Krooninen sairaus

tiivistelmä

E-vitamiini δ-tokotrienoli on osoitettu olevan kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta, mutta molekyylitason mekanismia, jolla se estää syöpäsolujen lisääntymistä on edelleen epäselvä. Täällä, osoitimme, että δ-tokotrienoliin kohdistama merkittävää solujen kasvun estäminen haimatiehyen syöpä (PDCA) soluja vaikuttamatta normaalin ihmisen haimatiehyen epiteelisolujen kasvuun. Osoitimme myös, että δ-tokotrienoliin aiheuttama kasvun esto tapahtui samanaikaisesti G

1 solusyklin pysähtymisen ja lisäsi p27

Kip1 tumakertymään. Tämä havainto on merkittävä, menetys ydin- p27

Kip1 ilme on vakiintunut haitallisia ennustetekijä PDCA. Lisäksi δ-tokotrienoli inaktivoitu RAF-MEK-ERK signalointi, polku tiedetään tukahduttaa p27

Kip1 ilme. Sen määrittämiseksi, ovatko p27

Kip1 induktio vaaditaan δ-tokotrienoliin esto PDCA soluproliferaation, me vakaasti tukkinut

CDKN1B

geeni, joka koodaa p27

Kip1, in MiaPaca-2 PDCA solujen ja osoitti, että P27

Kip1 hiljentäminen tukahdutettu solusyklin pidätyksen aiheuttama δ-tokotrienoliin. Lisäksi δ-tokotrienoli aiheuttama p27

Kip1 mRNA: n ilmentymisen mutta ei sen proteiinien hajoaminen. P27

Kip1 geenin promoottorin aktiivisuutta indusoitiin δ-tokotrienoliin kautta promoottori n E2F-1 sitoutumiskohdassa, ja tätä toimintaa lievitti E2F-1 ehtyminen käyttäen E2F-1 Sirna. Lopuksi vähentynyt proliferaatio, välittyy Ki67 ja p27

Kip1 ilmentymisen δ-tokotrienoliin vahvistettiin

in vivo

nude hiiren ksenografti haimasyöpä malli. Meidän havainnot paljastavat uuden mekanismin, riippuu p27

Kip1 induktio, jonka ö-tokotrienoliin voivat estää lisääntymistä PDCA soluissa, jotka tarjoavat uuden perusteet p27

Kip1 biomarkkerina varten δ-tokotrienoliin tehoa haimasyövän ehkäisyyn ja hoito.

Citation: Hodul PJ, Dong Y, Husain K, Pimiento JM, Chen J, Zhang A, et al. (2013) E-vitamiini δ-tokotrienoliin indusoi p27

Kip1-Dependent Cell-Cycle pidätys haimasyöpäsoluissa kautta E2F-1-Dependent Mechanism. PLoS ONE 8 (2): e52526. doi: 10,1371 /journal.pone.0052526

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 15 marraskuu 2012; Julkaistu: 05 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Hodul et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain National Institutes of Health (NIH) avustus K12 Clinical Scholar in Oncology avustus (PJ Hodul) ja Moffitt apurahat (Kurtz Pledge 09-33412-06-01, GI Cancer Research 09-33412-07- 01, ja Steinmann Family Foundation 09-33412-08-05). Tätä työtä tukivat myös NIH avustuksia 1R01 CA-129227-01A1, 5RO1 CA-098473-05, DAVOS 69-15099-99-01 (MP Malafa), ja Bankhead-Coley 08BR-02. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tämä tutkimus koskee henkisen omaisuuden, jossa M. Malafa ja S. Sebti on nimetty kuten keksijät. Drs. Malafa ja Sebti ja Moffitt Cancer Center on oikeus saada lisensointi tuloja hyödyntämisestä tällaisen henkisen omaisuuden. Yhdysvaltalaisen patenttihakemus on jätetty 26. kesäkuuta 2007, jolla on otsikko ”Delta-tokotrienoliin hoito ja ehkäisy haimasyövän” (OTML etiketti numero 06A069). Aineeton omaisuus sisältyvät patenttihakemus on lisensoitu BioGene Life Science, Singapore perustuu yrityksen. Tämä käyttöoikeussopimus antaa BioGene Life Science oikeudet Dr. Malafa löytö. BioGene Life Science on kokonaan omistama tytäryhtiö Davos Life Science. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Haimasyöpä on yksi tappavan syövät Yhdysvalloissa, sijoitus neljänneksi johtavia syitä syöpään liittyvien kuolemien [1]. Hoidosta huolimatta kehityksestä, kuolleisuus potilaiden haimasyöpä on kaiken pysyi ennallaan vuosikymmeniä. Tutkimukset uusiksi hoitomuotojen ja kemopreventiivisten aineet ovat selvästi perusteltuja.

