Krooninen sairaus

tiivistelmä

Amygdalin, luonnollinen yhdiste, on käytetty monet syöpäpotilailla on vaihtoehtoinen lähestymistapa hoitoon sairaudesta. Kuitenkin, onko tämä aine todella saa aikaan kasvaimen vastaisen vaikutuksen ei ole koskaan ratkaistu. Eräässä in vitro -tutkimuksessa aloitettiin tutkimaan vaikutusta amygdalin (1,25-10 mg /ml) kasvuun paneelin virtsarakon syövän solulinjoista (UMUC-3, RT112 ja TCCSUP). Kasvaimen kasvua, lisääntymistä, kloonikasvuun ja solusyklin etenemisen tutkittiin. Solusyklin säätelevä proteiineja cdk1, cdk2, cdk4, sykliini A, sykliini B, sykliini D1, p19, p27 sekä nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) liittyvien signaalien phosphoAkt, phosphoRaptor ja phosphoRictor tutkittiin. Amygdalin vähensi annosriippuvaisesti kasvun ja lisääntymisen kaikissa kolmessa virtsarakon syövän solulinjoissa, heijastuu merkittävästi viivästyttää solusyklin etenemisen ja G0 /G1 pidätykseen. Molecular arviointi paljasti vähentynyt phosphoAkt, phosphoRictor ja menetys Cdk ja sykliini komponentteja. Koska merkittävin vaikutuksia amygdalin havaittiin CDK2-sykliini A-akseli, siRNA kaataa tutkimusta suoritettiin, paljastaen positiivinen korrelaatio cdk2 /sykliini A: ekspressiotason ja kasvaimen kasvua. Amygdalin siis voi estää kasvaimen kasvua alas-moduloimalla cdk2 ja sykliini A In vivo tutkimus on noudatettava arvioida amygdalin käytännön merkitys kuin anti-kasvain huumeiden.

Citation: Makarević J, Rutz J, Juengel E , Kaulfuss S, Reiter M, Tsaur I, et ai. (2014) Amygdalin Blocks virtsarakon syövän Cell Growth

In vitro

vähentämällä sykliini ja cdk2. PLoS ONE 9 (8): e105590. doi: 10,1371 /journal.pone.0105590

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 22 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2014; Julkaistu: 19 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Makarevic et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat ”Brigitta und Norbert Muth Stiftung” (https://www.muth-stiftung.de) ja ”Freunde und Förderer der Goethe -Universität Frankfurt ”(https://www2.uni-frankfurt.de). Rahoitus sai RAB. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Virtsarakon syöpä on toiseksi yleisin maligniteetti urogenitaaliseen länsimaissa, esiintyvyys 37,9 /100,000 vuodessa miehillä ja 9,6 /100000 vuodessa naisten [1]. Noin 70% aluksi diagnosoidaan kasvaimet ovat pinnallisia ja voidaan hoitaa höyläysleikkaus, jolloin rakko on säilynyt. Loput 30% kasvaimista tullut lihasten invasiivisia ja liittyy suuri riski etäpesäkkeiden [2]. Niille potilaille, joilla on paikallisesti edennyt tai etäpesäkkeitä, kemoterapia on hoitovaihtoehto. Kuitenkin ennusteen potilaita, joilla on etäpesäkkeitä on edelleen heikko, joiden eloonjäämismediaani 14 kuukauden ja 5 vuoden eloonjäämisaste 15% [3].

Yli 50% syöpäpotilaista Euroopassa käyttää täydentävän /vaihtoehtoinen lääketiede (CAM) sijasta tai yhdistettynä, tavanomainen hoito [4]. Tyytymättömyys tavanomaisen hoidon ja vähentäminen kemoterapeuttisten haittavaikutukset ovat yleisimmät syyt käytön CAM [5], [6]. Vaikka CAM käyttö on suosittu syöpäpotilaita, näyttöön perustuva hyötyvät luonnollisesti yhdisteitä puuttuu. Välistä ristiriitaa käyttö luonnontuote ja tietoa sen anti-kasvain ominaisuuksia näkyy erityisesti, kun kyseessä on amygdalin. Amygdalin (D-mandelonitrile-β-gentiobioside) on syanogeeniset diglucoside läsnä kaivoksia monet hedelmät ja lukuisissa kuuluvien laitosten Rosaceae kuten Prunus persica (persikka), Prunus armeniaca (aprikoosi) ja Prunus amygdalus Amara (karvasmantelia ). Termi ”laetrile” käytetään usein synonyyminä amygdalin. Kuitenkin laetrile on rakenteellisesti erilainen kuin äidin yhdisteestä, amygdalin, ja on lyhenne (vasemmalle kiertävä ja mandeloniTRILE) on puhdistettu, semi-synteettinen muoto amygdalin. Tässä tutkimuksessa käytetään ”amygdalin”.

