Krooninen sairaus

tiivistelmä

22Rv1 solulinjaa käytetään laajalti eturauhassyövän tutkimusta ja muut tutkimukset kaikkialla maailmassa. Nämä solut perustettiin ihmisen eturauhasen kasvain, CWR22, joka sarjatuotantona kuljetettiin nude-hiirissä ja valitut androgeeniriippumattomuuteen. 22Rv1 solujen tiedetään tuottaa suuria tiittereitä ksenotrooppiset hiiren leukemiaviruksen liittyvä virus (XMRV). Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen XMRV oli vahingossa luotu 1990-luvulla, kun kaksi hiiren leukemiaviruksen (MLV) genomit (pre-XMRV1 ja pre-XMRV-2) rekombinoitua siirtojen aikana ja CWR22 kasvaimen hiirillä. Johtopäätös että XMRV peräisin hiiristä eikä potilas perustui osittain siihen, ettei havaita XMRV alussa CWR22 ksenografteissa. Vaikka vähennys on varmasti perusteltua, tutkimme mahdollisuutta, että läheistä sukua virus voisi olla läsnä primaarikasvaimen kudokseen. Me raportoimme tässä, että olemme löytäneet alkuperäinen eturauhasen kasvainkudoksen leikattiin potilaan CWR22 ja ovat määritettiin vastaavat DNA: sta PCR ja kudosleikkeiden fluoresenssin

in situ

hybridisaation läsnäolo XMRV tai vastaavaa virus. Primaarikasvaimen kudokset puuttui hiiren DNA: ta määritettiin PCR: llä ja intrakisternaalisen A-tyypin hiukkanen DNA, jolloin vältetään yksi rajoitukset tutkia ksenograftien. Osoitamme, että kumpikaan XMRV eikä läheistä sukua virus oli läsnä ensisijainen eturauhasen kudosta potilaan CWR22. Tuloksemme vahvistavat ja vahvistavat tätä päätelmää XMRV on yhdistelmä-DNA laboratoriossa syntyvän hiiri virus, joka on erittäin sovitettu ihmisen eturauhasen syöpäsolujen.

Citation: Das Gupta J, Luk KC, Tang N, Gaughan C, Klein EA , Kandel ES, et al. (2012) puuttuminen XMRV ja läheisesti liittyvät virukset Alkeisyhdistyksessä eturauhassyöpäkudoksille johtamiseen käytetty XMRV-Infected Cell Line 22Rv1. PLoS ONE 7 (5): e36072. doi: 10,1371 /journal.pone.0036072

Editor: Gilda Tachedjian, Burnet instituutti, Australia

vastaanotettu: 01 helmikuu 2012; Hyväksytty 25 maaliskuuta 2012 mennessä; Julkaistu: toukokuu 16, 2012

Copyright: © 2012 Das Gupta et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimukset suoritettiin tuella Charlotte Geyer Foundation, Maltz Family Foundation ja Abbott Laboratories (RHS ja EAK), NCI avustus CA137708 (ja ESK) sekä kudoksen, histologia ja immunohistokemia Core Facility Case Kattava Cancer Center (P30 CA43703). Co-kirjoittajan Abbott olivat mukana tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista ja valmistelu käsikirjoituksen. Toinen rahoittajat ei ollut tällaisia ​​rooleja.

Kilpailevat edut: KL, NT ja JH ovat työntekijöitä ja osakkeenomistajia Abbott Laboratories. JDG, EAK, ja RHS ovat keksijät patentteja lisensoitu Abbott Laboratories, jotka liittyvät XMRV. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

ksenotrooppiset hiiren leukemiaviruksen liittyvä virus (XMRV) on gammaretrovirus havaitut tutkimusten eturauhassyövän potilailla, joilla on hienovarainen geneettinen puute geeni antiviraalinen proteiini RNaasi L [1]. Vaikka useat myöhemmät tutkimukset toimittanut lisänäyttöä joko XMRV tai läheistä sukua olevan viruksen eturauhassyöpäpotilailla [2] – [6], lisää tutkimuksia joko ei havainnut mitään näyttöä XMRV eturauhassyöpäpotilailla tai näyttöä saatiin mutta rajoitettu pieni määrä ihmisen näytteitä [7] – [16]. Jotkut positiiviset havainnot eturauhassyövän, mukaan lukien, mutta ei rajoittuen, integraatiokohdan kartoitus ja havaitseminen PCR-tuotteiden havaittiin myöhemmin olevan laboratoriossa saastumisen [17], [18]. Mahdollisia saastuntalähteiden ovat hiiri-DNA, MLV proviruksia, XMRV plasmidiin tai PCR-tuotteiden, ja XMRV itsensä infektoituneista solulinjoista. Esimerkiksi hiiren DNA on joskus läsnä pieniä määriä joissain Taq polymeraasin PCR master mix valmisteet ja DNA: n eristämiseksi sarjat johtavat vääriä positiivisia PCR-määrityksissä [19] – [22]. Vääriä negatiivisia voidaan myös tuottaa PCR-määrityksissä edelleen sekoittavia havaitseminen XMRV tai virusten kanssa [23]. Yksi tutkimus osoitti myös läsnäolon XMRV vuonna krooninen väsymysoireyhtymä potilailla [24], mutta viime aikoina nämä tulokset ovat pitkälti johtuvan laboratorioon saastuminen [25] – [27] ja alkuperäinen raportti oli retracte [28]. Perustuen hiljattain laajamittainen tutkimus verenluovuttajien Yhdysvalloissa, on epätodennäköistä, että XMRV

