Krooninen sairaus

tiivistelmä

Poly (ADP-riboosi) polymeraasi-1 (PARP-1) ja autophagy pelata yhä tärkeä rooli DNA-vaurioiden korjaus ja solukuolemaa. Gemsitabiini (GEM) on edelleen ensilinjan kemoterapeuttisen lääkkeen haimasyövän (PC). Kuitenkin vähän tiedetään suhdetta PARP-1 ilmentymisen ja autophagy vastauksena GEM. Tässä osoitamme, että GEM aiheuttaa DNA-vaurioita vastaus ja hajoaminen mono-ADP ribosyloi PARP-1 läpi autophagy väylän PC soluja, jotka on pelastettu estämällä autophagy. Hypoksia ja seerumistarvaatio estävät autophagic aktiivisuutta johtuen kumotaan GEM aiheuttama mono-ADP-ribosyloi PARP-1 hajoamista. Aktivointi ekstrasellulaaristen säänneltyjen proteiinikinaasien (ERK) aiheuttama seerumistarvaatio osoittaa eroja solunsisäinen sijainti sekä modulaatio autophagy ja PARP-1 heikkenemistä GEM-herkkien KLM1 ja kestävä KLM1-R soluissa. Tutkimuksemme on paljastanut uutta roolia autophagy PARP-1 hajoaminen vastauksena GEM, ja erilaisten vaikutusten MEKin /ERK signalointireitille on autophagy välillä GEM-herkkä ja kestävä PC soluja.

Citation: Wang Y, Kuramitsun Y, Tokuda K, Baron B, Kitagawa T, Akada J, et al. (2014) Gemsitabiini indusoi Poly (ADP-riboosi) polymeraasi-1 (PARP-1) Hajoaminen kautta Autophagy in Haimasyöpä. PLoS ONE 9 (10): e109076. doi: 10,1371 /journal.pone.0109076

Editor: Shaida A. Andrabi, Johns Hopkins University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 lokakuu 2013; Hyväksytty: 08 syyskuu 2014; Julkaistu: 01 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat apurahan no. 24501352, www.jsps.go.jp/g-grantsinaid. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Gemsitabiini (GEM) on nykyisin tavallinen hoito kehittynyt ja metastasoituneen haimasyövän (PC) sekä adjuvanttia ja lievittävä asetuksia, mutta vastustuskyky GEM on ollut suuri ongelma kuin sen vastausprosentti on alennettu 20% [1] – [4]. GEM voi estää DNA-synteesiä kohdistamalla ribonukleotidireduktaasiin, mikä sen sisällyttäminen osaksi solujen DNA aiheuttaen DNA-replikaation virheiden [5], [6]. Aikaisempi tutkimus on raportoitu, että GEM aiheuttama DNA: n replikaatio stressi, pysähtynyt replikointi haarukat ja laukaisi tarkistuspisteen signalointireitteihin [7]. Esto tarkastuspiste kinaasi 1 (Chk1) kemiallisilla estäjien aiheuttama herkistyminen PC solujen vastauksena GEM [8], [9]. Lisäksi epäsuhta korjaus-puutosta HCT116-solut ovat herkempiä

in vitro

GEM-välitteisen säteilylle herkäksi [8]. Vaikka näyttö on osoittanut suhdetta DNA korjaukseen ja herkistyminen solujen GEM, mekanismeja vastuussa korjaamiseen GEM aiheuttaman DNA-vaurion ei ymmärretty.

Autophagy on solun polku mukana rutiini liikevaihdon proteiinien tai solunsisäisten soluelimiin läheiset yhteydet ihmisten sairauksien ja fysiologia [10]. Autophagic toimintahäiriö liittyy syöpään, neurodegeneraatio, mikrobi-infektion ja sekä vastuksen syöpäsolujen syövän hoitoon [11], [12]. GEM indusoi autophagy in Panc-1 ja MiaPaca-2-soluissa, ja inhibitio autophagy 3-metyyliadeniini (3-ME) tai ontelon membraaniproteiini 1 pudotus laski apoptoosin gemsitabiinin käsiteltyjä soluja [13]. Siksi tämä näyttö osoittaa, että autophagy voi olla keskeinen rooli apoptoosin PC solujen vastauksena GEM.