Tutkimukset ovat osoittaneet, että lisääntynyt saanti ravinnosta hedelmiä, vihanneksia, ja viljanjyvät saattaa vähentää haimasyövän riskiä [2], [3], [4]. Tokotrienoleja, löytyy viljanjyvät, muodostavat yhden kaikkein pakottavia ryhmiin kasvaimen vastaisen bioaktiiviset yhdisteet [5]. Tokotrienolit ovat ryhmä neljä (α-, β-, δ-, γ-) tyydyttymättömiä, luonnossa esiintyviä E-vitamiinin yhdisteitä, jotka eivät ainoastaan ​​inhiboimaan ihmisen erilaisten kasvainsolujen, mukaan lukien rinta-, koolon-, keuhko-, ja maksan [ ,,,0],6], [7], [8], mutta myös niillä chemopreventive ominaisuuksia [9], [10]. Kuitenkin miten tocotrienols vaimentaa kasvaimen leviämisen ymmärretään huonosti.

aiemmin osoitettu, että δ-tokotrienoliin esittelee tehokkain antituumorivaikutuksen joukossa neljä tokotrienoliin isoformia haiman syöpäsoluissa [11], [12]. Meneillään olevassa vaiheessa I annoksensuurentamistutkimuksessa kliinisessä tutkimuksessa haimasyövän potilaille, alustavat tulokset paljastivat, että δ-tokotrienoliin ei ollut ilmeistä myrkyllisyyttä jopa 3200 mg /vrk, mikä on 5 kertaa ennustettu biologisesti aktiivisen kliininen annos [13]. Nämä havainnot korostavat lupaus δ-tokotrienoliin haimasyövän intervention. Edelleen kääntää nämä havainnot klinikalla, on tärkeää tunnistaa asiaan biomarkkerit δ-tokotrienoliin aktiivisuutta varhaisen vaiheen hypoteeseja perustuva kliinisissä tutkimuksissa.

Tätä varten tutkimme miten δ-tokotrienoliin estää haimasyövän solujen kasvua ja tunnistettu sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) estäjä p27

Kip1 kuin molekyylitasolla δ-tokotrienoliin. p27

Kip1 toimii tuumorisuppressorina sen kyky estää solujen proliferaatiota. P27

Kip1 on epätyypillinen tuumorisuppressoriproteiinia koska mutaatiot sen geeni ovat erittäin harvinaisia. Kuitenkin kasvainsolut ovat kehittyneet muita mekanismeja inaktivoida p27

Kip1, mukaan lukien lisääntynyt proteolyyttinen hajoaminen ja syrjäytyminen tumasta. Itse asiassa p27

Kip1 menetys on liittynyt haimasyöpä etenemisen ja huonon ennusteen [14], [15], [16], [17]. Täällä raportoimme ensimmäistä kertaa, että p27

Kip1 on keskeinen rooli δ-tokotrienoliin aiheuttama G

1 pidätykseen. Havaitsimme myös, että induktio p27

Kip1 by δ-tokotrienoliin tapahtuu transkriptio joihin osallistuu E2F-1-välitteisen promoottoriaktivoinnilla ja mRNA induktio.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

Puhdistettu δ-tokotrienoliin alun perin toimitti tohtori Barry Tan (Hadley, MA) (90% δ-tokotrienoliin ja 10% γ-tokotrienoliin; IC

50: 15-20 μΜ) ja sittemmin Davosin Life Sciences (Singapore) (97% δ-tokotrienoliin; IC

50: 50 μΜ) liuotetaan etanoliin kantaliuoksena ja laimennettiin vaadittuun pitoisuuteen DMEM.

Solulinjat ja Culture

MiaPaca-2, SW1990, ja BxPC-3 haimasyöpä-solut saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA), ja kasvatettiin -70% konfluenssiin DMEM 10% FBS: ää. HPDE6 C7, ihmisen haiman kanava epiteelisolulinja kuolemattomiksi transduktiolla E6 /E7-geenit HPV-16 (jalomielinen lahjoitus tohtori Ming-Sound Tsao, University of Toronto, Ontario, Canada [18]), kasvatettiin serum- free keratinosyyttien väliaineessa kuten aiemmin on kuvattu [18]. Hiiren alkion fibroblasteja (MEF), joiden stabiili ekspressio p27

Kip1 (+ /+) ja p27

Kip1 (- /-), saatiin tohtori Pledger (Moffitt Cancer Center) [19], [20] ja kasvatettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% FBS: ää.

transfektio ja Generation stabiilien kloonien

MiaPaca-2 /shRNA p27

Kip1 ja MiaPaca-2 /vektori muodostettiin transfektoimalla MiaPaca-2-soluissa P27

Kip1 shRNA jo kloonattu pSuperiorRetroPuro vektoriin (OligoEngine, Seattle, WA), ystävällinen lahja Dr. J. Chen (Moffitt Cancer Center) [21]. Vakaa puromysiiniresistenttiä kloonit valittiin. Transfektiot suoritettiin Metafectene (Biontex Laboratories, Planegg, Saksa), valmistajan protokollan mukaisesti.

