Krooninen sairaus

tiivistelmä

yli-ilmentyminen peroxiredoxin 1 (Prx1) on havaittu lukuisissa syövissä kuten suun okasolusyöpä ( OSCC). Tarkka molekyylitason mekanismi säätely ylöspäin Prx1 karsinogeneesis- on kuitenkin edelleen huonosti. Tavoitteena tätä on tutkia suhdetta Prx1 ja hypoksia, ja mahdolliset mekanismi (t) Prx1 in OSCC solulinjassa SCC15 ja ksenograftimallissa. Me käsitelty villin tyypin ja Prx1 pudotus SCC15 solujen ohimenevän hypoksian seurasi uudelleenhapetukselle. Olemme havainneet kunnon hypoksian, reaktiivisten happiradikaalien (ROS), ja ilmaisun ja /tai aktiivisuutta Prx1, hemioksigenaasi 1 (HO-1) ja tumatekijä-kappa B (NF-KB). Huomasimme, että hypoksia indusoi ROS kertymistä, up-regulation Prx1, lisää NF-KB translokaatio ja sitoutuu DNA: han, ja alas-säätelee HO-1

in vitro

. Vuonna Prx1 knockdown-soluja, ilmentymisen taso HO-1 on lisääntynyt, kun taas NFKB translokaatio ja DNA: ta sitova aktiivisuus pieneni, kun hypoksian tai hypoksia /uudelleenhapetukselle hoitoon. Lisäksi olemme jäljitteli dynaaminen hapetus kasvaimen mikroympäristön ksenograftimallissa ja arvioidaan edellä indeksit kasvaimissa maksimaalinen halkaisija on 2 mm, 5 mm, 10 mm tai 15 mm, vastaavasti. Tuloksemme osoittivat, että kasvain hypoksinen kunto ja ilmentyminen Prx1 liittyvät merkittävästi kasvaimen kasvua. Ekspressio HO-1: n ja NF-KB: n ja NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus oli merkittävästi kohonnut 15 mm kasvaimia, ja taso 8-hydroxydeoxyguanosine lisääntyi 10 mm ja 15 mm kasvaimet, verrattuna koon 2 mm. Tulokset Tämän tutkimuksen säätää kokeellista näyttöä, että yliekspressio Prx1 liittyy hypoksiaa ja Prx1 /NF-KB /HO-1-signalointireitin voi olla mukana suun karsinogeneesissä.

Citation: Zhang M, Hou M, Ge L, Miao C, Zhang J, Jing X, et al. (2014) induktio Peroxiredoxin 1 Hypoksia Säätelee hemioksigenaasi-1 kautta NF-KB: Oral Cancer. PLoS ONE 9 (8): e105994. doi: 10,1371 /journal.pone.0105994

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: toukokuu 20, 2014; Hyväksytty: 25 heinäkuu 2014; Julkaistu: 27 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Natural Science Foundation (81070836), Beijing Natural Science Foundation (7102065) ja ZYLX201407, Pekingin Kunnan hallinto sairaala Key Medical Development Project. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Suun levyepiteelisyöpä (OSCC) on yleisin pään ja kaulan alueen syöpä maailmanlaajuisesti. Huolimatta eduista leikkaus, kemoterapiaa ja sädehoitoa, 5 vuoden eloonjäämisaste OSCC ei ole parantunut merkittävästi viimeisten 30 vuoden aikana [1] – [3]. Etäpesäke ja kemoterapia /sädehoidon kestävyys ovat edelleen suurimpia huolenaiheita kliinisessä syövän hoidossa. Hypoksia, yhteinen piirre syövän, edistää kasvainsolujen invaasion ja metastaasin kasvaimen mikroympäristössä, mikä johtaa tuumorisolujen resistenssiin kemoterapiaa ja sädehoitoa [4], [5]. On raportoitu, että patologinen ominaisuuksia, kuten aktiivinen invasiivisuus, imusolmuke etäpesäke ja verisuonten proliferaatio liittyy kasvaimen kudoshypoksia in OSCC [6], [7]. Altistuminen pienelle paineelle hypoksia johtaa merkittävään kasvuun reaktiivisten happiradikaalien (ROS) eläimillä. Kertyminen ROS aiheuttama hypoksia voi aiheuttaa oksidatiivista stressiä ja syövän etenemistä [8]. ROS-välitteinen vaste voidaan säätää antioksidantteja ja antioksidantti-entsyymin järjestelmät, kuten superoksididismutaasi, katalaasi ja tioredoksiini /peroxiredoxin [9].

