Krooninen sairaus

tiivistelmä

22Rv1 on yleinen eturauhassyöpäsolulinja käytetään vierassiirrekokeissa hiiren kokeiluja sekä in vitro soluviljelymäärityksillä tutkia näkökohtia eturauhassyövän kasvaimien syntyyn. Viime aikoina tämä solulinjan on osoitettu satamaan useita kopioita gammaretrovirus, nimeltään XMRV, integroitu sen genomiin. Vaikka alkuperäinen eturauhassyöpäksenograftista CWR22 on vailla retrovirus, myöhemmin syntyy solulinjoja 22Rv1 ja CWR-R1, kantaa tätä virusta ja lisäksi irtoa tarttuvien gammaretroviral hiukkasia niiden supernatantissa. Vaikka XMRV todennäköisesti tuotettiin rekombinaatioon soluviljelmässä tämän viruksen on osoitettu infektoivan ihmisen soluja in vitro ja 22Rv1 sekä CWR-R1-soluja pidetään nyt bioturvallisuus 2 reagensseja. Tässä osoitamme, että 22Rv1 soluja, joilla on alentunut retroviruksen transkription näytä vähensi kasvainten angiogeneesiä ja lisäsi kuolion primaarikasvaimen johdettu ksenosiirrettyjä soluista SCID-hiirissä verrattuna emosolulinjassa. Läsnäolo XMRV selostukset lisää merkittävästi eritystä osteopontiinin (OPN), CXCL14, IL13 ja TIMP2 in 22Rv1 soluissa. Lisäksi näitä tietoja tukevat in vitro solujen invaasiota ja erilaistumista määrityksissä. Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen, että läsnäolo XMRV selostukset ainakin osittain myötävaikuttaa 22Rv1 ominaisuuksien havaittu in vitro ja in vivo osalta maahanmuuttoa, invaasio ja kasvaimen angiogeneesiä. Ehdotamme, että vastaanotetun datan kanssa 22Rv1 soluja tai vastaavia, jotka kantavat ksenotrooppiset gammaretroviruses olisi valvottava, mukaan lukien muut eturauhassyöpäsolulinjoissa testattiin viruksen sekvenssit.

Citation: Stieler K, Schumacher U, Horst AK, Fischer N (2012 ) XMRV indusoi Cell Migration, Sytokiiniekspressioanalyysi ja tuumoriangiogeneesissa: Are 22Rv1 Cells Sopii Eturauhassyöpä Model? PLoS ONE 7 (7): e42321. doi: 10,1371 /journal.pone.0042321

Editor: Peter Sommer, Institut Pasteur Korea, Korean tasavalta

vastaanotettu 23. huhtikuuta 2012 Hyväksytty: 02 heinäkuu 2012; Julkaistu: 27 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Stieler et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PC) on yleisin syövän miesten länsimaisissa yhteiskunnissa yli 350.000 äskettäin diagnosoitu syöpiä ja yli 90.000 todellisen kuolemantapausta vuodessa, pelkästään Euroopassa, mikä aiheuttaa vakavan sosioekonomisesta ongelma. Eturauhassyöpä heijastaa heterogeeninen ja monivaiheinen sairaus, joka tarjoaa haaste kehittää sopiva in vitro ja in vivo malleissa.

In vitro-mallit luottaa muutaman eturauhassyövän solulinjoissa käytettävissä [1], jotka ovat epiteelisolujen alkuperä: yleisin käytetyt solulinjat ovat LNCaP [2], PC3 [3], DU145 [4] ja yhteisenä ksenograftimallia myös 22Rv1 soluihin [5]. Nämä solulinjat palveli aiemmin, ja vielä yleisesti käytössä, malleina tutkittaessa syövän etenemiseen, invaasio, etäpesäke, uusia terapeuttisia strategioita sekä huumausaineiden vastus. Transplantoitu immuunivajaisiin hiirissä nämä solulinjat tuottavat kasvaimia, jotka ovat samanlaisia ​​kuin vanhempien kasvain [5]. Tällainen in vivo ksenograftimalleissa on vahvistettu käyttäen LNCaP, 22Rv1 tai PC3-solujen oksastettu immuunivajausta SCID, NUDE tai NOD-SCID-hiirissä. Koska ihanteellinen hiiren malli näytteille liikauudiskasvun ja liikakasvun epiteelisoluissa (Eturauhasen epiteelinsisäisen neoplasian, PIN), korkea-asteen PIN (HGPIN), adenokarsinoomien ja invasiivisia eturauhasen karsinoomat (hiiret luonnollisesti eivät kehity PC), -ksenografti hiiri kokeet, joissa käytetään kudosta viipaleiksi tai ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ovat laajalti käytössä.