Amygdalin oli yksi suosituimmista, kuin perinteistä, anti-syöpähoitojen 1970-luvulla. Vuoteen 1978 70000 US syöpäpotilaat olivat käyttäneet amygdalin kohdella syövän [7]. Silti näyttöön perustuva tutkimus amygdalin on harvaa ja sen hyöty kiistanalainen. Kannattajat pitävät amygdalin luonnollinen syövän hoito, kun taas vastustajat varoittavat, että amygdalin on tehoton ja jopa myrkyllisiä. Vaikka on väitetty, että amygdalin on vaarallinen, ei vakavia akuuttia toksisuutta on kohdattu. On myös todettu, että amygdalin ei ole anti-kasvain potentiaali, vaikkakin 368 syöpäpotilasta lueteltu Yksi arvostelu, 12,5% koki täydellistä tai osittaista vastetta, 6,8%: lla oli stabiili tauti ja 22,9% osoittivat oireenmukaista hyötyä amygdalin [8]. Jotta saadaan käsitys siitä, miten amygdalin toimisi, in vitro tutkimus aloitettiin määrittää sen vaikutus virtsarakon syövän kasvua ja leviämistä. Lisäksi solusyklin etenemistä ja solusyklin säännellä proteiinien arvioitiin amygdalin käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen. siRNA kaataa tutkimusta suoritettiin tutkimaan proteiineihin muuttanut amygdalin, joilla voi olla kliinistä merkitystä.

in vitro Tässä esitetyt tiedot viittaavat merkittävän kasvun ja leviämisen estäminen vaikutukset amygdalin, luultavasti aiheuttama lasku solusyklin säätelevät proteiinit cdk2 ja sykliini A.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

RT112, UMUC-3 (ATCC /LGC Promochem GmbH, Wesel, Saksa) ja TCCSUP (DSMZ, Braunschweig, Saksa) rakkosyöpä- soluja kasvatettiin ja jatkoviljeltiin RPMI 1640, 10% vasikan sikiön seerumia (FCS), 20 mM HEPES-puskuria, 1% glutamax ja 1% penisilliini /streptomysiiniä (kaikki: Gibco /Invitrogen, Karlsruhe , Saksa). RT112 on invasiivinen (patologinen vaihe T2) kohtuullisesti erilaistunut (aste 2/3) malli ihmisen virtsarakon syövän, kun taas TCCSUP on siirtymäkauden cell carcinoma, grade 4. UMUC-3 edustaa korkealaatuista 3, invasiivisia virtsarakon syöpä. Alakulttuurit mistä kohdista 7-24 käytettiin.

Amygdalin hoito

Amygdalin alkaen aprikoosinsiementen (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Saksa) oli juuri liuotettu solukasvatusväliaineessa ja lisätään kasvainsoluihin pitoisuuksina vaihtelee 1,25-10 mg /ml. Controls jätettiin käsittelemättä. Kaikissa kokeissa kasvaimen soluviljelmiä verrattuna ei-käsitellyissä viljelmissä. Myrkkyvaikutusten arvioimiseksi amygdalin, solujen elinkelpoisuus määritettiin trypaanisinisen (Gibco /Invitrogen). Apoptoosin arviointi ilmentymisen anneksiini V /propidiumjodidi (PI) määritettiin käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, Heidelberg, Saksa). Kasvaimen solut pestiin kahdesti PBS: llä ja inkuboitiin sitten 5 ui anneksiini V-FITC ja 5 ui PI pimeässä 15 minuuttia huoneenlämpötilassa. Solut analysoitiin FACScalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Saksa). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen (varhainen ja myöhäinen) kussakin neljänneksessä laskettiin käyttäen CellQuest-ohjelmaa (BD Biosciences).

mittaus kasvainsolujen kasvua ja proliferaatiota

Solun kasvua arvioitiin käyttäen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) väriaineen vähentäminen määritys (Roche Diagnostics, Penzberg, Saksa). Kasvainsolujen (100 ui, 1 x 10

4 solua /ml) ympättiin 96-kuoppaisille kudosviljelylevyille. 24, 48 ja 72 h, MTT: tä (0,5 mg /ml), lisättiin vielä 4 tuntia. Sen jälkeen solut hajotettiin puskurissa, joka sisälsi 10% SDS: ää 0,01 M HCl: ää. Levyjä inkuboitiin sitten yön yli 37 ° C: ssa, 5% CO

2. Absorbanssi 570 nm: ssä mitattiin kustakin hyvin käyttäen mikrolevyn ELISA-lukijaa. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Jälkeen vähentämällä tausta-absorbanssi, tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona solujen määrä.

