Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa microRNA (miRNA) allekirjoitus tunnistettiin gemsitabiinin kestävä haiman adenokarsinooma (PDAC) solulinja malli (BxPC3-GZR) ja tämä allekirjoitus tutkittiin edelleen kehittyneissä PDAC kasvaimen yksilöitä Cancer Genome Atlas (TCGA) tietokantaan. BxPC3-GZR osoitti mesenkymaaliset fenotyyppi ilmaistuna korkeita CD44 ja osoittivat erittäin merkittävä vapauttaminen 17 miRNA. Perustuen merkitystä syövän, seitsemän miRNA allekirjoitus (miR-100, miR-125b, miR-155, miR-21, miR-205, miR-27b ja miR-455-3p) valittiin jatkotutkimuksiin. Vahva korrelaatio havaittiin kuusi seitsemästä miRNA 43 kehittynyt kasvain yksilöitä verrattuna normaaliin haiman kudosta. Arvioida toiminnallinen merkitys me aluksi keskittyi miRNA-125b, joka on yli-ilmentynyt sekä BxPC3-GZR malli ja kehittyneet PDAC kasvain yksilöitä. Knockdovvn miRNA-125b in BxPC3-GZR ja Panc-1-solujen aiheuttama osittainen käänteinen mesenkymaalisten fenotyypin ja tehostettu vaste gemsitabiinia. Lisäksi RNA-seq tiedot kustakin 40 kehittyneen PDAC kasvain yksilöitä TCGA tietokannasta osoittavat negatiivisen korrelaation ilmaisua miRNA-125b ja viisi kuudesta mahdollisten kohdegeenien (

BAP1

,

BBC3

,

NEU1

,

BCL2

,

STARD13

). Toistaiseksi kaksi näistä kohdegeenien,

BBC3

ja

NEU1

, jotka ovat tuumorisuppressorigeeneille mutta ei vielä tutkittu PDAC, näyttävät olevan toiminnallisia tavoitteita miR-125b alkaen knockdovvn miR125b panivat ylös sääntelyä. Nämä miRNA ja niiden molekyylitason tavoitteet voivat toimia kohteina parantaa herkkyyttä kemoterapiaa ja vähentää metastaaseja.

Citation: Bera A, VenkataSubbaRao K, noharan MS, Hill P, Freeman JW (2014) miRNA allekirjoitus solunsalpaajaresistentti mesenkymaaliset Fenotyyppikuvaus Tunnistaa Novel molekyylikohteista Associated Advanced Haimasyöpä. PLoS ONE 9 (9): e106343. doi: 10,1371 /journal.pone.0106343

Editor: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 06 heinäkuu 2014; Julkaistu: 03 syyskuu 2014

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Data Saatavuus: Kirjoittajat vahvistaa, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Käytimme tietoja analyysimme muodostavat julkisen arkiston – Cancer Genome Atlas (TCGA) Data Portal https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/. Tämä tarjoaa foorumin tutkijoille etsiä, ladata ja analysoida aineistoja syntyy TCGA. Se sisältää kliiniset tiedot, genomin kartoitus data, ja korkea sekvenssianalyysi kasvaimen genomien.

Rahoittajat: rahoituksensa National Institutes of Health-RO1CA069122 ja JWF, Veterans Affairs kunniapalkinnon 1I01BX000927 on JWF ja William ja Eula Owens Medical Research Foundation JWF. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

PDAC on edelleen pahin ennuste tahansa kiinteä kasvain. Vuonna 2013, on arvioitu, että yli 45000 uutta tapausta diagnosoidaan Yhdysvalloissa kuolleisuus on ilmaantuvuussuhde lähes yhtä suuri kuin yksi [1]. Gemsitabiini on yleisimmin käytetty kemoterapian haimasyöpä, mutta on merkittävästi metaboloituu plasmassa, ja siksi tarvitaan suuria annoksia johtaa myrkyllisyys [2]. Monet PDAC ovat aluksi vastustuskykyisiä gemsitabiinin ja reagoiva ne yleensä kehittää resistenssin aikana hoidon [3].

Vielä on selvitettävä, onko solunsalpaajaresistentti fenotyyppi indusoidaan seurauksena hoito vai onko alaryhmässä syövän solujen kasvain, joka on synnynnäisesti enemmän resistenttejä. Viimeaikaiset todisteet osoittavat, että suurin osa kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien PDAC omaavat erilaisia ​​alapopulaatio syövän kantasoluja (CSCS). Näyttöä on myös siitä, että CSCS ovat luonnostaan ​​vastustuskykyisiä kemoterapiaa ja hyödyntää itseuudistumisen potentiaalia uudistua uuden kasvaimen kasvua [4]. Aiemmassa tutkimuksessa on yhdistää CSCS epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) [5].