Poly (ADP-riboosi) polymeraasi-1 (PARP-1) näyttelee kriittistä roolia monissa molekyyli- ja solutason prosessit , mukaan lukien DNA vahinkosaneeraus, genomin vakautta, transkriptio ja apoptoosin [14]. PARP1 on mukana korjaukseen sekä yksijuosteisen DNA (ssDNA) ja kaksisäikeisen DNA: n (dsDNA) tauot sitomalla DNA päät ja /tai vuorovaikutuksessa DNA korjaukseen proteiineja, esimerkiksi (ataksia verisuoniluomen mutaation) ATM ja Ku-alayksiköiden [15 ] – [18]. Inhibitio PARP-1 tehostaa sytotoksisuutta DNA: ta vaurioittavien aineiden ja säteilyn

in vitro

[19]. PARP-1: n estäjät on raportoitu mahdollisina kemoterapeuttisia lääkkeitä BRCA1- /BRCA2-puutteellisia rintasyöpä ja keuhkosyöpä [20] – [21]. Näin ollen on tarpeen arvioida muutoksia PARP-1 vastaa GEM aiheuttaman DNA-vaurioita PC.

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että mikrotubuluksiin liittyvä proteiini 1A /1B-kevyt ketju 3 (LC3) keskeinen tekijä autophagosome muodostumista, on säädellä vähentävästi KLM1-R verrattuna KLM1 soluihin. GEM indusoi DNA-vaurioita vastaus ja autophagy vuonna KLM1 ja KLM1-R soluissa ja alassäädetty PARP-1 ilme. Esto autophagy estetty GEM-indusoimaa hajoamista mono-ADP ribosyloi PARP-1. MEK /ERK-signalointireitin oli erilainen vaikutus autophagy ja GEM-indusoidun PARP-1 hajoamisessa KLM1 ja KLM1-R-soluja. Niinpä me esiin uutta tietoa koskien autophagy reitin säätelyssä PARP-1 hajoamista PC soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

U0126 (9903S) ja wortmanniini (9951S) ostettiin Cell Signaling Technology. Vasta-aineet ovat spesifisiä p-ERK (sc-7383), ERK (sc-94200), p21 (sc-65595), Hsp27 (sc-13132), PARP-1 (sc-8007 varten Western blot ja sc-1562 vahvistusta ja immunofluoresenssilla), CTIP (sc-3970) ja aktiini (sc-1616) ostettiin Santa Cruz Biotechnology. Vasta-aineet ovat spesifisiä LC3A /B (4108S), SIRT6 (12486), kaspaasi-3 (9665) ja PI3KCIII (4263S) ostettiin Cell Signaling Technology. Vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä Bcl2 (B3170), Ulk1 (SAB4200106) ja Beclin1 (B6061) hankittiin Sigmalta. Vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä AMPKα1 (07-350) hankittiin Millipore.

Soluviljely

Kaikki käytetyt solulinjat Tässä tutkimuksessa aiemmin julkaistu solulinjat, jotka oli antanut meille lahjana . Ihmisen haiman solulinjaa KLM1 (ID: TKG0490) kloonattiin ja perustettiin tohtori Kobari M Institute of osasto, ikääntymisen ja syövän yhteys, Tohoku University (Sendai, Japani) vuonna 1996 [39]. GEM-herkkä KLM1 ja kestävä KLM1-R ihmisen haimasyövän solulinjat avokätisesti kuin lahja Department of Surgery ja Science Kyushun yliopistossa Graduate School of Medical Science. KLM1-R on perustettu altistaa KLM1 solujen GEM aiemmissa tutkimuksissa [40] – [41]. Näitä soluja viljeltiin Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640, GIBCO, 05918), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS, GIBCO, 26140-079), ja 2 mM L-glutamiinia ja inkuboitiin 37 ° C ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa, joka sisälsi 5% CO

2.

Ohimenevä transfektio

KLM1 soluja ympättiin ja inkuboi 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa, kunnes solut ovat 70% konfluentteja. Solut transfektoitiin validoitu ihmisen LC3B siRNA (sc-43390, Santa Cruz Biotechnology) tai ohjaamaan siRNA (sc-37007, Santa Cruz Biotechnology) seuraamalla siRNA transfektioprotokolla (Santa Cruz Biotechnology).