Peroxiredoxins (Prxs) ovat superperheen monitoiminen antioksidantti tioredoksiini-riippuvainen peroksidaasit. Peroxiredoxin 1 (Prx1) on merkittävä jäsen Prxs perheessä ja toimii antioksidanttina kaivella ROS monenlaisia ​​organismeja. Prx1 on mukana useita biologisia olosuhteissa /toimintaa myös oksidatiivista stressiä, solujen lisääntymisen ja apoptoosin [9]. Prx1 on yli-ilmentynyt useissa maligniteetteja, mukaan lukien ruokatorven, keuhko-, rinta- ja haimasyöpä. Kohonnut Prx1 ilmentyminen on heikentynyt eloonjäämiseen ja huono kliiniseen tulokseen [10], [11]. Yliekspressio Prx1 on myös raportoitu OSCC, mutta tarkkaa molekyylitason mekanismi Prx1 suun karsinogeneesissä epäselviä [12]. Ilmentyminen tumatekijä-kappa B (NF-KB) ja Hemi oxygenease-1 (HO-1) ovat suurempia OSCC [13], [14]. Lukuisat tutkimukset osoittivat, että NF-KB vastauksia hypoksian uudelleenhapetukselle

in vitro

[15]. NF-KB voidaan säädellä Prx1 kautta ensimmäisen aktivoinnin sytoplasmassa [16], tai muuttamalla pitoisuus hapettimen johtaa inaktivoituminen hapettumisen NF-KB: n [17]. HO-1, 32-kDa lämpöshokkiproteiini, voi katalysoida oksidatiivista hajoamista hemin ja biliverdiini, joka sen jälkeen pelkistetään bilirubiini. HO-1 voidaan saada aikaan hypoksia, lämpöshokin ja sytotoksisen hapettimien [18], [19]. HO-1 on yksi tavoitteista NF-KB stressaavissa olosuhteissa [20] – [23]. Vaikka mekanismi Prx1 in oksidanttirasituksen ei ole selvää, useat todisteet viittaavat siihen, että Prx1 voi vastata hypoksiaa ja säädellä NF-KB-reitin Cascade. Tässä tutkimuksessa selvitimme muuttaminen Prx1 vastauksena hypoksia ja arvioitava mahdollisia korrelaatioita Prx1 ja NF-KB /HO-1 käyttäen suun syöpäsolun järjestelmä ja ksenograftimallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen OSCC soluja, SCC15, (ATCC, Manassas, VA) pidettiin DMEM-F12, johon oli lisätty 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco, USA) joka sisälsi 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. SCC15 soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ja 95% ilmaa. Kaataa Prx1, SCC15 soluja transfektoitiin Prx1 shRNA Plasmidi (Santa Cruza Biotechnology) käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Ohjaus shRNA Plasmidi-A (Santa Cruza Biotechnology) transfektoitiin kontrollina. Tehokkuutta Prx1 shRNA pudotus määritettiin qRT-PCR: llä ja western blot -analyysit.

pimonidatsoli värjäytyminen SCC15 soluissa

Soluja kasvatettiin peitinlaseilla 24 tuntia ennen hypoksiaa hoitoa. Aikana hypoksia hoito, solut pantiin hypoksian inkubaattorissa kaasua, joka sisälsi 1% O

2, 5% CO

2 ja 94% N

2 37 ° C: ssa eri aikoja. 200 uM pimonidatsoli lisättiin keskipitkällä ja inkuboitiin 30 min. Sen jälkeen pestiin PBS: llä, solut kiinnitettiin paraformaldehydillä (3%) huoneen lämpötilassa 10 minuuttia ja sen jälkeen pestiin jälleen PBS: llä. Sen jälkeen estettiin BSA, peitinlasit inkuboitiin hypoxyprobe-1 hiiren monoklonaalinen vasta-aine mAb1 (1:100) on Hypoxyprobe-1 Plus Kit (Chemicon Int., Temecula, CA) yön yli. Toissijainen FITC-konjugoitu anti-hiiri-vasta-ainetta. Peitelaseja asennettu ja immunovärjättiin soluja tutkittiin Olympus-IX71 mikroskooppi (Tokio, Japani).