EMT edustaa trans-eriyttäminen ohjelma, joka tarvitaan kudoksen morphogenesis aikana eri cellular kehityshäiriöitä etenemistä [6]. EMT prosessi voidaan säätää monipuolisista sytokiinien ja kasvutekijöiden, kuten TGF-β, joiden toiminta vapautettu aikana syövän etenemistä [7]. EMT induktio syöpäsoluissa tulosten hankinnassa invasiivisen ja metastaattisen ominaisuuksia. Tutkimukset osoittavat myös, että EMT myötävaikuttaa myös chemoresistance ja että nämä solut omaavat CSC merkkiaineita [8]. Kehittäminen chemoresistance syöpäsoluissa ja syöpälääkkeiden kuten gemsitabiinia voidaan säännellä tai osaltaan mikro-RNA: t (miRNA). miRNA ovat pieniä ei-koodaava RNA-molekyylejä (22 nukleotidia), joka keskeisessä asemassa ovat transkription geenin ilmentymisen säätelyyn. Kehittäminen chemoresistance lisäämällä määrää CSCS syyksi on muutoksiin tasolla miRNA haiman ja muita kiinteitä kasvaimia [9].

Viimeaikaiset havainnot osoittavat keskinäisistä suhteista miRNA, EMT fenotyyppi, CSCS ja chemoresistance [10], [11]. Tutkimukset viittaavat myös siihen, että miRNA rooli säätelyssä EMT prosessi [3], [11]. Esimerkiksi miRNA on osoitettu ajaa EMT säätelemällä kadheriinin 1 ja lisäksi EMT liittyvien molekyylien [12]. MiR-200a miR-200b ja miR-200C oli alaspäin säännelty gemsitabiinin kestävä haimasyöpäsoluissa [13]. Tutkimukset osoittavat myös, että uudelleen ilmentymisen miR-200 perheen miRNA up säänneltyjen kadheriinin 1 ja säädeltiin ZEB1 ja vimentiinista [14]. Lisäksi syöpäsolut EMT fenotyyppi ja jotka olivat resistenttejä gemsitabiinin osoitti alas säätely let-7 jäsentä [5], [15], [16]. In vitro tutkimukset PDAC osoittavat sidoksen keskuudessa EMT, invasiivisuus ja kestävyys kemoterapiaa ja muut tutkimukset tukevat käsitystä, että miRNA osansa näissä prosesseissa säätelemällä geenin ilmentymistä [3], [11].

Tässä Tutkimuksella pyrittiin tunnistamaan miRNA allekirjoituksen PDAC soluja, jotka omistavat solunsalpaajaresistentti ja mesenkymaaliset fenotyyppi (CRMP). Koska potilaalla on kehittynyt PDAC näyttäisikin minimaalinen vaste kemoterapiaan me vielä selvitettävä, onko tämä miRNA allekirjoitus saattavat heijastua niiden tuumorikudoksissa. Nämä tutkimukset osoittavat, että gemsitabiinihoidon indusoi solujen populaation kanssa CRMP in vitro ja että miRNA allekirjoituksen valittu tätä CRMP on jaettu kasvaimia yksilöt kehittyneitä PDAC. Lisäksi tämä tutkimus pystyi aluksi olla käytännön merkitystä yksi yli ilmaisi miRNA (miR-125b) tämän allekirjoituksen ja mahdollisten tuumorisuppressorigeenin kohdegeenien. Tutkimus tarjoaa perustan edelleen dissecting roolit miRNA in CRMP. Nämä miRNA ja niiden molekyyli- tavoitteet voivat tarjota uusia terapeuttisia strategioita poistamiseksi tuumorisolupopulaatioon, joka on yleensä resistenttejä gemsitabiinin ja mahdollisesti muiden kemoterapia.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Gemsitabiini ostettu LKT Laboratories, Inc (St. Paul, MN) liuotettiin steriiliin PBS-liuosta. Käänteinen transkriptio reagenssit ja TaqMan reaaliaikainen PCR master-mix hankittiin Applied Biosystems /Life Technologies (Foster City, CA). Kaikki muut kemikaalit saatiin yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Solulinjat

Ihmisen haiman adenokarsinooman solulinjan BxPC3, Capan-2, AsPC-1 ja Panc-1 hankittiin ATCC ja viljeltiin niitä DMEM (paitsi BxPC3) 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS), kosteutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa. BxPC3 viljeltiin RPMI media 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 10% FBS. Tämä PDAC solulinja BxPC3 oli ohimenevästi alttiiksi neljä tuntia joka seitsemäs päivä kasvavien pitoisuuksien kanssa (50 ng 1,5 ug /ml) Gemsitabiinin yli kuuden viikon ajan. Saatu gemsitabiinin resistentti solulinja kutsutaan BxPC3-GZR. Ylläpitoon, BxPC3-GZR soluja lisättiin kasvatusväliaineeseen ja jäädytettiin erinä. Kokeisiin BxPC3-GZR solut sulatettiin ja annettiin laajentua viljelmässä kaksi päivää ja käsiteltiin sitten gemsitabiinin (1,5 ug /ml) neljän tunnin ajan. Gemsitabiini poistettiin ja BxPC3-GZR solut kerättiin seuraavana päivänä kokeisiin mukaan lukien laadunvalvonta Westerns blotteja osoittaa, että hankitun EMT fenotyyppi säilyi.