Solujen proliferaatio mitattiin käyttämällä BrdU soluproliferaation entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA) Kit (Calbiochem /Merck Biosciences, Darmstadt, Saksa). Kasvainsoluja, ympättiin 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille, inkuboitiin 20 ul: BrdU-merkintöjä kuoppaa kohti 8 tuntia, kiinteät ja havaittiin käyttäen anti-BrdU-mAb mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä.

klonogeeninen määritys

kasvainsoluista, esikäsitelty amygdalin varten 2 viikkoa, siirrettiin 6-kuoppalevyille 300 solua kuoppaa kohti. Seuraavat 10 päivää inkuboinnin, jonka aikana solut joko altistetaan amygdalin tai ei, pesäkkeet kiinteä ja laskettiin. Pesäkkeitä vähintään 50 solut laskettiin yhdeksi.

Solusyklianalyysiä

Solusyklianalyysiä suoritettiin subkonfluenteista kasvainsoluja. Kasvainsolupopulaatioissa värjättiin propidiumjodidilla, käyttäen Cycle TEST PLUS DNA Reagent Kit (BD Pharmingen), ja sitten alistettiin virtaussytometria, jossa on FACScan-virtaussytometrillä (Becton Dickinson). 10000 tapahtumaa kerättiin jokaisesta näytteestä. Tietojen hankinta suoritettiin käyttäen Cell-Quest ohjelmisto ja solukierron jakelu laskettiin ModFit ohjelmistoa (BD Biosciences). Lukumäärä aidatulla solujen G1, G2 /M tai S-vaihe on esitetty%.

Western blotting

tutkimiseksi proteiinit osallistuvat solujen kasvun säätelyssä, tuumorisolun lysaatit sovellettu 7% polyakryyliamidigeelissä ja elektroforeesi 90 minuutin ajan 100 V: sitten proteiini siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Sen jälkeen, kun esto ei-rasva kuivamaitoa 1 tunti, kalvoja inkuboitiin yön yli monoklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja solusyklin proteiineja: CDK1 (lgG1, klooni 1), cdk2 (IgG2a, klooni 55), cdk4 (lgG1, klooni 97), sykliini A (lgG1, klooni 25), sykliini B (lgG1, klooni 18), sykliini D1 (lgG1, klooni G124-326), p19 (lgG1, klooni 52 /P19), p27 (lgG1, klooni 57, kaikki: BD Pharmingen ). Nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) reitti tutkittiin käyttäen seuraavia monoklonaalisia vasta-aineita: anti fosfo Rictor (pRictor, IgG, Thr1135, klooni D30A3), anti-fosfo Raptor (pRaptor, IgG, Ser792, sekä: New England Biolabs, Frankfurt, Saksa), anti fosfo Akt (Pakt, IgG1, Ser472 /Ser473, klooni 104A282; BD Pharmingen). Epigeneettiset modulaatio tutkittiin anti asetyloitu H3 (AH3, IgG, Lys9, klooni C5B11) ja anti asetyloitu H4 (AH4, Lys8, polyklonaalinen IgG; sekä: New England Biolabs).

HRP-konjugoitua vuohen anti -hiiri IgG (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA; laimennus 1:5.000) toimi sekundäärisenä vasta-aineena. Kalvot lyhyesti inkuboitiin ECL detektointireagenssia (ECLTM, Amersham /GE Healthcare, München, Saksa) visualisoida proteiineja ja analysoitiin sitten Fusion FX7 järjestelmä (Peqlab, Erlangen, Saksa). β-aktiinin (1:1000; Sigma, Taufenkirchen, Saksa) toimi sisäisenä kontrollina.

Gimp 2.8 ohjelmistoa käytetään suorittamaan pikselimäärä analyysi proteiinijuovat. Suhde intensiteetti kunkin tutkitun proteiinin /intensiteetti β-aktiini laskettiin, ja intensiteetti arvot ilmaistiin sitten prosentteina, jotka liittyvät säätimet asetettu 100%.

Cdk2- ja sykliini A: kaataa

tuumorisoluja (3 x 10

5/6-kuoppa) transfektoitiin sirna (siRNA) suunnattu cdk2 (gene ID: 1017, kohdesekvenssi: AGGTGGTGGCGCTTAAGAAAA) tai sykliini A (gene ID: 890, kohdesekvenssin : GCCAGCTGTCAGGATAATAAA; Qiagen, Hilden, Saksa), jossa siRNA /transfektioreagenssi (HiPerFect transfektioreagenssi; Qiagen) suhde 01:06. Non-käsitellyt solut ja solut, joita käsiteltiin 5 nM ohjaus siRNA (Kaikki tähdet negatiivinen kontrolli siRNA, Qiagen) toimivat kontrolleina. Sen jälkeen, kasvainsolujen kasvua analysoitiin kuten edellä on esitetty.