Western blotting

solut lyysattiin lyysipuskurilla ((1% NP-40, 1 mM natriumvanadaattia, 1 mM PMSF, 50 mM Tris, 10 mM NaF: ää, 10 mM EDTA, 165 mM NaCl, 10 ug /ml leupeptiiniä ja 10 ug /ml aprotiniini) jäissä 1 h. Solulysaatit sentrifugoitiin 15000 x g 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. supernatantti kerättiin ja proteiinipitoisuus määritettiin Lowry-määrityksellä. Yhtä suuret määrät proteiinia (20 ug) erotettiin 5-20% SDS-polyakryyliamidigeelillä ja sitten siirrettiin PVDF-kalvolle (Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA). kalvoa inkuboitiin sopivan primaarisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli. sitten kalvo pestiin ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundääristä vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Immunoblottauksia visualisoitiin kemiluminesenssin reagenssilla (Immunostar, Wako). Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa.

Immunofluoresenssi

Soluja viljeltiin 15 mm: n pyöreä peitelaseille 12-kuoppalevyille tiheydeksi 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti. Solujen peitinlasit kiinnitetään käyttäen tuoretta 3,7% paraformaldehydillä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 30 minuutin ajan, kun ne saavuttivat 70-80% konfluenssin. Sitten näytteet pestiin PBS: llä, minkä jälkeen läpäiseväksi 0,1% Triton X-100: ssa 15 min. PBS-pesun jälkeen niitä inkuboitiin blokkausliuoksessa (1% vuohen seerumia tai 1% aasi seerumilla PBS: ssä, jossa oli 0,1% Tween 20) 1 h huoneen lämpötilassa. Soluja käsiteltiin primaarisen vasta-aineen blokkausliuoksessa yön yli 4 ° C: ssa. Inkubaation jälkeen primaarinen vasta-aine, solut huuhdeltiin PBS: llä, jossa oli 0,1% Tween 20 (PBS-T), ja niitä inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kun oli pesty PBS-T, niiden tumat olivat vasta-värjättiin 1,43 uM DAPI (4,6′-diamino-2-fenyyli) 5 minuutin ajan. Peitelaseja pestiin PBS-T, sitten asennetaan alaspäin päälle mikroskoopin kanssa Fluoromount (Diagnostic Biosystems, Pleasanton, CA, USA). Konfokaaliset kuvat saatiin käyttämällä Nikon Plan Apo 60X /1,40 tavoite, BZ-9000 (BIOREVO) ja BZ-II Viewer ohjelmisto (Keyence, Osaka, Japani) toimija, ei tiennyt kokeellisen kunnossa. Kaikki parametrit pidettiin vakiona jokaisessa kokeessa. Digitaaliset kuvat analysoitiin ja keskimääräinen intensiteetti mitattiin käyttäen Image J. ohjelmistoa.

apoptoosimäärityksessä

Sopiva määrä soluja maljattiin ja käsiteltiin 24 tunnin ajan. Solut värjättiin käyttämällä Apo-BrdU

In situ

DNA: n fragmentoituminen Assay Kit (80101, BioVision, Inc.) (dataa ei esitetty) tai Kaspaasit 3/7 iinianalyysikitissä (12D51, Immuno- Technologies, LLC.). Nämä kokeet tehtiin tiukasti ohjeiden suhteellisen protokollia.

Tulokset

Gemsitabiini (GEM) indusoi autophagy PC soluissa

Kaksi PC syöpäsolulinjoja GEM-sensitiive KLM1 ja kestävä KLM1-R, käytettiin tässä tutkimuksessa. Nämä solulinjat on määritelty niiden ilmentyminen lämpöshokkiproteiini 27 (Hsp27) (Fig. 1 A ja B), joka on raportoitu olevan mahdollinen merkki PC-resistenttejä GEM [22] – [24]. Lisäksi ilmentyminen p21 osoitettiin vähennetään KLM1-R verrattuna KLM1 soluihin (Fig. 1 B), joka osoittaa eri fenotyyppejä solukierron välillä. Sitten tutkittiin autophagic aktiivisuus KLM1 ja KLM1-R-soluja, jotka määritettiin ilmentymistä LC3 [25]. Olemme osoittaneet, että molemmat LC3-I ja II säädellä vähentävästi KLM1-R verrattuna KLM1 soluihin (Fig. 1 B). Lisäksi alas-säätely AMP-aktivoitu proteiinikinaasi A1 (AMPKα1) ja UNC-51 kaltainen kinaasi 1 (Ulk1) esitettiin, toisin fosfatidyyli 3- kinaasin (PI3K CIII) tai Coiled-kela myosiiniin kaltainen BCL2-vuorovaikutuksessa proteiinin ( Beclin-1), ja KLM1-R verrattuna KLM1-soluissa (kuvio. S1 A ja B), mikä osoittaa, että väheneminen autophagic aktiivisuuden GEM-resistenttejä KLM1-R solut voidaan liittyvän alas-säätely AMPKα1 ja /tai Ulk1 ilme. Sen vaikutuksen määrittämiseksi autophagy aiheuttama GEM, soluja käsiteltiin GEM: ssa 5 tuntia (h), ja sitten havaittiin immunofluoresoivan mikroskoopilla käyttäen anti-LC3 vasta-aine värjäys. Tässä koeasetelmassa, olemme osoittaneet, että LC3 II täplät lisättiin sen jälkeen, kun solut altistettiin GEM (Fig. 1 C). Nämä tiedot osoittivat, että GEM indusoi autophagy PC soluissa.