Western blotit analysoidaan ja immunofluoresenssivärjäyksen

Western blot -analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [17]. Ensisijainen vasta olivat seuraavat: E-kadheriinin ja Neu1 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA); CD44, beeta-aktiini ja PUMA (

BBC3

) ostettiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA), vimentiinistä Life Technologiesin (Carlsbad, CA). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Immunofluoresenssitutkimuksia (IF) värjäys, soluja kasvatettu pyöreä kansi luistaa 24-kuoppalevylle. Vahvistamisesta ja immunovärjäämällä seuraa kuvien suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18].

Matrigel Cell Invasion määritykset

invasiiviset käyttäytymistä solujen analysoitiin Matrigel invaasion määritykset kuten aiemmin on kuvattu [17], [18].

ilmaisu profilointi miRNA

Yhteensä RNA myös pienten ei-koodaavan miRNA eristettiin BxPC3 ja BxPC3-GZR käyttäen mirNeasy (Qiagen) per valmistaja menettelyjä. Expression analyysin miRNA sekä ohjaus BxPC3 ja BxPC3-GZR soluista suoritettiin LC Sciences (Houston, TX) käytetään patentoitua μParaflo mikrofluidinen biosiru tekniikkaa. Merkittävät muutokset miRNA ilmentyminen analysoitiin t-testi, kuten LC Sciences (Houston, TX). Vain eniten merkittäviä muutoksia sekä yli ja alle ilmaistuna miRNA katsottiin edelleen analyysi (taulukko 1).

Käänteinen transkriptio ja Kvantitatiivinen TaqMan-PCR

TaqMan-geeni-ilmentymisen määrityksissä ( Life Technologies, Carlsbad, CA) käytettiin määrittämään ekspressiotasoja sekä mRNA: n ja kypsä miRNA. Kokonais-RNA uutettiin Mirvana (Life Technologies, Carlsbad, CA) RNA: n eristys kit ja seuraa käänteistranskriptio reaktioseoksessa, joka sisälsi satunnaisia ​​heksameerialukkeita (mRNA: n RT-PCR) ja miR-specific varsi-silmukka-RT-alukkeita (ja miRNA RT- PCR). Kvantitatiivinen PCR suoritettiin kolmesti reaktioihin, jotka sisälsivät monistetun cDNA ja TaqMan alukkeita Universal Master Mix ilman AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) seuraamalla valmistajan protokollaa. Kaikki mRNA tiedot ja miRNA data on ilmaistu suhteessa 18S ja U6 vastaavasti TaqMan PCR suoritettiin samalla näytteistä, ellei toisin mainita. Kertainen ilmentyminen laskettiin kolmena C

T arvot käyttämällä 2

-ΔΔC

T -menetelmä.

Stable solulinja sukupolven miR-125b Knockdown

gemsitabiini kestävä BxPC3-GZR ja Panc-1-soluja käytettiin miR-125b kaataa tutkimus. System Bioscience n (SBI, Mountain View, CA) miRZipTM anti-sense miRNA stabiilisti ilmaistu RNAi pinnit, jotka estävät miRNA aktiivisuutta. MiRZip shRNAs tuottaa lyhyitä, yksijuosteisia anti-miRNA että kilpailukykyisesti sitovat heidän endogeenistä miRNA tavoite ja estää sen toimintaa. MiRZip lyhyt hiusneula-RNA: t kloonataan SBI: n pGreenPuroTM shRNA ekspressiovektoriin, parannettu kolmannen sukupolven HIV-pohjainen ekspressio lenti-vektoriin. Lentivirusvektorin sisältää geneettiset elementit vastaavat pakkaukset, transduktio, ja vakaa integraatio viruksen konstruktin osaksi genomi-DNA, joka indusoi ekspressiota anti-miRNA efektori-sekvenssin. Tuotantoon korkean tiitterin viruspartikkelien, käytimme ViraPowerTM Lentivirusvektorikonstruktit Support Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) käyttämällä LipofectamineTM 2000 (Invitrogen) ja transfektoidaan miRzip vektorit HEK-293T-soluihin. Koska infektoidut solut ilmentävät stabiilisti GFP ja puromysiinin, samoin kuin anti-miRNA kloonattu miRZipTM vektoriin, käytimme puromysiini valitsemiseksi infektoituneiden solujen kätkeminen miRzip. Sen jälkeen seulonta me eristetty BxPC3-GZRΔmiR-125b tai Pancin-1ΔmiR-125b soluissa. Vuonna samalla tavalla myös luotu Zip ohjaus sekä solu- linjat miRZipTM vektori. Määrittämiseksi lääkeaineen herkkyys, soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuudet gemsitabiinin 96 tuntia ja MTT-analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [19].

