tasoja GTP sitoutuneen-K-ras indusoitiin hypoksia koolonkarsinoomasoluissa villin tyypin

KRAS

(Caco2, HT29) taas ei tapahtunut muutoksia solulinjoissa mutantti

KRAS

onkogeeni (DLD1, HCT116, SW480). Rooli N-ras apoptoosin säätelyyn on ehdotettu paksusuolensyöpä, mutta N-ras spesifistä vasta-ainetta ei havainnut GTP-sitoutunut-N-ras Caco2, DLD1, ja HCT116 solulinjoissa joko normoxic tai hypoksinen olosuhteet (Fig. S1) [10].

Kasvain hypoksia usein mukana on kytkin anaerobinen Glykolyysivaiheen ja alempi pH, joten tutkimme onko hypoksinen sääntely Ras aktiivisuuden välittämä muuttamalla pH. Inkubointi Caco2 solujen happamissa olosuhteissa (pH 6,5) 4 tuntia ei lisätä toiminnan Ras, viittaa siihen, että pH-muutokset eivät säädellä tasoa GTP: hen sitoutuneen Ras (Fig. 1 C).

lisääntymisen merkkejä Ras aktiivisuus hypoksia vaatii c-Src

c-Src sijaitsee ylävirtaan K-ras, ja seuraavan kerran pyrittiin tutkimaan, onko c-Src aktivoituu myös hypoksian. Aika-riippuvainen aktivaatio c-Src, mitattuna fosforylaatio on Tyr

416, havaittiin sekä Caco2 ja HT29-solujen inkuboinnin jälkeen hypoksisissa olosuhteissa (Fig. 2A). Sen määrittämiseksi, onko c-Src-vaikutuksen osaltaan aktivointi Ras hypoksian, esikäsittelimme Caco2 solujen PP2, on voimakas ja selektiivinen Src-tyrosiinikinaasin estäjä. 50% vähennys hypoksinen induktio Ras havaittiin Caco2 soluissa, kun taas ei ollut vaikutusta veren kokonaiskolesterolia Ras (Fig. 2B, vasen paneeli). Tämä vaikutus oli annoksesta riippuva, ​​ja maksimaalinen vaikutus nähdään 20 uM (tuloksia ei ole esitetty).

A, Caco2 ja HT29-soluja inkuboitiin hypoksinen edellytykset ilmoitettu ajat, ja Western blotting ja fosfo-Src

416 ja koko Src suoritettiin. β-aktiini vahvisti yhtä suuri kuormitus. Densitometria arvot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna kontrolliarvoihin normalisoitu 1. B Caco2 solut esikäsiteltiin Src-estäjän PP2 (20 uM) tai DMSO: ssa 1 tunti (vasen paneeli), tai transfektoitu tilapäisesti c-Src erityisiä siRNA konstruktioita tai ei kohdistaminen ohjaus (oikea paneeli), ennen inkubaatiota hypoksinen tai happiolosuhteissa 4 tuntia. Aktivoitu Ras purettiin ja SDS-PAGE suoritettiin käyttäen Ras-GTP spesifistä vasta-ainetta. Yhteensä Ras vahvisti yhtä suuri kuormitus. Densitometria arvot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna kontrolliarvoihin normalisoitu 1. C lysaatteja Caco2pEVX ja Caco2SrcY527F solut immunovärjättiin p-Src

416 ja koko Src ja käytetään myös Ras aktivaatiomääritys. Densitometria arvot Ras-GTP ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna kontrolliarvoihin normalisoitu 1. D, vasen paneeli, valvonta soluja ja soluja esikäsitellään NAC (20 mmol) 20 minuutin altistettiin 10 minuuttia H

2O

2 (5 mM). Lysaatit Sitten immunoblotattiin p-Src

416 ja koko Src. β-aktiini vahvisti yhtä suuri kuormitus. Keskimmäinen ja oikeanpuoleinen paneeli, valvonta Caco2 soluja ja soluja esikäsitellään NAC (20 mM) 1 tunnin inkuboitiin hypoksia 4 tuntia. Western blotting for fosfo-Src

416 (keskimmäinen paneeli) ja Ras aktivoiva määritys (oikea paneeli) jälkeen suoritettiin. Densitometria arvot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna kontrolliarvoihin normalisoitu 1. E, lysaatit valvonnan Caco2 soluja ja soluja inkuboitiin hypoksia varten ilmoitettu ajat alistettiin Western blotting havaita p-EGFR (Tyr