(A) ilmentymistä Hsp27 testattiin Western blot ja suhteellinen intensiteetti mitattiin ylioppilas

t

testi (n = 3 ) (B) KLM1 ja KLM1-R solut hajotettiin ja SDS-PAGE: lla ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden. Aktiini käytettiin normalisoimaan lastaus proteiinin tasoja. (C) Ilmoitettu soluja käsiteltiin 100 ug /ml GEM: ssa 5 h ja ilmentymistä LC3A /B ja muodostuminen LC3-positiivisia autophagosomes tutkittiin konfokaalimikroskopialla. LC3A /B: vihreä ja DAPI: sininen. Nuolet osoittavat autophagosome. Mittakaava, 20 pm.

GEM nimenomaan down-regulation mono-ADP ribosyloi PARP-1 on kaspaasi-riippumattomalla tavalla

lisäksi vaikutus testattiin GEM on PARP-1 ilmentyminen PC-soluissa käyttäen western blot -analyysiä. KLM1 ja KLM1-R oli merkittävä väheneminen PARP-1, kun solut altistettiin 10 tai 100 ug /ml GEM 24 h (Fig. 2). Mielenkiintoista, havaittiin, että alennettu bändit PARP-1 GEM aiheuttama paneelit kasvoi hieman molekyylipaino kuin käsittelemättömän paneelit. Niinpä tämä ehdotti, että GEM nimenomaisesti indusoi alas-säätely PARP-1, joka oli mono-ADP ribosyloi (Fig. 2 A). Zhiyong Mao

et al.

Oli määritelty ylempi vyöhyke PARP-1, kuten mono-ADP ribosyloi muodossa lysiinitähde 521, joka indusoitiin Sirtuin 6 (SIRT6) [26]. SIRT6 on nisäkkään homologi hiivan SIR2 deasetylaasin ja mukana sytokiinituotannossa ja migraatio PC [27]. Lisäksi KLM1-R oli suurempi herkkyys GEM aiheuttama säätely alaspäin PARP-1 kuin KLM1 soluja. Kymmenen ug /ml GEM riitti vähentämään merkittävästi paljon PARP-1 ilmentymisen KLM1-R verrattuna KLM1 soluihin (Fig. 2). Voit etsiä selitystä, me verrataan ilmaus SIRT6 välillä KLM1 ja KLM1-R soluissa. Odotetusti SIRT6 osoitti voimakkaampaa ilmentymistä (noin 1,5-kertainen) in KLM1-R kuin KLM1 solut (Fig. 2). Tämä osoitti, että tehokkuus GEM on alas-säätely mono-ADP ribosyloi PARP-1 voi riippua ilmaus SIRT6. Havaitsimme myös, että GEM aiheuttama yli-ilmentyminen CtBP-vuorovaikutuksessa proteiinin (CTIP) sekä KLM1 ja KLM1-R-soluissa (kuvio 2 A). Koska kaspaasi perheen proteaasi pilkkoo kuoleman alustan PARP-1 tietylle 85 kDa: n muotoon havaittu apoptoosin [28], tutkimme seuraavaksi kaspaasi 3/7 liittyivät PARP-1 alassäätöä tässä. Olemme paljasti, että taso kaspaasi-3/7 toiminnan sekä apoptoosin ei osoittanut mitään eroja KLM1 ja KLM1-R-solut, vaikka solut tehtiin GEM hoitoa 24 h, kuten on esitetty western blottauksella (Fig. 2 A) ja kaspaasi-3: /7 aktiivisuuden määritys (Fig. 2 B). Nämä tiedot osoittivat, että GEM erityisesti alassäädetty mono-ADP ribosyloi PARP-1 on kaspaasi-riippumattomalla tavalla.