sinänsä

on tullut tämä väestöryhmä merkittävässä määrin (0% esiintyvyys; 95%: n luottamusväli 0% -0,017 %) [29]. Kuitenkin jotkut positiivisia löydöksiä liittyy ei-PCR-tekniikkaan perustuvat menetelmät, kuten serologia, immunohistokemia ja fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio (FISH), jotka ovat näennäisesti havaita XMRV tai vastaavia viruksia ihmisestä otetuista näytteistä ei ole vielä täysin explaine [1], [3], [24]. Tällaista näyttöä jättää avoimeksi mahdollisuuden, että joko hiiren DNA tai XMRV-tyyppisen viruksen on läsnä ainakin joissakin ihmisissä.

Tätä taustaa vasten alkuperä XMRV äskettäin selvitetty tutkimalla ihmisen eturauhassyövän solulinjaa, 22Rv1, ja sen ksenograftin lähtöaineiden kasvatettu nude-mikrofoni [30]. 22Rv1 solut infektoidaan, ja tuottaa korkeita tiittereitä, joka on XMRV, joka on lähes identtinen sekvenssi XMRV kanta VP62 eturauhassyöpään studie [1], [30], [31]. Alkuperä 22Rv1 solut voidaan jäljittää ihmisen eturauhasen syöpä (Gleason arvosana 9), joka leikattiin vuonna 1992 Case Western Reserve Universit [32]. Myöhemmin kasvain, dubattuna CWR22, sarja- istutetaan nude-hiirissä. Vuonna 1996 neljä vuotta serial passage nude-hiirissä, kastraatio hiirten tehtiin johtavat regressio ja uusiutumisen Tumo [33]. Tuloksena androgeenista riippumaton kasvain, CWR22R-, sitten sarjoittain istutetaan hiirillä vuoteen 1999 saakka, jolloin se, jota käytettiin määrittämään 22Rv1 solun lin [34]. Korkea XMRV ovat läsnä 22Rv1 solulinjoissa ja loppuvuodesta kohdat CWR22 kasvain, mutta ei alussa ksenografti- [30], [35]. Merkillistä, hiirten sisältävät kaksi proviruksia, pre-XMRV1 ja pre-XMRV2, jossa pitkiä ( 3,2 kb), jotka ovat 99,9% identtinen XMR [30]. Oletettiin, että rekombinaation kahden proviruksia johti XMRV ja että XMRV puuttui alkuperäisestä kasvaimesta. Kuitenkin alkuperäisestä kasvaimesta näytteitä ei arvioitu näissä raporteissa samalla ksenografteissa väistämättä sisältää pieniä määriä hiiren soluja. Läsnäolo hiiren endogeenisen provirusten DNA näiden kontaminoivien hiiren soluja rajoittaa valintaa koettimien ja PCR-alukkeita, joita voidaan käyttää yksilöimään XMRV elementit näissä näytteissä. Tässä me kuvaamme analyysi parafinoidut eturauhasen lohkot potilaasta CWR22 ja osoittavat, että kumpikaan XMRV tai läheistä sukua virukset ovat läsnä primaarikasvaimen.