siRNA knockdovvn p27

Kip1 in MiaPaca-2 Cells

Pre-suunniteltu, siRNA on CDK-estäjä 1B (p27

Kip1, # 118714) ja epäspesifinen siRNA (# 4611) ostettiin Ambion (Austin, TX). MiaPaca-2 solut levytettiin yön yli 12-kuoppalevyillä ilman antibioottia. Ohimenevä transfektio siRNA suoritettiin käyttäen Oligofectamine reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 5 nM p27

Kip1 siRNA tai ohjata siRNA sekoitettiin Opti-MEM-elatusainetta (Invitrogen) kokonaistilavuudessa 90 ui ja sitten kompleksoitu 2 ui Oligofectamine ja 8 ui Opti-MEM (kokonaistilavuus kompleksi oli 100 ui). Ennen transfektiota, vanha väliaine heitettiin pois, solut pestiin tuoreella Opti-MEM, ja 400 ui tuoretta Opti-MEM pantiin kuhunkin kuoppaan ennen kuin lisätään RNA-Oligofectamine monimutkainen. 8 tunnin jälkeen, 500 ui DMEM: ä, joka sisälsi 30% FBS: ää ja ilman antibiootteja lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin edelleen 40 tunnin ajan. Sen jälkeen, kun 40-tunnin transfektion jälkeen solut käsiteltiin δ-tokotrienoli vielä 24 tuntia ja korjataan trypaanisininen ja Western blot-analyysi.

Protein Extraction ja Western blot -analyysi

Viljellyt solut hajotettiin nisäkkäiden proteiinia uuttoreagenssi (Pierce, Rockford, IL), valmistajan protokollan mukaisesti. Vasta-aine p27

Kip1 hankittiin BD Bioscience (San Jose, CA). Membraanit blokattiin joko 5% maitoa PBS: ssä (pH 7,4), joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä tai 1% naudan seerumin albumiinia (BSA) TBS: ssä (pH 7,5), joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä Phospho-spesifisiä vasta-aineita inkuboitiin 2% BSA TBS (pH 7,5), joka sisälsi 0,1% Tween 20; kaikki muut vasta-aineet laimennettiin 5% maitoa PBS: ssä (pH 7,4), joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä yön yli 4 ° C: ssa. Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), laimennettiin 5% maitoa joko PBS: ää (pH 7,4), joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä tai TBS: ää (pH 7,5), joka sisälsi 0,1% Tween 20, jonka 1:1000 laimennus 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Western blotit visualisoidaan tehostetun kemiluminesenssin (Pierce). Käytimme beeta-aktiini hiiren monoklonaalinen vasta-aine (luettelo # 8H10D10) Cell Signaling yhdenvertaista Proteiinilisäyksen ja ilme.

Anchorage riippumattoman kasvun määritykset

pehmeä agar kasvun määritykset, solut ympättiin 1 x 10

3 solua /kaivo kolmena kappaleena 12-kuoppaisille kulttuuri ruokia 0,35% agar yli 0,6% agar-kerros. Eri pitoisuuksia δ-tokotrienolin tai ajoneuvon sisällytettiin 0,3% agar kerros soluja. Cultures ruokittiin ja käsiteltiin yhdisteellä tai ajoneuvon viikoittain, kunnes pesäkkeet kasvoivat sopivan kokoisiksi havainnointiin (~3-4 viikkoa). Pesäkkeet kuvattiin inkubaation jälkeen 1 mg /ml MTT: ssa yön yli ja laskettiin. Kasvu δ-tokotrienoli-käsitelty pesäkkeitä verrattiin apuaineella hoidettuun pesäkkeet (kontrolli). Kolme erillistä koetta suoritettiin.

FACS ja proliferaatiomääritystä

Eksponentiaalisesti kasvavat haiman soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin kasvavilla pitoisuuksilla δ-tokotrienolin tai ajoneuvon 24-72 tuntia. Kuopat tutkittiin solujen kasvun ja lisääntymisen käyttäen MTT kolorimetristä määritystä. IC

50 tulokset kutakin solulinjaa määritelty jokaiselle 24-tunnin kohdalla. Sillä solusyklin analyysi, haiman soluja kasvatettiin 70% konfluenssiin 100 mm: n maljoille ja sitten ilman seerumia 48 tunnin ajan, jotta synkronointiin. 48 tunnin kuluttua väliaine imetään pois ja tuoretta kasvualustaa δ-tokotrienolia (IC