(A) KLM1 ja KLM1-R-soluja käsiteltiin GEM kanssa ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Solulysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden. Ilmaisu PARP-1 varmistettiin toistuvasti selvä PARP-1-vasta-aine on kuvattu materiaaleissa. Nuoli pää osoitti mono-ADP ribosyloi muoto PARP-1. Nuolet merkitty asemaa alueen pilkkoa kaspaasi-3. (B) Ilmoitettu solut käsiteltiin kuten kohdassa (A) ja ne värjättiin sitten käyttäen kaspaasien 3/7 määrityskittiä (A). Kaspaasi 3/7 aktiivisuus testattiin ja mitattiin konfokaalimikroskopialla ja Image J. N. S., merkityksetön. Virhepalkkien, SD.

GEM: n ekspressiota vähentävän mono-ADP ribosyloi PARP-1 läpi autophagy hajoamisreitit

Koska GEM aiheuttama autophagy ja mono-ADP ribosyloi PARP-1 alassäätöä on kaspaasi-riippumattomalla tavalla, tutkimme jos mono-ADP ribosyloi PARP-1 voitiin suoraan hajottaa autophagy. KLM1 ja KLM1-R solut värjättiin sekä anti-LC ja anti-PARP-1-vasta-ainetta sen jälkeen, kun solut altistettiin GEM: ssa 5 h, ja sitten tutkittiin immunofluoresenssimikroskopian avulla. GEM-indusoidun autophagosome muodostuminen havaittiin yhteistyössä localizate kanssa PARP-1 sekä KLM1 ja KLM1-R-solut (Fig. 3 A), joka osoittaa suhdetta autophagy ja PARP-1. Voit testata GEM aiheuttama säätely alaspäin mono-ADP ribosyloi PARP-1: stä autophagy, LC3B siRNA, wortmanniini (PI3K-estäjä) ja PMSF (a vakuolaarisen proteaasinestäjä) käytettiin estämään autophagy solujen vastauksena GEM. GEM aiheuttama PARP-1 mono-ADP ribosylaatio- ja alas-sääntelyn KLM1, ja alas-säätely PARP-1 purettiin LC3B pudotus (kuva 3 B). Tämä vähennys PARP-1 ilmentymisen GEM sekä KLM1 ja KLM1-R solut pelasti myös käsittelemällä joko wortmanniini tai PMSF (Fig. 3C). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että GEM-induced down-regulation of mono-ADP ribosyloi PARP-1, jota välittää autophagy hajoamisen kautta.

(A) KLM1 ja KLM1-R-soluja käsiteltiin 100 ug /ml GEM 5 tuntia. Käsitellyt solut värjättiin spesifisten vasta-aineiden varalta LC3A /B ja PARP-1, ja sitten havaittiin konfokaalimikroskopialla. LC3A /B: vihreä, PARP-1: punainen ja DAPI: sininen. Mittakaava, 20 um. Nuolet osoittavat keltainen värjäytyminen yhteistyön lokalisointi välillä autophagosome ja PARP-1. (B) KLM1 solut altistettiin GEM 24 h kuluttua LC3B pudotus. (C) KLM1 ja KLM1-R solut altistettiin GEM 24 h läsnä tai poissa joko PMSF tai wortmanniini ilmoitettuina pitoisuuksina. Solulysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden varalta PARP-1. Nuoli pää osoittaa mono-ADP ribosyloi muoto PARP-1. Ilmaisu PARP-1 varmistettiin toistuvasti selvä PARP-1-vasta-aine on kuvattu materiaaleissa.

seerumistarvaatio indusoi aktivointi ja eri lokalisointi ekstrasellulaarisen signaalin säännelty kinaasi (ERK) in KLM1 ja KLM1- R solut

vaikutuksen määrittämiseksi seerumistarvaatio on ERK toimintaa ja autophagy, soluja viljeltiin tuoreessa väliaineessa tai ilman FBS 24 tuntia ja tutkittiin western blot ja immunofluoresenssimikroskopian avulla. Olemme osoittaneet, että ERK aktivoitiin seerumistarvaatio on KLM1 ja KLM1-R-soluja ja että GEM ei ole vaikutusta ERK aktiivisuutta (Fig. 4). Seuraavaksi tutkimme solunsisäinen sijainti fosfo-ERK by immunofluoresenssilla KLM1 ja KLM1-R soluissa. Mielenkiintoista, merkittävä ero solunsisäisen lokalisaation p-ERK osoitettiin niiden välillä. Under seerumistarvaatio, p-ERK osittain kulkeutua tumaan vuonna KLM1 soluissa; Päinvastoin, aktivoitu ERK oli läsnä ainoastaan ​​sytoplasmaan KLM1-R-solut (Fig. 4 B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että seerumistarvaatio indusoidun aktivaation ERK molemmilla KLM1 ja KLM1-R, mutta johti ero solunsisäinen sijainti välillä.