Tilastot

Kaikki kokeet suoritettiin 3-6 kertaa. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin ei-parametrinen Wilcoxonin-Mann-Whitney-U-testi kokeet toistettiin 6 kertaa. Kokeet suoritettiin 3 kertaa olivat tilastollisesti arvioitiin muuttujien t-testiä. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä ap arvoon alle 0,05.

Tulokset

annosvasteyhteys analyysi

altistaminen kasvainsolujen amygdalin (kerta-annos sovellus) johti keskittymän : sta riippuva väheneminen kasvaimen solujen määrä, joissa näkyvin vaikutus ilmeiseksi TCCSUP solulinjassa (kuva 1, 24 h sovellus). Ei merkkejä toksisuudesta osoittama trypaanisinieksluusiolla testi. Koska vahvin solu vähennys nähtiin 10 mg /ml amygdalin, tämä pitoisuus käytettiin kaikkien seuraavien tutkimuksessa. Pitkäaikainen hoito, joka koostuu 10 mg /ml amygdalin lisätään kasvainsoluihin kolme kertaa viikossa yli 2 viikkoa ajan osoitti, että solujen kasvu vähentynyt samassa määrin kuin kohdataan lyhytaikaisessa hoidossa protokollaa (kuva 1, 2 viikkoa sovellus).

Controls jätettiin käsittelemättä. Down: Kasvain solujen kasvua 2 viikon kuluttua hoidon 10 mg /ml amygdalin. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin 5 kertaa. Tulokset yhdestä edustavasta kokeesta on esitetty. * Tarkoittaa merkittävää eroa (p = 0,0022).

Controls jätettiin käsittelemättä. Oikeassa yläkulmassa quadrant näyttää prosentteina solujen myöhään apoptoosin, oikeanpuoleiseen alanurkkaan solujen prosenttiosuus alussa apoptoosin (yksi edustaja 3 testiä, SD

määrityksen sisäinen 10%).

apoptosis

Lyhyen aikavälin soveltamista amygdalin 24 tuntia ei indusoinut apoptoosia (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin tuumorisolujen prosenttiosuuteen, joka käy läpi aikaisen apoptoosin noin kaksinkertaiseksi kahden viikon kuluttua amygdalin altistuminen kaikissa kolmessa solulinjoissa: p = 0,0026 (UMUC-3), p = 0,0145 (TCCSUP) ja p = 0,0208 (RT112). Lisäksi kaksinkertaistaminen lopulla apoptoosin tapahtunut UMUC-3 solulinja (kuva 2; p = 0,0230).

kasvainsoluproliferaation ja klonaalinen solujen kasvua

leviämisen kaikissa kolmessa solulinjoissa väheni huomattavasti, onko amygdalin haettiin 24 tuntia tai 2 viikon ajan (kuvio 3, vasen). Seuraavat kaksi viikkoa amygdalin altistuminen subkonfluenteista soluihin, kloonikasvuun arvioitiin sitten, jolloin amygdalin oli joko lisätty myöhemmin 10 päivän periodin ajan ( ”amygdalin B”) vai ei ( ”amygdalin A”). Lukumäärä RT112 kloonien huomattavasti vähentynyt 10 päivää amygdalin altistus klonaalinen muodostumisen, eikä TCCSUP kloonit olivat näkyvissä (kuva 3, oikea). Kun amygdalin ei sovellettu aikana klonaalisen muodostumisen määrä RT112 ja TCCSUP kloonien pienensi myös, joskaan ei yhtä voimakkaasti kuin nähtiin ”amygdalin B” hoito (kuva 3, oikea). UMUC-3 solulinja eivät muodostaneet pesäkkeitä ja sen vuoksi ei ole arvioitu.

Right: klonogeeninen kasvu TCCSUP ja RT112 solut (sen jälkeen kaksi viikkoa subkonfluenteista kulttuuri 10 mg /ml amygdalin) ilman (kontrolli ) ja amygdalin. Amygdalin A = 10 päivää amygdalin ilmaiseksi inkubaation aikana klonogeeniset kasvua. Amygdalin B = 10 päivää klonogeenisten kasvua 10 mg /ml amygdalin. Kokeet tehtiin kolmena kappaleena ja toistettiin 5 kertaa. * Tarkoittaa merkittävää eroa (p = 0,0022).

