Krooninen sairaus

tiivistelmä

On kiireesti parantaa hoidon kehittyneitä munasarjasyövän joka voidaan täyttää antamalla immuuni-modulatorisen monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t) generoimaan kasvaimeen tuhoisa immuunivasteen. Käyttäen ID8 Hiiren munasarjasyöpä malli, tutkimme terapeuttista tehoa erilaisten mAb yhdistelmien hiirissä vatsaonteloon (i.p.) kasvain perustettiin siirtämällä 3 x 10

6 ID8 solua 10 päivää aikaisemmin. Vaikka suurin osa testattujen mAbien olivat tehottomia, kun sitä annetaan erikseen tai yhdessä, tiedot vahvistavat meidän aiempaan toteamukseen 2 i.p. injektiot yhdistelmä anti-CD137 anti-PD-1-mAb: kaksinkertaistaa elinaika. Hiiret, joita käsiteltiin tämän mAb yhdistelmällä on merkittävästi suurempi tiheys ja kokonaismäärä CD8

+ T-solut sekä vatsakalvon huuhtelu ja pernat, ja nämä solut ovat toimivia kuten on osoitettu antigeenispesifisen sytolyyttinen aktiivisuus ja IFN-γ tuotantoa. Vaikka antaminen anti-CD137 mAb monoterapiana samalla kasvattaa CD8

+ T-solut, joilla ei ole toiminnallista aktiivisuutta, joka saattaa johtua säätely ylöspäin yhteistyön estävä PD-1 ja TIM-3-molekyylien aiheuttama CD137 . Lisääminen syövän huumeiden sisplatiinin 2 mAb yhdistelmä lisäsi eloonjäämiseen 90 päivää (ja oli luultavasti parantava) mekanismilla, johon sisältyi systeeminen CD8

+ T-solujen vaste kasvainspesifisyys ja immunologinen muisti. Silmiinpistävän, yhdistelmähoito sisplatiinin ja CD137 /PD-1 mAb johti myös pitkällä aikavälillä säilyttämään hiirten vakiintuneiden TC1 keuhkokasvaimia. Samanlainen yhdistelmä 2 mAb: iden ja sisplatiinin olisi harkittava kliinisen ”käännös”.

Citation: Wei H, Zhao L, Li W, Tuuletin K, Qian W, Hou S, et al. (2013) Kombinatoriset PD-1 Blockade ja CD137 aktivointi terapeuttista tehoa Hiiren Cancer Mallit ja synergoi sisplatiinia. PLoS ONE 8 (12): e84927. doi: 10,1371 /journal.pone.0084927

Editor: Ramon Arens, Leiden University Medical Center, Alankomaat

vastaanotettu: 5. kesäkuuta, 2013 Hyväksytty: 20 marraskuu 2013; Julkaistu: 19 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Wei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81372528), Ministry of Science Teknologia Kiinan ”973” (nro 2012CB917104), erityistä avustusta opetusministeriön Kiinan ja Shanghai komissio Education erinomaisen tutkimusryhmän onkologian ja Shanghaissa KeyProject onkologian sekä RO1CA134487 U.S. National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpäpotilailla (EOC) on johtava kuolinsyy peräisin gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia Yhdysvalloissa ja on neljänneksi yleisin syy syövän naisten yleisin kuolinsyy [1]. Yli 70% naisista, joilla EOC läsnä pitkälle sairaus ja kasvaimen levittämistä koko vatsaonteloon [2]. Standardi munasarjojen syöpä on kirurginen debulking seurasi platina-taksaani kemoterapian [3]. Sisplatiini ja sen platinan johdannaiset ovat ensilinjan kemoterapeuttisten aineiden hoidossa munasarjasyöpä. Sisplatiini aiheuttaa apoptoosia peruuttamattomasti interkalatoivista DNA kautta kansainvälisten ja juosteensisäisellä DNA additiotuotteet, aiheuttaen siten DNA-vaurioita ja aktivointi apoptoottisen koneiston [4]. Useimmat potilaat reagoivat kemoterapiaa ensin; kuitenkin suurin osa on lopulta uusiutumisen ja kuolee tautiin. Siksi uusia täydentäviä strategioita parantamiseksi tarvitaan tulosten munasarjasyöpä.

On useita syitä olettaa, että immunoterapiaa EOC voivat olla tehokkaita [5]. EOC-solut ilmentävät kasvaimeen liittyviä antigeenejä, joita vastaan ​​immuunivasteita on havaittu [6-10]. Tutkimukset uranuurtajana Coukos osoittavat, että immunologisten mekanismien tärkeä rooli kliiniseen tulokseen sillä on läheinen korrelaatio selviytymisen ja kasvaimen tunkeutuminen CD3

+ T-solujen [11]. EOC etäpesäkkeitä usein rajoitettu vatsakalvononteloon, joka helpottaa paikallinen toimitus terapeuttisten aineiden [12]. Useimmat potilaat, joilla on edennyt tauti voi tuoda tilapäisiä kliininen remissio, jossa kasvain kuormitus on pieni ja siksi todennäköisemmin vastata [9]. Kuitenkin kliininen menestys immunoterapioiden varten EOC on ollut vaatimatonta [13].

Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet terapeuttista tehoa sekä hiiren malleissa ja ihmispotilaille antamalla mAb: t, jotka voivat muuttaa immuunivastetta, kun sitä käytetään yksinään tai yhdistelminä. Esimerkiksi mAb: t CTLA4 on tuumoria teho pitkittyneen kokonaiselossaoloaikaa metastasoituneen melanoomaa, ja anti-CTLA4-mAb on kliinisesti hyväksytty FDA [14]. Hyödylliset terapeuttiset vaikutukset on osoitettu hiirillä, joilla on todettu kasvaimia [14,15] saamalla CD137 (eli 4-1 BB), käyttäen agonistina vasta-aineita, dimeerisiä RNA aptameerit tai ilmentävien kasvainsolujen pinta-liitetty anti-CD137 yksiketjuinen vasta-aine [15, 16], ja prekliiniset tiedot ovat johtaneet kliinisiin kokeisiin humanisoitu mAbien suunnattu CD137 [17]. Ohjelmoitu Death 1 (PD-1) proteiini on co-estävä reseptorin T-solujen, joilla on samanlainen rakenne kuin CTLA-4, mutta joilla on erilainen biologinen funktio ja ligandin spesifisyys [18]. Blockade välisen vuorovaikutuksen PD-1 ja sen ligandi, PD-L1, tehostaa T-solun immuunivasteiden in vitro ja välittää antituumoriaktiivisuus [19-21]. Prekliinisissä havainnot ovat johtaneet viime aikoina raportoitu kliinisistä tutkimuksista osoittaa, että anti-PD-1 ja anti-PD-L1-mAb: t tuottavat vaikuttava antituumorivaikutus ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, melanooma ja munuaisten syöpä täysin regressio saavutettu joillakin potilailla [22-24].

Vaikka lupaavia tuumorin vastaista tehokkuutta useiden mAb monet kasvaimet ovat reagoinut hoitoon yhden anti-CD137, anti-PD-1 tai anti-CTLA4-mAb: [25,26] ja kahden tai useamman mAb: t voidaan tarvita. Olemme viime aikoina osoittaneet kaikissa 4 hiiren kasvainmallissa, mukaan lukien ID8 klooni MOSEC hiiren munasarjasyövän, että toistuva toimitus tuumoripaikkaan yhdistelmä mAb-molekyylien CD137 /PD-1 /CTLA4 aiheuttama pitkäaikainen kasvaimen regressioita ja jopa kovettuu ja että mAb yhdistelmä, joka käsittää myös mAbin CD19 oli vielä tehokkaampi [27]. Vaikka nämä tiedot ovat tärkeitä osoittamalla, että siirtyminen Th2 tyypin tulehdusreaktio, joka on yleistä kasvaimissa [28-30], joka Th1-tyypin vaste voi olla parantava, toistuva toimitus 3-4 mAb: iden kasvaimeen sivustoja ei ole käytännöllistä kliiniseen ”käännös”.

Ongelma liittyy tarve paikallinen toimitus voidaan voittaa munasarjojen syöpien, koska ne kasvavat ja ennen kaikkea etäispesäkkeitä vatsaontelossa ja ovat siten helposti. Lisäksi määrä tarvitaan mAb: iden voidaan vähentää kahteen, koska meillä on jo havaittu, että yhdistelmä, anti-CD137 ja anti-PD-1-mAb: t voivat kaksinkertaistaa hiirten eloonjääntiin kanssa vakiintuneita ID8 kasvaimia, vaikka se ei ole parantava [28]. Näiden tulosten perusteella olemme nyt verranneet

in vivo

terapeuttista tehoa, mitattuna pitkäaikainen kokonaiseloonjääminen, anti-CD137 /PD-1 yhdistettynä että mAbeista annettiin yksittäisinä aineina sekä muiden mAbien ja mAb yhdistelmät. Tutkimme lisäksi systeemistä ja paikallisten immunologisten mekanismien harjoittaa yksin tai yhdistettynä anti-CD137 /PD-1-mAb: t. Tärkeintä, sen jälkeen osoitti, että yhdistelmä anti-CD137 /PD-1-mAb: t anti-cancer drug sisplatiinin merkittävästi pidentää elämää ja on luultavasti parantava 80% hiiristä, joilla on todettu ID8 karsinooma mekanismilla, johon liittyy toiminnallinen CD8