22Rv1 on johdettu uusiutunut ksenosiirrettyjä kasvain CWR22, joka on sarjamuotoisesti siirrettyjen nude-hiirissä [5]. Vuonna 2009, 22Rv1 solujen on osoitettu kuljettamaan useita integroitujen kopioiden gammaretrovirus XMRV (ksenotrooppinen hiiren leukemiavirus liittyvä virus); nämä solut tuottavat korkea-tiitterit viruksen viljelmän supernatantissa [6]. Viimeaikainen työ antaa näyttöä, että kaksi solulinjaa syntyvät ksenografti kasvain CWR22, 22Rv1 (CWR22Rv1) ja CWR-R1, tuottavat tarttuvia XMRV hiukkasia niiden supernatantista [7].

XMRV on alunperin tunnistettu eturauhasen kudosta potilaille, joilla on familiaalinen eturauhassyöpä [8]; myöhempi työ toimitti näyttöä XMRV proteiinin ilmentymistä jopa 23% kaikista eturauhassyövän tapauksissa [9]. Kuitenkin useat tutkimukset ei havainnut XMRV vuonna eturauhassyöpänäytteissä käyttäen PCR tai IHC menetelmillä [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [ ,,,0],18], [19] Koska ei ole sekvenssin vaihtelu XMRV geenin fragmenttien potilaiden isolaattien verrattuna sekvenssin vaihtelu tunnistettu XMRV positiivisen solulinjan 22Rv1 oletettiin, että XMRV voi olla laboratorioon kontaminantin sijaan todellinen eksogeenisen ihmisen virus [20]. Nämä tiedot vahvistavat viimeaikaiset tiedot Paprotka ja työtovereiden analysoimalla eri kohtia CWR22 ksenograftien: XMRV on läsnä 22Rv1 soluissa ja CWR-R1 solut kuitenkin varhainen kohtiin CWR ksenograftissa eivät kanna mitään havaittavaa XMRV sekvenssit. Nämä tiedot ovat kannattavat rekombinaatiotapahtuma siirtojen aikana ja ksenografti CWR22, jolloin syntyy XMRV [7].

22Rv1 solut ovat yleisesti käytetty prekliinisen malli eturauhassyövän [21], [22], [23] . Vasta äskettäin, tämä solulinja luokiteltiin bioturvallisuustason 2 solulinjassa. Tämä solulinja tuottaa suuria tiittereitä ksenotrooppiset gammaretroviral hiukkasia, jotka voivat tartuttaa ihmisen soluja [6], [7]; sisäsiittoinen hiiret solut yleensä mutaatio reseptorin näiden virusten, kutsutaan Xpr1, ja ei salliva tämän ryhmän viruksia. Kuitenkin tietyt hiiren solut (feral hiiret ja jotkut sisäsiittoinen kantavien kantojen sopivan reseptorin alleelin [24], [25]), voidaan virustartunta. Varoitus tietojen tulkinnassa yksinomaan johtuva 22Rv1 jotka kantavat virusta on käsitelty aiemmin [26] mutta ei suoraan in vivo tai in vitro kokeissa.

Tässä nykyisessä tutkimuksessa olemme analysoineet välinen syy-yhteys gammaretrovirus XMRV ja transformoidun fenotyypin 22Rv1 soluihin käyttäen in vitro -määrityksiä käytetään yleisesti tutkia solujen lisääntymistä, vaeltamisen ja erilaistumisen vertaamalla 22Rv1 solut ja 22Rv1 soluja, joilla on alentunut virustiittereitä vierassiirrekokeissa hiiri kokeissa in vitro muuttoliike, invaasion ja putken muodostumiseen määrityksissä. Tarjoamme näyttöä siitä, että gammaretrovirus XMRV merkittävästi vaikuttavan kasvainten kehittymiseen ja 22Rv1 hiirissä. Nämä havainnot tukevat in vitro -tulokset osoittavat eroja sytokiinien vapautumista 22Rv1 soluissa tartunnan XMRV ja 22Rv1 soluja, joilla on alentunut viruksen selostukset. Lisäksi tarjoamme todisteita siitä, että XMRV infektio eturauhasen strooman fibroblasteissa merkittävästi saa aikaan muutoksia sytokiinien vapautumisen. Huomaamme erot solussa kulkeutumista LNCaP kun sitä käytetään in vitro Solujen migraation ja invaasion määrityksiä yhdessä viljelysupernatantti stroomasolujen tartunnan XMRV; supernatantti infektoitujen solujen amfotrooppinen gammaretroviruses tai XMRV env pseudo- virus kaltaiset partikkelit ei vaikuta solujen migraatiota LNCaP osoittaa, että tämä vaikuttaa on spesifinen XMRV ja ei riipu reseptoreiden tai reseptorin signalointia.

Yhteenvetona, meidän tulokset osoittavat, että transformoivan kapasiteetti 22Rv1 solujen riippuu voimakkaasti läsnäolosta XMRV. Siksi tulokset saatiin kokeissa käyttämällä 22Rv1 soluja osalta eturauhassyöpä kasvaimien syntyyn on validoitu muuta virusta negatiivinen eturauhassyövän solulinjoissa.