#indicates merkittävää eroa amygdalin A (p = 0,0022).

solusyklin etenemisen

Amygdalin moduloidun solusyklin etenemistä, riippuen kasvaimen solulinja (kuva 4 ). Lyhytaikaiset amygdalin sovellus (24 h) UMUC-3 lisäsi G0 /G1 solut (p = 0,0169) ja vähensi S-vaiheessa olevien solujen (p = 0,0138). Vuonna TCCSUP soluissa lyhytaikainen hoito lisäsi G0 /G1-vaiheen solut (p = 0,0121), mutta vähensi solujen G2 /M-vaiheen (p = 0,0406). Vuonna RT112 soluissa lyhytaikainen amygdalin aiheuttama altistuminen G2 /M-vaiheen vähennys (p = 0,0039) ja S-vaiheen lisäys (p = 0,0040). Kaksi viikkoa amygdalin altistus alensi G2 /M-vaiheen (p

UMUC-3 = 0,0036, p

TCCSUP = 0,0080; p

RT112 = 0,0015) ja lisäsi G0 /G1-vaiheen kaikissa kasvainsolun linjat (p

UMUC-3 = 0,0019, p

TCCSUP = 0,0143, p

RT112 = 0,0018). Määrä S-vaiheessa olevien solujen oli myös merkitsevästi vähentynyt kahden viikon kuluttua hoidon UMUC-3 (p = 0,0093) ja RT112 solut (p = 0,0032) verrattuna kontrolleihin.

solupopulaatio ilmaistaan ​​prosentteina koko soluja analysoitiin. Yksi edustava koe kolmesta esitetään.

Cell cycle säätelemiseksi proteiinin ilmentymisen

Koska amygdalin vaikuttavat solujen kasvuun ja solusyklin etenemisen, muutoksia solun syklin ohjaamiseksi proteiinien voitaisiin odottaa. Ilmentyminen cdk1 ja cdk2 (kaikki solulinjat) ja cdk4 (TCCSUP, RT112) väheni 24 h kuluttua amygdalin sovellus (kuva 5). P-arvot olivat seuraavat varten cdk1 (p

UMUC-3 = 0,0029, p

TCCSUP = 0,0052, p

RT112 = 0,0007), CDK2 (p

UMUC-3 = 0,0001, p

TCCSUP = 0,0006, p

RT112 = 0,0001), ja cDK4 (p

TCCSUP = 0,0006, p

RT112 = 0,0001), sykliini A (p

UMUC-3 = 0,0001, p

TCCSUP = 0,0001, p

RT112 = 0,0002), sykliini B (p

TCCSUP = 0,001, p

RT112 = 0,0001) ja sykliini D1 (p

UMUC-3 = 0,0001, p

TCCSUP = 0,0001, p

RT112 = 0,0001). p19 parannettiin UMUC-3 (p = 0,0013) ja RT112 (p = 0,0012), mutta pienennetään TCCSUP (p = 0,0001), kun taas p27 väheni kaikissa solulinjoissa (p

UMUC-3 = 0,0013, p

TCCSUP = 0,0001, p

RT112 = 0,0001). Pakt sekä pRictor (mutta ei pRaptor), mistä mTOR reitin, poistettiin käytöstä kaikissa kolmessa solulinjoissa. P-arvot olivat seuraavat varten Pakt (p

UMUC-3 = 0,0002, p

TCCSUP = 0,0004, p

RT112 = 0,0082) ja pRictor (p

UMUC-3 = 0,0015, p

TCCSUP = 0,0017, p

RT112 = 0,0001). pRaptor väheni vain TCCSUP (p = 0,0024).

Tuumorisolut esikäsiteltiin amygdalin 24 tunnin tai 2 viikon ajan (valvonta jätettiin käsittelemättä). p-aktiini toimi sisäisen valvonnan. Yksi edustaja kolmesta eri kokeesta. Oikeus paneeli kuvio 5 esittää pikselimäärä arvot prosentteina kontrollien ei käsitelty amygdalin. * Tarkoittaa merkitsevää eroa kontrolliryhmään.

vähäisiä eroja oli havaittavissa 2 viikon kuluttua verrattuna 24 tunnin amygdalin altistumista. Cdk1 mutta ei CDK2 säädellä vähentävästi UMUC-3 (p = 0,0001). 24 h pienenee vaikutus amygdalin on p27 ilmentymistä UMUC-3 ja TCCSUP solujen katosi sen jälkeen, kun 2 viikkoa, ja pRaptor lisääntynyt sen jälkeen, kun 2 viikkoa in TCCSUP solujen (p = 0,0019), toisin kuin 24 h pienenee vaikutusta (kuva 5 ).

cdk2 /sykliini A: knockdown

Koska amygdalin voimakkaasti muutettu cdk2 ja sykliini A kaikissa kasvainsolulinjoissa ja nämä proteiinit säätelevät tuloa mitoosi syklin näiden proteiinien osuutta tuumorikasvun arvioitiin siRNA knock-down. Inkubointi UMUC-3, RT112 ja TCCSUP solujen siRNA vastaan ​​cdk2 tai sykliini Selvästi vähentynyt valkuaispitoisuus (kuva 6, alhaalla oikealla) ja siihen liittyi merkittävää kasvua saarrosta kaikissa kolmessa solulinjoissa (kuva 6).