+ T-solujen ja on kasvain antigeenispesifisyydeltään sekä immunologinen muisti. Samanlainen hoito johti myös pitkällä aikavälillä säilyttämään 33,3% hiiristä vakiintuneiden TC1 keuhkokarsinooma. Samanlaista lähestymistapaa olisi ”käännettävissä” klinikalle.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiret ja solulinjat

kokeita Kiinassa, 6-8 -week naisten C57BL hankittiin Animal Experimental Centerin toisen Military Medical University ja eläinten pöytäkirjat hyväksynyt Institutional Review Board of Second Military Medical University. Eläinkokeet suoritettiin Seattlessa käytetty hiiriä ostettiin Charles River Laboratories (Wilmington, MA) ja protokollat ​​hyväksyttiin Institutional Review Board of University of Washington.

ID8 on klooni MOSEC munasarjakarsinooman C57BL /6 alkuperä [31] ja TC1 on klooni johdetut keuhkojen epiteelisolujen C57BL /6-hiirten, jotka on kotransformoitu HPV-16 E6 ja E7 [27]. EL4 hiiren T-solulymfooma-solut ovat C57BL /6-alkuperää [32]. ID8 ja TC1 kasvainsoluja viljeltiin täydellisessä DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Thermo Scientific, Rockford, IL), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä ennen solujen suspensioita valmistettiin ja siirretty hiirillä. EL4-soluja ja pernasoluja pidettiin täydellisessä väliaineessa RPMI-1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 25 mM HEPES, 2 mM glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä.

Reagenssit

seuraavat monoklonaalisia vasta-aineita (mAb), joita käytetään eläinkokeissa hankittiin BioXcell (West Lebanon, NH): anti-CD137 (Clone lob12.3), anti-PD-1 (klooni RMP1-14), anti- CTLA4 (klooni 9D9), anti-NK1.1 (Clone PK136), anti-CD8 (klooni 2,43), anti-CD4 (klooni GK1,5) ja ohjaus (klooni 2A3). Anti-CD137-vasta Kloonin 2A valmistettiin meidän lab kuten aiemmin on kuvattu [33].

Eläinkokeet

Hiiret injektoitiin intraperitoneaalisesti (i.p.), 3 x 10

6 ID8 solua 0,1 ml: ssa PBS: ää. Päivinä 10 ja 14 tuumorin istuttamisen jälkeen hiiriin ruiskutettiin i.p. 0,5 mg kutakin mAb yhteensä 0,5 ml: ssa PBS: ää, kuten on esitetty kuviossa legendoja. Kokeissa mAb /sisplatiinin yhdistelmähoitoa, ryhmä hiiriä (10 hiirtä ryhmää kohden), joissa 10 päivä perustettu ID8 kasvaimen saivat kaksi annosta ohjaus, anti-PD-1, anti-CD137 ja anti-PD-1 /CD137 mAb (0,5 mg per annos per hiiri) 4 päivän välein tai ilman sisplatiinia (10 mg /kg) samanaikainen heidän ensimmäinen käsittely. Hiiret punnittiin joka toinen päivä ja tarkastettiin päivittäin turvonnut vatsa osoituksena askites tietoja ja todistusaineistoa myrkyllisyydestä, kuten muuttunut käytös, kykenemättömyys liikkua, syödä tai juoda. Sen jälkeen hoitokäytännön, hiiret tapettiin, kun he kehittivät vatsaonteloon sekä oli painonnousu 30%. Selviytyminen kunkin hiiren tallennettiin ja kokonaiselossaolo laskettiin. Yhdistetyn hoidon kokeiluja TC1 kasvain malli, hiiriä (6 ryhmää kohti) injektoitiin ihon alle (s.c.) 5 x 10

5 TC1 solua 0,1 ml: ssa PBS: ää. Päivinä 5 ja 9 kasvaimen siirron jälkeen, hiiriin injektoitiin kasvaimen (i.t.) mAb ja /tai sisplatiinin käyttäen annos /yllä on kuvattu. Kolme kohtisuorassa halkaisijat s.c. kasvaimet mitattiin joka toinen päivä käyttäen paksuus ja kasvainten tilavuudet laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti: 1/2 x (pituus) x (leveys)

2. Hiiret tapettiin, kun he näyttivät kuolemaisillaan tai niiden s.c. kasvaimet olivat saavuttaneet 10 mm halkaisijaltaan.

kehittymisen arviointi immunologinen muisti, 15 pitkään elossa hiiret sisplatiinia /anti-PD1 /CD137 yhdistelmähoidon (yhdistetty 2 itsenäistä koetta) tai 5 samanikäisiin naiivi hiiret (joka toimi kontrollina) altistettiin ip tai s.c. 3 × 10

6 ID8 soluja tai 1 x 10

6 syngeneeisissä mutta antigeenisesti erilainen TC1 soluja. Kasvaimen kasvua hiirissä arvioitiin kuten edellä on kuvattu.