1068) ja yhteensä EGFR-proteiinin tasoja. Käsittely EGF (100 ng /ml) toimi positiivisena kontrollina.

suoremmin roolin arvioimiseksi c- Src, me pudotti endogeenisen c- Src in Caco2 soluihin RNA-interferenssi. Knock-down c-Src johti 33%: n vähennys hypoksia aktivointi GTP-sitoutuneen Ras (Fig. 2B, oikea paneeli). Lisäksi Caco2-solut ilmentävät konstitutiivisesti aktiivinen c-Src-vektoriin (SrcY527F) osoitti 70%: n nousu tason GTP: hen sitoutuneen Ras (Fig. 2C) verrattuna tyhjällä vektorilla (pEVX). Western blotting tarkasti K-ras-isoformin aktivoitiin ilmentymisen Src (Fig. S2).

reaktiivisen hapen (ROS) tuottamat hypoksia on aiemmin osoitettu aktivoivan Src. Ulkoisten hallinnon H

2O

2 (5 mM) voimakkaasti indusoi fosforylaatiota Src at Tyr

416 Caco2 soluissa (kuvio. 2D, vasen paneeli). Tämä vaikutus heikkeni huomattavasti NAC (20 mM), antioksidantti, joka estää ROS. Sitten pyrittiin määrittämään, onko NAC voi estää hypoksinen aktivointi endogeenisen Src ja Ras. NAC hoito vähensi induktion p-Src

416 hypoksia noin 30% ja samanaikaisesti 17%: n vähennys GTP: hen sitoutuneen Ras (Fig. 2D). Nämä havainnot viittaavat siihen, että sukupolven ROS voi osittain myötävaikuttaa hypoksinen aktivoinnin c-Src in koolonkarsinoomasoluissa.

Viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että hypoksia voivat lisätä tasoja EGFR ja että fosforylaatio EGFR voi olla välivaihe että signalointi Src Ras [11], [12]. Voit selvittää EGFR voi pelata tällaisen tehtävän, mittasimme koko EGFR ja fosfo-EGFR tasot Caco2 soluja inkuboitiin hypoksia. Siellä oli pieni lisäys yhteensä EGFR hypoksia. Kuitenkin, ei ollut kasvua EGFR fosforylaation Tyr

1068 (Kuva. 2E). Kaiken kaikkiaan tiedot viittaavat siihen, että säätely ylöspäin c-Src-vaikutuksen hypoksia välittyy osittain kautta ROS mutta aktivointi K-Ras c-Src in hypoksia ei riipu EGFR.

aktivointi Akt hypoksia on alavirtaan c-Src ja K-ras

vieressä pyrittiin määrittämään mikä alavirtavaikuttajainhibiittorit reittejä aktivoitiin c-Src ja K-ras hypoksia. Altistuminen hypoksisissa olosuhteissa indusoimaa fosforylaatiota Akt Ser

473 sekä Caco2 ja HT29-soluja, kun taas mitään aktivointi ERK havaittiin samoissa olosuhteissa (Fig. 3A). Akt aktivoitiin ajasta riippuva tavalla ja saavutti huipputason 12 tunnin ajan. Sen määrittämiseksi, onko Src oli mukana hypoksinen aktivointi Akt, esikäsittelimme Caco2 solujen erityisten Src-estäjällä PP2 12 tuntia ennen altistusta hypoksia. Kuten kuviossa 3B on esitetty, hypoksia aktivointi Akt väheni PP2 hoito annoksesta riippuvalla tavalla. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen kaataa c-Src myös täysin tukossa hypoksia aktivointi Akt verrattuna soluihin transfektoitu ohjaus siRNA (Fig. 3C).