UMUC-3, TCCSUP ja RT112 solut transfektoitiin cdk2 tai sykliini A: siRNA ja kaataa kontrolloitiin western blot (alhaalla oikealla). Yksi edustaja 6 kokeesta. * Tarkoittaa merkittävää eroa (p = 0,0022).

Keskustelu

Todisteet esitetään tässä osoittaa, että amygdalin tukahduttaa kasvun ja lisääntymisen kolmella virtsarakon syövän solulinjoissa. Lukumäärä kasvainsolujen läpi aikaisen apoptoosin hieman kasvanut pitkäaikaisen amygdalin altistuksen kanssa, mutta ei sen jälkeen lyhytaikainen altistuminen ja tämä estyminen proliferatiivista aktiivisuutta ei aiheuttanut myrkkyvaikutus amygdalin. Muut tutkijat ovat myös osoittaneet merkkejä apoptotosis aiheuttamien amygdalin. Rapid kaspaasi-3 yhdessä alas-säätely Bcl-2 ja säätely ylöspäin Bax läsnäollessa 0,1 mg /ml amygdalin on osoitettu DU145 ja LNCaP eturauhassyövän solut [9]. Apoptoottisen solukuoleman on myös herättämän amygdalin kohdunkaulan syövän solulinja HeLa [10] ja ihmisen promyelosyyttinen leukemia (HL-60) soluista [11]. Kaikkiaan nämä raportit osoittavat, että amygdalin voi selittää apoptoottisia tapahtumia erilaisissa syöpäsoluissa, mukaan lukien virtsarakon, ja auttaa vähentämään kasvaimen kasvua.

Amygdalin voimakkaasti muuttunut solusyklin etenemisen kaikissa kolmessa virtsarakon syövän solulinjoissa. Aikana lyhytaikaiseen hoitoon, UMUC-3 ja TCCSUP kertynyt G0 /G1, kun taas RT112 pidätettiin S-vaiheessa. Mitosis vuoksi vaikuttaa eri tavalla eri solulinjoissa amygdalin. Toinen ero oli, että p19 kasvanut RT112 mutta laski TCCSUP. Rictor oli deaktivoitu ja CDK4 tukahdutettiin vuonna RT112 muttei UMUC-3. CDK4 inhibition ja p19 kasvu on hiljattain osoitettu ajaa kasvainsoluja S-vaiheessa [12]. Koska sekä Cdk4 esto ja p19 yhdistelmänä, vain tapahtui RT112 soluissa, tämä voi selittää, miksi RT112 kertynyt S-vaiheessa, ennemmin kuin G0 /G1 vaiheeseen. Todellakin, cdk4 ei vähennetty 2 viikon kuluttua amygdalin sovellus, ja RT112 solut pidätettiin G0 /G1. Kuitenkin S-vaihe merkintä ei pelkästään ohjaa cdk4 ja P19. Pikemminkin kohortin solusyklin proteiineja on mukana ajo solunjakautumisen eteenpäin. Amygdalin näyttää tämän vuoksi puuttua solulinja riippuvaisella tavalla useiden tarkastuspiste molekyylien häiriten hiottiin mitoottisiin koneita. Kasvu saarto on lopputulos.

merkityksellisyyttä p19 ja p27 virtsarakon syövän etenemisessä ei ole täysin selvitetty. Molemmat proteiinit voimakkaasti muutettu jälkeen amygdalin soveltaminen tässä tutkimuksessa, p27 ollessa alassäädetty kaikissa solulinjoissa, p19 ollessa säädellään ylöspäin UMUC-3 ja RT112 mutta väheni TCCSUP. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR sarjan 32 virtsarakkosyöpänäytteiden pariksi viereisen normaaleissa kudoksissa ei ole ilmennyt mitään merkittäviä eroja p19 ja p27 ilmaisun [13]. Toisaalta, mahdollinen arviointi korkealaatuisesta virtsarakon syöpä potilailla, joita hoidettiin radikaali cystectomy osoittivat enemmän p27 positiivisia kuin negatiivisia kasvaimia potilailla, joilla tauti uusiutuu [14]. Mikrosiruanalyysi on osoittanut positiivinen korrelaatio P27 ilmaisun ja kehittynyt virtsarakon syöpä [15]. Sen sijaan toisessa tutkimuksessa on raportoitu epäsuotuisa vaikutus p27 aiheuttamaa virtsarakon syöpä [16]. In vitro kokeet ovat viitanneet määrittelemättömän rooli p27 niin paljon kuin tukahduttaminen tämän proteiinin kohonnut kasvua, mutta samalla pienentää hyökkäys [17] – [19]. Tämän perusteella ei ole mahdollista lopulta sen arvioimiseen, onko p27 vähentämisen jälkeen amygdalin hakemus liittyy proliferaatiota, ja invaasio tai molemmille. Perehtyä hyökkäystä prosessi, uusi tutkimus on aloitettu keskittyi toiminnan amygdalin on syöpäsolun leviämistä.