50) tai ajoneuvon lisättiin 24 tunnin ajan. Käsitelty elatusaine kerätään sitten, monokerrokset pestiin kylmällä PBS: llä, solut trypsinoitiin ja solujen pelletit kerättiin. Cell pelletit pestiin kahdesti PBS: llä, kiinnitettiin kylmällä metanolilla ja pestään uudelleen PBS metanolin poistamiseksi. Uudelleensuspendoinnin jälkeen 300-500 ui PBS: ää, solut hajotettiin 20 ug /ml RNaasi ja solujen DNA värjättiin propidiumjodidilla (50 ug /ml) 3 tunnin inkuboinnin jälkeen huoneenlämpötilassa pimeässä. Solusyklin jakautuminen analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) järjestelmä (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

konfokaalimikroskopialla Analyysi

Käsitellyt MiaPaca-2-soluissa (50000) per 250 ui 20% FBS PBS: ssä lisättiin jokaiseen cytofunnel paikkaan ja sentrifugoitiin 570 rpm: llä 5 minuutin ajan voimakkaan kiihdytyksen. Levyt poistettiin ja kuivattiin ilmassa huoneen lämpötilassa. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan, pestiin kolme kertaa 1X PBS: llä sekoittaen 5 minuuttia /pesu, ja sitten läpäiseviksi 0,5% Triton X-100: ssa 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut blokattiin 2% PBS-BSA: ta (100 ui) 30 minuuttia, ja p27

Kip1-vasta-ainetta (1 :500) laimennus valmistettiin 2% BSA: ta pantiin suoraan. Leikkeitä inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa suljetussa kosteassa kammiossa. Sitten solut pestiin kolme kertaa 1X PBS: llä sekoittaen 5 minuuttia /pesu. Sekundaarinen vasta-aine (Alexa Fluor 594) PBS: ssä (1:500) valmistettiin ja lisättiin kiinteitä soluja. Leikkeitä inkuboitiin uudelleen 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa suljetussa kosteassa kammiossa ja pestiin sitten kolme kertaa 1X PBS: llä 5 minuuttia /pesu. Vectashield (50 ui) DAPI lisättiin, ja peitelaseja sovellettu. Kun oli inkuboitu 4 ° C: ssa pimeässä, objektilasit tutkitaan -konfokaalimikroskoopilla.

Sytosoliset ja Nuclear Protein Extraction

Proteiinit uutettiin käyttäen NE-PER Ydin- ja Sytoplasmiset Extraction Reagent Kit (Pierce ). Käsiteltiin MiaPaca-2-solut eristettiin 20 ui hematokriitin (40 mg) 1,5 ml: n mikrosentrifugiputkeen 5 minuutin sentrifugaatiolla 500 x g. Supernatantti heitettiin pois, solujen pelletit kuivattiin ja jääkylmää CER-1, joka sisälsi proteaasi-inhibiittorit (200 ui) lisättiin. Putket vorteksoitiin voimakkaasti 15 sekunnin ajan ja inkuboitiin jäillä 10 minuutin ajan. Seuraavaksi jääkylmää CERII (11 ui) lisättiin putkiin, jotka vorteksoitiin 5 sekuntia ja inkuboitiin jäillä 1 minuutin ajan, vorteksoitiin jälleen 5 sekuntia, ja sen jälkeen sentrifugoitiin 14000 x g 5 minuuttia. Supernatantti (sytosolinen uute) siirrettiin tuoreisiin ennalta jäähdytetty putkiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Olemme suspendoitiin liukenematon pelletti, joka sisälsi ytimiä 100 ui jääkylmää NER sisältävät proteaasi-inhibiittoreita. Putkia vorteksoitiin 15 sekuntia ja pidettiin jäillä 10 minuutin ajan. Tämä vaihe toistettiin neljä kertaa (40 minuuttia). Putket sentrifugoitiin 14000 x g 10 minuuttia, ja supernatantti (tumauutteesta) siirrettiin etukäteen jäähdytetty putkiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa.

Luciferase Reporter Assay

MiaPaca-2 -soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille 2 x 10

5 solua /kuoppa. Kukin kuoppa transfektoitiin seuraavana päivänä 2 ug p27

Kip1 lusiferaasireportteriplasmidi (täyspitkän p27

Kip1-1609, eri 5 ’deleetiomutanttien hiiren p27

Kip1 promoottorin lusiferaasireportteri- tai pGL- 3 pohja cDNA tyhjän vektorin, kaikki plasmidit tri Pantinantaja) yhdessä siRNA E2F-1 tai ei-kohde siRNA (Santa Cruz). Metafectene käytettiin transfektioreagenssi, valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lysaatit kerättiin 24 tunnin kuluttua δ-tokotrienoliin hoito (IC

50 50 uM). Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin Luciferase Assay-järjestelmän Kit (Promega). Normalisoidaan transfektion tehokkuuden, 200 ng Renillan reniformis lusiferaasin ekspressioplasmidin (PRL-TK vektori, Promega) sisällytettiin transfektioon.

