Krooninen sairaus

tiivistelmä

Verihiutaleiden aktivoiva tekijä (PAF) on pitkään liittynyt akuuttia turvotusta ja tulehdusreaktioita. PAF vaikuttaa sitoutumalla spesifiseen G-proteiiniin kytketty reseptori (PAF-R,

Ptafr

). Kuitenkin rooli kroonisen PAF-R-aktivaation on jatkuva tulehdusreaktioita on suurelta osin huomiotta. Olemme viime aikoina osoittaneet, että hiirillä, joilta puuttuu PAF-R (

Ptafr

– /- hiiret) näytteille lisääntynyt ihon kasvainten synnyssä vastauksena kaksivaiheisessa kemiallinen syövän synnyn protokollaa.

Ptafr

– /- hiirissä ilmeni kohonneita krooninen tulehdus vastauksena forboliesteri sovellus. Tässä esillä olevassa tutkimuksessa, osoitamme, että yhdisteen ei-hydrolysoituvan PAF jäljittelevää (karbamoyyli-PAF (CPAF)), kohdistaa voimakas, annoksesta riippuvaa, ja lyhytaikainen turvotusta vasteen WT hiirillä, mutta ei

Ptafr

– /- hiirissä tai hiirissä, joilta puuttuu C-

Kit

(c-

Kit

W-sh /W-sh hiiret). Käyttämällä korva tulehdus malli, samanaikainen ajankohtaisista CPAF hoito johti paradoksaalinen pieneneminen sekä akuuteissa korvan paksuuden muutoksia, jotka liittyvät yhteen PMA sovellus, sekä jatkuva tulehdus liittyy krooninen toistuvia PMA sovelluksia. Lisäksi hiiret, joita käsiteltiin paikallisesti kanssa CPAF oli myös merkittävä väheneminen kemiallisen karsinogeneesissä. Kyky CPAF tukahduttaa akuutti ja krooninen tulehduksellinen muutokset vasteena PMA sovelluksen (t) oli PAF-R riippuvainen, koska CPAF ei ollut vaikutusta perustason tai PMA-indusoidun tulehduksen

Ptafr

– /- hiirissä. Lisäksi c-

Kit

näyttää olevan tarpeen tulehdusta vaikutuksia CPAF, koska CPAF ei ollut näkyvää vaikutusta C-

Kit

W-sh /W-sh hiirillä. Nämä tiedot tuovat lisänäyttöä, että PAF-R-aktivaation saa aikaan monimutkaisia ​​immunomodulaarisia vaikutuksia mallissa kroonisen tulehduksen, joka on merkittäviä neoplastisten kehittämiseen.

Citation: Sahu RP, Rezania S, Ocana JA, DaSilva-Arnold SC, Bradish JR, Richey JD, et ai. (2014) ajankohtaisista Soveltaminen Verihiutaleiden aktivoiva tekijä reseptoriagonisti vaimentaa forboliesterillä aiheuttama akuutti ja krooninen tulehdus ja on syöpä kemiallinen estoaktiivisuus in Mouse Skin. PLoS ONE 9 (11): e111608. doi: 10,1371 /journal.pone.0111608

Editor: Paul Proost, Leuvenin yliopisto, Rega instituutti, Belgia

vastaanotettu: 11 helmikuu 2014; Hyväksytty: 02 lokakuu 2014; Julkaistu: 06 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Sahu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health (www.nih.gov) (R01 HL062996, R21 ES017497, ja R21 ES020965), Veterans Administration (www.research.va.gov/funding)(VA Merit 510BX000853), ja estää Cancer Foundation (www.preventcancer.org). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Verihiutaleiden aktivoiva tekijä (1-alkyyli-2-asetyyli glycerophosphocholine, PAF) on bioaktiivinen lipidimolekyyli tuotetaan sekä entsymaattisten ja ei-entsymaattisten mekanismien [1]. Ei-entsymaattinen tuottaminen PAF on riippuvainen vapaiden radikaalien välittämän muuttaminen sn-2 monityydyttymätön rasvahappo on glycerophosphocholines muodostamiseksi PAF itsensä ja muiden hapetetaan glycerophosphocholines (ox-GPCs), joilla on kyky aktivoida PAF-reseptori [1] – [5]. Biologista aktiivisuutta PAF on välittää sitoutuminen yhden G-proteiiniin kytketty reseptori (PAF-R), joka ilmentyy erilaisia ​​soluja, mukaan lukien keratinosyytit [1], [6], [7]. Kun tuotetaan, PAF saa aikaan erilaisia ​​fysiologisia ja patologisia vaikutuksia, jotka on rooli akuutti tulehdus, haavan paranemista, ja angiogeneesi. Kuitenkin PAF on ehkä parhaiten tunnettu sen pro-inflammatorisia vaikutuksia, jotka välittävät systeeminen reaktio sokki, allergisia reaktioita, ja anafylaksia [1]. Tässä roolissa PAF toimet arvellaan välittyvän sen kyky stimuloida verisuonten laajenemista ja verisuonten läpäisevyyttä, verihiutaleiden aggregaatiota, bronkokonstriktio, ja muutokset leukosyyttien toiminto [1]. Nämä vaikutukset valkosoluissa kuuluu kyky PAF stimuloida syöttösolujen aktivaation ja muuttoliike [8] – [10], mononukleaariset ja neutrofiiliseen fagosytoosin [11] – [13], ja M2 polarisaatio makrofagien [14].