ROS havaitseminen

tuotanto solunsisäisten ROS soluissa mitattiin 2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCF-DA) käyttäen FACS-analyysiä. SCC15 solut kerättiin ja suspendoitiin 500 ui laimennettua DCF-DA. Seosta inkuboitiin 37 ° C: ssa 20 minuutin ajan ja pestiin sitten kahdesti PBS: llä. Näytteet analysoitiin virtaussytometrillä 1 tunnin kuluessa. Data normalisoitiin arvot valvontaa. Keskimääräinen DCF fluoresenssi-intensiteetti mitattiin virityksellä 488 nm: ssä ja emissio 525 nm: ssä. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Immunofluoresenssi

Soluja kasvatettiin peitinlaseilla huuhdeltiin PBS: llä, kiinteä ja läpäiseviksi asetonissa -20 ° C: ssa 10 min. Inkuboinnin jälkeen PBS: llä, joka sisälsi 5% BSA: ssa 1 h, monoklonaalinen anti-NF-KB: n vasta-aineella (Cell Signaling Technology, 1:100 PBS-BSA), lisättiin 4 ° C: ssa ja inkuboitiin yön yli. Peitelaseja pestiin PBS: llä, inkuboitiin Alexa Fluor 546 anti-kanin (Molecular Probes, 1:500) sekundaarista vasta-ainetta huoneen lämpötilassa 1 h, ja asennettu Dako Cytomation loisteputki kiinnitysväliaine. Konfokaaliset kuvat kerättiin käyttämällä Leica SP2 laserskannaus -konfokaalimikroskoopilla varustettu UV heräte, argonlaser, 633 /1,32 OIL PH3 CS tavoite, ja konfokaali pinhole asetettu 1 Airy yksikkö. Kaikki konfokaali kuvat olivat yhden optisen kohdat.

ksenograftimallia

Neljäkymmentä BALB /c-nude-hiiriin (Beijing Vital River Laboratories, Kiina) käytettiin tuottamaan tuumorigeenisyystesti että SCC15 solujen

in vivo

. Kokeilu protokolla hyväksyi paikallinen eettinen komitea eläinten käyttöä. SCC15 soluja (6 x 10

6) suspendoitiin 100 ul: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta ja istutettiin ihonalaisesti oikean ja vasemman sivun 4-viikkoa vanhojen nude-hiirissä. Kasvaimen kasvua seurattiin joka 3 päivä transplantaation jälkeen. Kasvaimet kerättiin, kun maksimaalinen halkaisija kasvaimet saavuttivat 2 mm, 5 mm, 10 mm tai 15 mm, vastaavasti. Merkitä hypoksinen soluja nude-hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti 0,1 ml: lla suolaliuosta, joka sisälsi pimonidatsoli hydrokloridi (1 – [(2-hydroksyyli-3-piperidinyyli) propyyli) -2-nitroimidatsoli hydrokloridi) annoksena 60 mg /kg kehon paino 1 tunti ennen kasvain leikkaaminen. Hiiret toteutettu eutanasia ja kasvain näytteet poistettiin ja välittömästi varastoitiin nestemäisessä typessä molekyyli- /solu-analyysi, tai formaliinilla tehdä parafinoidut kudospaloista. Yhteensä 80 kasvaimet jaettiin neljään ryhmään sen mukaan kasvaimen halkaisija (20 kasvaimet /koko).

pimonidatsoli värjäytymistä kasvaimissa

parafinoidut lohkojen kasvainnäytteestä leikeltiin varten pimonidatsoli värjäystä. Leikkeitä inkuboitiin primääristen kanin anti-pimonidatsoli antiseerumia hypoxyprobe-1 mAb1 (laimennus: 01:50; Chemicon, USA) 4 ° C: ssa yön yli. Arvioidaan kunnon hypoksia, viisi edustaja valomikroskooppisella alueet laskettava kunkin osan (suurennos x 200) ja keskimääräinen optinen tiheys (MOD) laskettiin käyttäen Image Pro Plus 7.0 analysaattori, MOD = IOD /alue.

qRT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA uutettiin viljellyistä soluista ja tuumorikudokset käyttäen TRIzol (Invitrogen Life Technologies, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin käänteiskopioinnissa 2 ug RNA: n High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA). Yhden mikrolitran alikvootteja cDNA: ta käytettiin templaatteina. FAMTM Dye /MGB mittapäiden Prx1, HO-1 ja ß-aktiini syntetisoitiin ABI (määritys ID: Prx1, HS0060202, HO-1, HS00015796, ihmisen ACTB, 4352935E). Data-analyysin, 2

-ΔΔCT menetelmää käytettiin normalisoituivat tietojen kiinnostunut geenien taloudenhoito geeni ß-aktiini. Kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena.