Materiaalit ja menetelmät

käsittely Eturauhasen Tissue Blocks

Jalostus formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut (FFPE) lohkot suoritettiin Genominen lääketieteen instituutin ja osasto laboratoriolääketieteen, Cleveland Clinic. Viisi eturauhasen kudosta parafiiniblokit potilaasta CWR22 (merkitty A, B, C, E ja K) leikeltiin, jonka leveys on 5 μ on mikrotomilla, jota oli käytetty yksinomaan ihmisen näytteitä. Osuudet ovat joko kerättiin putkiin DNA: n eristämisessä tai sijoitetaan mikroskoopin FISH analyysiä. Osiot varastoitiin 4 ° C jääkaappi Genominen Medicine Institute biorepository (Cleveland Clinic). DNA: n eristys suoritettiin samassa laboratoriossa, jossa ei XMRV eikä XMRV plasmidia koskaan käytetty. Kudos kerättiin alun perin josta CWR22 siirto on tuotettu heitettiin pois kudoksesta eikä potilaan suostumus on tarpeen.

uuttaminen DNA eturauhasen kohdat

DNA: n uutto suoritettiin seuraavalla menetelmällä (toimittanut tohtori Charis Eng, Genomic Medicine Institute, Cleveland Clinic: https://www.lerner.ccf.org/gmi/gmb/methods.php). Deparaffinization tehtiin lisäämällä 1 ml ksyleeniä ja 18 osaa (5 μ kunkin leveys) varovasti ravistaen 10 min, sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 16000 g huoneenlämpötilassa ja heitetään supernatantit. Tämä vaihe toistettiin kahdesti. Uutto suoritettiin sen jälkeen 1 ml: lla 100% etanolia (2 kertaa), 80% etanolia (2 kertaa) ja 50% etanolia (2 kertaa), joka kerta sentrifugoimalla 10 minuutin ajan 16000 g huoneenlämpötilassa ja heitetään supernatantit . Pellettiin 1 ml nukleaasivapaata vettä (USB /Affymetrix) lisättiin ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Pelletti otettiin talteen sentrifugoinnin jälkeen 10 minuutin ajan 16000 g huoneen lämpötilassa sen jälkeen, hylätään supernatantti. Nucleic Acid Lysis-puskuria, 700 ui, (10 mM Tris-Base, 400 mM NaCl, 2 mM Na

2EDTA ja 0,7% SDS), lisättiin pellettiin. Proteinaasi K, 50 ui (30 mg /ml) (Invitrogen) lisättiin ja digestio suoritettiin 65 ° C: ssa 24 tuntia. Lisäksi 50 ui proteinaasi K-liuosta lisättiin, inkuboitiin yön yli 65 ° C: ssa, 250 ui 6 M NaCl lisättiin, sekoitettiin perusteellisesti, ja jätettiin huoneen lämpötilaan 10 min. Näytteitä sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 16000 g huoneen lämpötilassa DNA: n pelletoimiseksi ja supernatantit varovasti heitettiin pois. Pelletit pestiin 70% etanolilla ja kuivattiin ilmassa pöydän päällä muutaman minuutin ajan. Kukin pelletti suspendoitiin uudelleen 40 ui TE (10 mM Tris-HCI, pH 8,0; 1 mM EDTA) (USB /Affymetrix) ja säilytettiin 4 ° C: ssa.

Yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) genotyypin (Roswell Park Cancer Institute) B

SNP genotyypitys suoritettiin käyttäen MassARRAY Compact järjestelmä (Sequenom, Inc., San Diego, CA) on paneelin 30 mukautetun SNP suunniteltu käyttäen RealSNP ja MassARRAY Pitoisuus Designer (Sequenom). Lyhyesti, protokolla käsittää PCR-monistuksen 10 ng DNA: ta käyttäen SNP spesifisiä alukkeita, minkä jälkeen emäksen pidennyksestä reaktiossa käyttäen iPLEX Gold kemia (Sequenom). Lopullinen base extension tuotteita käsiteltiin ja täpliksi 384-pad SpectroCHIP (Sequenom) käyttäen ChipSpotter LT nanodispenser (Samsung). MassARRAY Analyzer Compact MALDI-TOF MS (Sequenom) käytettiin tietojen hankinta päässä SpectroCHIP. Saatu genotyypit kutsutaan käyttäen MassARRAY typer Analyzer v4.0 (Sequenom).

Kvantitatiivinen PCR (qPCR) ja XMRV (Cleveland Clinic) B

DNA-näytteet laimennettiin 100 ng /ul TE puskuria ja 2 ui (200 ng) alikvootteja käytettiin kahtena varten qPCR määritykset (paitsi näyte K, 17 ng DNA: ta käytettiin, koska pienempi määrä käytettävissä DNA: ta). Fast Mastermix (Applied Biosystems) käytettiin qPCR määrityksissä käyttäen Step One Plus Reaaliaikainen PCR koneen seuraten valmistajan ohjeita (Applied Biosystems). PCR-olosuhteet PCR: ää käyttäen Fast Mastermix olivat: 95 ° C 20 sekuntia alkudenaturaation seurasi 95 ° C 1 sek, 60 ° C: ssa 20 sekunnin ajan (tiedonkeruu vaihe), toistettiin 50 kertaa. Oligonukleotidikoettimista sisälsi 6-karboksifluoreseiini (FAM), jotka liittyvät 5-päähän ja fluoresoimaton Quencher-Minor Grove Binder (NFQ-MBG) liitetty 3′-päähän (Applied Biosystems].