Amygdalin vähensi fosforylaatioon Akt ja mTOR alayksikön, rictor. Akt-mTOR signalointi on merkittävä rooli virtsarakon syövän synnyn, jossa Akt aktivointi tapahtuvat koko kirjon virtsarakon urothelial karsinoomien [20]. Cancer Genome Atlas hanke on tunnistanut AKT /mTOR-reitin kriittiseksi terapeuttisena kohteena virtsarakon syöpä [21]. Erityinen toiminta amygdalin on mTOR monimutkainen rictor on kiinnostava, koska hyväksytyn mTOR-inhibiittorit everolimuusi ja temsirolimuusi, kohdistaa mTOR monimutkainen raptor, kun taas rictor katsotaan herkkä molemmat lääkkeet [22]. Rictor on osoitettu olevan tärkeä tekijä virtsarakon syövän muuttoliike ja invaasiota [23]. Siten amygdalin ehkä ole vain innovatiivinen väline neutraloimaan metastaattisen levittäminen vaan myös täydentää mTOR-estäjä perustuva hoito.

CDK yhdessä sykliinejä, ovat keskeisiä molekyylejä vastuussa solusyklin etenemisen ja solunjakautumisen, jolloin erityisesti CDK sidoksissa erityisen sykliinien. Näin ollen poikkeava syöpäsolukasvua syyksi on modulaatiolle cdk–sykliini ekspressiotason. Vahvin proteiini Muutokset 24 tunnin jälkeen amygdalin inkubaation havaittiin cdk2 ja sykliini A, ja voi edustaa keskeiset tavoitteet amygdalin. Vaikka ei tutkijat ovat tähän mennessä edennyt Tämän hypoteesin amygdalin on osoitettu muuttavan osallistuvien geenien solusyklin säätelyyn ihmisen paksusuolen syövän soluja [24]. CDK2-sykliini A-akseli edistää G1 /S faasimuutos, joka saattaa selittää cdk2 /sykliini A: down-modulaatiota amygdalin liitteenä oli G0 /G1 vaiheessa pidätyksen UMUC-3 ja TCCSUP soluja. In vitro tutkimus pehmytkudossarkooman soluja on osoittanut, että cdk2 lasku yhdistettynä p27 menetys vaikuttaa solujen hyökkäys ohjelmaa [25]. Koska cdk2 vähennys rinnastettiin jonka p27 lasku virtsarakon syövän malli, näyttää todennäköiseltä, että amygdalin toimii paitsi kasvaimen kasvuun, mutta voi vaikuttaa myös metastaaseja.

Itse vaikka cdk2-sykliini A muuttunut monissa kiinteitä kasvaimia, tietoa cdk2-sykliini A virtsarakon syöpä on niukkaa. Proteiini ja mRNA analyysit rakkosyöpä- kudoksia ovat esittäneet, että cdk2 läheisesti liittyy virtsarakon kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen [26]. Cdk2: n sitova kumppani, sykliini, on korreloinut kasvaimen ja huono tautikohtaista selviytymistä, osoituksena immunohistokemiallisesti ja cDNA microarray [27]. Nykyisessä kokeissa kaatamalla cdk2 tai sykliini A: johtanut melkoiseen vähentää kasvaimen solujen määrä, joka osoittaa kliinistä merkitystä molemmat proteiinit virtsarakon syövän. Koska CDK ja sykliinejä tehostuu, kun lääkeresistenssi kehittyy [28], [29], torjua tämä prosessi voi olla tehokas strategia estää tai voittaa vastustus [29]. Viime vuosina useita uusia terapeuttisia strategioita on suunniteltu kohde CDK. Tällä hetkellä ne ovat eri vaiheissa kliinistä kehitystä, koska sekä yksittäisinä aineina ja yhdistelmässä [30]. Amygdalin voisi olla ”luonnollinen” vaihtoehto, jolloin vakavia sivuvaikutuksia liittyy perinteisiin cdk–estäjät [31] voidaan välttää.