RT-PCR-analyysi

MiaPaca-2-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin δ-tokotrienolia (IC

50 50 uM) tai vehikkeliä (kontrollina) 24 tunnin ajan. Sitten solut otettiin talteen 1X lyysipuskuria, ja RNA eristettiin käyttäen Allprep RNA /proteiini mukainen pakkaus, valmistajan ohjeiden mukaisesti (Qiagen, Valencia, CA). Käänteistranskriptio kokonais-RNA suoritettiin käyttäen SuperScript III (Invitrogen). Seuraavat forward- ja reverse-alukkeet, vastaavasti, käytettiin PCR-reaktiossa, sillä p27

Kip1, 5′-TAACCCGGGACTTGGAGAAG ja 5′-GCTTCTTGGGCGTCTGCTC monistamaan 450 bp: n tuote; aktiinin, 5′-GCTCGTCGTCGACAACGGCT ja 5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC monistamiseksi 353-bp tuote. Välttää overamplification, p27

Kip1 mRNA: n ilmentymisen tasot määritettiin RT-PCR: llä eri monistussykliä (20, 25, 30, ja 40 PCR-sykliä) ja analysoitiin agaroosigeelielektroforeesilla. Edustavia tuloksia sykli 40 on esitetty.

sykloheksamidin Blocks proteiinisynteesiä

Kun 12 tunnin δ-tokotrienoliin hoito (IC

50 50 uM), δ-tokotrienoli poistettiin huuhtomalla MiaPaca -2 soluja kolme kertaa PBS; syklohek- (40 ug /ml) käytettiin sitten estää proteiinisynteesiä. P27

Kip1 vaihtuvuus tutkittiin Western blot.

Ethics lausunto

Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals että National Institutes of Health. Protokolla hyväksyttiin University of South Florida Institutional Animal Care ja Käytä komitea (Application 2805).

antituumorivaikutuksen in Nude Mouse ksenograftimallia

Käytimme nainen kateenkorvattomissa nude (nu /nu) hiiriin, 5-6 viikkoa vanhoja (Charles River, Wilmington, MA), meidän eläinkokeissa. Eläimet pidettiin puhtaana häkeissä rajoitettu 4 hiirtä häkkiä kohden. Hiiriä hoidetaan runsaasti ruokaa ja vettä ja tutkittiin päivittäin. Jos kasvaimet puuttua ambulation, aiheutti merkkejä laihtuminen 10%, aiheutti hengitysvaikeuksia, tai kasvoi 2 cm kokoinen, hiiret inhimillisesti eutanasia altistuminen kasvavia pitoisuuksia hiilidioksidia.

MiaPaca-2-solut kerättiin ja suspendoitiin PBS: ään (1 x 10

6 solua /50 ui), ja yhtä suuri tilavuus Matrigel (BD Biosciences). Cell näytteet (100 ui) injektoitiin sitten ihonalaisesti oikeaan kylkeen. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet 250 ja 300 mm

3, hiiret satunnaistettiin ryhmiin 10 ja annostellaan letkulla suun kautta 0,1 ml ajoneuvon (puhdistettu oliiviöljy) tai δ-tokotrienoliin (100 mg /kg) päivässä 3 viikon ajan. Kasvaintilavuudet määritettiin kahdesti viikossa mittaamalla pituus (

l

) ja leveys (

w

) ja laskemalla tilavuus: V = (

l

+

w

) /2 x (

l

×

w

) x 0,5236. Tilastollinen merkitys välillä ohjaus ja hoidettujen eläinten määritettiin käyttämällä Studentin

t

-testissä.

immunohistokemia ja Slide kvantitointi

Kasvaimet alkaen vierassiirrekokeissa fiksoitiin 4% paraformaldehydi, pH 7,2 . Kiinnityksen jälkeen kudosnäytteet jalostetaan parafiinilohkoihin. Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään tässä tutkimuksessa olivat hiiren monoklonaalista (p27, p-MAPK: n, ja Ki-67) vasta-aineita vastaan, jotka vastaavat antigeenejä ihmisperäisten parafiiniin upotetut leikkeet. Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin Ventana BenchMark XT (Tucson, AZ) automatisoitu dia värjäyslaitteella käyttäen 4-pm paksu parafiinileikkeillä kustakin edustajan kasvainkudospalasta valittu. Leikkeet poistettiin parafiini, vedettömät, ja inkuboitiin 3% H