Tulokset

eturauhasen epiteelisolujen linja 22Rv1, johdettu ihmisen eturauhassyöpä ksenosiirrettyjä immuunivajaissa hiirillä, sisältää useita kopioita gammaretrovirus XMRV integroidaan isäntäsolun DNA. XMRV aktiivisesti toisintaa tässä solulinjassa johtaa virus, joka sisältää tarttuvaa supernatantti [6], [7]. 22Rv1 soluja on käytetty vierassiirrekokeissa hiiren kokeiluja aiemmin tietämättä että tarttuva virus on se levitti tämän solulinjan. Huolimatta siitä, että XMRV todennäköisesti ei ole virusta ihmisen väestöstä olemme analysoineet panos tämän viruksen solulinjaa ominaisuudet: solujen vaeltamiseen ja sytokiinin vapautumisen sekä syövän etenemisen immunodefisienttien hiirillä.

ksenosiirrettyjä 22Rv1 kasvaimia SCID Hiiret pienennetty Viral Transcripts ovat erittäin Necrotic ja Show Less Vessel Formation

Perustimme 22Rv1 solulinjan pienentää XMRV transkriptio määrällä siten vähemmän tarttuvia viruspartikkeleita viljelmän supernatantissa. Kaksi eri shRNAs kohdistaminen kaksi eri alueiden XMRV LTR alueen (kuvio 1A) yhdistettiin. Stable hiusneulat, jotka sisältävät sekvenssit shLTR1 ja shLTR2 (taulukko S1) on yksittäin kloonattiin lentivirusvektori LEGO G-puro-[27]. Pseudotyypittää viruspartikkelit sisältävä supernatantti sekä shRNAs sisältävät lenti- RNA: ita käytettiin infektio 22Rv1 soluja, joita käsitellään myöhemmin puromysiini valita shRNA ilmentäviä soluja. Sulkea pois erityistä valintaa yksittäisten integraatio tapahtumia, suurin valikoima sijasta yhden kloonin valinta suoritettiin sekä ohjaus sisältävä supernatantti pseudotyypittää viruspartikkelien kanssa vanhempien lentiviruksen plasmidi LEGO G-puro ilman shRNA insertti syntyy. Kuten kuviossa 1B on esitetty Gag p30 /CA (kapsidi) proteiinin ilmentymisen tasot olivat vähentyneet huomattavasti, sekä määrä tarttuvien hiukkasten irtoa supernatanttiin oli vähentynyt huomattavasti shLTR1 + 2 ilmentävät 22Rv1 soluja (kuvio 1C). Käyttämällä näitä soluja vierassiirrekokeissa in vivo kokeissa, yhteensä kuusi SCID kohti shRNA ryhmä injektoidaan subku- 2 x 10

6 solua Matrigel kussakin sivusuunnassa kylki. Kasvain puhkeaminen ja paino tarkkailtiin 36d. Emme havainneet merkittäviä eroja puhkeamista kasvaimen kasvun välillä 22Rv1 ohjaus solujen ja 22Rv1 solut, jotka ilmentävät shLTR1 + 2, kun arvioidaan päivittäin silmämääräinen tarkastus ja painonhallintaan hiirillä (tuloksia ei ole esitetty). Jälkeen 36d, hiiret tapettiin ja kasvaimen paino, nekroosi sekä aluksen muodostuminen analysoitiin. Paino 22Rv1 shLTR1 + 2 kasvainten väheni merkittävästi (kuvio 2A vasen paneeli) verrattuna kontrolliin kasvaimia. Nämä kasvaimet näkyy suuri nekroottinen alueilla (kuten nähdään kuviossa 2B vasen ruutu, kuvio S2A (kontrolli solut) ja S2B (22Rv1 shLTR1 + 2)), ja osoittivat, merkittävästi vähemmän alusten lukumäärä kun suoritetaan immunohistokemiallisella värjäyksellä käyttämällä CD34 monoklonaalinen vasta-aine kasvainkudossektioista ( Kuva 3A ylemmät paneelit ja kuvio 3B) verrattuna kontrolleihin.

(A) Kaavamainen esitys XMRV LTR alueen ja 5’UTR Gag. Lokalisointi shRNAs käytetään vähentämään XMRV transkriptien 22Rv1 soluissa on esitetty nuolilla. Kolme eri sekvenssit, shLTR1 (R alue), shLTR2 (U5 alue) ja shLTR3 (sijaitsevat pian alavirtaan silmukointidonoripaikan (SD)) valittiin käyttäen Ambion n siRNA Target Finder verkossa työkalu. (B) 22Rv1 transdusoitujen solujen lentivi- sisältävä supernatantti osoitti shRNAs ja puromysiinin valittu: 22Rv1 shLTR1 + 2-solut osoittavat merkittävästi vähentää p30-proteiinin (CA) on Western blot-analyysi verrattuna kontrollisoluihin. Aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) Reaaliaikainen PCR määritettäessä suhteellinen määrä tarttuvien hiukkasten supernatantissa shRNA transdusoitujen 22Rv1 soluja.