Depleetiokokeita, anti-CD4 (0,2 mg /hiiri), anti-CD8 (0,2 mg /hiiri), anti-NK1.1 (0,1 mg /hiiri) tai kontrolli-mAb (0,2 mg /hiiri) injektoitiin ip 48 ja 72 tuntia ennen käsittelyä ja joka 3-4 päivä sen jälkeen keston kokeissa. Ehtyminen asianmukaisia ​​solualaryhmiä varmistettiin virtaussytometrianalyysillä (tietoja ei ole esitetty).

arviointi immuunijärjestelmän solujen osajoukkoja pernassa ja vatsakalvon pesuja virtaussytometrialla

Hiiret, jotka oli transplantoitu i.p. jossa ID8 solut tapettiin 7 ja 14 päivää sen jälkeen, kun ne oli injektoitu anti-PD1, anti-CD137, anti-PD1 /CD137 tai valvontaa, kuten terapiassa kokeissa. Yhden solun suspensiot pernoista valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [27]. Saada vatsakalvon immuunisolujen, 3 ml PBS: ää injektoitiin vatsaonteloon hiirien ID8 kasvaimia heti eutanasia, niiden vatsa oli hierotaan ja neste poistettiin, suodatettiin 70 uM solusiivilän (BD Biosciences, San Jose, CA) , pestiin ja immuunijärjestelmän solut eristettiin käyttäen hiiren lymfosyyttien eristäminen puskuria (Cedarlane, Burlington, Ontario) valmistajan ohjeita.

Single-solususpensiot pestiin FACS-värjäys ja inkuboitiin hiiren Fc-reseptorin sitoutumisen estäjä 10 minuuttia ennen värjäystä vasta-aineiden CD45 (klooni 30-F11), CD3 (klooni 145-2C11), CD4 (klooni GK1,5), CD8 (klooni 53-6.7), CD19 (klooni eBio1D3), CD11 (klooni M1 /70), GR-1 (klooni RB6-8C5), TIM-3 (klooni 8B.2C12) ja PD-1 (klooni J43; kaikkea eBioscience, San Diego, CA) 30 minuutin ajan. Solunsisäistä värjäystä FoxP3 (klooni FJK-16s, eBioscience), IFN-γ: n (klooni XMG1.2, eBioscience), ja IL-10: n (klooni JES5-16E3, eBioscience), solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin ja värjättiin ohjeita noudattaen of Cytofix /Cytoperm kit (BD Bioscience). Virtaussytometria suoritettiin käyttäen FACSCalibur (BD Biosciences) ja lymfosyyttipopulaatiossa valittiin portittamisella CD45-positiivisia soluja. Aineisto analysoitiin käyttämällä Flow Jo ohjelmistoa (Puu Star, Ashland, OR). Kaikki virtaussytometrillä kokeet suoritettiin vähintään 3 kertaa.

arviointi antigeenispesifisen immuunivasteen

eristetty splenosyyteillä käsitellyistä hiiristä viljeltiin, kun läsnä oli 10 ug /ml H-2Db-rajoitettua Mesothelin -johdannainen peptidejä (Mesothelin aminohappo 406-414) tai ohjaamaan HPV-E7-peptidiä (HPV-E7 49-57; kaikkea Shanghai Science Peptide Biotekniikka Co.Ltd., Shanghai) 3 päivää. Sen jälkeen, IFN-γ supernatanteissa havaittiin hiiren IFN-γ Quantikine-ELISA Kit (R 0,05.

Tulokset

synergistinen antituumorivaikutusta anti-CD137 /PD-1-mAb: t

arvioitiin antituumorivaikutuksen tehosta eri yhdistelmiä agonistinen tai antagonistinen mAbien vastaan ​​kostimuloivana tai co-estävä molekyylien C57BL hiirissä, ip 10 päivää aikaisemmin 3 × 10

