Krooninen sairaus

tiivistelmä

Korkea solunsisäisen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) soluissa on tunnustettu yhdeksi tärkeimmistä syistä syöpäsolun apoptoosin ja on kehittynyt lupaava terapeuttinen strategia syövän hoidossa. Kuitenkin myös apoptoosin liittyvät biofysikaalisten ominaisuuksien syöpäsolujen liittyy solunsisäisten ROS toimintoja on vielä epäselvä. Tässä ensimmäistä kertaa, määritimme muutokset biofysikaalisten ominaisuuksien liittyvän ROS-välitteisen ruokatorven syöpään KYSE-150 solujen apoptoosin avulla korkearesoluutioisia atomivoimamikroskooppi (AFM). Oridonin on osoittautunut aiheuttavan ROS-välitteisen KYSE-150 solujen apoptoosin annoksesta riippuvalla tavalla, joka voisi olla päinvastainen N-asetyylikysteiini (NAC) esikäsittelyä. Perustuen AFM kuvantaminen, morfologinen vahinko ja Mikroskooppitutkimus muutokset KYSE-150 soluja havaittiin tiiviisti ROS-välitteisen oridonin aiheuttama KYSE-150 solujen apoptoosin. Muutokset solujen jäykkyys määräytyy AFM voimamittausvahvistimen osoitettiin myös ROS riippuvia muutoksia oridonin aiheuttama KYSE-150 solujen apoptoosin. Meidän havainnot paitsi säädetty uusia oivalluksia syöpää ehkäisevistä vaikutuksista oridonin, mutta korostetaan myös käyttöä AFM laadullinen ja määrällinen nanotool havaitsemaan ROS-välitteisen syöpäsolujen apoptoosia perustuu solujen biofysikaalisten ominaisuuksien aikaan uusia tietoja roolien ROS syöpäsolu apoptoosin nanokokoluokassa.

Citation: Pi J, Cai H, Jin H, Yang F, Jiang J, Wu A, et al. (2015) Laadullinen ja määrällinen analyysi ROS-välitteisen Oridonin aiheuttama ruokatorvisyöpää KYSE-150 solukuoleman atomivoimamikroskopialla. PLoS ONE 10 (10): e0140935. doi: 10,1371 /journal.pone.0140935

Editor: Etienne Dague, LAAS-CNRS, FRANCE

vastaanotettu: toukokuu 25, 2015; Hyväksytty: 30 syyskuu 2015; Julkaistu: 23 lokakuu 2015

Copyright: © 2015 Pi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Macaon Technology Development Fund (nro 028/2014 /A1), https://www.fdct.gov. mo /.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) soluissa, kuten vetyperoksidi, superoksidi anionit ja hydroksyyli radikaalit, toimivat toisena sanansaattajia säätelyyn monia tärkeitä solun tapahtumia, kuten transkriptiotekijän aktivaation, geenien ilmentyminen ja solujen proliferaatiota, erilaistumista ja vanhenemista [1]. ROS on myös liitetty aineenvaihdunnan uudelleenohjelmointi syöpäsolujen tärkeässä osassa kasvaimen aloittamista etenemisen ja etäpesäkkeiden [2]. Ja perustuu eri redox tilan normaalien ja syöpäsolujen, lupaava terapeuttinen strategia perustuu lääkkeet, jotka lisäävät ROS sukupolvi ja apoptoosin syöpäsoluissa tulee ulos syöpähoitoa varten [3]. Korkea ROS voi suoraan aiheuttaa hapettumista lipidien, proteiinien ja nukleiinihappojen, siis tappaa syöpäsoluja häiritsemällä aineenvaihduntaa ja signaalitransduktion. Lisääntynyt ROS tuotanto on aina mukana syövänvastainen mekanismi mahdollisia syöpälääkkeitä, ja myös mukana joissakin kliinisissä käytettyjen syöpälääkkeet, kuten paklitakseli, 5-fluorourasiili ja doksorubisiini [4-6].

Rabdosia rubescens, joka on eräänlainen kasviperäisten lääkeaineiden, on perinteisesti käytetty Kiinassa hoitoon nielutulehdus ja ruokatorven syöpä. Oridonin, tärkein farmakologinen tehoaine rabdosia rubescens eri farmakologisia ja fysiologisia vaikutuksia, on kiinnittänyt nouseva huomiota syövän biologit koska sen merkittävää tuumorin vastaista toimintaa [7, 8]. On raportoitu, että oridonin voivat indusoida apoptoosia tai autophagy erilaisten syöpäsolujen, kuten multippelin myelooman solujen [9], paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja, [10], hepatooman karsinoomasolujen [11], eturauhasen syöpäsolujen [12], kohdunkaulan karsinooma soluihin [13] and.oesophageal syöpäsoluja [14]. Ja hyvin kiinnostavaa, altistus näiden syöpäsolujen oridonin johtaa merkittävään kasvuun ROS: n syntyminen ja ROS scavenger, kuten N-asetyylikysteiini (NAC), täysin suojaa näitä syöpäsoluja oridonin solukuolema [9-13]. Siksi oridonin voitaisiin toiminut ihanteellinen syöpälääke tutkimiseen ROS-välitteisen apoptoosin syöpäsoluissa.