Western blot-analyysi

Solut ja kasvainkudoksista lysoitiin immunosaostuksella määrityspuskurissa (50 mM Tris-Cl [pH 7,4], 1% NP40, 150 mM NaCl: a , 1 mM EDTA, 1 M fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 ug kutakin aprotiniinia ja leupeptiiniä ja 1 mM Na3VO4). Jälkeen sentrifugoitiin 12000 g: ssä 30 min, supernatantti kerättiin talteen ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen Lowryn menetelmällä. Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin 12% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Blotteja inkuboitiin anti-Prx1 (1:5000, Upstate, USA) ja anti-HO-1 (1:2000, Abcam, USA) vasta-aine. Vasta-aine β-aktiini (Sigma, St. Louis, MO) käytettiin latauskontrollina. Immunoreaktiivisia vyöhykkeet havaittiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita ja parannetaan kemiluminesenssin reagenssit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

NF-KB: n DNA: ta sitovan aktiivisuuden havaitseminen

ydin- proteiini uutettiin soluista ja kasvainkudoksista käyttäen NE-PER Ydin- ja sytoplasmisia Extraction Reagenssit (Thermo, USA) . Lyhyesti, solujen ja kudosten suspendoitiin hypotoniseen puskuriin ja inkuboitiin jäillä 10 min, minkä jälkeen sentrifugoitiin 12000 g ja 4 ° C: ssa 10 min saostamiseksi ytimiä. Sen jälkeen, kun on pesty hypotoninen puskuri, tumat lyysattiin lyysipuskurissa saada ytimet uutteet. NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus havaittiin käyttäen NF-KB (p65) Transcription Factor Assay Kit (Cayman Chemical Company, USA).

immunohistokemia

parafinoidut lohkot leikattiin immunohistokemiaa varten analyysi. Leikkeitä käsiteltiin 20 mg /l proteinaasi K: n (laimennus: 1:1000; Sigma-Aldrich, USA) 37 ° C: ssa 30 min antigeenin haku. Jälkeen estää endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus 0,3% vetyä peroksidaasi 15 minuutin ajan, kohdat käsiteltiin 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG-pitoisuuksiin, 1:8000, Abcam, USA) tai NF-KB: n (Cell Signaling Technology, 1:100) ensisijainen vasta-ainetta 4 ° C: ssa yön yli. Levyjä inkuboitiin biotinyloidun sekundaarisen IgG-vasta-aineita 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, ja sitten visualisoidaan käyttäen DAB 2-5 min. Mayerin hematoksyliinillä käytettiin vastavärjäämiseksi kohdat, jotka sitten kuivattu ja kiinnitetty. Negatiivinen kontrolli, PBS sijasta käytettiin ensisijaisen vasta-aineita. Solut positiivista värjäytymistä määritettiin laskemalla prosenttiosuus värjäytyneiden solujen käyttäen Image Pro Plus 7.0 analysaattorin. Vähintään 1000 solua laskettiin kullekin tuumorinäytesylinterin.

Tilastollinen analyysi

ekspressiotasot Prx1, HO-1, NF-KB: n ja 8-OHdG-pitoisuuksiin, ja tiedot ROS, pimonidatsoli värjäys, immunofluoresenssi ja NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus analysoitiin ja verrattiin käyttäen yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA). Kaikki tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS ohjelmisto Windows 17,0. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä

P

0,05. Kaikki

P

arvot olivat kaksipuolisia.