env

geeni:

6124F: 5′-GGCCGAGAGAGGGCTACT-3 ’

6159R: 5′-FAM-CACATCCCCATTTGCC-NFQ-MGB-3′

6197R: 5 ’ -TGATGATGATGGCTTCCAGTATGC-3 ’

gag

geeni:

625F: 5′- GTAACTACCCCTCTGAGTCTAACCT-3′

668F: 5′- FAM-TCCAGCGCATTGCATC- NFQ-MGB-3 ’

708R: 5′- CTTCTTGACATCCACAGACTGGTT-3′

pol

geeni:

4843F: 5′-CGGGACAGAACTATCCAGTATGTGA-3 ”

4873F: 5′-FAM-ACCTGCACCGCCTGTG- NFQ-MGB-3 ’

4912R: 5′-TGGCTTTGCTGGCATTTACTTG -3′

sisäisenä kontrollina mittasimme tasoilla RNaasi P-geeni (yhden kopion geeni), joka koodaa RNA: ta osa on RNaasi P entsyymi. VIC-leimattua ohjaus RNaasi P aluke-koetin yhdistelmä Applied Biosystems käytettiin. tunnettu kopioluvun täyspitkän XMRV VP62 genomin plasmidissa pcDNA 3.1 [36] käytettiin positiivisena kontrollina testata kumpaakin aluketta-koetin yhdistelmä.

intrakisternaalisen A-hiukkaset (IAP) qPCR määritykset (Cleveland Clinic) B

qPCR hiiren IAP DNA tehtiin seuraavat oligonukleotidialukkeita /koetin:

IAP-1414F: 5′-TGGCGAAAGTCAGCGTACTG-3 ’

IAP-1435F: 5′-FAM-TCAACCTCCCGGCAGT-NFQ-MGB-3 ”

IAP-1472R: 5′-CATAGGGCGGACCTTGAAAC-3 ’

positiivisena kontrollina IAP, hiiri häntä DNA uutettiin käyttäen Qiagen DNA: n eristämiseksi pakki, sen pitoisuus mitattiin absorbanssilla ja sarjalaimennetun TE-puskuri tuottaa standardikäyrän. PCR-olosuhteet olivat samat kuin ne, joita käytetään havaitsemaan XMRV sekvenssejä.

Reaaliaikainen RT-PCR-testaus XMRV (Abbott Molecular) B

Yhden kierroksen reaaliaikainen RT-PCR ( RT-PCR) prototyyppi määritykset ajettiin

m

2000

rt

TM (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) väline. Keskimäärin 500 ng DNA: ta eturauhassyövän potilaan CWR22 (lohkot A, B, C, E ja K), monistettiin kaksi aluketta, jotka on suunniteltu erikseen kohdistaa polymeraasia (

pol

) tai vaipan (

env

) alueilla XMRV genomin. Jokainen DNA-näyte laimennetaan vedellä saavuttaa 25 ui yhdistettiin 25 ui master mix joka sisälsi 10x EZ-puskuria, rTth entsyymi, dNTP, Rox viittaus väriaine, MnCl

2, alukkeita, ja koettimia, jotta saadaan lopullinen PCR-reaktion tilavuus oli 50 ui. Primer /koetin sekvenssit, pyöräily olosuhteet ja herkkyys /spesifisyys arvio

pol

ja

env

RT-PCR-määrityksissä on kuvattu yksityiskohtaisesti previousl [37]. Aluke /koetinsarjaa havaitsemiseksi 136 emäkset ihmisen

β

globiinin geeniä käytettiin ohjaamaan Näytteen riittävyyden ja monistettiin ja havaittiin samanaikaisesti XMRV (Fam signaali) samassa reaktiossa eri fluoresenssiväriä (Cy5 signaali). TE-puskuria, joka sisälsi 1,5 ug /ml poly-dA: dT käytettiin määrityksessä negatiivisena kontrollina (NC). XMRV VP62 DNA-plasmidi laimennettu NC käytettiin määrityksessä positiivisen kontrollin (PK).

Fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio (FISH) (Abbott Diagnostics) B

XMRV- SO FISH koetin valmistettiin suoraan leimaamalla koko plasmidi-DNA (~13.6 kb) kloonin VP62 /pcDNA3.1 kuljettaa täyspitkän genomin (~8.2 kb) ja XMRV VP62 (36), jossa SpectrumOrange fluoroforin kemiallisten reaktioiden kautta, kuten on kuvattu previousl [38], [39]. Prosentuaalinen sisällyttäminen SpectrumOrange että XMRV-SO koetin oli ~8%. CEP8-SA koetin peräisin sentromeerisen sekvenssin ihmisen kromosomin 8, ja sitä on merkitty SpectrumAqua fluoroforin saatiin Abbott Molecular, Inc.

arviointia varten XMRV FISH koettimen suorituskykyä, XMRV infektoimattomia DU145 eturauhassyövän solu [36] käytettiin negatiivisena kontrollina, kun taas 22Rv1 eturauhassyövän -solut -10 integroitu kopiota XMRV solua kohti ja tuottaa korkean tiitterin XMRV virus [31], käytettiin positiivisena kontrollina. Molemmat solulinjat kasvatettiin DMEM-F12 täydelliseen elatusaineeseen (Invitrogen, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa, kun läsnä oli 5% CO

2. Sen jälkeen, kun se oli 60% -70% konfluenssiin, 1 ml Colcemid liuosta (10 ug /ml; Invitrogen), lisättiin per 50 ml viljelyalustaa ja soluja viljeltiin 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Solut kerättiin sen jälkeen, kun trypsinoimalla, pestiin kerran 40 ml: lla 1 x DPBS (Invitrogen), suspendoitiin uudelleen 40 ml: aan 0,075 M kaliumkloridiliuosta (Invitrogen), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Solut pestiin sen jälkeen 40 ml: lla Carnoy fiksatiiviin (03:01 v /v metanolia: jääetikkaa, Fisher, Pittsburgh, PA) neljä kertaa, suspendoitiin uudelleen 5 ml: aan Carnoy fiksatiiviin ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Dioja seosta DU145 ja 22Rv1 valmistettiin saostamalla 10 ui kutakin solususpensiota on SuperFrost Plus positiivisesti varautunut dia (ThermoShandon, Pittsburgh, PA). Dia kuivattiin ilmassa yön yli ennen FISH esikäsittely ja hybridisaatio.

Cell näytteen objektilasit esikäsitelty 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumsitraatti, pH 7,0, Invitrogen) 73 ° C: ssa 2 min sitten inkuboitiin 0,5 mg /ml pepsiiniä 10 mM HCl: a (USB, Cleveland, OH), 37 ° C: ssa 10 min. Objektilasit huuhdeltiin 1 x DPBS: ssä (Invitrogen) 5 minuuttia huoneen lämpötilassa, kiinteä 1% neutraalissa puskuroidussa formaliiniliuoksella (Fisher) 5 minuutin ajan, sitten upotetaan 1x DPBS: ssä 5 minuutin ajan. Levyjä pidettiin dehydratoidaan etanolisarjassa 70%, 85% ja 100% 1 min, ja sitten kuivataan ilmassa. Kymmenen ui hybridisaatio- liuos valmistettiin sekoittamalla 100 ng XMRV-SO, 100 ng CEP8-SA, 1000 ng sonikoitua ihmisen istukan DNA: ta, 250 ng ihmisen Cot-1 DNA: ta, ja 7 ui LSI /WCP hybridisaatio- puskuria (Abbott Molecular, Inc. ), ja levitettiin kunkin dian. Peitelasi (22 x 22 mm, VWR, Radnor, PA) asetettiin päälle anturi ratkaisu, ja tiivistetty luistin kumilla sementin (Staples, Framingham, MA). Koettimet ja solun nukleiinihappojen kummallakin dia oli co-denaturoitiin 73 ° C: ssa 3 minuuttia ja sitten hybridisoidaan 37 ° C: ssa 16-24 tuntia on hybridisaatio alustalla (ThermoBrite; Abbott Molecular, Inc.). Hybridisaation jälkeen kalvot pestiin 0,4X SSC /0,3% NP-40 (Abbott Molecular, Inc.) 2 minuutin ajan 73 ° C: ssa ja sitten 2 x SSC /0,1% NP-40 (Abbott Molecular, Inc.) 1 min huoneenlämpötilassa. Kymmenen ui ydin- vastavärinä DAPI II (125 ng /ml; Abbott Molecular, Inc.) levitettiin kunkin yksilön osalta ja objektilasit arvioitiin fluoresenssimikroskoopilla. XMRV-SO koetin visualisoitiin oranssi suodatin set, CEP8-SA koetin visualisoitiin aqua suodatin asetettu, ja DAPI tumavärjäystä visualisoitiin DAPI suodinsarja.