Vaikka on selvää, että PAF vaikuttaa edistää akuutteja inflammatorisia vaikutuksia, erityisesti niitä, jotka liittyvät anafylaksian ja sokki, uudempi osoittavat, että PAF voi olla monimutkaisempi rooli immuunijärjestelmän toimintaa. PAF tuotantoa entsymaattista ja hapettumalla näyttää osansa keratinosyyttien vastauksissa genotoksisia aineita, kuten ultravioletti B, tupakansavu tai kemoterapia-aineiden [3], [15] – [18]. Tutkimukset mekanismien ultravioletti B (UVB) aiheuttaman systeemisen immunosuppression ovat osoittaneet vaatimus PAF-R-aktivaation [3], [10], [19], [20]. Tämä UVB-indusoidun systeemistä immunosuppressiota on tunnusomaista antigeenispesifisen tukahduttaminen adaptiivisen T-soluvälitteinen immuunivaste [21], [22]. Lisäksi olemme hiljattain osoittaneet, että

Ptafr

– /- hiirillä lisääntyminen ihon kemiallinen karsinogeneesissä, joka liittyy vastaava lisäys forboliesterillä (PMA) aiheuttama ihon tulehdus [7]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että PAF-R aktivaatio voi olla myös olla tärkeä säätelyssä luonnollinen immuniteetti. Kuitenkin alavirran solu välittäjiä tämän immuunivastetta säätelevä vaikutus ei tunneta.

C-

Kit

geeni koodaa reseptorin tyrosiinikinaasin, joka sitoo ligandin, kantasolu- tekijä (SCF), ja on tärkeää [23]. C-

Kit

W-sh

(puitteen) mutaatio on käänteinen 3,1 Mbp segmentin, joka häiritsee promoottorialueen c-

Kit

geeni [23]. Hiiret homotsygoottisia C-

Kit

W-sh

mutaation omaavat perusteellinen katoaminen syöttösolujen, mutta puuttuu myös melanosyyttejä ja interstitiaalinen solujen Cajal [23], [24]. Siten, c-Kit

W-sh /W-sh hiiret edustavat yhteistä keino arvioida mastsolun toiminto. Mast-solut ovat kudoksessa asuvat luuytimestä peräisin olevia soluja, jotka, kuten PAF, ovat hyvin tunnettuja välittäjiä allergiset ja anafylaktiset reaktiot [25]. Syöttösolut strategisesti lokalisoitu epiteelinalaisella ja limakalvon alaista tilat altis ympäristön ja tarttuvan solvausten [25]. Lisäksi se, että PAF edistää anafylaktinen vastauksia on riippuvainen syöttösolujen aktivaation [8]. PAF on myös tunnettu aktivaattori ja kemotaktinen aine syöttösoluista [9]. Lisäksi niiden rooli pyörän ja leimahtaa reaktio, johon liittyy tyypin I yliherkkyysreaktioita, syöttösolut on myös osoitettu tukahduttaa kroonisen tulehduksen sekä adaptiivista immuunivastetta [26] – [31]. Erityisen merkityksellisiä, syöttösolut toimivat rajoittaa hiiren malleja ketusyliherkkyyteen ja kroonisten UVB aiheuttama tulehdus [32]. Lisäksi, rooli PAF-R UVB-indusoidun immunosuppression on osoitettu johtuvan PAF-R-riippuvaisen kulkeutumista maston solujen imusolmuke, jossa ne kohdistavat interleukiini (IL) -10-riippuvainen immunosuppressiivinen vaikutus [ ,,,0],10].