Tulokset

Prx1 pudotus kasvaa hypoksia ja solunsisäistä ROS tuotanto

Käytimme shRNA plasmidia kaataa Prx1 vuonna SCC15 soluja. Kuten kuviossa 1A ja 1B, tasot Prx1 mRNA: ta ja proteiinin ilmentyminen vähenivät 40-50%: iin shRNA transfektiolla SCC15 soluissa. Jälkeen Prx1 pudotus, olemme havainneet hypoksia kunnossa sekä Prx1 knockdown-soluja ja kontrollisoluja, jotka oli transfektoitu tyhjällä vektorilla. Tuloksemme osoittivat, että hypoksinen ehto korotettiin hypoksia tai hypoksia /uudelleenhapetukselle paitsi 12-h hypoksia hoidon ohjaus soluissa (kuvio 1 C, yläpaneeli). Vuonna Prx1 knockdown-soluja, hypoksia ehto kasvoi enemmän merkittävästi kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio 1 C, alempi pannel). Korkeimmat hypoksia havaittiin Prx1 Knockdown soluissa kuluttua 24 h hypoksian /2 h uudelleenhapetukselle hoitoa, ja 2 h uudelleenhapetukselle hoito ei vähennä hypoksia tasolla koholla hypoksia hoitoa. Olemme myös havainneet tuotannon solunsisäisten ROS. Samanlaisia ​​hypoksia kunnossa, tuotanto solunsisäinen ROS korotettiin hypoksia käsittely paitsi 12 h hypoksia ja 12 h hypoksia /2 h uudelleenhapetukselle käsittely (kuvio 1 D). Kertymistä solunsisäisten ROS on suurempi Prx1 pudotus soluissa verrattuna sen valvonta soluissa.

, Prx1 proteiini oli merkittävästi vähentynyt shRNA transfektiolla. B, Prx1 mRNA vähentää merkittävästi shRNA transfektiota. C, pimonidatsoli värjäys osoitti lisääntynyt hypoksian tila soluissa hypoksian jälkeen /uudelleenhapetukselle hoitoa. D, Intersellulaarinen ROS taso tunnistetaan virtaussytometrialla soluissa hypoksian jälkeen /uudelleenhapetukselle hoitoa. *

P

0,05 vs. WT SCC15 soluja;

#

P

0,05 vs. kontrolli hypoksinen WT SCC15 soluja.

Prx1 säätelee negatiivisesti HO-1 hypoksisissa olosuhteissa

Sen määrittämiseksi onko Prx1 liittyi HO-1: SCC15 soluja hypoksisissa olosuhteissa, arvioimme ekspressiotasot Prx1 ja HO-1 jälkeen hypoksinen hoidon. Kuten on esitetty kuviossa 2A (a, b), proteiinin ilmentymistä Prx1 lisättiin hypoksinen hoitoon. Kuitenkin proteiini-ilmentymisen HO-1: laskivat alkuvaiheessa hypoksia, kun Prx1 ekspressio lisääntyi, ja sitten kasvoi, kun taas Prx1 ilmentyminen väheni 12 h hypoksia /2 h uudelleenhapetukselle, 24 h hypoksia ja 24 h hypoksia /2 h uudelleenhapetukselle, kuten kuviossa 2A (c ja d). 4 h hypoksia /2 h uudelleenhapetukselle ryhmä, taso Prx1 proteiinin korotettiin 50%, kun taas HO-1-proteiini alassäädetty 30% verrattuna käsittelemättömiin soluihin (kuva 2A-b ja d). Kuitenkin Prx1 pudotus soluissa, HO-1 oli merkitsevästi sääteli jälkeen hypoksia tai hypoksia /reoxygenantin hoitoa paitsi 24 tunnin ryhmässä. Proteiinin ilmentyminen HO-1 lisättiin 30% (kuvio 2A-d), ja mRNA: n taso kasvoi 1,4-kertaiseksi Prx1 pudotus SCC15 soluja käsiteltiin 4 tunnin hypoksian /2 h uudelleenhapetukselle käsittelemättömiin soluihin verrattuna (kuvio 2C) . MRNA: n ilmentyminen Prx1 kasvoi 2,7-kertaiseksi, kun taas ekspressio HO-1-mRNA: n alas-säädellä 40% (kuvio 2B ja 2C).

A (a), proteiinin ekspressio Prx-1 ja HO-1 havaittiin Western blot hypoksian jälkeen /uudelleenhapetukselle hoito; A (b ja d), Prx1 ja HO-1-proteiini kvantitoimiseksi suhteessa p-aktiini; A (c) korrelaatio Prx-1 ja HO-1 hypoksian jälkeen /uudelleenhapetukselle hoitoon. B ja C, mRNA: n ilmentyminen Prx-1 ja HO-1 havaitaan qRT-PCR: llä sen jälkeen, kun hypoksian /uudelleenhapetukselle hoitoon. *

P

0,05 vs. WT SCC15 soluja;

#

P

0,05 vs. kontrolli hypoksinen WT SCC15 soluja.