diat asennettu FFPE eturauhassyöpä kudosleikkeiden paistettiin 56 ° C: ssa 4 tuntia säilytetään sitten huoneen lämpötilassa. Valmisteltaessa FISH hybridisaatiota, kudosnäyte objektilasit poistettiin parafiini kolme kertaa Hemo-De liuotinta (Scientific Safety Liuottimet, Keller, TX) 5 min kulloinkin huoneen lämpötilassa ja huuhdeltiin absoluuttista etanolia kahdesti 1 min. Objektilasit jälkeen esikäsitelty liuos, jossa oli 45% muurahaishappoa (Fisher) /0.3% vetyperoksidia (Calbiochem, San Diego, CA) 15 min ajan huoneen lämpötilassa ja huuhdeltiin H

2O 3 min. Sitten aluslaseja inkuboitiin esikäsittelyn liuokseen (Abbott Molecular, Inc.) 80 ° C: ssa 35 min, pestiin H

2O huoneenlämpötilassa 3 minuutin ajan, inkuboitiin pepsiiniliuosta (1,5 mg /ml 0,1 N HCl: lla ) 37 ° C: ssa 22 minuutin ajan, huuhdeltiin H

2O huoneenlämpötilassa 3 minuutin ajan. Levyjä pidettiin sen jälkeen dehydratoitiin 70%, 85% ja 100% etanolissa 1 min, ja sen annettiin kuivua huoneenlämpötilassa. Kymmenen ui koettimen hybridisaation yhdistelmä, joka sisälsi 100 ng XMRV-SO, 100 ng CEP8-SA, 1000 ng sonikoitua ihmisen istukan DNA: ta, 250 ng ihmisen Cot-1 DNA: ta, ja 7 ui LSI /WCP hybridisaatiopuskurissa asetettiin kummankin kudoksen osassa. Peitelasi levitettiin ja reunat sinetöitiin dia kumi sementtiä. Koettimet ja kudosnäyte nukleiinihappojen kummallakin dia olivat yhdessä denaturoitu 5 minuuttia 73 ° C: ssa ja hybridisoitiin 16-24 tunnin ajan 37 ° C: ssa ThermoBrite. Hybridisaation jälkeen levyt sijoitettiin 2 x SSC /0,1% NP-40 huoneenlämpötilassa 5-10 minuutin ajan, pestiin 0,4 x SSC /0,3% NP-40: stä 73 ° C: ssa 2 minuuttia ja 2 x SSC /0,1% NP-40 huoneen lämpötilassa 1 min ajan. Kymmenen ui ydin- vastavärinä DAPI I (1000 ng /ml; Abbott Molecular, Inc.) levitettiin jokaiseen kudosleikkeestä ja objektilasit arvioitiin fluoresenssimikroskoopilla.

Eettinen linjaus

Nämä tutkimuksia hyväksynyt Cleveland Clinic Foundation Institutional Review Board # 1.

tulokset

tunnistaminen ja todentaminen CWR22 eturauhaskudoksiin

Vuonna 1992 eturauhassyöpä potilas CWR22 koki höyläysleikkaus eturauhasen Case Western Reserve Universit [32]. Leikkauksen jälkeen sirut eturauhasen kudosta kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin ja upotettiin parafiiniin lohkoissa. Seuraavat diagnostiset tutkimukset ja liikkeeseen standardin patologian raportin, lohkot pidettiin varastot patologian osaston (Case Western Reserve University) kiintein huoneenlämmössä, lähinnä valaisematon huoneissa. Vuoden 2011 puolivälissä, kudos lohkot tunnistettiin vaikka arkistoidut paperilla kirjaa olevan peräisin potilaasta CWR22 ja sitten haetaan varastoinnista. Yliopistollisen sairaalan (Cleveland) Institutional Review Board mahdollistaa ylläpitämiseksi potilaan ja tietuetta tulevia tutkimuksia; joiden kyky uudelleen kytkennän säilyttäen palomuuri estää vapautumisen mitään kansanterveyden tietoa tutkijoille.

eturauhasen lohkot leikeltiin on mikrotomi käytetään yksinomaan ihmisen kudoksia laitoksella Laboratoriolääketiede (Cleveland Clinic ). DNA uutettiin genomisessa Medicine Institute (Cleveland Clinic) laboratoriossa jossa kumpikaan XMRV eikä XMRV nukleiinihappoja käytettiin. Vahvista yhteinen alkuperä yksilöt, DNA näytteet viidestä FFPE eturauhasen korttelin päässä potilaasta CWR22 (merkitty A, B, C, E K) verrattiin keskenään sekä aiemmin kuvatun [35] näytteitä CWR ksenografti ja 22Rv1 solulinjassa yhden emäksen monimuotoisuus (SNP) analyysi Roswell Park Cancer Institute (Buffalo). Me vetosi menetelmän kehittämiseen SNP käyttäen täysin automatisoitua järjestelmää Sequenom, Inc. (San Diego, CA). Järjestelmä perustuu PCR-monistus kiinnostuksen kohteena olevan alueen, jota seuraa alukkeen pidennys kautta polymorfisen läsnä kolmen deoksiribonukleotiditrifosfaattien ja yksi dideoxyribonucleotide trifosfaatti, ja määritetään nukleotidin koostumus lyhyttä tuotteita käyttämällä massaspektrometriaa [ ,,,0],40]. Havaitsimme, että kaikki seitsemän näytettä suorittaa identtisen rakenteen SNP kaikkien kolmekymmentä tutkittujen sivustojen (taulukko 1), mikä vahvistaa, että eturauhasen kudosta lohkojen alkunsa saman potilaan kuin teki CWR-ksenograftissa ja 22Rv1 soluja.