2O

2 endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi. Sen jälkeen kun antigeeni paljasten käyttäen omaa CC1 ratkaisu 60 minuuttia verkossa (vakio) 100 ° C: ssa, leikkeitä inkuboitiin vasta-aineita p27 (Kip 1, cloneSX53G8) (proprietary laimennus, Cell Marque, Rocklin, CA) ja Ki-67 (proprietary laimennus, Ventana, Tucson, AZ). Inkubaatioajat olivat 32 minuutin P27 ja Ki-67, mukaan valmistajan ohjeiden. Fosfo-P44 /42 MAPK rabbit monoklonaalinen vasta-aine (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) (luettelonro. 4376, Cell Signaling, Danvers, MA) käytettiin 1: 200-pitoisuus PSS laimennusaineet (Ventana) ja inkuboitiin 32 minuutit. Ventana anti-kani sekundääristä vasta-ainetta käytettiin 20 minuuttia. Sitten leikkeitä altistettiin biotiini lohkoon käyttäen Ventana endogeeninen biotiini Kit (Ventana). Leikkeitä inkuboitiin biotiinilla-leimatun sekundaarisen vasta-aineen ja streptavidiini-peroksidaasia 30 min (DAKO Diagnostics). Liuosta, jossa oli 3,3′-diaminobenzidene tetrahydrochloride (Sigma, St. Louis, MO) käytettiin kromogeenina seuraa natriumatsidia ja 20 ui H

20

2 100 ml: ssa Tris-HCl: ää (50 uM, pH 7,6). Sen jälkeen valo vastavärinä kanssa Harrisin hematoksyliinillä, kohdat tutkittiin valomikroskoopilla.

arviointi tahrat

Immuunihistokemialliset ilmentymistä p27, p-MAPK, ja Ki-67-proteiineja määritettiin tuote immunostain intensiteetti ja prosenttia soluja värjätään. Nämä pisteytettiin 0-3 mittakaavassa, jossa 3 on maksimaalinen. Immunostain intensiteetti pisteytettiin ilman värjäystä on 0, valo värjäystä kuin 1, kohtalainen värjäytyminen kuin 2, ja raskas värjäytyminen kuin 3. prosenttia solun värjätään mitattiin ilman havaittavaa värjäytymistä kuin 0, 1-33% kuten 1, 34- 66% kun 2, ja 67-100% kuten 3. lopullinen IHC pistemäärä oli tuote prosentuaalisen värjättyjen solujen pisteet kerrotaan intensiteetti pisteet, mikä mahdollistaa maksimaalisen pisteet 9 ja minimaalinen pisteet 0

tilastollinen analyysi

Data ilmaistuna keskiarvoina ± SEM, analysoitiin tilastollisesti käyttämällä paritonta t-testejä tai yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) tarvittaessa. Käytimme GraphPad Prism versio 5.04 meidän analyysejä. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin

P

0,05.

Tulokset

δ-tokotrienoliin Estää Anchorage riippuva ja riippumattaman Cell Growth ja indusoi G

1 pidätyksen haimasyöpäsoluissa

vaikutuksia δ-tokotrienolia (1A) solujen kasvua MiaPaca-2, BxPC-3, ja SW1990 ihmisen haimasyövän soluja tutkittiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2- yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) soluproleferaatiomäärityksessä. Soluja käsiteltiin 0-50 uM δ-tokotrienolia 24, 48, ja 72 tuntia. Vaikutukset δ-tokotrienoliin arvioitiin myös ei-transformoidut ihmisen haimatiehyen epiteelisolulinja HPDE6 C7 poissulkemiseksi mahdollisia sytotoksisia vaikutuksia δ-tokotrienoliin ei-neoplastisten solujen. δ-tokotrienoliin hoito esti kiinnittymisestä riippuvaisen soluproliferaation sekä ajasta ja pitoisuudesta riippuvaisella tavalla ihmisen haimasyövän soluja (kuvio 1 B); kuitenkaan mitään merkittävää kasvua estäviä vaikutuksia havaittiin HPDE6 C7 soluissa. δ-tokotrienoliin hoito myös esti merkittävästi pesäkkeenmuodostusta MiaPaca-2 soluja kasvatettiin pehmeä agar 2,5 uM (

P

= 0,02) (kuvio 1 C).

, Kemialliset rakenteet tokotrienolien. B, δ-tokotrienoli estää selektiivisesti haimasyöpä soluproliferaatiota. HPDE6 C7 ja ihmisen haimasyövän solulinjoissa MIAPaCa2, BXPC3, ja SW1990 käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla δ-tokotrienolin tai ajoneuvon ja analysoitiin MTT 24, 48, ja 72 tuntia. Tulokset osoittavat, estää selektiivisesti haiman syöpäsoluissa ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla. C, δ-tokotrienoli estää kiinnittymisestä riippumattomaan kasvuun transformoitujen MiaPaca-2 haimasyövän soluja. Pesäkkeiden määrä normalisoitiin ja verrattuna ajoneuvoon. * Pitoisuus, jolla tilastollista merkittävyyttä alkaa. D, vaikutukset δ-tokotrienoliin solusyklin etenemisen. Haimasyövän soluja ja HPDE6 C7 soluja inkuboitiin, kun läsnä oli δ-tokotrienolia (IC

50) (harmaa) tai vehikkeliä (musta) kontrollina 24 tuntia. Solut kerättiin määrittämiseksi solusyklin jakautuminen FACS-analyysillä sen jälkeen, kun solujen propidiumjodidilla. Kukin analyysi edustaa keskiarvoja ± SD 3 riippumattoman kokeen. δ-tokotrienoliin estää G

1-to-S solusyklin etenemisen valikoivasti transformoiduissa haimasyövän solulinjoissa.