miRNA ja transcriptome profiloinnin kasvaimen tietojen Cancer Genome Atlas (TCGA)

miRNA:

taso 3.1.1.0 miRNA järjestyksessä dataa TCGA data portaali ladattiin 43 kasvainnäytteestä yhdellä normaalia kudosta. Tietojen matriisi valmistettiin yhdistämällä raaka lukea laskee 1046 miRNA 44 [43 kasvain ja 1 normaali] näytteitä. Perustuu oletukseen, että miRNA sekvenssi data noudattaa negatiivinen binomijakauma [20], [21] luku- määrä oli koko tekijän normalisoidaan käyttäen DESeq versio 1.10.1 [22] paketin R version 2.15.3. Normalisoitu luku- määrä dataa käytetään laskemaan log2 kertaluokkamuutos välillä kasvain ja normaali näytteitä.

transcriptome:

taso 3.1.1.0 RNA-sekvenssin tietoja TCGA data portaali ladattiin 40 kasvainnäytteestä yhdellä normaalia kudosta kontrollina. Käytimme RSEM ohjelmisto määrittämiseksi määrän selostukset RNA-Seq data. RSEM yläkvartiili normalisoitu lukea laskee dataa 41 (40 kasvainten ja 1 normaali) kudosnäytteitä käytetään laskemaan log2 kertaluokkamuutos välillä kasvain ja normaali näytteitä.

Tilastollinen

Opiskelijan pariton t- testiä käytettiin vertaamaan yksittäisen ryhmän avulla. P-arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki arvot sekä teksti ilmaistiin keskiarvona ± SD

Tulokset

Generation of haimasyöpä CRMP solulinjassa malli

PDAC solulinja BxPC3 oli lyhytaikaisesti alttiiksi pitoisuuksia nostettiin gemsitabiinin yli kuuden viikon ajan. Saatu gemsitabiinin kestävä BxPC3-GZR soluja verrattiin vanhempien BxPC3 solujen erot morfologiassa, vastauksena gemsitabiinin, ilmentymisen mesenkymaalisten, epiteelin markkerit ja CD44. Vertailut morfologia osoittavat, että vanhempien BxPC3 solut kasvoivat tiiviisti pakattu alueilla ja oli tasainen ja pyöristetty ulkoasu, tunnusmerkki epiteelin kaltainen morfologia; ottaa huomioon, BxPC3-GZR solut kasvoivat löysästi liittyvät solujen karamaisen morfologia ominaisuus mesenkymaaliset fenotyypin (Fig. 1A). Herkkyys gemsitabiinihoidon verrattiin välillä BxPC3-GZR ja vanhempien BxPC3 soluja. BxPC3-GZR solut osoittivat suurempi kuin kaksinkertaiseksi reaktion heikentymistä gemsitabiiniannokseen verrattuna sen vanhempien soluihin BxPC3 (Fig. 1 C). Sen määrittämiseksi, onko BxPC3-GZR solut ovat myös ristiin vastustuskykyisiä toisen kemoterapeuttisen yhdisteen, soluja käsiteltiin paklitakselia ja MTT-määritykset suoritettiin. Vaikka BxPC3-GZR solut osoittivat yli kaksinkertaiseksi lasku herkkyys gemsitabiinin, nämä solut osoittivat vain vaatimaton väheneminen herkkyys paklitakseliin (Fig. S1). Nämä havainnot viittaavat siihen, että eri signalointireittejä voivat olla vastuussa vastustuskykyä eri huumeita. Tuoreessa tutkimuksessa on sivuttainen populaatio PDAC solujen ominaisuuksia syövän kantasoluja ja että valittiin vastustuskyky gemsitabiinin eivät olleet resistenttejä 5-FU [23]. Western blot-analyysi soluista, kerättiin viikoittain yli kuuden viikon lisätä gemsitabiinihoidon paljasti, että taso epiteelin marker E-kadheriinin laski asteittain samanaikaisesti tasojen nousu mesenkymaaliset merkki vimentiinista ja kantasolujen markkerin CD44 (Fig. 1 B) .