poissaolo XMRV DNA tai sellaisen läheisesti viruksen potilaan CWR22

Voit selvittää nukleiinihappojen XMRV tai läheisesti liittyvien virus oli läsnä eturauhasen potilaan CWR22 PCR itsenäisesti suoritettiin laitoksella syöpäbiologian, Cleveland Clinic (Cleveland) ja Abbott Molecular, Inc. (Des Plaines).

qPCR klo Cleveland Clinic.

määrittämiseksi herkkyydet qPCR varten XMRV

gag

,

pol

, ja

env

, määritykset tehtiin kanssa täyspitkän virus molekyyli kloonin plasmidi XMRV VP62 [36]. Niin vähän kuin 15 kopiota XMRV plasmidia toistettavasti havaittu alukkeita ja koettimia kaikkien kolmen XMRV geenit (

gag

,

pol

, ja

env

) (Fig. 1A ). Koska nukleotidisekvenssi XMRV on jopa 95% identtinen, jossa on useita MLV endogeenisen proviruse [1], pyrimme määrittämään, onko qPCR varten XMRV

gag

,

pol

, ja

env

myös monistaa MLV-sekvenssit hiiren DNA. QPCR kanssa XMRV

gag

ja

env

alukkeiden ei monistamaan tuotteita niin vähän kuin 100 fg hiiren hännän DNA, kun taas XMRV

pol

alukkeet eivät tuottaneet PCR-tuotteiden hiiren DNA: ta (Fig. 1 B 40 sykliä, mikä on vähemmän kuin luotettava havaitsemisraja ja todennäköisesti edustaa artefakti. Ei hiiren IAP-DNA havaittiin PCR: llä DNA uutetaan CWR22 eturauhaskudoksiin osoittaa poissaolon kontaminoivien hiiren DNA näistä näytteistä (taulukko 2).

monistaminen käyrä reaaliaikaisen qPCR analyysi (A) havaitseminen XMRV tiettyihin alueisiin (

gag

,

pol

ja

env

) käyttäen XMRV VP62-DNA (3750 kappaletta) ja (B) DNA: ta eri osien CWR22 eturauhasen kudosten (kudoksen lohkojen A, B, C nämä perustuivat verrattuna useille testeille koodattu ohjauspaneelit luoma Veren XMRV tieteellisen tutkimuksen työryhmä (BSRWG) [37], [43]. Käyttämällä kokoveren ja plasman paneelit valmistetaan BSRWG, nämä määritykset olivat samat herkin määritykset teste [43]. Käyttäen sarjalaimennoksia XMRV VP62 plasmidi kontrolleja, sekä määritykset luotettavasti havaita 5 kopiota DNA-reaktiota kohti. Tämän perusteella herkkyyttä, arvioimme alempi havaitsemisraja on noin 1 provirusrakenteen genomin kohti 17000 solua. Positiivinen kontrolli reaktiot olivat positiivisia ja negatiivisia kontrolleja olivat negatiivisia (Fig. 3A). Ei XMRV havaittiin joko

pol

tai

env

määrityksissä DNA: ta CWR22 eturauhasen lohkot A, B, C, E ja K (Fig. 3A, taulukko 2). Signaalin vahvistus käyrät

β-

globiinin (Cy5) monistettu samana run (Fig. 1 B, taulukko 2) paljasti, että kaikki potilaan näytteet olivat positiivisia

β

globiini DNA, mikä kertoo riitti DNA näytteissä monistamiseen.

monistaminen tonttia reaaliaikainen PCR-analyysi (A) XMRV (FAM) signaalin DNA: ta eri osissa CWR22 eturauhasen kudosten ja suorita valvontaa kanssa

pol

ja

env

pohjamaali /koetin sarjat; (B)

β-

globiinin (Cy5) signaali saman ajon.