δ-tokotrienoliin hoito oli myös merkittävä selektiivinen vaikutus solusyklin etenemisen, kuten osoituksena kasvu prosenttiosuuden haimasyöpäsoluissa mutta ei HPDE6 C7 solut G

1 vaihe (

P

0,001 vs.

P

= 0,92) (kuvio 1 D ). Huomasimme, että haiman syöpäsoluja kerääntynyt G

1 vaihe kustannuksella väheneminen S-vaiheen väestöstä.

δ-tokotrienoliin indusoi p27

Kip1 Expression ja estää RAS-MEK -ERK Signaling

asetus solunsisäisten signalointireittien on keskeinen kyky onkogeenien edistää solusyklin etenemisen. Kaksi suurta reittejä läheisesti mukana G

1-to-S poikittainen ovat RAS-aktivoitua RAF-MEK-ERK ja PI3-AKT reittejä. Nämä reitit vaikuttavat ilmaisua, toimintaa, tai solunosasijaintia avaintekijät solusyklin koneita kuten sykliinejä, CDK, ja CDK-inhibiittorit, mikä sopiva aktivointi E2F-1 transkriptiotekijöiden. Useita aineita on kuvattu, jotka säätelevät G

1 poikittainen ja siirtyminen S-vaiheeseen haiman syöpäsoluissa, ja p27

Kip1 on raportoitu korotetaan nämä aineet [22], [23], [ ,,,0],24], [25], [26]. Siksi määritettiin kinetiikkaan p27

Kip1 tasoja ja RAF-MEK-ERK-reitin aktiivisuuden haimasyöpäsoluissa ja HPDE6 C7 solut altistetaan δ-tokotrienoliin. Olemme havainneet, että δ-tokotrienoli huomattavasti p27

Kip1 tasolla 6 tuntia haimasyövän soluja (kuvio 2A). Tämä lisääntynyt taso säilyi ja kasvoi kaikilla solulinjoissa 48 tuntia ja liittyy vastaavaan esto aktiivisuuden aktivoituneen RAF-MEK-ERK signalointireitin, mitattuna laski fosforyloidun MEK ja ERK tasoilla haimasyöpäsoluissa (kuvio 2A ). Sen sijaan PI3-AKT-reitin alun perin indusoitiin 12 tuntia, minkä jälkeen myöhemmin inhibitio 24 tuntia, mitattuna fosforyloidun AKT tasot (kuvio 2A ja 2B). Yhdenmukainen vaikutus proliferaatioon, δ-tokotrienoli tukahdutetaan p27

Kip1 tasoilla transformoimattomina ihmisen haimatiehyen solulinjaa, HPDE6 C7, ja ei ollut vaikutusta MEK, ERK tai AKT. Osoitimme myös, että vaikutukset δ-tokotrienoliin olivat ominaisia ​​pahanlaatuisia soluja, kuten δ-tokotrienoliin ei indusoinut p27

Kip1 tasoja tai muuttaa MEK, ERK tai AKT ilmaisun transformoimattomina haimatiehyen epiteelisolujen. Mekanismit Tämän tarvitsevat lisätutkimuksia.

, haimasyövän ja HPDE6 C7 soluja käsiteltiin δ-tokotrienoliin ennalta IC

50 jokaista solulinjaa. Proteiini lysaatit 0-48 tuntia kerättiin ja analysoitiin Western blot-analyysi Ras onkogeeniset signalointi tavoitteita, MEK ja ERK, ja p27

Kip1. Tulokset edustavat 3 itsenäistä koetta. δ-tokotrienoliin estää selektiivisesti MAP kinaasisignaloinnin ja lisää p27

Kip1 ilmentymistä transformoiduissa haiman syöpäsoluja. B, MiaPaca-2-soluja käsiteltiin δ-tokotrienoliin ennalta IC

50. Proteiini lysaatit 0-24 tuntia kerättiin ja analysoitiin Western blot varten AKT ja alavirran kohde GSK-3β. C, MiaPaca-2-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai δ-tokotrienoli in FBS: ää 12 tunnin ajan, ja puhdas ydin- ja solulimafraktioita eristettiin. Western-blotit osoittavat kohonneeseen p27

Kip1 in δ-tokotrienoliin käsitellyt solut suuria pitoisuuksia tumassa. D samanaikaisesti koko solut värjättiin immunofluoresenssimenetelmällä p27