Vaikka äskettäin esittänyt todisteita siitä, että PAF on anti-inflammatorisia vaikutuksia kroonisen PMA-indusoidun kasvaimen edistämiseksi [7], on mahdollista, että vaikutukset sukusolujen menetys PAF-R voisi olla johtuvat korvaavat alkion tai synnytyksen jälkeiseen muutoksia ihon kehitykseen [7]. Siten osoitus siitä, että PAF-R agonistihoidon johtaa tukahduttamiseen DMBA /PMA aiheuttama syövän synnyn ja tulehduksen antaisi lisätukea ajatukseen, että PAF-R: llä on tärkeä antineoplastisia ja immunomodulaarisia vaikutuksia. Nykyinen tutkimukset, joissa tutkitaan roolia PAF-R PMA aiheuttama tulehdus lisää edellisessä raportissa ja paljastaa monimutkainen immunomodulatorinen roolia PAF-R-signalointia. Lisäksi meidän havainnot käyttäen C-

Kit

W-sh /W-sh

hiiret osoittavat rooli

c-Kit

ja mahdollisesti maston solujen immunomodulaarisia vaikutukset PAF.

Methods

Ethics selvitys

protokollat ​​hyväksyttiin valiokunnan Ethics eläinkokeiden Indiana University School of Medicine (Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) (Protocol numero: 3841 ja 10639). Jokainen yritettiin minimoida eläinten kärsimyksiä.

reagenssit ja kemikaalit

forboli 12-myristaatti 13-asetaattia (PMA) hankittiin Promega, Madison, WI. 7,12-dimetyylibents (a) antraseenia (DMBA) saatiin Acros Organics, Fair Lawn, NJ. Carbamyl-PAF saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Eläimet

Ptafr

knockout (

Ptafr

– /-), että C57BL /6 taustalla alun perin saatu tri Satoshi Ishii (Biokemian ja molekyylibiologian, Lääketieteellinen tiedekunta The University of Tokyo), johdettu aikaisemmin kuvatulla [33]. Ikä (8-12 viikkoa) -matched

Ptafr

+ /+ C57BL /6 (WT) käytettiin kontrolleina (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). SKH-1 karvaton, albinohiirten saatiin Charles Rivers (Wilmington, MA). Hiiret, jotka sisältävät W-puitteen (W-sh) inversio mutaatio promoottorialueen

c-kit

geenin (

Kit

W-sh

) saatiin Jackson Laboratories C57BL /6 taustalla (B6.Cg-

Kit

W-sh Twitter /HNihrJaeBsmGlliJ). Hiiriä pidettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa on Indiana University School of Medicine.

Ear paksuusmittausten

vasempaan korvaan kunkin hiiren käsiteltiin 20 ui cPAF (0,1, 0,3, tai 1 mM asetonissa). Oikea korva käsiteltiin 20 pl vehikkeliä (asetoni) yksin. PMA hoitoja, vasemman korvan käsiteltiin 10 ug PMA 20 ul: ssa asetonia, ja oikea korva käsiteltiin vehikkelillä (VEH) yksinään 3 kertaa viikossa (nuolet) ja 16 päivää. PMA ja CPAF hoitoja, hiiret käsiteltiin PMA ensin, sitten 20 ui 0,3 mM CPAF (asetonissa) lisättiin heti PMA hoidon. Korvan paksuus mitattiin ilmoitettuina ajankohtina hoidon jälkeen käyttäen jatkuva paine analoginen paksuustulkilla (Peacock Model G, 0,4 N).

epidermaalinen paksuusmittausten

Hiiren korvat hoidettiin 18 päivän ajan kolmesti viikoittain ajoneuvon CPAF (6 nmol), PMA, tai PMA: lla ja CPAF oli formaliiniin ja parafiiniin (FFPE), ja värjättiin hematoksyliinillä eosiini (H 1 mm halkaisijaltaan suurin laskettiin. Jälkeen 25 viikkoa PMA hoidon jälkeen hiiret tapettiin ja kasvaimen kokoa (koko on suurin mitta) mitattiin kunkin tuumorin. FFPE tuumorisektioiden WT ja

Ptafr

– /- hiiret värjättiin H 0,05.