SCID-hiirten (n = 6) olivat s.c. ruiskutetaan 22Rv1 shLTR1 + 2, shLTR3 tai 22Rv1 kontrollisoluihin. Kutakin solulinjaa lopullinen kasvain määrä oli n = 12. 36d p.i. hiiret tapettiin ja kasvaimet analysoitiin paino (A) ja kuolion (B).

(A) immunohistokemia värjäyksen CD34 paljasti alkeellista verisuonten muodostumista XMRV kaataa kasvaimia, kun taas kasvaimissa 22Rv1 ohjaus näyttö syntynyt rakenteita angiogeneesiä. (B) CD34

+ alueilla kasvaimia määrällisesti ohjaus ja shLTR3 kasvain (n = 10 kussakin). Prosenttiosuudet CD34

+ alueet on ilmaistu suhteessa koko alueille analysoitu.

sulkea pois, että havaitut erot ovat seurausta ns armottoman vaikutukset shRNAs kohdistaminen XMRV transkriptien tai kloonivalinnan yksittäisen integraatio tapahtuma, kolmasosa shRNA täydentäviä sekvenssit 5’GAG alueella (229-250, NC_007815) (kuvio 1A) kloonattiin LEGO G-puro-plasmidin. Samanlainen 22Rv1 transfektoitujen solujen shLTR1 + 2, 22Rv1 solut, jotka ilmentävät shLTR3, osoitti merkittävästi vähentää p30 CA /gag-proteiinin ilmentymisen tasot (kuvio 1 B, kaista 3 ja 4), ja jopa 80% vähemmän tarttuvia viruspartikkeleita viljelmän supernatantissa (kuvio 1C) verrattuna kontrollisoluihin. Pistämällä nämä solut kuhunkin kylkeen kuusi SCID ei vähentänyt ajankohtana kasvaimen kasvu sekä ei ollut merkittävää muutosta tuumorin paino kuin havaittiin shLTR1 + 2 (kuvio 2A, oikea paneeli). Olemme kuitenkin havaittu suuria nekroottisen alueita 22Rv1 shLTR3 kasvaimissa (kuvio 2B, oikea paneeli). Vaikka tuumorit 22Rv1 shLTR1 + 2 osoitti vain vähäisiä eroja koko nekroottisen alueilla nämä erot olivat tilastollisesti merkitseviä kasvaimia indusoitiin 22Rv1 shLTR3 soluja. Vastaavasti, CD34-värjäys osoitti, väheni aluksen muodostumista, joka perustuu CD34 positiivinen IHC värjäytymistä kasvainten aiheuttamaa 22Rv1 shLTR3 solujen verrattuna kontrolliin kasvaimia (kuvio 3).

Nämä kokeet osoittavat, että ominaisuudet 22Rv1 ksenograftien immuunipuutteisilla hiirillä osittain riippuvaisia on tuotannon gammaretrovirus XMRV näissä soluissa.

22Rv1 solut, jotka ilmentävät shLTR1 + 2 eroavat Cytokine Expression Pattern verrattuna Vanhempien Cells

viljelysupernatantteja 22Rv1 kontrollisoluja, infektoitiin pseudotyyppiseksi lentivirus supernatantin joka sisältää tyhjän LEGO G puro-plasmidin ja 22Rv1 shLTR1 + 2 solut kerättiin ja niistä määritettiin sytokiinien käyttämällä kiinteän faasin immunoblottauksella menettelyä (RayBio Human Cytokine Vasta Array 5, RayBiotech) (kuvio S3). Supernatantit sovelletaan kalvoihin, jotka sisältävät vasta-aineita 80 ihmisen sytokiineja. Pieniä eroja sytokiinien tällaisia ​​soluja havaittiin (kuvio S3). In 22Rv1 solujen vähentää XMRV transkriptitasot, osteopontiini (OPN), kudoksen estäjä matrixmetalloproteinase TIMP2 ja IL13 alennettiin hieman, kun taas hepatosyyttikasvutekijän (HGF) lisättiin.

käyttäminen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä osoitetun mRNA selostukset olemme vahvistaneet nämä havainnot: OPN, TIMP2 ja IL13 ilmentyminen on vähentynyt merkittävästi 22Rv1 soluissa, jotka ilmentävät shLTR1 + 2, kun HGF: n ilmentyminen on lisääntynyt huomattavasti (kuvio 4). Lisäksi testasimme ilmentyminen matriksimetalloproteinaasi MMP-9 ja CXCL14 ilmentymisen 22Rv1 soluissa ja 22Rv1 shLTR1 + 2-soluissa. Vaikka emme löytäneet eroja MMP-9 mRNA: n ilmentymisen näissä solulinjoissa (tuloksia ei ole esitetty), CXCL14 ilmentyminen vähenee merkittävästi 22Rv1 shLTR1 + 2-soluilla.

Yhteensä RNA 22Rv1 ohjaus ja 22Rv1 shLTR1 + 2 analysoitiin mRNA: n ilmentymisen tasoja merkitty sytokiinien qRT-PCR: llä. Data normalisoitiin kolmea siivous geenien (GAPDH, TBP, RLP13).