Kip1 vasta-aineella ja analysoitiin fluoresoivalla mikroskoopilla p27

Kip1 lokalisointi. δ-tokotrienoliin lokalisoitu p27

Kip1 tumaan samanlainen nälkään tilaan, kun taas seerumin käsiteltyjä soluja osoitti yhtäläinen p27

Kip1 tumassa ja sytoplasmassa. E, δ-tokotrienoli (DT3) estää tuumorisolujen kasvua MiaPaca-2-soluja, kun läsnä on lisättyä mevalonaatin, metaboliitti HMG-CoA-reduktaasin. MiaPaca-2-soluja (96-kuoppaisilla levyillä) käsiteltiin 24 tunnin ajan δ-tokotrienolin tai lovastatiinin puuttuessa tai kasvavien pitoisuuksien läsnä mevalonaatin. MTT tulokset osoittavat, että mevalonaatin pelastaa kasvua estäviä vaikutuksia lovastatiinin, mutta ei että δ-tokotrienoliin. Vuonna E, linjat 1 ja 7 ei ollut δ-tokotrienoliin (DT3) tai lovastatiinia.

Lisäksi modulaatio sen ekspressiotasoja, solunosasijaintia on tärkeää myös säätelevät p27

Kip1 toiminto. Toimia solukierron estäjä, p27

Kip1 on sijaittava tumassa, kun taas sen soluliman mislocalization suosii solusyklin etenemisen ja voi osaltaan solutransformaatioon [27], [28]. Kuvio 2C esittää, että p27

Kip1 arvot kohoavat sekä sytosolin ja ydinvoima osastoissa δ-tokotrienoliin käsiteltyä MiaPaca-2-soluissa verrattuna ajoneuvoon. Kuviossa 2D, havaitsimme p27

Kip1 sytoplasmisen kerääntymisen vehikkelillä käsiteltyjen MiaPaca-2-soluja vastaan ​​kasvoi p27

Kip1 tasot ydin- osaston seerumia lepotilassa MiaPaca-2-solujen ja δ-tokotrienoli-käsitelty MIAPaCa- 2-soluissa. Jotkut tutkijat ovat ehdottaneet, että tokotrienoleja moduloivat HMG-CoA-reduktaasin aktiivisuuden kautta transkription jälkeinen toimia estäen siten farnesyloitumista alavirran onkogeenisten signaloinnin tavoitteet, samanlainen vaikutus lovastatiinin [29], [30], [31]. Sen määrittämiseksi, onko δ-tokotrienoliin estää leviämisen kautta mevalonaatin reitin esto, käsittelimme MiaPaca-2-solujen δ-tokotrienoliin tai lovastatiinin ja kasvavien pitoisuuksien kanssa mevalonaatin, loppupään tuote HMG-CoA-reduktaasin. Lisäksi mevalonaatin ja ö-tokotrienoliin käsiteltyjä soluja ei johtanut merkittävää pelastus kasvusta estäviä vaikutuksia δ-tokotrienoliin on MiaPaca-2-soluissa (kuvio 2E); kuitenkin, lovastatiini kyky estää proliferaatiota pelastettiin mevalonaatin.

p27

Kip1 tarvitaan δ-tokotrienoliin aiheutetun G

1 pidätys

määrittämiseksi roolin p27

Kip1 induktio in δ-tokotrienoliin haiman syöpäsolujen kasvun estäminen, me ohimenevästi alennetaan p27

Kip1 ilmentymistä MiaPaca-2-soluissa käyttäen p27

Kip1 sirna (siRNA; vahvistettiin Western blot). 24 tunnin puuttuminen p27

Kip1 ilmentyminen merkitsevästi kumottu δ-tokotrienoli-indusoitua solun kasvun esto (kuvio 3A). Vahvista Näiden havaintojen stabiileja solulinjoja ilmentävät p27

Kip1 lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) tai vektori luotiin käyttäen MiaPaca-2-soluissa. Alennettu p27

Kip1 ilmentyminen vahvistettiin Western blot -analyysillä. Kuvio 3B esittää, että ehtyminen p27

Kip1 johti resistenssiä δ-tokotrienoliin hoitoa. Tutkia nämä havainnot voidaan yleistää yli MiaPaca-2-solut, analysoimme vakaa MEF [19], [20] jolla p27

Kip1 knock-out tai villin tyypin solujen jälkeen δ-tokotrienoliin hoitoa. Olemme havainneet, että ei ole p27

Kip1 sulatettu MEF osittain resistentti anti-proliferatiiviset vaikutukset δ-tokotrienoli tässä solulinjassa (kuvio 3C). Yhdessä nämä tutkimukset korostavat p27

Kip1 in δ-tokotrienoliin aiheuttama G

1 pidätyksen ja osoittavat, että panos tämän CDK-inhibiittori ei ole solulinjassa erityisiä.

, P27

Kip1 siRNA vaimentaa δ-tokotrienoliin välittämää kasvun hidastuminen ihmisen MiaPaca-2 haiman syöpäsoluja.