tulokset

CPAF on paikallisesti aktiivinen ja aiheuttaa annoksesta riippuvainen ohimenevä lisääntyminen korvan paksuuden, joka on riippuvainen syöttösoluista

aikaisemmassa tutkimuksessa [7] ja kuvassa 1A, osoitamme, että yksi ainoa paikallisesti kasvavien annosten ei-hydrolysoituvaa PAF-R-agonistia, CPAF, aiheuttaa annoksesta riippuvalla lisäys korvan paksuuden kahden tunnin jälkeen. Kuviossa 1B, aika kurssi tutkimus osoittaa, että CPAF aiheuttama korvan paksuuden muutoksia tapahtuu nopeasti, jossa merkitsevää korvan paksuuden todennut 1 tunti levittämisen jälkeen ja huippu korvan paksuuden todettiin 2 tuntia. Tärkeää on, seuraava yhden hakemuksen CPAF muutokset korvan paksuuden olivat ohimeneviä ja laski lähelle lähtötasosta 8 tunnin kuluttua. Nopea ja tilapäinen luonne vaste viittaa vahvasti siihen, että muutokset verisuonten läpäisevyyden johtaa turvotuksen muodostumista ovat suurelta osin vastuussa muutoksista korvan paksuuden. Tämä on sopusoinnussa tunnettu kyky PAF aiheuttaa vasodilataatiota ja verisuonten läpäisevyyden [37]. Poissulkemiseksi PAF-R riippumattomia vaikutuksia [38], hiiriä ituradan menetys

Ptafr

geeni (

Ptafr

– /- hiiret) käsiteltiin myös CPAF. Kaikilla tutkituilla annoksilla, paikallisesti CPAF hakemus ei saada tulehdusreaktion in

Ptafr

– /- hiirissä (kuviot 1A B), tarkistaa spesifisyys farmakologinen vaikutus.

1A

.

Paikallisesti CPAF annosriippuvaisesti indusoi nopean tulehdusreaktioita mitattuna korvan paksuuden mittausta.

Yksi korva WT ja

Ptafr

(- /-), käsiteltiin yhdellä kolmesta annosta CPAF (20 ui 0,1, 0,3, ja 1,0 mM liuosta yhteensä annos on 2, 6 tai 20 nmol CPAF korvaa kohti). Contralateral korva käsiteltiin pelkällä asetonilla (VEH). Korvan paksuus mitattiin ennen hoitoa ja 2 tuntia hoidon jälkeen. Esikäsittelyn jälkeen korvan paksuuden arvot vähennettiin, keskiarvo ja SEM piirrettiin (n = 4 20 nmol ja n = 8 2 6 nmol CPAF VEH käsiteltiin hiiren korvat).

1B

.

Ajankohtainen CPAF hoito sai aikaan nopean, mutta ohimenevä nousu tulehdusta mitattuna korvan paksuuden muutoksia.

Yksi korva villityypin (WT) ja

Ptafr

(- /-) hiirillä käsiteltiin 20 ui CPAF (20 nmol 0,1 mM liuos asetonissa) ja 20 ui asetonia (VEH) levitettiin contralateral korvaan. Korvan paksuus mitattiin juuri ennen reagenssiin soveltamista ja 1, 2, 4 ja 8 tunnin kuluttua. Tulokset edustavat keskiarvoa ja SEM (n = 4 hiirtä) vähentämisen jälkeen esikäsittelyn korvan paksuuden. CPAF indusoi merkittävää kasvua korvan paksuuden WT-hiirissä suhteessa WT + VEH käsiteltiin korvat. *,

p

0,05; **,

p

0,01; ***;

p

0,001; 2-tailed

t

-testissä.

Lisäksi kyky CPAF aiheuttavan nopean turvotusta reaktioita on yhdistetty masto soluaktivaation [8], [9]. Siksi määrittää, onko kyky CPAF aikaansaamiseksi varhaisessa turvotus reaktio 2 tunnin voitaisiin estää hiirillä puuttuu syöttösolujen (c-Kit

W-sh /W-sh hiiret). Kuviossa 2 olemme vahvistaneet, että syöttösolut ovat todellakin tarvitaan alussa lisäys korvan paksuuden välittämä CPAF sovellus.

WT ja c-Kit:

W-sh /W-sh hiiriä käsiteltiin vehikkelillä ( VEH) yksin toisen korvan, ja 20 ml 0,3 mM CPAF (6 nmol) kontralateraaliselle korvaan. Korvan paksuus mitattiin sekä ennen 2 tunnin kuluttua reagenssin sovellus. Vähentämisen jälkeen korvan paksuuden hetkellä 0, keskiarvo ja SEM piirrettiin (n = 5 WT-hiirissä, n = 4 Kit

W-sh /W-sh hiiret). *,

p

0,05; 2-tailed

t

-testissä.