Prx1 Knockdown estää NF-KB translokaatio ja sitoutuu DNA: han

Olemme havainneet endogeenisistä NF-KB ilmentymistä soluissa hypoksian jälkeen hoidon. Havaitsimme lisääntynyt ydin ilmentymistä NF-KB: SCC15 soluissa hoidon jälkeen, erityisesti 24 tunnin hypoksian ryhmä (kuvio 3A, yläpaneeli). Lisäksi Prx1 pudotus soluissa NF-KB translokaatio välillä sytoplasmasta tumaan väheni verrattiin kontrolli soluja (kuvio 3A, alempi paneeli). Sitten havaittiin NF-KB aktiivisuuden soluissa hypoksian jälkeen hoidon. Olemme havainneet, että NF-KB: n p65: n DNA: ta sitova kyky oli merkittävästi vähentynyt Prx1 pudotus soluissa hypoksian jälkeen hoidon kontrollisoluihin verrattuna (kuvio 3B).

A, endogeenisten ytimet ekspressiota NF-KB: n. B, NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus havaittiin ELISA: lla. *

P

0,05 vs. WT SCC15 soluja;

#

P

0,05 vs. kontrolli hypoksinen WT SCC15 soluja.

Hypoksia liittyy kasvaimen kasvua ksenograftimallia

arvioimiseksi muutos on hypoksinen olosuhteet aikana kasvainten kehittymiseen, arvioimme hypoksia kasvaimissa maksimaalinen halkaisija on 2 mm, 5 mm, 10 mm tai 15 mm. Kuten kuviossa 4A on esitetty, pieni ja hajallaan positiivisia soluja havaittiin 2 mm kasvaimia. 5 mm, 10 mm ja 15 mm kasvaimia, hypoksia solut sijaitsevat pääasiassa keskipisteet syöpä pesiä. Hypoksian 5 mm, 10 mm ja 15 mm kasvaimet oli merkittävästi suurempi kuin se 2 mm: n kasvaimia (kuvio 4B). Olemme myös havainneet taso 8-OHdG-pitoisuuksiin arvioida oksidatiivista DNA vammoja kasvainsoluissa. Ekspression 8-OHdG-pitoisuuksiin kasvanut 2 mm ja 15 mm kasvaimia (kuvio 4C). Se oli merkittävästi korkeampi 10 mm ja 15 mm kasvaimet verrattuna 2 mm kasvaimia (kuvio 4D).

A, Hypoksia havaittiin 2 mm (a), 5 mm (b), 10 mm (c) ja 15 mm (d) kasvaimia pimonidatsoli värjäystä. B, Hypoksia MOD merkittävästi kasvaa 5 mm, 10 mm ja 15 mm kasvaimet verrattuna 2 mm kasvaimia. C, 8-OHdG-pitoisuuksiin havaittiin immunohistokemia 2 mm (a), 5 mm (b), 10 mm (c) ja 15 mm (d) kasvaimia. D, taso 8-OHdG-pitoisuuksiin oli korkeampi 10 mm ja 15 mm kasvaimet verrattuna 2 mm kasvaimia. *

P

0,05; **

P

0,01.

yli-ilmentyminen Prx1 ja HO-1 aikana tuumorigeneesiä ksenograftimallissa

Kuten on esitetty kuviossa 5A, mRNA: n ilmentymistä Prx1 merkittävästi lisääntynyt 5 mm, 10 mm ja 15 mm kasvaimet verrattuna 2 mm kasvaimia. Proteiinin ilmentyminen Prx1 myös koholla 10 mm ja 15 mm kasvaimia (kuvio 5B). Yliekspressio HO-1 havaittiin 15 mm kasvaimet, kuten kuviossa 5C ja 5D.

A ja C, mRNA: n ilmentyminen Prx1 ja HO-1 havaitaan qRT-PCR: llä. B ja D, Protein ilmentyminen Prx1 ja HO-1 havaitaan western blot. *

P

0,05; **

P

0,01.