, Proteiiniekstraktit Caco2 ja HT29 kasvatettu in normoxic tai hypoksinen olosuhteet ilmoitettu aikoja tehtiin immunoblottaus varten fosfo-Akt ja fosfo-ERK1 /2. Jälkeen blotit stripattiin ja uudelleenseulottiin vasta-aineiden koko Akt ja yhteensä ERK. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Densitometria arvot p-Akt ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna kontrolliarvoihin normalisoitu 1. B, Caco2-soluja inkuboitiin 1 tunnin PP2 annettuina pitoisuuksina, ennen siirtoa normoxic tai hypoksisissa olosuhteissa 12 tuntia. Western blottaus suoritettiin määrittämään tasojen fosfo-Akt yhteensä Akt, fosfori-Src

416, ja yhteensä Src. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Densitometria arvot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna kontrolliarvoihin normalisoitu 1. C, Caco2-solut transfektoitiin ohjaus siRNA, K-ras siRNA tai c-Src siRNA oligoja (kukin 20 nM) ennen altistusta normoxic (N) tai hypoksinen (H) olosuhteissa 12 tunnin ajan. Immunoblottaus mainituilla vasta-aineilla suoritettiin sitten. Densitometria arvot p-Akt ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna kontrolliarvoihin normalisoitu 1. D, Caco2 solut stabiilisti yli-ilmentävät K-rasV12 (Caco2pCSGWK-ras V12) transfektoitiin c-Src siRNA oligoja. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin solut inkuboitiin hypoksia tai normoksia 12 tuntia ja Western-blottauksella mainituilla vasta-aineilla suoritettiin sitten. Densitometria arvot p-AKT ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna kontrolliarvoihin normalisoitu 1.

Koska Akt tiedetään olevan alavirtaan K-ras, testasimme Akt on myös erityinen tavoite K-ras hypoksisissa olosuhteissa hyödyntämällä K-ras siRNA oligoja. Hiljentäminen K-ras vähensivät Akt hypoksia verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu ohjaus siRNA (Fig. 3C). Nämä tiedot osoittavat, että hypoksinen aktivaatio Akt välittyy sekä Src ja K-ras. Ei muutoksia fosfo-Src

416 ja yhteensä Src-proteiinin tasoja on havaittu, kun K-ras oli vaimennettu (Fig. 3C), mikä osoittaa, että Src on todellakin ylävirtaan K-ras tässä hypoksinen signalointireitin.

Jotta itsenäisesti tarkistaa, että K-ras oli alavirtaan Src tässä hypoksian indusoiman fosforylaation Akt teimme kokeiluja Caco2 solulinjassa stabiilisti ilmentävät mutantti onkogeeni

KRAS

V12

(Caco2 /pCSGWK- rasV12). Hypoksia induktio p-Akt ei estänyt hiljentäminen c-Src siRNA (Fig. 3d). Nämä havainnot osoittavat, että c-Src tehtävät ylävirtaan K-ras hypoksia aktivointi Akt.

K-ras ja Src välittävät resistenssiä apoptoosin hypoksia

Akt on keskeinen rooli säätelyssä apoptoosin ja solusyklin etenemisen. Koska Akt on alavirtaan tavoite K-ras tässä hypoksia laukaisema solunsisäisen signalointireitin, etsimme onko hiljentäminen K-ras vaikuttaisi solujen eloonjäämistä. Knock-down K-ras laski solujen elinkelpoisuus jopa happiolosuhteissa 20% vuonna HCT116-soluissa, mutta ei ollut merkittäviä muutoksia DLD1 tai Caco2 soluja. Sen sijaan K-ras pudotus in hypoksinen olosuhteissa vähennetään solumäärät paljon suuremmassa määrin: 40% vähennys HCT116 (

P

0,05) ja 50% vähennykset DLD1 ja Caco2 solut (

P

0,01) havaittiin (Fig. 4A). Hiljentäminen K-ras Caco2 soluissa johti eloonjääntiaste hypoksia verrattavissa DLD1 ja HCT116-solut, jotka satama mutantti

KRAS

geeni, mikä viittaa siihen, että villityypin K-ras-proteiini on myös tärkeä rooli mukautuva mekanismi hypoksian.