. Morfologiset erot vanhempien BxPC3 ja chemoresistance mesenkymaalisten BxPC3-GZR soluissa. B. Western blot, joka osoittaa, että BxPC3-GZR soluilla EMT fenotyyppi, mikä on osoitettu lisääntyneen ilmentymisen vimentiinista ja lasku E-kadheriinin ja ilmaista kantasolujen merkki CD44. C. MTT-analyysi vertaamalla kasvua vanhempien BxPC3 ja BxPC3-GZR 96 tunnin käsittelyn jälkeen eri pitoisuuksilla gemsitabiinia. D. Länsi pyyhi vertaamalla ilmentymä CD44, E-kadheriinin, Zeb-1 ja vimentiinista neljän kohtia BxPC3 ja BxPC3-GZR. E ja F. Immunofluoresenssi konfokaalimikroskopialla kuvat osoittavat ero ilmentymistä CD44 ja vimentiinin in BxPC3 ja BxPC3-GZR soluissa.

Vielä tärkeämpää on, olemme myös seurattava ja verrattiin ekspressiotasot saman proteiinien BxPC3 ja BxPC3-GZR soluja, jotka missä laajennettu ja seulotaan sukupolvet kulttuuriin. Vakaus BxPC3-GZR fenotyyppi vahvistettiin lyhyellä aikavälillä viljelmissä BxPC3-GZR soluissa osoittaa alempaa E-kadheriinin, säätelyn vimentiinista ilmaisun ja kohonnut ilmentyminen kantasolujen merkkiaineita CD44 (Fig. 1 D). Yhteisymmärryksessä Western blot data, immunofluoresenssianalyysillä osoitti paljon voimakkaamman värjäytymisen Sekä CD44 ja vimentiinista in BxPC3-GZR solujen verrattuna vanhempien BxPC3 vastine (Kuva. 1 E, F).

tunnistaminen miRNA allekirjoituksen liittyvä CRMP vuonna PDAC

Tutkimukset osoittavat, että eri miRNA kuten miR-100, miR-21, anna-7, luki- 34a ja miR – 200c pelata kriittinen rooli säätelyssä kasvainten synnyssä ja chemoresistance eri syöpiä, kuten haiman syöpä [24] – [26]. Tutkimukset osoittivat myös rooli miRNA kehittämisessä lääkeresistenssin erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia [11]. Ilmaisu taso miRNA verrattiin BxPC3 ja BxPC3-GZR soluissa μParaflo mikrofluidinen siru miRNA profilointia. Laskennan jälkeen ja poistaa ei-merkitsevä miRNA (mitattuna ilmaisun), erittäin merkittävä miRNA profiili vahvistettiin, että erottaa BxPC3-GZR soluja vanhempien BxPC3 soluista (Fig. 2,

Taulukko 1

). Tämä profiili osoitti Merkittävin yhdeksän miRNA jotka jopa säännellään BxPC3-GZR solujen verrattuna BxPC3 (miR-125b, miR-155, miR-100, miR-4324, miR-21, miR-15b, miR-25, asennuspalveli- 424 *, miR-99b) ja kahdeksan jotka säädeltiin (miR-1246, miR-205, miR-4443, miR-30d, miR-27b, miR-4485, miR-378 *, miR-455-3p).

. Heat karttatietoja analyysi miRNA microarray määrityksissä verrataan BxPC3 vanhempien soluja ja lääkkeille vastustuskykyiset BxPC3-GZR soluissa. Vain miRNA valittiin joka oli huomattavasti yli tai alle ilmaistuna verrattuna vanhempien soluihin (korkea kertainen muutokset perustuvat log2 arvoihin ja hyvin alhaiset p-arvot) otettiin lisävalidointia. Tilastolliset arvot ovat edustettuina

Taulukko 1

. B. validointi miRNA microarray tietojen tehtiin kahdeksan ilmentyvät eri miRNA käyttäen TaqMan qPCR määritystä. Kussakin solulinjassa, ilmentymisen taso ilmoitetaan miRNA verrattiin emo BxPC3 solujen ja BxPC3-GZR soluja. RNU43 tai U6 käytettiin sisäisenä miRNA valvontaa. C. TCGA tietojen analysointi osoittaa, että 6 7 miRNA validoitu parhaillaan vapautettiin BxPC3-GZR solut osoittivat myös ero ilmentymistä kasvain potilas jolta näyte kehittyneitä PDAC. Kasvain näytteitä 43, joilla on pitkälle PDAC analysoitiin miRNA ilmentymisen verrattuna normaaliin haiman kudosta.