Ajankohtainen CPAF suojaa ihon kemiallinen syövän synnyn

Tutkimukset Kuviossa 1 osoittavat, että CPAF esiintyy erityisiä annoksesta riippuvaa farmakologista aktiivisuutta paikallisen levityksen jälkeen. Käyttää ajankohtainen toimitus lähestymistapa myös vältetään mahdollisia toksisuuksia liittyy systeemisiä PAF-R agonistihoidon [37]. Lisäksi PAF-R on altis ilmiö ligandin indusoiman alassäätöä ja siedätyshoito [1], [39]; Tämä sääntely ominaisuus on ominaista G-proteiiniin kytkeytyvien reseptorien ja voi johtaa paradoksaalinen menetyksen reseptorin aktivoitumisen myöhemmissä ligandia sitova [1], [40]. Siten sillä karsinogeenisuustutkimuksia vaatisi pitkäaikaista toistuva soveltaminen CPAF, käytimme 0,3 mM pitoisuuden CPAF joka indusoi välissä, mutta merkittävää kasvua korvan paksuuden mittauksia (Kuva 1A). Näitä tutkimuksia varten CPAF levitettiin heti DMBA tai PMA hakemuksen koko tutkimuksen ajan.

Yhdenmukainen aiempien tutkimus, joka osoitti, että

Ptafr

– /- hiirillä kasvoi DMBA /PMA indusoimaan kasvaimen muodostumisen, kuviossa 3A osoitetaan, että paikalliseen hoitoon CPAF johti merkittävään vähenemiseen DMBA /PMA-indusoidun kasvaintaakkaa. CPAF hoito osoitti myös vaatimaton, mutta merkittävä suojaava vaikutus kasvaimen esiintymistiheys (kuvio 3B). Lisäksi, kun taas

Ptafr

– /- hiiret osoittivat merkittävää kasvua taajuus suurempi kasvaimia [7], hiiret, joita käsiteltiin paikallisesti CPAF osoitti merkittävää kasvua pienempi kasvaimen kokoa (kuvio 3C). Lisäksi olemme aiemmin osoittaneet, että

Ptafr

– /- hiirillä lisääntyminen SCC muodostumista suhteessa WT-hiirissä [7]. Kuitenkin tässä nykyisessä tutkimuksessa ei Frank SCC havaittu ja hiirillä käsitelty paikallisesti epäonnistui näytteille merkittävän muutoksen osuus luokan 1-3 syyliä tai microinvasive SCC (Kuva S1 File S1). Lopuksi kasvaimettomina ihoalueille käsitelty CPAF näytteillä selvä vähentäminen DMBA /PMA aiheuttama tulehdus, kuten arvioitiin käyttäen myeloperoksidaasi (MPO aktiivisuus), merkkiaine granulosyyttistä soluinfiltraat- (kuvio 3D) [41]. Tämä on yhdenmukaista aiempien tulosten

– /-

hiiriä, jotka osoittivat lisäämisen MPO aktiivisuudesta krooninen, toistuva PMA hoidot [7].

3A. Hoidettu paikallisesti CPAF tukahduttaa DMBA /PMA aiheuttama kasvainten lukumäärää.

SKH-1 hiiriä hoidettiin kerran DMBA +/- CPAF, sitten PMA tai PMA + CPAF 25 viikon ajan. Kestävä kasvaimet laskettiin viikoittain. Kasvainten lukumäärää (Avg kasvain lukumäärä per hiiri piirrettiin kunkin viikon. Tulokset edustavat keskiarvoa ja SEM n = 19-20 hiirtä /ryhmä.

p

0,05 viikkoja 9-12,14-25;

p

0,01 viikolla 13, U-testi.

3B. Ajankohtainen CPAF viivästynyt kasvaimen esiintymistiheys hiirillä, joille DMBA /PMA.

prosenttia hiiristä jäljellä kasvaimen ilmaiseksi yli 25 viikkoa kemiallinen tumorigeneesin tutkimuksessa piirrettiin käyttäen selviytymisen käyrä. käsittely CPAF johti merkittävään muutokseen kasvaimen esiintymistiheys, ajan mediaani kunnes ensimmäinen kasvain esiintyminen 8 viikkoa DMBA /PMA käsitelty ja 9 viikkoa DMBA /PMA + CPAF käsitellyillä hiirillä. *,

p

0,05, log-rank (Mantel-Cox) Test.

3C

.

Ajankohtainen CPAF hoitotuloksia harvempiin suuria kasvaimia ( ≥3 mm halkaisijaltaan suurin) sen jälkeen kun 25 viikon hoidon.

Kasvaimen kokojakauma piirrettiin kasvainten määrä kussakin kokojakauma kussakin testiryhmässä. histopatologinen tentti osoittanut mitään merkittävää eroa määrien papilloomavirus ja SCC muodostumisen välillä hoitoryhmissä (ei esitetty). ***,

p

= 0,0001 Fisherin testiä.