, DLD1, HCT116 ja Caco2 solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai K-ras siRNA, ja sitten inkuboitiin hypoksia 48 tuntia. Solumäärät määritettiin käyttäen hemasytometriä värjäyksen jälkeen trypaanisinisellä ja tulokset ilmaistaan ​​prosentteina elävien solujen verrattuna siRNA-ohjaus transfektoitujen solujen normoksia. Tiedot ovat kolmen erillisen kokeen ja esitetään keskiarvona ± SD. *, P 0,05; **, P 0,01. B, Colo320DM soluja kasvatettiin steriileillä peitinlaseilla transfektoitiin siRNA ohjaus oligojen (esitetty ylä- riveillä) tai siRNA oligoja K-ras (esitetty alariveihin) 24 tuntia, jonka jälkeen inkuboitiin hypoksia 48 tuntia. Varhainen apoptoottinen (FITC + PI) ja myöhäinen apoptoottiset /nekroottisia soluja (FITC + PI +) havaittiin. Vasen paneeli: 20x vaihekontrasti ja 20x fluoresenssi vihreä ja punainen kanava yhdistyivät kuvia. Oikea paneelit: 20x ja 40x fluoresenssi vihreä ja punainen kanava yhdistyivät kuvia. C, Caco2-solut transfektoitiin K-ras siRNA tai valvoa siRNA, ja sitten niitä inkuboitiin normoksia tai hypoksia 48 tuntia. Solukuolemaa määritettiin FACS, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. D, Early apoptoottiset (anneksiini V + PI) ja myöhäiset apoptoottiset /nekroottinen (anneksiini V + PI +) solut määritettiin FACS-analyysillä. Keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *, P 0,05. **, P 0,01. E, DLD1, HCT116 ja Caco2-solut transfektoitiin ohjaus siRNA tai c-Src siRNA oligoja (20 nM) 24 tunnin ajan ja altistettiin sitten hypoksialle 48 tuntia. Soluja ilman trypaanisinistä, laskettiin ja tulokset ilmaistaan ​​prosentteina elävien solujen verrattuna siRNA-ohjaus transfektoitujen solujen normoksia. Keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. *, P 0,05. **, P 0,01.

Sen jälkeen leimatut solut FITC-konjugoidulla anneksiini-V: n ja propidiumjodidi (PI) mitataan hinnat apoptoosin. Toinen villityypin

KRAS

solulinja, Colo320DM, tutkittiin koska sen kasvumalli yksittäisinä soluina sallii visualisointi apoptoottisten kalvo muuttuu selvemmin. Hiljentäminen K-ras johti muutoksiin solujen morfologia, mukaan lukien kupliminen, kutistuminen, ja ydinvoiman pirstoutuminen, sekä vähennetään kiinnitys kudosviljelymaljassa ja lisääntynyt kelluva. Hiljentäminen K-ras myös lisänneet anneksiini V-positiivisten solujen verrattuna ohjaus siRNA (Fig. 4B). Määrittää anti-apoptoottisen vaikutusten K-ras hypoksia, analysoitiin apoptoottisten solujen populaatiot virtaussytometrialla (FACS). Caco2-solut transfektoitiin joko ei kohdistettu ohjaus- tai K-ras siRNA oligoja inkuboitiin normoksia tai hypoksia 48 tuntia. Soluja ilman mitään käsittelyä toimi negatiivisena kontrollina, ja solut altistetaan UV-valolle 10 minuuttia, ja viljeltiin TNF-α ja Sykloheksimidi (CHX) toimi positiivisena kontrollina (Fig. 4C, vasen paneeli). Histogrammi anneksiini V-FITC positiivisten solujen paljasti, että knock-down K-ras normoksia ei muuttanut merkitsevästi hinnat apoptoosin. Kuitenkin hypoksisissa olosuhteissa, menetys K-ras merkittävästi noussut solukuoleman 22%: sta 57% verrattuna ohjaus siRNA hoitoon (Fig. 4C, keskimmäinen ja oikea paneeli). Olemme edelleen analysoitiin apoptoottisten solujen kahtena eläinryhmät: varhainen apoptoottisia soluja (anneksiini V +, PI-) ja myöhäinen apoptoottiset /nekroottisia soluja (anneksiini V +, PI +). Vasta kun K-ras oli tippuu alas hypoksisissa olosuhteissa oli merkittävä apoptoosin induktio havaitaan FACS-analyysillä; oli 1,3-kertainen määrä alussa apoptoottisten solujen (

P

0,05) ja 2,0-kertainen lisääntyminen myöhään apoptoottisten solujen (

P

0,01) verrattuna ohjata siRNA hypoksian (Fig. 4D). Nämä tutkimukset osoittavat, että K-ras voi estää apoptoosia hypoksian.

tiedot osoittivat, että Src voi myös säädellä eloonjäämisreittejä jotka estävät apoptoosin hypoksia. Me määritelty suhde Src ja solujen eloonjäämistä suoraan laskemalla elävät solut että ulkopuolelle trypansininen. Knock-down Src in DLD1 ja HCT116-solut eivät muuttaneet solujen selviytymistä normoksia (1% ja 9% vähennykset solumäärät, vastaavasti), kun taas hypoksia, solumäärät laski 36% ja 45%, tässä järjestyksessä (Kuva. 4E ). Samoin knockdown c-Src in Caco2 soluissa vähennetään solumäärä 20% vuonna normoksia verrattuna merkittävämmän 58% vähennys hypoksia. Siksi aktivointi K-ras tai Src hypoksisissa olosuhteissa parantaa selviytymisen koolonkarsinoomasoluissa.