De Novo Infektio Eturauhasen stroomakasvaimet Fibroblastin kanssa replikaatiokompetentin XMRV aiheuttama Erot Sytokiiniekspressioanalyysi

analysoida, havaittu eroja sytokiiniekspressiota ja julkaisu on solutyyppi riippuvainen, analysoimme sytokiiniekspressiota ja vapauttaa eturauhasen strooman fibroblasteissa (kyseistä luottoa) tartunnan replikaatiokompetentin XMRV johdettu LNCaP XMRV VP62 proviruksen DNA. Kyseistä luottoa eristettiin eturauhasessa kollagenaasilla sulattaa ja viljelemällä selektiivisissä alustoissa kuvatulla äskettäin [28], [29]. Outgrowing soluja laajennettiin ja vahvistettiin FACS-värjäystä ilmentymisen α-SMA (sileän lihaksen aktiini) ja vimentiinin (markkereita aktivoitu strooman fibroblastien) ja puute sytokeratiinia ilmaisun [28]. Vain varhainen määriä näitä soluja käytettiin XMRV infektion kokeissa. 2d ohittaa infektio supernatantista XMRV tartunnan kyseistä luottoa tai valeinfektoituja soluja levitettiin kaupallista vasta-aineen kalvon pakat (RayBio; katso kuvio S4). XMRV infektio solujen vahvistettiin XMRV gag-spesifisten PCR (tuloksia ei ole esitetty). 60 sytokiinien analysoitiin vasta-kalvo paneelit kahdeksan (GRO, GROα, TIMP1, TIMP2, HGF, IGFBP2, IGFBP4, IL13) on differentiaalisesti ilmaisseet XMRV tartunnan verrattuna meinfektoiduissa soluihin. Vaikka GRO ja GROα transkriptit ylös säännelty supernatanttia kyseistä luottoa XMRV tartunnan soluja, HGF, IGFBP2, IGFBP4, IL13, TIMP1 ja TIMP2 ilmentyminen väheni.

Vahvista saatujen tulosten sytokiinien vasta-taulukot ja jättää erojen solujen valmistuksessa ensisijainen eturauhasen strooman fibroblastien, suoritimme kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR kokeissa käytetään kahta eri kyseistä luottoa strooman fibroblasti saatujen linjojen eri potilaista (kuvio 5). Solut infektoitiin viljelmän supernatanttia, joka sisälsi replikaatiokompetentteja XMRV peräisin LNCaP-soluja, jotka on transfektoitu XMRV VP62 proviruksen DNA [30], [31]; Kokonais-RNA uutettiin, DNaseI käsiteltiin ja analysoitiin sen jälkeen qRT-PCR erot sytokiiniekspressiota. Vaikka pystyimme vahvistamaan tuloksemme saatiin Ab matriisia GROα, IL13 ja TIMP1, emme pystyneet vahvistamaan meidän ennakkotietojen TIMP2, HGF ja IGFBP4. TIMP2 ja IGFBP4 ilmentyminen kasvoi vasteena XMRV infektion ja induktio HGF ilmentymistä havaittiin vain PrSc29 soluissa, kun taas PrSc5 solut osoittivat päinvastainen vaikutus.

Ensisijainen eturauhasen strooman fibroblasteissa (kyseistä luottoa) infektoitiin XMRV sisältävä supernatantti on LNCaPi soluja tai mock supernatanttia. Kokonais-RNA analysoitiin mRNA: n ilmentymisen tasoja eri sytokiinien qRT-PCR: llä. Data normalisoitiin kolmea erilaista siivous geenejä ja havainnollistettu suhteellinen geenin ilmentymisen verrattuna meinfektoiduissa solujen kunkin yksittäisen ajankohtana.

sytokiinioireyhtymän Riippuu XMRV Replikointi Vaikutteet invasiivisuus ja Tube Formation in vitro

Jotta saadaan mekanistinen käsitys havaitut erot sytokiinien vapautumisen eturauhasen epiteelisolujen tai stroomasoluissa tartunnan XMRV useita in vitro tutkimukset tehtiin. Emme havainneet eroja solujen lisääntymisen välillä tartunnan (22Rv1 ohjaus shRNA ja 22Rv1 shLTR1 + 2 tai kyseistä luottoa tartunnan ja ei-tartunnan kyseistä luottoa solujen soveltamalla MTT-määritys (kuvio S1). Seuraavaksi tutkittiin, XMRV infektoiduissa soluissa voisi edistää muuttoa LNCaP parakriinisesti. Ensisijainen eturauhasen strooman fibroblastien joko pilkata tai XMRV tartunnan ympättiin pohjalle osastoon 24 siirtokuoppaan kammioon lautasen. kautta salliva kalvo vapauttaa sytokiineja vaikuttavat suoraan invaasiokyvyssä LNCaP. tätä määritystä käyttämällä teimme kurssin koskevasta XMRV infektio, on esitetty kuviossa 6A. XMRV infektio strooman fibroblastien johtaa tilastollisesti merkittävää kasvua muuttavia LNCaP-soluja, jotka on lisäksi lisääntynyt infektoiduissa soluissa pidemmän ajan (28 päivää). Tämä kasvu on spesifinen XMRV, koska niihin liittyvät MLV (MoMCF, amfotrooppiseksi MLV käyttäen PIT2 reseptori) ei aiheuttanut suurempia määriä vaeltavien LNCaP-soluja (kuvio 6B). Mielenkiintoista, replikaatioinkompetentin viruksen kaltaisia ​​partikkeleita pseudotyypitetty XMRV env ei johtanut kasvua LNCaP solumigraation (kuvio 6B ) viittaa siihen, että tapahtumien riippumaton reseptorin sitoutumisen ja signalointi edistää havaitun fenotyypin.