NF-KB translokaatio ja sitoutuu DNA: han ovat suurempia ksenograftimallia

NF-KB translokaatio ja proteiinin DNA molempia olivat koholla, kun kasvain kehittyi. Immunohistokemia osoitti, että ilmentyminen NF-KB: n on kasvanut merkittävästi 15 mm kasvaimissa verrattuna 2 mm kasvaimia (kuvio 6A ja 6B). Samoin NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus oli merkittävästi kohonnut 15 mm kasvaimet kuin 2 mm kasvaimia (kuvio 6C).

A, NF-KB: n ekspressiota havaittiin immunohistokemialla 2 mm (a), 5 mm ( b), 10 mm (c) ja 15 mm (d) kasvaimia. B, osuus ydin- NF-KB: n positiivisia soluja on merkittävästi lisääntynyt 15 mm kasvaimissa verrattuna se 2 mm: n kasvaimia. C, NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus oli merkitsevästi korkeampi 15 mm kasvaimissa verrattuna 2 mm kasvaimia. *

P

0,05; **

P

0,01.

Keskustelu

yleisenä tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on selvittää rooli Prx1 vuonna hypoksian in OSCC. Ensinnäkin, käytimme shRNA kaataa Prx1 vuonna SCC15 soluissa ja sitten havaitaan Prx1, NF-KB ja HO-1 hypoksia. Tutkimme myös Prx1 kanssa hypoksian aikana kasvainten kehittymistä ksenograftimallissa. Tuloksemme osoittivat, että altistumisen jälkeen hypoksia tai hypoksia /uudelleenhapetukselle, solunsisäinen hypoksia ja ROS tasoilla pahensi. Olemme myös havainneet, että HO-1: n ilmentyminen oli säädellään ylöspäin Prx1 pudotus soluissa, kun taas NF-KB translokaatio ja sitoutuu DNA: han laskivat. Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että kohonnut kertyminen ROS aiheuttama hypoksia voi säätää ylös Prx1, joka voi aktivoi NF-KB: n ja säätelee negatiivisesti HO-1 in hypoksian aiheuttaman suun syöpäsoluja. Meidän

in vivo

tiedot osoittivat, että yli-ilmentyminen Prx1 liittyy hypoksiaa ja kasvaimen kasvua. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Prx1 /NF-KB /HO-1-signalointireitin voi olla avainasemassa karsinogeneesis- hypoksian aiheuttaman suun syöpä.

Yksi tärkeimmistä tehtävistä Prx1 on tioredoksiini riippuva Peroksidaasiaktiivisuuden käyttää yksinomaan on kysteiini N-terminaalinen alue [24]. Se huuhtelee ylimääräinen ROS antioksidanttina. Hypoksia suurentaa solujen välinen ROS tasoilla kautta mitokondrioiden elektroninsiirtoketju. Hypoksia on yksi tärkeimmistä tekijöistä, jotka vaikuttavat kasvaimen aloittamista ja etenemistä lisäämällä oksidatiivisen DNA-vaurioita [25]. Viime vuosina, yliekspressio Prx1 on raportoitu olevan tärkeä rooli monissa maligniteettien, koska sen keskeinen rooli patogeneesissä hypoksian. Keuhkosyövän soluja, hypoksia /uudelleenhapetukselle voi lisätä Prx1 ilmentymistä aktivoimalla tumatekijä erytroidi- 2 liittyvä tekijä 2 (Nrf2), joka on tärkeä transkriptiotekijä mukana oksidanttirasituksen [26]. Menetys Prx1 ilmentyminen voidaan parantaa herkkyyttä hapettimien ja sen vuoksi lisää ROS tuotannon ja oksidatiivisen DNA-vaurioita [27]. Esillä olevassa tutkimuksessa, mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä Prx1 oli säädellään ylöspäin SCC15 soluissa joko hypoksian (4 h, 12 h) yksin tai seuraa uudelleenhapetukselle (2 h). Toisessa tutkimuksessa raportoitu Kim

et al.,

Prx1 oli vain ajan säännelty hypoksia /uudelleenhapetukselle, mutta ei hypoksia yksin [27]. Olemme havainneet, että SCC15 solut ovat vielä hypoksinen 2 h kuluttua uudelleenhapetukselle hoitoa, joka osoittaa, että Prx1 voidaan vielä indusoida hypoksia, vaikka 2 h uudelleenhapetukselle hoitoon. Tuloksemme viittaavat siihen, että hypoksia liittyy läheisesti yli-ilmentyminen Prx1 in OSCC. Ylös-säätely Prx1 lisää solujen kykyä poistaa ylimääräisiä ROS ja suojella kasvainsoluja, jotka voivat parantaa kasvaimen etenemistä ja vähentää tehokkuudet kemo- ja sädehoidot.