Hypoxic sääntelyä VEGF K-ras

Hypoksia on myös voimakas kannustin angiogeneesin kautta induktion VEGF. Olemme aiemmin osoittaneet, että hypoksia ja onkogeeniset K-ras voi synergistisesti säätää ylös VEGF [2]. Vaikka tällaiset tutkimukset antavat arvokasta oivalluksia kasvaimia synnyttävän K-ras-toiminto, ne eivät tarjoa oivalluksia mekanismeja koolonkarsinoomasoluissa kanssa villityypin

KRAS

voi käyttää. Siksi esti endogeenisen villityypin

KRAS

in Caco2 solujen siRNA oligoilla määritellä suhde K-ras aktivointi ja VEGF tuotantoa. Vuonna Caco2 transfektoiduissa soluissa ohjaus siRNA, hypoksia lisääntynyt VEGF-mRNA-tasoja 4.9-kertaiseksi. Knockdown K-ras pienensi VEGF mRNA: n ilmentymisen 60% ja 76% vuonna normoxic ja hypoksinen olosuhteet vastaavasti verrattuna soluihin transfektoitu ohjaus siRNA (Kuva. 5A). Me seuraavaksi käytettiin VEGF-promoottori reportteri-konstrukti (kuvio. 5B). Hypoksinen olosuhteet aiheuttama VEGF-promoottorin aktiivisuutta 2,2 kertaiseksi. Vastaa meidän qRT-PCR-tuloksiin, hiljentäminen K-ras dramaattisesti vähentänyt hypoksinen induktion VEGF-promoottorin aktiivisuutta 72%. Normaaleissa happiolosuhteissa, oli 38% pienempi VEGF-promoottorin toimintaa sen jälkeen, K-ras hiljentäminen. Tämä lasku VEGF-promoottorin aktiivisuus korreloi havaitut muutokset K-ras aktivointia. Lopuksi ELISA määritys osoitti, että erittyvä VEGF-proteiinin tasot olivat sääteli 2,6-kertainen hypoksia. Knockdown Villityypin

KRAS

vuonna Caco2 soluissa laski VEGF-proteiinin tasot vain 8% normoksia mutta vähensi VEGF-proteiinin tasot lisää merkittävästi hypoksian 51% (Kuva. 5C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että villityypin

KRAS

geeni on myös tärkeä säätelijä VEGF: hypoksisissa olosuhteissa.

A, suhteellinen mRNA-tasoja VEGF, kuten arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR: ään, Caco2 solut transfektoitu K-ras-spesifisiä siRNA rakentaa tai ei kohdistaminen ohjaus ja alttiina normoksia tai hypoksia. Tiedot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna siRNA-ohjaus solujen normoksia, normalisoitu 1. Sarakkeet, keskimäärin vähintään kolmen kokeen; baareja, SEM. *, P 0,05 verrattuna kontrollisoluihin. B, Caco2-solut transfektoitiin lyhytaikaisesti joko siRNA suunnattu endogeenisen K-ras tai ei kohdistuksen ohjaus siRNA. 24 tunnin kuluttua, joka on 2,3 kb VEGF-lusiferaasireportteri konstrukti oli ko-transfektoitiin PRL-CMV ja soluja inkuboitiin normoksia tai hypoksia vielä 24 tunnin ajan. Tiedot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna siRNA-ohjaus solujen normoksia, normalisoitu 1. Sarakkeet, keskimäärin vähintään kolmen kokeen; baareja, SEM. *, P 0,05 verrattuna kontrollisoluihin. C, supernatantti soluista (A) otettiin talteen, ja ELISA-VEGF suoritettiin. Tiedot ilmaistaan ​​kertainen muutos verrattuna siRNA-ohjaus solujen normoksia, normalisoitu 1. Sarakkeet, keskimäärin vähintään kolmen kokeen; baareja, SEM. *, P 0,05 kontrolliin verrattuna soluihin.