3D

.

DMBA /PMA-indusoidun MPO-aktiivisuus suppressoida CPAF.

Jälkeen hiiret lopetettiin seuraavat 25 viikkoa DMBA: n /PMA +/- CPAF hoidon kasvainta ihoalueille leikattiin irti ja MPO-aktiivisuus arvioitiin kudoksesta lysaatit. Sen jälkeen normalisoinnin kokonaisproteiinin, MPO aktiivisuus piirrettiin keskiarvona ja SEM (n = 5-9 hiirtä ryhmää kohti). **,

p

0,05; ***,

p

0,001; 2-tailed

t

-testissä.

Ajankohtainen CPAF hoito estää tulehduksen aiheuttama toistuva sovelluksia kasvaimen promoottori PMA

Edellisessä raportissa [7], osoitimme, että ensimmäinen PMA sovellus indusoi merkittävää kasvua korvan paksuuden WT hiirillä 2 päivää sen jälkeen, kun sovellus. Toinen PMA sovellus johti kasvaa edelleen korvan paksuus osittain ratkaistu. Sen jälkeen, myöhemmät PMA sovellukset eivät ole pystyneet osoittamaan lisäkorotukset korvan paksuuden. Sitä vastoin merkittävä ja jatkuva lisääntyminen korvan paksuuden aikana havaittiin 18 päivää PMA hoitoja (jatkuva krooninen tulehduksellinen vaihe). Kuten edellisessä tutkimuksessa, menetys PAF-R johti laimentuminen huippu korvan paksuuden havaittiin jälkeen toisen PMA sovellus, mutta korkeampi jatkuva kroonisen tulehduksen jälkeen jatkettiin kolmesti viikossa PMA sovellukset (Kuva S2 File S1 ja [ ,,,0],7]). Siksi tutkittiin, paikallisesti CPAF hallinto olisi päinvastainen vaikutus ja estää jatkuva krooninen tulehdus aiheuttama PMA hoitoa. Kuviossa 4A osoitetaan, että soveltaminen paikallisesti CPAF heti kunkin sovelluksen PMA johtaa merkittävään vähenemiseen sekä huippu tulehdusvasteen huomattava, päivänä 4, sekä vähentäminen hitaasti tulehdusvasteen, joka todettiin koko ajan PMA sovellus (18 päivää). Mielenkiintoista on, että nämä myöhempinä ajankohtina, CPAF ei ollut vaikutusta korvan paksuuden mittauksiin WT hiirillä ei ole käsitelty PMA: lla, mikä viittaa siihen, että paikallisesti CPAF on tehoton indusoimaan merkittävää jatkuvaa tulehdusvasteen testatulla annoksella (0,3 mM). Lopuksi seuraava osoittaneet, että vaikutus CPAF oli täysin riippuvainen PAF-R, kuten CPAF ja Veh sovelluksia osoittivat lähes identtiset korvan paksuuden mittauksia kaikissa aikapisteissä PMA- sovelluksen

Ptafr – /-

hiirissä ( kuva 4B). Vaikka CPAF merkitsevästi esti PMA-indusoidun korvan paksuus WT hiirillä (kuvio 4A), tämä vaste oli täysin menetetty

Ptafr

– /- hiiret, joita käsiteltiin PMA (kuvio 4B). Lopuksi, kuviossa 4C, osoitamme, että kyky CPAF tukahduttaa PMA aiheuttamaa ihon paksuuden muutoksia ei ollut riippuvainen anatominen päällä. CPAF merkittävästi tukahdutti PMA-indusoimaa kasvua selkä takaisin ihon paksuuden kun 18 päivän kolmesti viikossa hoidon.

4A. Paikallisesti CPAF hoito estää PMA aiheuttamat muutokset korvan paksuus WT-hiirissä.

CPAF (6 nmoolia) yksinään tai PMA +/- CPAF levitettiin WT hiiren korvat kolmesti viikossa 18 päivää. Ihon paksuuden mittaukset tehtiin ajankohtana 0 ja juuri ennen kutakin reagenssia sovelluksen. Vähentämisen jälkeen, kun 0 korvan paksuuden, korvan paksuuden muutoksiin piirrettiin keskiarvona ja SEM (n = 4-5 hiirtä ryhmää kohti). PMA suhteessa PMA + CPAF (

a), PMA + CPAF suhteessa CPAF (

b); *,

p

0,05; **,

p

0,01; ***,

p

0,001; 2-tailed

t

-testi.