6 ID8 soluja. Perustuvat julkaistuihin näyttöä terapeuttista potentiaalia useilla kasvainmuodoista testasimme mAb: t CD137, CD40, CTLA-4, PD-1, TIM-3 ja LAG-3 [34,35], yksittäisinä aineina ja yhdistelminä. Käsittelemättömät hiiret ja hiirtä sai kontrollina mAb kehitetty askites noin 30 päivän kuluttua tuumorin istuttamisen ja jouduttiin lopetettiin. Kuten kuviossa 1 on esitetty, suurin osa testattiin mAb: iden yhdistelmät oli vähän tai ei lainkaan vaikutusta yleiseen eloonjäämiseen kasvaimen kantavien hiirten, ja yksikään mAb: iden on terapeuttisesti tehokas, kun sitä käytetään yksin. Vastaa meidän äskettäin julkaistut tulokset [27], yhdistetty hoito anti-CTLA4, PD-1 ja CD137 mAbien merkittävästi pidentynyt eloonjääminen hiirten keskimääräinen eloonjäämisaika yhä 80 vuorokautta (kuvio 1A, B; p 0,05 verrattuna kontrolleihin) . Yhdistetty hoito anti-CTLA4, PD-1, TIM-3 ja CD40 mAb: t myös tukahdutti kasvaimen kasvua, mutta oli vähemmän tehokas kanssa keskimääräinen eloonjääminen 49 päivää. Muut mAb yhdistelmät, mukaan lukien anti-CTLA4 /PD-1, anti-CTLA4 /PD-1 /CD40, anti-CTLA4 /PD-1 /TIM-3, anti-CTLA4 /PD-1 /LAG-3 ja anti-CTLA4 /PD-1 /LAG-3 /CD40 ei ollut vaikutusta kasvaimen kasvua.

Hiiret (5 /ryhmä) istuttaa i.p. 3 × 10

6 ID8 solua 10 päivää aikaisemmin ruiskutettiin i.p. kahdesti 4 päivän välein, jossa on esitetty mAb yhdistelmät (0,5 mg kutakin mAb /hiiri); selviytyminen kirjattiin (A, C) ja keskimääräinen elinaika on laskettu (B, D). Koe toistettiin kerran samanlaiset tulokset. E, Hiiret (8-9 /ryhmä) istuttaa i.p. 3 × 10

6 ID8 solut 3 päivää aikaisemmin ruiskutettiin i.p. kahdesti 4 päivä välein 0,5 mg ohjaus, anti-PD-1, anti-CD137 ja anti-PD-1 /CD137 mAb ja niiden selviytyminen kirjattiin. * P 0,05, ** P 0,01 verrattuna ohjaus mAb hoidetuissa hiirissä.

vieressä toisti edellä kokeiluja käyttämällä kahta erilaista kloonia mAb vastaan ​​CD137 (2A ja lob12.3). Kuten kuviossa 1C ja D, vaikka yksi mAb hoitoa ei pidentänyt kokonaiseloonjääminen, yhdistelmä anti-PD-1 mAb joko anti-CD137 mAb yhtä pitkäaikainen eloonjääminen hiirten keskimääräinen eloonjäämisaika kaksinkertaistui (p 0,05 verrattuna ohjaus ja yhden mAb ryhmiä), joka edelleen parantaa lisäämällä anti-CTLA4-mAb (p 0,01 verrattuna sekä single mAb ryhmiä). Toistuminen kokeilun tulokset ovat samanlaisia ​​(tuloksia ei ole esitetty).

Erityisesti emme havaitse Ilmaisulla ja CD137 ja PD-1-molekyylejä ja niiden ligandit CD137L ja PD-L1 /PD-L2-pinnalla ID8 munasarjasyöpäsoluja (tuloksia ei ole esitetty), lukuun ottamatta mahdollisuus, että inhibitio ID8 kasvaimen kasvun

in vivo

suoraan välittyy anti-CD137 ja anti-PD-1-mAb: itä.

Mielenkiintoista, joko anti-CD137 tai anti-PD-1-mAbin suojattu seuraus ID8 solujen 3 päivässä perustettu ID8 malli vastaavien 66,7% ja 37,5% hiiristä elossa 90 päivää, jolloin koe lopetettiin ja hiiret lopetettiin (kuvio 1 E). Vatsaonteloon näillä hiirillä oli kasvaimettomia. On huomattava, että anti-CD137-mAb oli tehokkaampi kuin anti-PD1 mAb ja että näiden kahden yhdistelmä oli hieman tehokkaampi (77,8% elossa hiiret) kuin anti-CD137-mAbin.

Lisääntynyt prosenttiosuus T-soluja ja laski prosenttiosuus immunosuppressiivisten indusoiman anti-CD137 /PD-1-mAb: t

Tutkitaan onko yhdistetyn anti-PD-1 /CD137-mAb: t indusoi systeemistä immuunivasteen vastausta, ruiskutetaan hiirissä, 10 päivää aiemmin ID8 soluja (kuten hoidon koetta) joko yhdistelmä anti-PD-1 /CD137-mAb: t tai joko mAb yksin. Seitsemän päivää myöhemmin, analysoitiin virtaussytometrialla prosenttiosuus, absoluuttinen määrä ja efektoritoiminnan lymfosyyttien osajoukot, että pernat käsitellyissä hiirissä. Kuten kuviossa 2A on esitetty, pemat käsitellyillä hiirillä yhdistetyn anti-PD1 /CD137-mAb: t näytetään merkittävästi suurempi tiheys ja absoluuttinen määrä CD3