(A) KLM1 ja KLM1-R-soluja viljeltiin alustassa, jossa tai ilman FBS: ää tai altistunut 10 ug /ml GEM 24 tuntia. Solulysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden varalta p-ERK ja ERK. (B) ja (C) Ilmoitettu solut värjättiin erityisiä vasta-aineita p-ERK, Hsp27 ja LC3A /B sen jälkeen, kun soluja viljeltiin väliaineessa tai ilman FBS: ää 24 tunnin ajan. DAPI: sininen ja p-ERK: punainen (B) ja LC3A /B: vihreä ja Hsp27: punainen (C). Mittakaava, 20 pm.

seerumistarvaatio vaimentaa GEM aiheuttaman PARP-1 hajoamista estämällä autophagy kautta ERK signalointireitille

vieressä tutki autophagic aktiivisuuden seerumideprivaation in KLM1 ja KLM1-R-soluilla yhdessä ekstrasellulaarinen signaali säädelty (ERK) kinaasi (MEK) estäjä, U0126, arvioida vaikutuksia MEK /ERK-reitin päälle autophagy. Olemme osoittaneet, että ilmentyminen LC3 väheni seerumistarvaatio yli ajan kuluessa 24 h KLM1 ja KLM1-R-solut (Fig. 5 A ja B) ja pelastettiin U0126 on KLM1 (Fig. 5 A), mutta paljon vähemmän KLM1-R (Fig. 5 B). Aktiivisuus ERK silti oli kasvava suuntaus KLM1-R hoidetuilla U0126 (Fig. 5 B), mikä osoittaa toleranssi U0126 in KLM1-R verrattuna KLM1 soluihin. Tämä data osoitti, että seerumistarvaatio aiheuttama autophagy estyminen välittyy MEK /ERK signalointireitille. Under seerumistarvaatio, U0126 ei ollut vaikutusta ilmaisun B-solujen leukemia /lymfooma 2 (Bcl2) in KLM1 ja KLM1-R soluissa ja väheneminen p21 viivästyi käsittelemällä U0126 in KLM1 muttei KLM1-R soluissa ( kuva S2 A ja B), mikä viittaa siihen, että MEK-inhibiittori oli eri teho on solusyklin etenemisen välillä KLM1 ja KLM1-R-soluja. Koska MEK estäjän osoittivat eri tehoa sillä modulaatioon autophagy välillä KLM1 ja KLM1-R-soluilla seerumistarvaatio, tutkimme sen tehoa sillä PARP-1 hajoaminen vastauksena GEM. Todellakin, GEM-indusoitu PARP-1 hajoaminen estyi seerumistarvaatio sekä KLM1 ja KLM1-R solujen kaspaasi-riippumattomalla tavalla, ja purettiin vain KLM1 soluissa U0126 (Fig. 5 C ja D). Lisäksi hoitoa U0126 yksinään ei ollut vaikutusta PARP-1 ilme. Tämä data viittasi siihen, että seerumistarvaatio estää autophagy ja GEM-indusoidun PARP-1 hajoamista aktivoimalla ERK signalointireitin, jossa KLM1 ja KLM1-R-solut osoittavat eri herkkyydet MEK estäjä U0126.

(A) KLM1 ja KLM1-R solut altistettiin 10 ug /ml GEM läsnä ollessa tai poissa ollessa 20 uM U0126 varten osoitetun ajanjaksoista. Solulysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden varalta p-ERK ja LC3A /B. (B) ja (C) KLM1 ja KLM1-R-soluja viljeltiin väliaineessa tai ilman FBS: ää ja samalla alttiiksi joko toinen tai molemmat GEM ja U0126 osoitettuna pitoisuutena. Solulysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden. Nuoli pää osoittaa mono-ADP ribosyloi muoto PARP-1. Nuolet osoittavat asemaa alueen pilkkoa kaspaasi-3. Ilmaisu PARP-1 varmistettiin toistuvasti selvä PARP-1-vasta-aine on kuvattu materiaaleissa.