pieniä eroja lyhyen aikavälin ja pitkän aikavälin amygdalin sovellus havaittiin erityisesti UMUC-3 solulinja. Cdk2 ei enää väheni sen jälkeen, kun 2 viikkoa, mutta cdk1 on voimakkaammin väheni yli 24 tunnin jälkeen amygdalin sovellus. Syy tähän kytkimen yli pitkäaikaisen sovellus ei ole selvä. Cdk2 kertyy G1 /S-vaiheeseen rajan, kun taas cdk1 asemat solujen mitoosiin [32]. Monipuolinen mekanismit cdk1 ja cdk2 ovat heijastuu solusyklin määrityksessä osoitetaan ylimääräistä pidätys UMUC-3 G2 /M 2 viikon amygdalin altistumista. Koska UMUC-3 kasvun ja lisääntymisen oli niinikään muuttunut 24 h ja 2 viikkoa amygdalin sovellus, cdk2 voinut tulla tunteeton amygdalin tukahduttaminen, mutta tämä oli kompensoi tukahduttaminen cdk1. Itse asiassa, cdk1 on raportoitu kompensoimiseksi cdk2 suuntaamalla cdk1 osaksi sykliini Polku, joka on yleensä rajoitettu cdk2 [33].

Tämä on ensimmäinen tutkimus, josta saa tietoa amygdalin vaikutus virtsarakon syöpäsolujen linjat in vitro. Tällaiset in vitro -tutkimuksissa voi tehdä muuta kuin esittää ennusteen amygdalin tehon potilailla. Kliinisiin tutkimuksiin amygdalin ei ole hyvin dokumentoitu ja satunnaistettuja kontrolloituja tutkimuksia ei ole koskaan tehty. Retrospektiivinen analyysi 67 kasvain potilailla, jotka olivat ottaneet amygdalin raportoitu kaksi täydellistä ja 4 osittaista vastetta [34]. Vaiheen II tutkimus tehtiin vuonna 1982, jolloin potilaat saivat myös vitamiineja ja haiman entsyymejä. Hoito lopetettiin, kun veren syanidin nousivat ja todettiin, että Laetrile ollut tehokas syövän hoitoon [35]. Muut raportit viittaavat amygdalin olevan selvää hyötyä syöpäpotilailla [8]. Kuitenkin termi ”etu” ei ollut selkeästi määritelty. Ambivalence on näkynyt myös siinä tapauksessa, mikäli sellaisia ​​amygdalin oli tehoton viidessä ja tehokkaasti neljässä tapauksessa [8].

On vielä epäselvää, onko amygdalin voi toimia normaali, fysiologisesti ehjät epiteelisolujen. Koska ensisijainen kuin kuolemattomaksi epiteelisolujen eivät näytä mitoosi toimintaa tai menettää nopeasti mitoosi toimintaa in vitro, nämä solut eivät voi joutua MTT kasvun määrityksessä. Kuitenkin amygdalin on hiljattain osoitettu estää endoteelisolujen kasvun [36]. Olipa tämä ilmiö voidaan siirtää muihin soluihin jää auki. Kuitenkin tukkeutuminen endoteelisolujen kasvua amygdalin osoittaa, että amygdalin voi tukahduttaa kasvaimen aiheuttamaa angiogeneesiä.

muodostumisen riski syanidimyrkytykseen ei myöskään ole ratkaistu. Tässä suhteessa antoreitistä (suun kautta tai laskimoon), määrä ja laatu varmasti vaikuttaa riski-hyöty-suhde. Koska kliiniset raportit amygdalin hoito ovat yli 30 vuotta vanhoja [8], ja tänä aikana ymmärrystä molekyyli syövän mekanismeja on suuresti edistytty, kannattaisi testata in vitro olettamuksia esitetään tässä käytettäessä vivo -mallissa. Hyvin suunnitellut, kontrolloiduissa kliinisissä tutkimuksissa kriittisesti testi amygdalin olisi sitten tarkasteltava.

Kaiken amygdalin on osoitettu estää kasvun virtsarakon syövän solujen in vitro. Tukahduttaminen cdk2 ja sykliini A: voisi olla yksi varteenotettava mekanismi määrittelemällä amygdalin voi pidättää tai vähentää kasvainten lisääntymistä.

Kiitokset

Haluamme kiittää Karen Nelson Kriittisesti käsikirjoitusta lukiessaan. Tätä työtä tukivat ”Brigitta und Norbert Muth Stiftung” ja ”Freunde und Förderer der Goethe-Universität Frankfurt”.