Hypoxic induktion VEGF on myös Src riippuvainen

Vaikka edellinen todisteet ovat osoittaneet, että c-Src signaalintransduktioreitteihin voi säädellä VEGF ilmaisu, suhde aktivaation Src hypoksia ja tuotannon VEGF koolontuumorisolut ei ole vielä selvitetty. Sen sijaan yli-ilmentävät v-Src, me esti endogeenisen c-Src kanssa PP2. PP2 hoito 24 tuntia Caco2 soluissa vaimennetaan VEGF-mRNA-tasoja 87% vuonna hypoksia verrattuna 60%: n lasku normoksia (Fig. 6A). PP2 tukahdutti myös VEGF-promoottorin aktiivisuutta 85% hypoksia verrattuna 50%: n vähennys normoksia (Fig. 6B).

A ja C, suhteellinen mRNA-tasoja VEGF, kuten arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR: ään, Caco2 ja HT29 esikäsiteltiin 10 uM PP2 (A) tai transfektoitiin ohimenevästi Src-spesifisen siRNA-konstrukti (C), ja altistettiin normoksia tai hypoksia 24 tuntia. Tiedot ilmaistaan ​​kertainen muutos kontrollisoluihin verrattuna normaaleissa happiolosuhteissa, normalisoitiin 1 *, P 0,05. B ja D, VEGF lusiferaasireportteri- määrityksiä Caco2 ja HT29-soluja, esikäsitellään 10 uM PP2 (B) tai transfektoitiin ohimenevästi Src-spesifisen siRNA-konstrukti (D), ja altistettiin normoksia tai hypoksia 24 tuntia. Tulokset ovat kolmesta itsenäisestä kokeesta suoritettiin kahtena sekä esitetty kertainen muutos verrattuna kontrolli solujen normoksia normalisoidaan 1. Data näytetään keskimääräisenä ± SD. *, P 0,05. **, P 0,01.

Voit tarkistaa erityistä roolia c-Src in hypoksia induktion VEGF, käytimme Src siRNA oligojen. Tämän lähestymistavan, mRNA VEGF pysyivät muuttumattomina happiolosuhteissa mutta pienentää 39% hypoksian (Fig. 6C), ja VEGF-promoottorin aktiivisuus laski 56% verrattuna 33%: n lasku normoksia (Fig. 6D). Vahvista tämä vaikutus ei ollut ainutlaatuinen Caco2 soluihin, HT29 analysoitiin myös. Käsittely PP2 tai Src siRNA oligoja in HT29 alle happiolosuhteissa oli vähäinen vaikutus VEGF mRNA tai promoottorin aktiivisuutta. Sen sijaan hypoksisissa olosuhteissa, PP2 tukahdutti VEGF mRNA-tasoja ja promoottorin aktiivisuutta 67% ja 53%, tässä järjestyksessä (Kuva. 6A ja 6B, oikea paneeli); vastaavasti c-Src siRNA oligoja vähensi VEGF-mRNA-tasoja ja promoottorin aktiivisuutta 37% ja 76% vuonna hypoksian, vastaavasti (Fig. 6C ja 6D, oikea paneeli). Yhdessä nämä tulokset myös syytöstä c-Src kriittisenä säätelijänä VEGF hypoksian.

Keskustelu

Hypoksia on väistämätön seuraus kasvaimen nopeasta kasvusta että ylittää nykyiset verenkiertoa. Huolellisesti organisoidusta joukko sopeutumisreaktiot varmistaa selviytyminen kasvainsolun näissä hypoksinen olosuhteissa. HIF-1 transkriptiotekijä tiedetään olevan rooli tässä hypoksinen vastauksena [13], [14], [15]. Olemme pyrkineet onko muita kasvaimia synnyttävän reittejä voidaan parantaa näitä sopeutumisreaktiot. Paksusuolen syöpä, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet synergistisen vuorovaikutuksen

KRAS

mutaatioiden ja hypoksiaa säätelyssä useiden geenien mukaan lukien VEGF [2], [8], [9]. Kuitenkin

KRAS

mutaatiot tunnistetaan alle puolet kaikista paksusuolen syövistä, ja rooli villityypin