+ (p 0,01) ja CD8

+ T (p 0,001) solut ja alentuneet CD4

+ FoxP3

+ säätelijä-T (Treg) solut (p 0,001) ja GR-1

+ CD11b

+ myelooinen johdettuja vaimennin soluja (MDSCs) (p 0,05 ); palstojen esitetään (kuvio 2B). Yhdistetty anti-PD1 /CD137 mAb: itä myös kohonneita tasoja CD44

+ CD62L

– efektori /muisti (p 0,01), CD44

+ CD62L

+ keskusmuistia (p 0,05), IFN -γ tuottavat efektori CD8

+ T-solujen (p 0,01) ja laski CD8

+ T-solut tuottavat IL-10 (p 0,001) pernat (kuvio 3A); palstojen on esitetty kuvassa 3B. Tulokset osoittavat, että anti-PD-1 /CD137-mAb: hoidon syntyy systeeminen immuunivaste hallitsi huomattavasti CD8

+ T-soluja ja laski immunosuppressiivinen soluja.

Hiiret (3 /ryhmä) istuttaa i.p. 3 × 10

6 ID8 solua 10 päivää aikaisemmin ruiskutettiin i.p. 0,5 mg ohjaus, anti-CD137, anti-PD-1 tai anti-PD-1 /CD137 mAb ja mAb injektio toistettiin 4 päivää myöhemmin. Seitsemän päivää toisen injektion jälkeen, pernat kerättiin ja yhden solun suspensiot valmistettiin ja värjättiin fluoresenssileimattu vasta-aineita markkereiden lymfosyyttien osajoukot ennen analysointia virtaussytometrisesti. Prosenttiosuudet ja lukumäärät CD3

+, CD4

+, CD8

+, CD19

+, FoxP3

+ /CD4 ja GR-1

+ CD11b

+ solujen pernassa on esitetty (A) ja edustava pistekuvaajat esitetään (B). Tulokset esitetään M ± SEM 3 hiirtä /ryhmä, ja ne edustavat 3 itsenäistä koetta. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, Havainnot anti- PD-1 tai CD137 yhden mAb: t verrataan ohjaus mAb, ja havainnot anti- PD-1 /CD137-mAb: t verrataan sekä ohjaus ja yhden mAb.

Hiiret (3 /ryhmä), jotka oli transplantoitu i.p. 3 × 10

6 ID8 solua 10 päivää aikaisemmin ruiskutettiin i.p. kahdesti 4 päivän välein 0,5 mg ohjaus, anti-CD137, anti-PD-1 tai anti-PD-1 /CD137 mAb. Pernat käsitellyistä hiiristä analysoitiin ja fenotyyppien efektoritoimintojen CD8

+ T-lymfosyyttien virtaussytometrialla 7 päivää sen jälkeen, kun toisen mAb injektio. Prosenttiosuudet ja lukumäärät CD44

+ CD62L

– efektori /muisti ja CD44

+ CD62L

+ muisti-ja IFN-γ- ja IL-10-tuottavia soluja CD8

+ T-solupopulaatio on esitetty (A) ja edustavat pistekuvaajat on esitetty (B). Tulokset esitetään M ± SEM 3 hiirtä kussakin ryhmässä, ja ne edustavat 3 itsenäistä koetta. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, PD-1 tai CD137 mAb verrattuna ohjaus mAb, PD-1 /CD137 mAb verrattuna ohjaus ja yhden mAb.

antigeeni-spesifisen CTL-vasteen aiheuttama anti-CD137 /PD-1-mAb: t

edellinen tutkimus osoitti, että yhdistetyn anti-CTLA4 /PD-1 /CD137-mAb: t indusoivat voimakas antigeeni erityisiä Th1-tyypin immuunivasteen pernat ID8-hiirille [27], jonka pernasoluja tuotti suuria IFN-γ stimulaation vaikutuksesta johdettu peptidi ID8 solun ilmentävän Mesothelin, hyvin tunnettu munasarjakasvain antigeenin [9]. Samoin olemme havainneet IFN-γ tuotantoa pernasoluja hiiristä käsiteltiin yhdistettynä anti-PD-1 /CD137-mAb: vasteena stimulaatiolle Mesothelin mutta ei HPV-E7-peptidiä käytettiin kontrollina (tuloksia ei ole esitetty). Olemme edelleen selvitettävä, pernasolujen oli sytolyyttinen aktiivisuus. Pernasoluja hiiristä, jotka oli käsitelty anti-PD-1 /CD137-mAb: t stimuloitiin uudelleen UV-säteilytettyjen ID8 soluja 4 päivää ennen CTL-määritykset suoritettiin käyttämällä EL4-soluja pulssitettiin HPV-E7 tai Mesothelin peptidin kohdesoluina. Kuten on esitetty kuviossa 4A, splenosyytit anti-PD-1 /CD137 käsitellyissä hiirissä näytetään sytotoksinen EL4 solujen pulssitettiin Mesothelin mutta ei HPV-E7-peptidiä. Pre-inkubointi CD8-vasta tukahdutti tappaminen aktiivisuutta (kuvio 4B). Voimme päätellä, että yhdistetyn anti-PD-1 /CD137-mAb: iden aikaansaama tuumorin antigeeni-spesifisen CTL-vasteen välittämä CD8-soluja.