XMRV FISH analyysi CWR22 kudosleikkeiden

Vaihtoehtoinen lähestymistapa molekyylien tunnistamiseksi virusinfektio on FISH. FFPE kudosleikkeiden kustakin CWR22 eturauhasen lohkot A, B, C, E ja K seulottiin näyttöä XMRV infektion käyttäen suoraan-leimattu koetin (XMRV-SO). Koetin sekoitus sisälsi myös toinen koetin, CEP8-SA, joka hybridisoituu sentromeerisen alueen ihmisen kromosomin 8, joka toimi sisäisenä kontrollina seurata eheyden FISH hybridisaatio vaihe. Dioja sisältää seoksen infektoitumattomien DU145 eturauhassyövän solut ja XMRV-tartunnan 22Rv1 syöpäsolujen (≥10 integroidut kopiota /solu) käytettiin luomaan spesifisyyden ja lokalisaation FISH hybridisaatio. Tämän analyysin tulokset on esitetty (Fig. 4A B). CEP8-SA kromosomi merkki helposti erottaa kahdessa solulinjassa kuin kolme kopiota oli läsnä DU145 taas 22Rv1 sisälsi kaksi kappaletta. XMRV FISH hybridisaatio havaittiin ainoastaan ​​varten 22Rv1 soluja. XMRV-värjäytyminen 22Rv1 soluissa pääasiassa tumassa, kun taas jotkut värjäytyminen havaittiin sytoplasmassa. Solujen esikäsittely RNaasi A: lla sulattaa sekä solu- ja virus-RNA ennen hybridisaation XMRV-SO koetin johti pistemäinen kuvio värjäys, joka osoittaa integroitu XMRV proviraalisen DNA, tumassa (tuloksia ei ole esitetty). Edustaja kuvia XMRV FISH-analyysi CWR22 kudosleikkeiden lohkojen A, B, C, E ja K on esitetty (Fig. 4C-G, vastaavasti). Kudoksen osat lohkojen B, C ja E olivat negatiivisia värjäystä kanssa XMRV-SO koetin vaikka ne olivat positiivisia sisäisen valvonnan CEP8-SA anturi (Fig. 4 ja tietoja ei näytetty). Palasia lohkot A ja K olivat negatiivisia XMRV värjäytymistä lukuun ottamatta joitakin solujen yhtä reunaa pitkin kunkin dian. Tutkia erityispiirteenä värjäystä, ihmisen papilloomavirus mittapäätyypin 16 koetin merkitty samalla tavalla kuin XMRV koetin hybridisoitiin osastoja lohkot A ja K. Kuten mitä oli havaittu XMRV-SO koetin, osat olivat negatiivisia lukuun ottamatta solujen samaa reunaa kalvot (tuloksia ei ole esitetty). Näin ollen, värjäytyminen havaittiin reunaa pitkin näiden dioja näyttää olevan epäspesifinen artefakti. Tämän analyysin perusteella, voimme päätellä, että osat kaikilta CWR22 kudoksen lohkot ovat negatiivisia XMRV ja liittyvät virukset.

Dia hybridisoitiin koettimella sekoitus koostuu XMRV-SO virus koetin johdettu täyden pituuden matkan XMRV VP62 ja CEP8-SA sisäisen tarkastuksen koettimen sentromeerisen sekvenssi ihmisen kromosomin 8 (A), joka edustaa kuva, jossa XMRV-SO oranssi värjäys seoksessa infektoituneiden DU145 eturauhassyöpäsolujen ja XMRV-tartunnan 22Rv1; (B) sama kuva osoittaa CEP8-SA aqua värjäytymisen DU145 (kolmena kappaleena /solu) ja 22Rv1 (kaksi kopiota /solu); (C – G) edustava kuvat osoittavat XMRV-SO FISH tuloksia kudosleikkeiden lohkojen A, B, C, E ja K, vastaavasti, mistä CWR22.

Keskustelu

Aiemmassa tutkimuksessa on ehdotettu, että XMRV syntyi rekombinaation kahden endogeenisen provirusten hiirten, pre-XMRV1 ja pre-XMRV2, kulkiessa CWR22 kasvainsolujen nude mikrofoni [30]. Vaikka XMRV alkunsa hiirissä, se on erittäin sovitettu ihmisen eturauhasen epiteelisolujen seurauksena virus-isäntä-solu-vuorovaikutuksia in vivo. Esimerkiksi XMRV salakuljetetaan eturauhasen epiteelin sisällä 6 tai 7 päivää kokeellisten tartunnan reesusmakaki [44], vaikka ei saparopäinen makakeilla 119 päivän kuluttua infectio [45]. Initial infektioiden CWR22 solulinjaan, joka johti 22Rv1 solulinjaa todennäköisesti helpottaa luontaisen immuniteetin puutteita.