(A) Ensisijainen tukikudosten fibroblasteissa (kyseistä luottoa) 8 d tai 28d pi jossa XMRV ympättiin pohjalle osastoon hyökkäystä kammion. Invasiivisuus LNCaP-soluja laskettiin kolmessa riippumattomassa kokeessa suoritettiin kahtena kappaleena. (B) kyseistä luottoa infektoitujen solujen ksenotrooppisia MLV (XMRV) indusoivat invaasion eturauhassyövän soluissa in vitro, kun taas stroomasoluissa tartunnan amfotrooppinen MoMCF tai XMRV env pseudo- virus kaltaiset partikkelit eivät lisää hyökkäystä LNCaP-soluja. (C) ja (D) XMRV infektio indusoi putken muodostumiseen HMEC-soluissa. Solut ympättiin matrigeeliä inkuboitiin supernatantin joko XMRV tai valeinfektoituja strooman fibroblastit ja putken muodostumisen jälkeen 5 h. Edustava kuva putken muodostumiseen havaittu näytetään (C). (D) kvantifiointi kaksi erillistä koetta suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Kuvia kolmesta eri näkökentät kuoppaa kohti analysoitiin putken (20 putkia per kenttä) käyttäen Adobe Photoshop hallitsija työkalu.

Lisäksi olemme suorittaa in vitro angiogeneesissä määrityksissä: putken muodostumiseen analysoitiin käyttämällä supernatanttien joko XMRV tai meinfektoiduissa solujen nautintoaine kuin niiden sisältämät ilmentyvät eri /tai eri angiogeneesiä sytokiineja. Viljelysupernatantti eturauhasen strooman fibroblastien lisättiin HMEC soluihin Matrigelillä ja putken muodostumiseen seurattiin 5 tuntia. Muutokset sytokiinien vapautumista vastauksena XMRV infektion huomattavasti pituus kapillaariverkon muodostama HMEC-soluissa (kuvio 6C ja D), joka on linjassa in vivo havainnot.

Keskustelu

Tutkimuksemme osoittaa, että ksenotrooppisen gammaretroviruses, jotka on usein havaittu syöpäsolulinjoissa perustettu viemällä ne kuitenkin nude-hiirissä, paitsi kantaa riskin infektion, mutta myös voisi merkittävästi vaikuttaa kokeellista tietoa vastaanotetaan näistä solulinjoista. Erityisesti eturauhassyövän solulinja 22Rv1 yleisesti käytetty eturauhassyövän in vitro-tutkimuksissa sekä in vivo ksenograftimalleissa kuljettaa useita kopioita XMRV integroitu ja aktiivisesti suojista tarttuvaa virusta sen supernatanttiin.

XMRV alun perin tunnistettiin ihmisen eturauhassyövän kudoksen ja sen yhdessä ihmisen sairauksista on ehdotettu viime vuosina. Viimeaikaiset tiedot viittaa rekombinaation kahden esi hiiren XMRV sekvenssit, kutsutaan Pre-XMRV1 ja Pre-XMRV2, soluviljelmässä mikä kasvattaisi XMRV [7] yhdessä useiden tutkimusten ei tunnista XMRV sekvenssit ihmisen näytteissä [11], [12], [ ,,,0],14], [17], [18], [20], [32], [33], [34], [35], [36], [37] kyseenalaistaa yhdistys XMRV ihmisen sairauksiin.

Silti analyysi XMRV transformaatiopotentaali on merkittävää etua, koska 22Rv1 soluja ja CWR22-R1 solut tuottavat infektioosivirusta ja yleisesti hyväksytty in vitro mallissa sekä ksenograftimallia tutkia eturauhassyövän tuumorigeneesiprosessin etenemistä, biomarkkereita ja kehittäminen terapeuttisen strategioita.