Hiiret (3 /ryhmä) siirrettyjen i.p. 3 × 10

6 ID8 solua 10 päivää aikaisemmin ruiskutettiin i.p. kahdesti 4 päivän välein 0,5 mg anti-PD-1 /CD137 mAb. Seitsemän päivää toisen mAb injektio, yhdistettiin pernasoluja (5 x 10

6) 3 hiirtä inkuboitiin 5 x 10

5 UV-säteilytettyjen ID8 solujen 4 päivää. Saatu pernasoluja arvioitiin sitten antigeenispesifisten CTL-aktiivisuuden CytoTox 96 Ei-radioaktiivinen sytotoksisuusmääritys käyttäen EL4-soluja pulssitettiin H-2Db-rajoitettua Mesothelin tai HPV-E7-peptidiä kohdesoluina (A). Tappaminen aktiivisuus arvioitiin myös, kun läsnä on anti-CD4, anti-CD8 tai kontrollivasta-ainetta (B). Data ilmaistiin M ± SEM kolmen kuopan.

Paikallinen Th1-tyypin immuunivasteen, edistää anti-CD137 /PD-1-mAb:

analysoida muutoksen paikallisen immuunijärjestelmän solujen, hiirillä, joilla on 10-päivän vakiintunut ID8 kasvaimen käsiteltiin joko yhden tai yhdistettynä anti-PD-1 /CD137-mAb: t, ja niiden vatsakalvon pesuja kerättiin 7 päivää sen jälkeen, kun viimeinen mAb injektion. Vahvistaminen meidän aiempia havaintoja [27], hoito anti-PD-1 /CD137-mAb: t indusoi huomattavasti soluttautuminen CD3

+ (p 0,01) ja CD8

+ (p 0,01) soluja vähenemisestä sekä tunkeutumisen CD19

+ (p 0,001), solut verrattuna joko ohjattu tai yhden mAb hoitoa (kuvio 5A). Edelleen analyysi CD44 ja CD62L ilme osoitti, että suurin osa CD4

+ ja CD8

+ T-solut anti-PD-1 /CD137-mAb: t hoidettujen hiirten oli CD44

+ CD62L

– efektori /muisti-T solut ja niiden osuudet olivat paljon suuremmat (p 0,01) kuin valvonnan tai yhden mAb käsiteltyihin hiiriin (kuvio 5B); edustava pistekuvaajat on esitetty kuvassa S1. Meillä on myös vahvistettu alentuneet Tregs ja MDSCs, kuten aiemmin on raportoitu (tietoja ei ole esitetty, viite 27).

Hiiret (3 /ryhmä) siirrettyjen i.p. 3 × 10

6 ID8 solua 10 päivää aikaisemmin ruiskutettiin i.p. kahdesti 4 päivän välein 0,5 mg ohjaus, anti-CD137, anti-PD-1 tai anti-PD-1 /CD137 mAb. Kaksi viikkoa myöhemmin, vatsakalvon huuhtelu hoidettujen hiirten analysoitiin virtaussytometrialla prosenttiosuuden ja fenotyypin vatsakalvon lymfosyyttejä. Prosenttiosuudet CD3

+, CD4

+, CD8

+ ja CD19

+ lymfosyyttien vatsakalvon huuhtelu ja CD44

+ CD62L

– efektori /muisti solujen CD4

+ ja CD8

+ T-solujen on esitetty (A) ja (B), vastaavasti. Prosenttiosuus PD-1

+ TIM-3

+ ja PD-1

TIM-3

+ solujen vatsakalvon CD4

+ ja CD8

+ T-solut näkyvät in (C) edustavien pistekuvaajat kuvassa S2. Tulokset esitetään M ± SEM 3 hiirtä kustakin ryhmästä ja ne edustavat 2 toisistaan ​​riippumatonta koetta. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, PD-1 tai CD137 mAb verrattuna ohjaus mAb, PD-1 /CD137 mAb verrattuna ohjaus ja yhden mAb.