Perustuu merkitystä syövän ja chemoresistance, näistä seitsemän miRNA valittiin jatkotutkimuksiin. Real Time PCR käyttäen TaqMan määritykset tehtiin vahvistamaan yli tai ali-ilmaistuna miRNA tunnistaa miRNA pakat (Fig. 2B). Lopuksi tunnistettiin neljä yli-ilmaisivat miRNA (miR-125b, miR-155, miR-100, miR-21) ja kolme alle ilmaisi miRNA (miR-27b, mir-205, ja miR-455-3p) by miRNA mikrosirut todensi Real-Time PCR (Kuva. 2B).

mirna allekirjoituksensa CRMP solulinjasta malli on myös havaittu kliinisissä näytteissä potilailta, joilla on edennyt PDAC

Muodosta mahdollisen merkityksellisyys validoidun CRMP miRNA allekirjoitusta miRNA löytyy kehittynyt PDAC, koko transcriptome analyysit (miRNA ja mRNA-seq, ekspressiotasot) suoritettiin kanssa PDAC potilaan näyte datan TCGA aineistoja. Vuonna TCGA tietokannassa on yhteensä 43 PDAC potilaiden näytteitä, jotka sisältävät ilmentymisen taso miRNA normaali haima kudosta. Neljäkymmentä näistä potilaiden kasvain näytteet olivat tiedot sekä mRNA ja miRNA ekspressiotasot. Vertailu yli ja alle ilmaistu miRNA vuonna TCGA kanssa meidän miRNA array on esitetty

Taulukko 2

. Kuten esitetään

taulukko 2

, seitsemästätoista miRNA käsittää miRNA poikkeuksellisesti vapautettiin BxPC3-GZR (9 yli ilmaistuna ja 8 alla ilmaistuna) miRNA tiedot 14 näistä oli käytettävissä TCGA analyysien ja kaikkien seitsemän validoitua miRNA. Kun verrataan edelleen tehtiin kuuden miRNA allekirjoituksen validoitu jonosta tiedot ja joille oli vastaavia tietoja kokeneille PDAC yksilöitä. Analysointi näitä tietoja on esitetty kuviossa 2C. Mielenkiintoista oli merkittävä korrelaatio yhteisiä ekspressiotasojen miRNA kehittyneissä PDAC kasvain näytteet kanssa validoitu CRMP miRNA allekirjoituksen viisi kuudesta miRNA (Fig. 2C,

Taulukko 2

). On tärkeää huomata, että miR-125b tiedot Tuumorinäytteet annetaan sekä miR-125b-1 ja miR-125b-2-isoformeja, kun taas solulinjat, meillä on vain määritetty miR-125b-1-isoformin (nimetty asennuspalveli- 125b). Mielenkiintoista, esiasteita miR-125b-1 ja miR-125b-2 isoformit tiedettiin olevan peräisin itsenäisesti eri kromosomi loci vaikka niiden kypsä sekvenssit ja tavoitteet ovat samat [27]. Merkittävin miRNA yli ilmaistu molemmissa BxPC3-GZR ja kliinisissä näytteissä olivat miR-100, miR-21, miR-125b-1, miR-125b-2 taas miR-205, miR-27b ja miR455 olivat alle ilmaistiin.

miR-125b on rooli säätelyssä CRMP vuonna PDAC

Alustavat tutkimukset tehtiin onko miRNA tunnistettu BxPC3-GZR soluja ja jotka ovat yhteisiä kliinisiä näytteitä häntä rooli CRMP. MIR-125b, joka oli yleisesti yli ilmaistu sekä pitkälle PDAC kliinisissä näytteissä ja BxPC3-GZR soluja (Fig. 2) valittiin näiden analyysien. Lisätutkimuksia, kolme PDAC solulinjoja (AsPC-1, Capan-2, Panc-1) lisäksi BxPC3 seulottiin ekspressiotasot EMT markkereita yhdessä miR-125b ja miR-30d (Fig. 3 A, B) . MiR-30d käytettiin vertailussa ero ilmentymisen miRNA koska se osoitti yhtä suuri ilmentyminen tasolla sekä vanhempien (BxPC3) ja resistenttien solujen qPCR analyysi. Näissä solulinjoissa epiteelin merkki E-kadheriinin on kääntäen verrannollinen ilmentymisen miR-125b; katsoo, mesenkymaaliset merkki vimentiinista ja kantasolujen markkeri CD44 oli verrannollinen ilmentymisen miR-125b (Fig. 3A, B). Nämä tiedot ehdottaa lisäksi, että EMT fenotyyppi voidaan säädellä osittain ilmentämällä miR-125b in Capan-2 ja BxPC3 solut näyttävät epiteelin kaltainen fenotyyppi ja ilmaista alhainen miR-125b; kuitenkin, AsPC-1 ja Panc-1-solut ovat mesenkymaaliset kuten ja osoittaa korkeampi miR-125b (Fig. 3 A, B). Lisäksi olemme myös seurata ilmaus miR-125b in BxPC3 soluissa upon gemsitabiinihoidon. Data osoittaa, että 72 tuntia gemsitabiinihoidon indusoi ilmentymisen miR-125b in BxPC3 soluissa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 3C). Siksi nämä tulokset osoittavat, että sekä chemoresistance ja mesenkymaalisten fenotyypit säädellään ero ilmaus miR-125b.