Hypoksia tukahduttaa autophagy ja GEM aiheuttama PARP-1 hajoaminen

Hypoksia johtaa solujen sykli pidätys kautta laski p21 synteesi [29]. Me vahvisti, että ilmaus p21 alassäädetty ja Hsp27 oli säädelty 1% O

2 hypoksia 24 tuntia KLM1 ja KLM1-R-solut; kuitenkin, hypoksia ei ollut vaikutusta ilmaisun fosfo-ERK ja Bcl2 (Fig. 6). Hypoksisissa kunnossa, sekä AMPKα1 ja Ulk1 ilmentyminen säädellä vähentävästi KLM1 ja KLM1-R soluissa ja ilmentymistä LC3 vuonna KLM1 laski samalle tasolle kuin käsittelemättömän KLM1-R solut (Fig. 6), mikä osoittaa, että hypoksia aiheuttama fenotyyppinen muutos KLM1 johtaa KLM1-R-kaltainen kunnon ja esto autophagy. Niinpä testasimme jos hypoksia esti GEM aiheuttaman PARP-1 hajoamista. Western blot-analyysi osoitti, että GEM aiheuttama PARP-1 hajoaminen oli merkittävästi lakkautettiin hypoksia on kaspaasi-riippumattomalla tavalla sekä KLM1 ja KLM1-R solut (Fig. 6 B). Nämä tulokset osoittivat, että hypoksia estää GEM-indusoidun PARP-1 hajoamista vähentämällä autophagic toimintaa.

(A) KLM1 ja KLM1-R-soluja viljeltiin normaaliolosuhteissa tai 1% O

2 hypoksia 24 tuntia ja sitten solulysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden. (B) Ilmoitettu soluja viljeltiin normaaliolosuhteissa tai 1% O

2 hypoksia yhdessä 10 ug /ml GEM 24 tunnin ajan. Solulysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden. Nuoli pää osoittaa mono-ADP ribosyloi muoto PARP-1. Nuolet osoittavat asemaa alueen pilkkoa kaspaasi-3. Ilmaisu PARP-1 varmistettiin toistuvasti erilliset PARP-1-vasta-aine on kuvattu materiaaleissa.

Keskustelu

Autophagy voidaan korkeudella GEM hoidossa PC-solujen [13 ]. PC-solut osoittivat olevan herkempiä sytotoksista vaikutusta GEM kun tämä yhdistettiin kannabinoidit kautta reaktiivisen hapen (ROS) -välitteisen autophagic solukuolemaa [30]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että autophagic aktiivisuus väheni GEM-resistenttejä KLM1-R verrattuna -sensitive KLM1 soluihin. Siksi aktivoituminen autophagy saattaisi olla käyttökelpoinen strategia resensitising PC GEM. Kuitenkin tiedetään vähän roolista autophagy DNA vaurioita indusoiman GEM. On tärkeää, todisteita siitä, että autophagy liittyy käsittelyyn kaksinkertaisen säikeen katkoksia (DSB: t) ja solukuolemaa vastauksena DNA-vaurioita hiiva kautta hajoamiseen asetyloitu rekombinaation proteiinin Sae2 (ihmisen CTIP) [31]. Esto /ablaatio histonideasetylaaseja (HDAC: t) indusoi autophagy ja asetylointi useita DNA-vaurion vasteen (DDR) proteiinien, mukaan lukien Sea2 ja Exo1 [31], [32]. Tässä osoitamme, että GEM indusoi DNA-vaurioita vastaus (havainnoida CTIP yliekspressio Western blot) ja mono-ADP ribosyloi PARP-1 hajoaminen johtaa lisääntynyt autophagy. Niinpä autophagy osallistuvat DNA-vaurioiden korjaus voi tapahtua valvonnassa PARP-1 hajoamista sijaan CTIP (hiiva Sae2) ihmisen PC. Kuitenkin onko mono-ADP ribosylaatiota PARP-1 on välttämätön autophagy hajoamista ja miten tämä erityinen hajoamista toteutetaan vastauksena GEM olisi selkeytettävä jatkotutkimuksiin.