Yhden CD137 mAb käsitellyillä hiirillä esiintyi myös lisääntynyt soluttautuminen CD3

+ (p 0,05), CD8

+ (p 0,05) ja CD44

+ CD62L

– efektori /muisti CD8

+ T (p 0,05) soluja vatsaonteloon vaikka se oli tehoton pidentämiseksi kokonaiselinaikaa (kuvio 1 D). Tutkia mekanismeista epäonnistuminen kasvainten suojan aiheuttamien anti-CD137-mAbin, tutkimme ilmentymistä PD-1 ja immuuni säädin T-solujen immunoglobuliinin musiini (TIM-3) co-estävä molekyylejä T-solujen, joita on raportoitu olla tiiviisti mukana toiminnallinen sammumiseen T-solujen [36,37]. Kuten kuviossa 5C, anti-CD137 mAb sääteli ilmentymistä PD-1 ja TIM-3 peritoneaalidialyysia CD4

+ ja CD8

+ T-solujen ja yhden anti-PD-1 mAb oli vähän vaikutuksia TIM-3: n ekspressio, vaikka se lievensi ilmentymisen PD-1 CD8

+ T-solujen kontrolliin verrattuna mAb. Varsinkin samanaikainen PD-1 saarto merkittävästi esti säätely ylöspäin PD-1 ja TIM-3 T-soluissa aiheuttamien CD137 aktivointi; edustava pistekuvaajat esitetään (kuva S2). Yhdenmukainen säätelyä PD-1 ja TIM-3, vatsakalvon T-solut eristettiin anti-CD137-mAb: llä käsitellyissä hiirissä tuotettu alhaisempi IL-2: n ja IFN-γ (kuvio S3).

Pitkäkestoinen antituumorivaikutus aiheuttama yhteenlaskettu anti-CD137 /PD-1-mAb: t ja sisplatiinia

Ennen tutkimuksissa on havaittu, että anti-CD137 mAb synergizes sisplatiinin, yleisesti käytetty kemoterapeuttisen lääkkeen munasarjasyövän syöpä, aiheuttaa regressiota hiiren CT-26 paksunsuolen syövän 60% hiirissä [38]. Tutkia tehokkuuden anti-PD-1 /CD137-mAb: plus sisplatiinin ID8 munasarjasyövän mallissa, ensin kasvaimen kantavien hiirten kanssa i.p. injektion Sisplatiinin seurasi 2 annosta anti-PD-1 /CD137-mAb: t 4 päivän välein. Kuten on esitetty kuviossa 6A, yhdistetty anti-PD-1 /CD137 /sisplatiinihoitoon tuotti merkittävän antituumorivaikutus verrattuna yhden mAb, sekä mAb-molekyylien tai sisplatiinia yksin, jolloin pitkällä aikavälillä säilyttämään 80% (8 hiirtä 10 ) hiiriä; ei ollut eloonjääminen hyötyä sisplatiinia yksin tai yhdistettynä joko anti-PD-1 tai anti-CD137-mAb: t. Saimme samanlaisia ​​tuloksia toistuvalla kokeilu. Poistamalla CD8

+ T-solujen täysin kumosi antituumorivaikutuksen (kuvio 6B), mikä osoittaa keskeinen rooli näiden solujen kasvaimen suojaa. Pitkän aikavälin eloonjääneitä kehittänyt systeeminen immuunivaste muistilla ja kasvainspesifisyyden osoituksena niiden vastustuskyky altistusta ID8 soluissa, mutta ei haastaa kanssa antigeenisesti etuyhteydettömille TC1 soluja (kuvio 6C). Ohjaus, naiivi hiiret menehtyivät haastaa joko ID8 tai TC1 soluja, jotka olivat samanlaisia ​​kasvu (kuvio 6D).

Hiiret (10 /ryhmä) istuttaa i.p. 3 x 10

6 ID8 solua 10 päivää aikaisemmin ruiskutettiin i.p. jossa kaksi annosta ohjaus, anti-PD-1, anti-CD137 ja anti-PD-1 /CD137 mAb (0,5 mg per annos per hiiri) 4 päivän välein tai ilman annettiin yhdessä sisplatiinin (10 mg /kg) ensimmäisessä käsittely ja niiden selviytyminen arvioitiin (A). Hiiret (10 /ryhmä), käsiteltiin yhdistetyn anti-PD-1 /CD137 /sisplatiinin köyhdytettyä lymfosyyttien osajoukot injektoimalla anti-CD4 (0,2 mg /hiiri), anti-CD8 (0,2 mg /hiiri), anti-NK1. 1 (0,1 mg /hiiri) tai kontrolli-mAb (0,2 mg /hiiri) 48 ja 72 tuntia ennen ensimmäistä käsittelyä ja joka 3-4 päivä sen jälkeen keston kokeissa. Hoitamaton kasvain hiiret olivat negatiivisina kontrolleina (UNT ryhmä). Selviytymistä hiirten tallennettiin (B).