. Western blot-analyysit osoittavat ilmentymisen tasoja EMT merkkiaineiden PDAC solut, joissa miR-125b ekspressio määritettiin. B. TaqMan qPCR analyysi osoittaa suhteellista ilmentymistä miRNA (miR-125b ja miR-30D) erilaisissa PDAC soluissa. MiR-30d käytetään kontrollina. C. induktio miR-125b ilmentymisen BxPC3 käsiteltäessä gemsitabiinia. Kvantitatiivinen PCR (TaqMan) tehtiin sen jälkeen, kun 72 tunnin inkubaation lääkkeen valvomiseksi ilmentymistason miR-125b in BxPC3 soluissa. Tiedot osoittavat, että ilmentyminen miR-125b kasvatetaan käsittelemällä gemsitabiinin annosriippuvaisesti.

Sen määrittämiseksi, onko miR-125b ilmentyminen liittyy suoraan CRMP, me pudotti ilmaus Mir-125b käyttämällä Zip teknologiaa ja vakaa solulinjojen tuottamat ja analysoitiin ilmentymistä miR-125b sekä BxPC-GZR-Zip-Ctrl ja BxPC3-GZR-ΔmiR-125b-soluissa (kuvio. 4A). Morfologia miR-125b pudotus soluja arvioitiin myös ja knockdovvn miR-125b palautti epiteelin kaltainen morfologia (Fig. 4A). TaqMan qPCR määritys osoitti noin 80% knockdovvn miR-125b in BxPC3-GZR soluja (Fig. 4B). Pudotus anti-miR125b päinvastaiseksi EMT markkereita, kuten on esitetty lisääntynyt ekspressio epiteelin markkerin E-kadheriinin ja vähentynyt ilmentyminen mesenkymaalisten markkerin vimentiinista ja vähensi myös CD44 ilmentymistä (Fig. 4C). Knockdovvn miR-125b laski solumigraation (Fig. 4D, E) ja osittain kääntänyt gemsitabiinin vastus BxPC3-GZR soluja (Fig. 4F).

. Luodaan Lenti-viruksesta peräisin vakaa soluja, jotka ilmentävät anti-miR-125b in BxPC3-GZR (Zip-ohjaus ja miR-125b knock-down). B. TaqMan qPCR määrityksissä osoittaa knockdovvn miR-125b in BxPC3-GZR-Zip ctrl solujen verrattuna BxPC3-GZRΔmiR-125b soluissa. C. Expression of anti-miR-125b (Zip teknologia, SBI) pienenee ilmentymistä EMT ja stemness merkki seurattiin Western pultti määrityksiä. Paneelit D ja E esittävät vaimennus solumigraation lakkauttamalla miR-125b ilme. Kuvat on otettu sen jälkeen, kun kristallivioletilla värjäämällä siirtynyt solujen ja data piirrettiin kuvaaja (Bar = 50 um). F. knockdovvn miR-125b lisää vastaus gemsitabiinia. BxPC3-GZR-Zip-Ctrl ja BxPC3-GZRΔmiR-125b solut käsiteltiin gemsitabiinin eri pitoisuuksina ja MTT määritykset suoritettiin 96 tunnin kuluttua hoidon. G. knockdovvn miR-125b in Pancin-1-soluissa. Lenti-viruksesta peräisin stabiileja soluja tuotetaan estävän miR-125b lauseke (Zip teknologiaan,). TaqMan qPCR määritykset suoritettiin mitata ilmentymisen miR-125b Zip-ohjaus Pancin-1-soluissa ja kaataa soluja (Panc-1 ΔmiR-125b). H. estävä miR-125b vähenee CD44 ja vimentiinista ilme taas ylös ekspressiota sääteleviä E-kadheriinin. I. knockdovvn miR-125b kasvattaa vastetta Pancin-1 gemsitabiinia. MTT määritykset tehtiin 96 tunnin kuluttua gemsitabiinihoidon. Tilastollinen merkitys arvot * p 0,05 ** p 0,01 laskettiin opiskelijan T-testejä.

Jotta voitaisiin vahvistaa, että tämä vaikutus miR-125b Knockdown ollut ainutlaatuinen BxPC3-GZR soluissa , miR-125b myös tippuu alas Pancin-1-soluissa. Samanlaisia ​​kuin vuonna miRNA-125b knockdowns varten BxPC3-GZR soluissa, Western blot ja MTT-analyysi viittasivat siihen, että knockdovvn miR-125b ilmentymisen Pancin-1 solun osittain päinvastaiseksi mesenkymaaliset fenotyypin (kuvio. 4G, H) ja parannettu vastaus gemsitabiinia (Fig. 4I).