tässä nykyisessä tutkimuksessa tuotti 22Rv1 solulinjan pienentää XMRV selostukset ja virusperäisen proteiinin tasot soveltamalla shRNAs kohdistaminen kaksi eri alueiden XMRV LTR alueella. in vivo -kokeet osoittivat, että kasvaimia indusoitiin 22Rv1 solujen alentunut XMRV transkriptit olivat erittäin nekroottisen ja osoittivat huomattavasti vähemmän vaskularisaation arvioituna CD34-värjäyksellä (kuvio 3) ja CEACAM-1 värjäyksen (tuloksia ei ole esitetty). Jos haluat sulkea pois integraatio sijoituspaikan valinnassa sekä shRNA armottoman vaikuttaa nämä kokeet toistettiin käyttämällä riippumatonta 22Rv1 LEGO-shXMRV LTR infektiokokeet sekä käyttämällä erilaisia ​​shRNA sekvenssit kohdistaminen kolmannen alueen XMRV (shLTR3). Toisin kuin kokeissa, joissa käytettiin 22Rv1 shLTR1 + 2-soluissa, ei ole merkittäviä eroja tuumorin koon havaittiin mikä saattaa johtua siitä, että pieni määrä eläintä ryhmää kohti. Vaihtoehtoisesti havaitut erot kasvaimen koon ensimmäiset vierassiirrekokeissa käyttäen shRNA sekvenssit kohdistaminen LTR alueilla 59-79 ja 103-125 voisi olla seurausta ns off-tavoite vaikutuksia soluissa. Huomautamme, että sen sijaan, että shRNA vastaan ​​lusiferaasin tai muut sekvenssit, yleensä ei ole löydetty ihmisen genomin, tyhjä lentivirusvektori käytettiin synnyttämään ohjaus lentiviruksen supernatanttia käytettiin myöhemmin transdusointiin 22Rv1 soluihin. Siten emme voi sulkea pois kyllästyminen komponenttien siRNA koneen johtaen epäspesifisesti vaikutuksia. Emme kuitenkaan ei havainnut fenotyyppi, kohonneeseen apoptoosin, vähentää elinkelpoisuus soluja, jotka on kuvattu korreloivan epäspesifinen aiheuttamia kyllästämällä siRNA-reitin [38]. Off-tavoite vaikutuksia sulkea pois toistamalla eläinkokeiden kolmannen, erilainen alue XMRV genomista shRNA järjestyksessä.

Ei etäpesäkkeiden muodostumista keuhkoissa, pernassa ja maksassa sekä luumetastaasipotilailla havaittiin kontrollihiiret sekä SHLTR hiiret (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi kasvaimia ei vaihdella erilaistumista tila, stroomasolujen organisaatio eikä kasvaimet näyttää erot leukosyyttien infiltraatiota, heijastuu suhteellisen läsnäolo CD18

+ leukosyyttien (tuloksia ei ole esitetty). Mielenkiintoista, molemmat joukko vierassiirrekokeissa (shLTR1 + 2 sekä shLTR3) paljasti vähensi verisuonten muodostumista ja lisätä alueiden kuolion. Koska meillä ei luoda XMRV virus on muuttunut kohdepaikkaan käytetyn shRNAs että voisimme käyttää täydentämään 22Rv1 transdusoitujen solujen kanssa shLTR3, on mahdollista, että havaittu in vivo ja in vitro erot näiden solujen ovat seurausta lukea läpi tai rekombinantti XMRV ja solujen selostukset.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet tärkeitä tehtäviä sytokiinien eri osa kasvaimen kasvua. Suurin osa sytokiinien tunnistettu meidän määrityksissä on kuvattu vaikuttamaan kasvaimen mikroympäristölle muodostumiseen aikana eturauhasen kasvaimien syntyyn. GRO /GROα (CXCL1), jäsen CXC kemokiiniperhe, edistää angiogeneesiä ja rekrytoi neutrofiilien ja endoteelisolujen aikana pahanlaatuisten etenemisen eturauhasen syöpä. Poikkeavaan ilmentyminen HGF (hepatosyyttikasvutekijää) ja sen reseptori, c-Met, usein korreloi edenneen eturauhassyövän vaiheissa. Vastaavasti IGFBP2 ja 4 (insuliinin kaltainen kasvutekijää sitovat proteiinit 2 ja 4) ovat biomarkkereita edenneen eturauhassyövän vaiheissa. Tissue inhibiittorit matrixmetalloproteinases (TIMP) on riippumatta niiden toiminta – estämällä proteinaasi MMP (matrixmetalloproteinases) on kuvattu tekijät osallistuvat kasvaimen etenemistä: TIMP 1 ja 2, molemmat inhiboivat tuumorisolujen apoptoosia; TIMP 1 edistää kasvaimen angiogeneesiä ja TIMP 2 kiihdyttää kasvaimen etenemistä.

XMRV aiheuttamaa sytokiinien vapautumista ei näytä olevan kasvain epiteelisoluspesifinen mutta voidaan myös havaita käyttäen eturauhasen strooman fibroblasteja (kuviot 5, S4). Haluamme huomauttaa, että näissä kokeissa XMRV virusstokkeja johdettu LNCaP proviraalinen XMRV VP62 DNA käytettiin. Emme sekvensoida viruspopulaatiossa johdettu de novo tartunnan LNCaP poissulkemiseksi akuutisti muuttamassa XMRV variantteja johdettu rekombinaatiotapahtumista äskettäin julkaistu [39].