4B. Ajankohtainen CPAF hoito on tehoton muuttaa PMA aiheuttama korvan paksuuden muutoksia Ptafr – /- hiirissä. Ptafr

– /- hiiriä käsiteltiin ja arvioitiin kuten 4A yllä. Yksinkertaisuuden vuoksi vertailussa tiedot PMA + CPAF hoidon WT hiirillä on mukana. (Keskiarvo ja SEM, n = 4-5 hiirtä ryhmää kohti). WT hiiret hoidettiin PMA + CPAF näytteille merkittävä lasku korvan paksuuden mittauksiin verrattuna

Ptafr

– /- hiiret, joita käsiteltiin PMA + CPAF (*,

p

0,05; **,

p

0,01; ***,

p

0,001; 2-tailed

t

-testi).

4C. Paikallisesti CPAF hoito estää PMA-indusoidun ihon paksuus kasvaa selän orvaskeden seuraavat 18 päivää hoidon jälkeen.

Selän orvaskeden SKH-1-hiiriä käsiteltiin kolmesti viikossa vehikkelillä, CPAF, PMA, tai PMA + CPAF. Annokset PMA ja CPAF olivat samat kuin se, jota kasvainten synnyssä tutkimusten kuvassa 3. ***,

p

0,05 suhteessa PMA käsitelty iho; 2-tailed

t

-testi (n = 3 per ryhmä).

vieressä määritti histopatologisia muutoksia korvan ihoon, jotka johtuvat useista PMA sovelluksia tai ilman CPAF hoitoja. Useita PMA sovellukset hiiren ihon tiedetään aiheuttavan orvaskeden liikakasvua ja leukosyyttien infiltraatiota [42], [43]. Kuviossa 5A-I, osoitamme, että useita PMA sovelluksia WT hiiren korvat johtaa selvään kasvuun korvan paksuuden mukana ihon laajeneminen, leukosyyttien infiltraatiota ja orvaskeden liikakasvua. Lisäksi co-hoito WT hiirten korvat CPAF johti vähenemiseen PMA aiheuttama leukosyyttien tunkeutuu samalla

Ptafr

– /- hiiret osoittivat selvän kasvun korvan paksuuden, ihon laajennus, tulehdussolujen infiltraatit, ja orvaskeden liikakasvun (kuvio 5A-H). Suhteessa WT hiiret,

Ptafr

– /- hiiret osoittivat selvän kasvun granulosyyttistä infiltraatit kroonisen PMA hoitoja (kuvio 5 ja kuvio S3 File S1). Lisäksi CPAF hoito tukahdutti havaitun PMA aiheuttama tulehduksellisten infiltraatit WT, mutta ei

Ptafr

– /- hiirissä. Tämä data on yhtäpitävä edellisessä tutkimuksessa osoittavat tiedot

Ptafr

– /- hiirillä selvän kasvun MPO aktiivisuuden PMA- hoitoa [7], sekä myös data kuvassa 3D, joka osoittaa, että CPAF hoito vaimentaa MPO aktiivisuus DMBA /PMA-käsitellyistä hiiristä. Koska neutrofiilit esitetään olevan tärkeä rooli hiiren ihon photocarcinogenesis [35], tämä vähennys granulosyyttistä infiltraatit voisi olla tärkeä rooli havaittu antituumorivaikutuksia ajankohtaisista CPAF hoidon kemiallinen karsinogeneesissä (kuvio 3A B). Koska aste krooninen tulehdus liittyy yleisesti epidermaalinen liikakasvu, on jokseenkin yllättävää, että vaikka CPAF hoito tukahdutti PMA aiheuttama granulosyyttistä tulehduksen WT hiirillä, CPAF käsittely ei muuttanut PMA aiheuttama orvaskeden liikakasvun joko WT tai

Ptafr – /-

hiiriä (Kuva 5I).

5A

–

H. Inflammatorinen infiltraatit lisääntyvät Ptafr – /- hiirillä käsitelty PMA, kun taas CPAF tukahduttaa tulehduksellinen soluinfiltraat- PMA käsitelty WT hiirillä.

Käsittelyn jälkeen WT ja

Ptafr

– /- hiiri korvat 18 päivää VEH , CPAF, PMA, tai PMA + CPAF, kuten on kuvattu kuviossa 4, hiiret tapettiin, ja korvat leikattiin irti formaliinia kiinnittäminen, parafiinivalu ja hematoksyliinillä eosiini (H B. Epidermaalinen paksuus mm ilmaistaan ​​keskiarvo ja SEM 3-4 korville per koeryhmä. Merkittävästi erilainen WT VEH ohjaus (

a), poikkeaa merkittävästi

Ptafr

– /- VEH ohjaus (

b). *,

p

0,05; **,

p

0,01; ***,

p

0,001; 2-tailed

t

-testissä.