Gene tavoitteita miR-125b

Koska miRNA teko joko repressoiva tai pilkkomalla tavoitteensa mRNA: iden, suoritimme geeniekspressioanalyysiä useita tunnettuja loppupään tavoitteet miR -125b. Useat tutkimukset osoittivat, että mRNA tavoitteita miR-125b ovat

BBC3

(PUMA),

ITCH

,

BAK1

,

BCL2

,

NEU1

,

PPP1CA

,

PPP2CA

[28] [29];

STARD13

(DLC2) [30];

AP1M1

,

STK11IP

,

PSMD8

,

TBC1D1

,

VAK

,

MKNK2

,

DGAT1

, BAP1,

GAB2

,

SGPL1

[28]. Analysoimme kliininen kasvaimen tietoja näitä edellä mRNA ekspressiotasoja (Fig. 5). RNA-seq TCGA osoitti, että ilmaukset joitakin näistä geeneistä (

BAP1

,

BBC3

tai PUMA,

BCL2

,

NEU1

,

STARD13

) korreloivat negatiivisesti ilmentymisen miR-125b. Analysoimme sekä yleistä ilmaisua suuntaus kohdennettujen geenien PDAC yksilöitä TCGA tietokannasta (Fig. 5A), sekä ilmentymisen taso kohdegeenin suhteen ilmentymisen miRNA-125b samassa Tuumorinäytteet (kuvio . 5B). Seuraavaksi olemme seuranneet ekspressiotason p53 sääteli modulaattorin apoptoosin (PUMA). PUMA tunnetaan myös Bcl-2-sitova komponentti 3 (BBC3) on pro-apoptoottisen proteiinin jäsen ja Bcl-2-proteiinin perheen [31], [32]. PUMA on mukana sekä p53-riippuvaista ja riippumattaman apoptoosireittiä indusoiman erilaisia ​​signaaleja [33]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat myös, että

NEU1

tuote Neu1 salidase on tärkeää sääntelyssä integriinin β4-välitteistä signalointia, mikä tukahduttaminen syövän etäpesäkkeiden [34]. Kuitenkin erillinen tutkimus osoittaa, että Neu1 salidase parantaa EGFR signalointi ja siten voisi olla kasvain edistää [35]. Esillä olevat havainnot yhdessä web-pohjainen miRNA tavoite skannata tiedot viittaavat siihen, että miR-125b suoraan kohdistuu 3’UTRs PUMA (BBC3) ja Neu1 (Fig. 6. F, G). Tämän tueksi, mRNA lausekkeita

BBC3

(PUMA) ja

NEU1

oli korreloi käänteisesti ilmentymisen miR-125b (Fig. 6A) in BxPC3-GZR soluissa.

. Kohde-mRNA mentymisprofiili analyysit miR-125b. Määrätietoinen ilmaus tunnettujen miR-125b tavoitteet (

BBC3

(PUMA),

BCL2

,

STARD13

,

BAK1

,

BAP1

,

ITCH

ja

NEU1

). B. Suora co-suhde kohde-mRNA ja miR-125b ilmentymistaso mitattiin samassa kasvain haiman adenokarsinooma [PDAC] potilaan näytteestä. Ensimmäinen paneeli selittää eri neljännesten, joka sisältää ylössäätöä (+ Ve merkki) tai alaspäin asetuksen (- Ve merkki) mRNA ja miRNA ekspressiotasot. Muut paneelit edustavat ilmentymisen taso eri mRNA (

BBC3, Neu1 ja BAK1

) verrattuna ilmentymisen miR-125b samassa kasvain.

. PUMA (

BBC3

) ja Neu1 ovat näkyvin mRNA tavoitteista miR-125b. Taqman qPCR analyysit tehtiin vahvistamaan kliinistä tietoa. QPCR tulokset osoittavat ilmentymisen tasoa eri mRNA: ta (

BBC3, Neu1 ja BAK1

), jotka ovat suoraan kohteena miR-125b verrataan BxPC3 emosoluista ja kestävä GZR soluja. B. Vertailu mRNA: n ilmentymisen tason

BBC3, Neu1 ja BAK1

in BxPC3-GZR soluihin ja stabiili BxPC3-GZR soluja, jotka ilmentävät anti-miR-125b. C. Western pyyhkii analyysin seurata ilmentymisen taso PUMA ja Neu1 in BxPC3, BxPC3-GZR, ja miR-125b knockdown-soluja. D ja E. estävä miR-125b palauttaa BBC3 ja Neu-1 ilmentymisen Pancin-1-solut, qPCR (D) ja Western blot (E). F, G Laji säilyttäminen ja sovitus siemenen sekvenssin 3’UTR

BBC3

ja

NEU1

mRNA: iden miR-125b sekvenssin seurattiin käyttämällä Targetscan ilmainen web-pohjainen ohjelmisto.

Seuraavaksi verrattuna ilmentymisen kolmen eri potentiaalisten miR-125b kohdegeenien PUMA (

BBC3

) (useimmat alle ilmaistu geeni potilaan näytteessä),

NEU1

ja

BAK1

(säädelty geeni) mRNA: iden välillä BxPC3 vanhempien ja BxPC3-GZR solut (Fig. 6B).