Tuore tutkimus osoitti, että HeLa-soluissa , sytoplasminen Prx1 muuttunut sytoplasminen NF-KB translokaation tumaan. Nuclear Prx1 säätelee NF-KB /DNA sitova poistamalla H

2O

2 [23]. Wang

et al.

Raportoitu että Prx1 vuorovaikutuksessa NF-KB DNA-tasolla ja oletettavasti moduloi sen transkriptioaktiviteettia rintasyöpäsoluissa [10]. Koska voimakas antioksidantti, HO-1 helpottaa kasvaimen etenemisen kudosspesifisellä tavalla. Tutkimukset ovat osoittaneet, että NF-KB: n indusoi HO-1 kasvainkudoksissa [28] – [31]. Lisäksi lukuisat tutkimukset ehdotti suora suhde NF-KB ja HO-1, mutta toiminta NF-KB säätelyssä HO-1 ilmentymisen ihmisen soluissa on kiistanalainen [32] – [35]. Tässä tutkimuksessa, meidän tiedot osoittivat, että hypoksia indusoi Prx1 ja NF-KB: n, ja Prx1 säätelee HO-1 kautta aktivoimalla NF-KB: n.

Prx1 on äskettäin tunnistettu endogeeninen ligandi Toll-kaltainen reseptori (TLR ) ligandit [36]. Vuonna happiolosuhteissa, Prx1 voi parantaa ilmentymistä verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) kautta induktion hypoksia-indusoituva tekijä 1-alfa-promoottorin aktiivisuus kautta Prx1: TLR4 vuorovaikutusta. Tämä prosessi on välittyy NF-KB. NF-KB: n vuorovaikutuksessa VEGF-promoottori, ei kuitenkaan vaadita Prx1, mikä viittaa siihen, että NF-KB voi säädellä VEGF ilman Prx1 induktio [37]. Prx1 ja HO-1 ovat molemmat luonteeltaan oksidatiivisen stressin-indusoituva ja Hemi liittyviä proteiineja. Prx1 on hemi-sitovaa aktiivisuutta. Tioli-spesifinen antioksidantti aktiivisuus Prx1 voidaan estää hemin. Co-ilmaisu tai yhdessä induktio Prx1 ja HO-1 on havaittu joissakin kudoksissa tai soluissa, mikä osoittaa, että Prx1 ja HO-1-proteiinit voivat yhteistyössä paikallistaa ja vuorovaikutuksessa näytteille antioksidantti toimintaa [15]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmentyminen HO-1 on pääasiassa ajan säädellään Nrf2. Nrf2 on myös yksi tärkeimmistä transkription tekijöitä Prx1 geenin ilmentymisen hypoksinen syöpäsoluja. Ensimmäistä kertaa, me raportoimme että Prx1 ja HO-1 voisi olla kielteinen sääntelyn suhteen epäsuoraa. Tarkka molekyylitason mekanismeja kuitenkin tulee varmistaa ja tutkitaan tulevaisuudessa tutkimuksessa.

OSCC ksenograftimallia, löydettiin samanlaisia ​​tuloksia, että merkittävä nousu HO-1 jäljessä kuin Prx1. Hypoksisissa kunnossa ja oksidatiivisen DNA-vaurioita, Prx1 ja HO-1 voimistunut ja NF-KB: n DNA: ta sitova aktiivisuus paranee. Tuloksemme viittaavat siihen, että Prx1 lla antioksidanttisia rooli aktivoimalla NF-KB ja säännellä HO-1 in hypoksia liittyvissä OSCC etenemistä. Lopuksi, olemme huomanneet, että hypoksia on tärkeä rooli OSCC kautta säädellään Prx1 /NF-KB /HO-1-signalointireitin. Tutkimuksemme tarjoaa systeeminen tarkastelu Prx1 solu- järjestelmissä ja ksenograftimallia of OSCC, kullakin on erityisiä etuja biomarker tutkimukseen. Lisätutkimukset toiminnallista roolia Prx1 suun karsinogeneesissä ovat perusteltuja. Tiedot tässä tutkimuksessa saattaa olla hyödyllistä kehittää kemopreventiivisten /terapeuttisia aineita kohdistaminen Prx1.