KRAS

on hypoksinen vastaus on epävarmempaa. Tietääksemme tämä on ensimmäinen osoitus siitä, että hypoksinen aktivointi K-ras paksusuolen syövän.

tulokset osoittavat, että hypoksia on voimakas aktivaattori villityypin K-Ras paksusuolen syöpäsoluissa. Aktivointi K-ras johti loppupään aktivointi Akt, induktion VEGF, ja apoptoosin inhibitioon. Nämä vaikutukset angiogeneesiin sekä apoptoosin ovat kriittisiä kasvain hengissä olosuhteissa jatkuvan hypoksian. Rekrytointi Akt-reitti on yhdenmukaista aikaisempien raporttien hypoksinen signaloinnin mutantti K-ras säätelyssä OPN geenin ilmentymisen [9]. K-ras voi aktivoida hypoksia-indusoituva factor-1 (HIF-1) kautta, proteiinin fosforylaation, ja jotkut havaitut vaikutukset induktion VEGF voi mahdollisesti olla välittyy HIF-1 [16]. On kuitenkin epätodennäköistä, että HIF-1 on ainoa välimies tätä prosessia, kuten K-ras voi myös säädellä VEGF kautta HIF-1 riippumattomia reittejä hypoksia [17].

aktivoituminen K-ras hypoksia riippui ylävirtaan aktivoinnin c-Src. On ennakkotapaus hypoksinen aktivointi Src, joka on todettu sekä

in vivo

ja

in vitro

muissa solutyypeissä [18]. On olemassa useita erityisiä välittäjäaineita, jotka viittaavat Src K-ras, ja rooli aktivointia EGFR on hyvin kuvattu [11], [19], [20]. Huolimatta perustettu yhteys paksusuolen kasvainten synnyssä, EGFR ei osansa hypoksia aktivointi K-ras.

Cellular vastaukset hypoksia pyrkivät ylläpitämään selviytymisen vihamielisessä mikroympäristön. Aktivointi K-ras hypoksinen olosuhteissa merkitsee avainasemassa hypoksinen vasteen, ja tutkimuksemme esiin kaksi tärkeää tehtävää: apoptoosin ja stimulaation angiogeneesiä. Rooli K-ras apoptoosin säätelyyn on erittäin riippuvainen yhteydessä ja solutyypistä. Joissakin tapauksissa, K-ras voi olla pro-apoptoottisen aktivoitumisen kautta RASSF1 tai Nore1, mutta muissa tilanteissa se voi toimia anti-apoptoottisen toimintoja kautta PI3K tai Tiam1 [21]. Meidän tutkimukset koolonkarsinoomasoluissa osoittaa avainasemassa aktivaatio Akt-reitin hypoksia, joka on aiemmin osoitettu estävän apoptoosia muissa solukkojärjestelmissä [22], [23], [24]. Mielenkiintoista, ERK ei aktivoitu hypoksia järjestelmäämme. Rooli ERK aktivaation paksusuolen kasvaimia ei ole yksinkertaista. Vaikka ilmaus onkogeenisten K-ras normaaleissa paksusuolen epiteelisoluissa voidaan voimakkaasti aktivoida ERK

in vivo

vain rajallinen ERK signalointi havaittiin paksusuolen kasvaimia, jotka kehittyi näillä eläimillä [10]. Lisäksi, koolonkarsinoomasoluissa kantavat K-ras-mutaatio ei osoita merkittävää aktivoitumista ERK, ja luotettavaa korrelaatiota

KRAS

mutaation asemaa ja ERK aktivointia on havaittu ihmisen paksusuolen syövän näytteitä [10], [ ,,,0],25]. Erityinen mekanismeja mitkä efektori reitit kytkeytyvät K-ras hypoksinen versus normoxic edellytykset on vielä määriteltävä ja havainnollistaa plastisuus K-ras-toiminto riippuen Mikro-ympäristön ärsykkeille.

Hypoxic olosuhteet voivat siis luoda ympäristö, jossa proto-onkogeenien, jotka eivät ole mutatoitunut voivat jäljitellä aktivoida onkogeenien. Vaikka villityyppi-K-ras voidaan aktivoida hypoksia, on todennäköistä, että sen aktiivisuuden kirjo ei täysin päällekkäin, että mutantti K-ras ja muitakin ominaisuuksia erityisiä kasvaimia

KRAS

alleeleja.