ablaatio PARP-1 ei häiritse DSB korjaus, mutta viiveet aktivoituminen pysähtynyt lisääntymään haarukoiden [33]. Siksi GEM aiheuttama hajoaminen PARP-1 voi edistää GEM-pysähdyksissä replikointi haarukat. DSB vastetekijät ATM, MRE11, ja RAD50 tarvitaan solujen selviytymisen jälkeen replikaatiohaarukan pysähtyminen vastauksena GEM aiheuttaman DNA-vaurion [34]. Uudelleenkäynnistys pysähtynyt lisääntymään haarukat ja korjaus romahtanut lisääntymään haarukoiden vaativat RAD51 aktiivisuutta ja RAD51 välittämä homologisen rekombinaation (HR) reitin, vastaavasti [35]. Lisäksi osoitamme, että CTIP yli-ilmentyy vastauksena GEM vuonna KLM1 ja KLM1-R solut (Fig. 2 A). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että DSB korjaus tarvitaan solujen eloonjääntiä sekä PC-soluissa sen jälkeen, GEM-indusoidun DNA-vaurioita. CTIP osoitettiin olevan ajan säännelty kummassakin KLM1 ja KLM1-R aiheuttama GEM, mutta sen vakaus näyttää vahvempi KLM1-R, erityisesti yli pitoisuus rage 10-100 ug /ml GEM, joka ilmaisee korkeampaa SIRT6 verrattuna KLM1 soluihin (Fig. 2). SIRT6 edistää DNA vakautta ja aktivaatio ja stabilointi CTIP deasetyloinnilla [31], [35], mikä osoittaa mahdollinen mekanismi alemman herkkyyden KLM1-R GEM verrattuna KLM1 soluihin. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että PARP-inhibiittorit ovat erityisen tappava soluihin puutteellinen homologinen rekombinaatio (HR) proteiinien kautta vapauttamiseen virhealtista ei-homologisen end liittymällä [36]. Samoin siksi, yhdistelmä eräänlainen HR estäjän kanssa GEM (kuten PARP-1 vaimennin) voi olla mahdollinen terapeuttinen strategia PC. Kuitenkin on olemassa merkittävä rajoitus, sillä seerumistarvaatio ja hypoksia (matkimalla kasvain mikroympäristöihin

in vivo

) estävät GEM aiheuttama PARP-1 hajoamista vähentämällä autophagic aktiivisuutta (Fig. 5 ja 6). Siten edullinen ehdokas yhdistelmähoito GEM ei pitäisi vain estää komponenttien DSB, mutta myös edistää autophagy, esimerkiksi histonideasetylaasi-inhibiittoria, nimittäin, valproiinihappo [37]. Lisätutkimuksia tarvitaan testata onko tämä estäjä voisi parantaa tietokoneen solukuolemaa vastauksena GEM.

MEK estäjä U0126 näyttää erilaisia ​​vaikutuksia tasoon autophagy ja PARP-1 hajoaminen vastauksena GEM välillä KLM1 ja KLM1 R soluissa, mikä osoittaa, että mahdollisesti on rajoituksia terapeuttisesta strategiasta kohdistettu EGFR /Ras /ERK-reitin PC. Oletetaan, että havaitut erot riippuvat yhdellä kolme vaihtoehtoa: 1) eroja solunsisäinen lokalisaatio aktivoitua ERK välillä KLM1 ja KLM1-R solut (Fig. 4 B); 2) tuntematon palautetta signalointireitin ERK uudelleenaktivointi vastauksena MEK estäjä (Fig. 5 B) [37], [38]; 3) seerumin aiheuttama säätely alaspäin ULK1 in KLM1-R soluissa johtavat autophagy ei valvo ERK (Fig. S1 B).

Tässä tutkimuksessa olemme paljastaa uusia kohokohtia, että GEM toimii estäjänä PARP-1 edistämällä autophagy hajoamisreitit ja esittää siihen liittyviä ehdotuksia haluttujen ominaisuuksien mahdollisten ehdokkaiden yhdistelmähoito GEM PC.

tukeminen Information

Kuva S1.

(A) KLM1 ja KLM1-R solut hajotettiin ja ajettiin SDS-PAGE: lla ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden. Aktiini käytettiin normalisoimaan lastaus proteiinin tasoja. (B) KLM1 ja KLM1-R-soluja viljeltiin väliaineessa tai ilman FBS: ää tai altistunut 10 ug /ml GEM 24 tuntia. Solulysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0109076.s001

(TIF)

Kuva S2.

KLM1 (A) ja KLM1-R (B) solut altistettiin 10 ug /ml GEM nykyisissä tai poissa 20 uM U0126 varten osoitetun ajanjaksoista. Solulysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja tutkittiin spesifisten vasta-aineiden varalta että p21 ja Bcl2. Suhteellisten intensiteettien western blot mitattiin ja esitetty tässä kuvassa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0109076.s002

(TIF) B

Kiitokset

Kiitämme Ikeda E. ja Cui D. antaa meille käyttää hypoksian hautomo.