PAF saa aikaan monimutkaiset vaikutukset alkuperäisestä tulehdusvasteen PMA hakemuksen

tulehdusta kasvaimen promoottori PMA tiedetään aiheuttaa nopeasti turvotus reaktio hiiren korvat [42], [43]. Tätä seuraa asteittainen nousu valkosolujen tunkeutuminen mitattuna MPO ja /tai N-asetyyliglukosaminidaasia (NAF) aktiivisuus, joka on huipussaan noin 24 tuntia [42], [43]. Koska PAF on voimakas vasoaktiivinen lipidi välittäjänä, joka edistää nopeaa turvotus reaktiot [37], tutkimme seuraavaksi, miten CPAF vaikuttaa alussa tulehduksellisten muutosten jälkeen, ensimmäisen PMA hakemuksen WT ja

Ptafr

– /- hiirissä. Kuten kuvasta 6A, PMA hoito sai aikaan nopean kasvuun korvan paksuuden, joka on ensimmäiseksi havaittiin kahden tunnin jälkeen. Korvan paksuuden muutokset olivat korkeimmillaan noin 24-48 tuntia. Sen sijaan,

Ptafr

– /- hiiret osoittivat vähenemistä alkuperäisessä korvan paksuuden muutoksiin huomattava, 2 8 tuntia, mikä viittaa siihen, että PMA-indusoidun ödeeman vasteet olivat PAF-riippuvaisia. Tästä syystä oli yllättävää havaita, että WT hiiret, joita käsiteltiin CPAF heti PMA hakemus oli myös noin 50% menetys PMA-indusoidun varhaisen korvan paksuuden muutoksia havaittiin 2 tuntia (kuvio 6B). Tämä viittaa siihen, monimutkaisen roolin PAF-R säätelyssä alkuperäisen vasoaktiivinen turvotus muutoksia vasteena PMA.

Kaikissa tutkimuksissa kuvioissa 6, WT ja

Ptafr

– /- hiiriä käsiteltiin VEH, PMA, CPAF (6 nmol) tai PMA + CPAF kuvatulla kuviossa 4A B. Korvan paksuuden mittaukset tehtiin juuri ennen reagenssiin hakemuksen sekä ilmoitettuina ajankohtina osoittaa jopa 48 tuntia.

6A. Ptafr – /- hiirillä vähenemiseen alussa ja viivästynyt korvan paksuus kasvaa seuraavien yhden PMA sovellus.

Ear paksuus tontteja WT ja

Ptafr

– /- hiirissä, joita käsiteltiin ilman PMA näkyvät. Tilastollisesti merkittäviä muutoksia huomattiin WT hiiriä hoidettiin PMA verrattuna

Ptafr

– /- hiiret hoidettiin PMA. Tulokset edustavat keskiarvoa ja SEM korvan paksuuden vähentämisen jälkeen korvan paksuus hetkellä 0 (n = 4-12 hiirtä per ryhmä). *,

p

0,05; **,

p

0,01;

t

-testi.

6B. Samanaikainen paikallisesti CPAF lohkojen PMA-indusoidun nousun korvan paksuuden kaikkina ajankohtina (2-48 h).

PMA-indusoidun korvan paksuuden muutoksia arvioitiin WT tai

Ptafr

– /- hiirissä, joita hoidettiin PMA: lla tai PMA + CPAF. Vähentämisen jälkeen korvan paksuuden hetkellä 0, kyky CPAF tukahduttaa PMA-indusoidun korvan paksuuden muutokset laskettiin prosentuaalinen estyminen PMA-indusoidun korvan paksuus kasvaa. CPAF hoito johti merkittävään eston PMA-indusoidun korvan paksuuden muutoksia kaikkina ajankohtina (p 0,01-0,05;% estäminen poikkeaa merkittävästi ei estoa, Wilcoxonin testi). CPAF hoito ei ollut merkittävää vaikutusta PMA aiheuttamaa korvan paksuuden muutoksista

Ptafr

– /- hiirillä (One analyysissä Wilcoxonin testi). Prosentuaalinen inhibitio PMA-indusoidun korvan paksuuden muutokset CPAF WT hiirillä oli myös huomattavasti erilainen kuin nähdään

Ptafr

– /- hiirillä (*,

p

0,05; **

p

0,01;

t

-testi).

Vaikka edellä tiedot osoittavat monimutkaisen roolin PAF-R säätelyssä alkuperäisen PMA-