XMRV infektio strooman fibroblastien johti tilastollisesti merkittävää kasvua vaeltavia LNCaP-solut, jotka on lisäksi lisääntynyt infektoiduissa soluissa pidemmän ajan (28 päivää). Tämä kasvu ovat rakenteeltaan XMRV ja riippuu XMRV replikointi: liittyvä MLV (MoMCF, amfotrooppiseksi MLV käyttäen PIT2 reseptori) ei aiheuttanut suurempia määriä LNCaP liikkuvien solujen (kuvio 6B). Mielenkiintoista, supernatanttia solu tartunnan replikaatioviallinen XMRV-env pseudotyypitettyä hiukkasia ei aiheuttanut muutoksia solumigraation viittaa siihen, että reseptoriin sitoutuminen ei edistä havaitut muutokset.

Yleensä havaintomme ovat yhdenmukaiset joidenkin näkökohdat äskettäin julkaissut tietoja, jotka osoittavat, että XMRV infektio LNCaP edistää proliferaatiota, transformaatio ja invasiivisuus näiden solujen in vitro [40] sekä viime aikoina on osoitettu, että XMRV infektio voi aiheuttaa apoptoosia joissakin ihmisen solulinjoissa [41]. Vaikka me myös tarkkailla kasvu invasiivisuuden soluja inkuboidaan viljelmän supernatantista XMRV infektoitujen solujen, emme tarkkailla proliferaation kasvun vuoksi XMRV infektio, ei 22Rv1 solut transdusoitiin shRNAs kohdistaminen XMRV transkriptit (kuvio S1) tai LNCaP-solujen tai stroomasolujen infektoitu XMRV (tietoja ei esitetty) osoitti vähenemistä tai lisääntymistä leviämisen määrä.

Emme havainneet eroja MMP-9-mRNA-tasojen seurauksena XMRV infektion julkaistiin äskettäin [40]; vaikka vähentäminen TIMP2 vapautumisen kyseistä luottoa infektoitujen solujen XMRV havaittiin. Koska MMP pääasiassa säädellään proteiinin tasot emme voi sulkea pois eroa MMP-9 toimintaa. Sytokiini-vasta paneelit käytetään tässä ei sisältänyt MMP-9 tai MMP2 sekä emme sisältää zymografian tekniikoita testata eroja MMP-9 tai MMP2 proteiinin aktiivisuutta. On selvää, että nopeus ja laajuus angiogeneesin on kriittinen osa syövän etenemisen. Tarkkaa mekanismia, jonka kautta XMRV voivat vaikuttaa angiogeneesiin, alus muodostuminen ja erot sytokiinioireyhtymän ei ymmärretä.

Retroviirus saastuminen näyttää olevan yleisempiä laajalti käytetty solulinjat [11], [42], [43], [44], [45], [46], [47]. Tuntematon läsnäolo retrovirusten solulinjoissa vieressä tartuntavaaraa riski voi vaikuttaa tuloksiin kokeita. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat selvästi, että ihmisen solulinjat, mukaan lukien eturauhasen syöpäsolulinjoissa yleisesti suorittaa gammaretroviral sekvenssit [6], [20], [48]. Joillekin niistä tarttuvien hiukkasten muodostumista on osoitettu: ihmisen T-solulinjassa Jurkat J6, lymfoblastoidisolulinjassa A3.0 /F7 [47], B-solulinja DG75 [45] ja eturauhassyövän solulinjoissa LAPC4, VCAP ja EKVX [6], [48]; kuitenkin, vain muutamia esimerkkejä seurauksena kokeelliseen tulokseen on osoitettu [44], [47], [49]. Voimme päätellä, että saatuja kokeellisia tuloksia in vitro tai in vivo suoritettiin retrovirus positiivisia solulinjoja (erityisesti 22Rv1 tai CWR-R1) voi heijastaa molekyylirakennetta viruksen sijaan solutyypin erityispiirteet. Siksi retrovi- tila solulinjojen kokeissa käytettyjen olisi annettava sekä tutkimuksia (mukaan lukien ksenograftin in vivo kokeissa) on validoitu käyttämällä useita solulinjoja.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines

ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa LNCaP (ATCC # CRL-1740) ja 22Rv1 (ATCC # CRL-2505) kasvatettiin RPMI 1640: ssä (Gibco), jota oli täydennetty 10% FCS: ää, 5% penisilliini /streptomysiiniä ja L- glutamiini. Samanlaisia ​​olosuhteita sovelletaan shRNA käsiteltiin 22Rv1 soluja. TE671 (ATCC # CRL-8805) ja 293T-solut (ATCC # CRL-11268) viljeltiin DMEM: ssa Glutamax (Gibco), jota oli täydennetty 10% FCS: ää, 5% penisilliini /streptomysiiniä. HMEC-soluissa (Lonza) viljeltiin Endoteelisolukasvun Medium MV2 (Promocell). Strooman solulinjoja (kyseistä luottoa) perustettiin kuvatulla [29], [50], [51].