jäsenenä tunnelointimikroskooppi (STM) tekniikat, atomivoimamikroskooppi (AFM) on erittäin hyödyllinen topografian kuvantaminen, mekaaninen määritys ja yksi molekyyli voima tutkimus vedoten havaitsemiseen ulokkeen taipuma aiheuttama väliset voimat AFM kärjen ja näytteen. Perustuen nämä edut, AFM on tullut yksi tehokkaimmista nanoteknologian varten

in situ

yksittäinen molekyyli kuvantaminen solujen, erityisesti solukalvon llä [15]. Äskettäin AFM on otettu käyttöön tutkimuksen syöpäsolun kuoleman aiheuttama lääkehoito, joka ei ainoastaan ​​tarjoaa korkean resoluution morfologinen tieto, mutta korostetaan myös biomekaaniset muutokset solukuoleman aikana [16-18]. Nämä työt osoittavat, että AFM on erittäin hyödyllinen tutkittaessa syöpää ehkäisevistä vaikutuksista huumeiden perustuu solujen biofysikaalisten ominaisuuksien. Aiemmat AFM tutkimukset ovat osoittaneet, että syöpäsolujen apoptoosi liittyy läheisesti solunsisäinen ROS taso [19-21]. Mutta vieläkään ei ole järjestelmällistä AFM tutkimusta tai analyysia muutoksista biofyysisiä ominaisuuksien ROS-välitteisen syövän apoptoosin.

Tässä tutkimuksessa käyttämällä korkean resoluution AFM, me selvitetty systemaattisesti biofyysisten ominaisuuksien ihmisen ruokatorvisyöpää KYSE -150 soluja, jotka havaittiin olevan läheistä sukua ROS-välitteisen apoptoosin indusoiman oridonin. Oridonin havaittiin uudiskasvun estämiseksi, häiritä mitokondrion kalvon potentiaalia ja indusoida KYSE-150-solujen läpi tuotanto ROS KYSE-150-soluja. Kaikki nämä vaikutukset oridonin on KYSE-150 soluja voitaisiin kumota ROS-raadonsyöjä NAC, joka osoittaa ROS välittämää syöpää ehkäisevistä vaikutuksista oridonin on KYSE-150 soluja. Sitten, korkearesoluutioisia AFM sovellettiin analysoitaessa syöpää ehkäisevistä vaikutuksista on oridonin on KYSE-150 soluja perustuu biofysikaalisten ominaisuuksien soluja. Ja erityisesti, olemme huomanneet, että, ensimmäistä kertaa, AFM havaittu morfologisia vaurioita, kalvo Mikroskooppitutkimus muutokset ja biomekaaniset muutokset apoptoottisten KYSE-150-solut indusoitiin oridonin myös läheisesti solunsisäisen ROS tason KYSE-150-soluissa, mikä osoittaa, käyttö AFM on voimakas nanotool tutkimiseen ROS-välitteisen syöpäsolun apoptoosin.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Oridonin (≥98%, HPLC) saadaan Mingwang biotechology (Kiina). Vasikan sikiön seerumia (FCS), penisilliiniä /streptomysiiniä, Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), ja trypsiini kit saadaan Gibco (USA). Paraformaldehydiä Sigma (USA). 3- (4, 5) -dimethylthiazo (z-y1) -3,5-diphenyt- etrazoliumromide (MTT), N-asetyyli-L-kysteiini (NAC), anneksiini V-FITC /PI (anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti /propidiumjodidia) apoptoosin detektioreagenssipakkaus, DCFH-DA (2 ’, 7’-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti) reaktiivisen hapen assay kit, Rhodamin 123, aktiini-tracker green (phalloidin- fluoreseiini-isotiosyanaatti), 2- (4-amidiinofenyyli) -6 -indolecarbamidine dihydrokloridi (DAPI) ja solukierron analyysiin sarjat (propidiumjodidia) ostetaan Beyotime Biotekniikan instituutti, Kiina.

Soluviljely

Ihmisen ruokatorven syöpään KYSE-150 solulinja ostetaan kasvainsolun kirjasto Kiinan Academy of Medical Sciences (Peking, Kiina), jotka ovat viljeltiin DMEM täydennetty 10% FBS, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 g /ml streptomysiiniä kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2 37 ° C: ssa.

solujen elinkelpoisuus mittaus

MTT-määritystä käytettiin testaamaan solujen elinkelpoisuuden KYSE-150-solut altistettiin oridonin. Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille, joiden tiheys on 5 x 10

3 solua /kuoppa 24 h ja niitä inkuboitiin eri konsentraation oridonin 24 tuntia. Sitomiseksi ROS tuottama oridonin solut esikäsiteltiin 2,5 mM NAC: ssa 1 tunti ja käsiteltiin sitten oridonin 24 tuntia. Jälkeen oridonin hoito, MTT-reagenssia (10 ui, 5 mg /ml) lisättiin sitten kuhunkin kaivoon 4 h inkuboinnin jälkeen väliaine poistettiin ja solut suspendoitiin 150 ul DMSO inkuboitua 10 min. Spektrofotometri (TECAN, Switzer-maa) käytettiin testaamaan absorbanssi 490 nm: ssä.

Solunsisäinen ROS pitoisuuksien määrittämiseen

solunsisäinen ROS taso KYSE-150-soluissa määritettiin DCFH-DA pohjainen reaktiivisia happiradikaaleja määritys kit. Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, joiden tiheys 1 x 10

5 solua /kuoppa 24 h ja niitä inkuboitiin eri konsentraation oridonin 3 tuntia. Sitomiseksi ROS tuottama oridonin solut esikäsiteltiin 2,5 mM NAC: ssa 1 tunti ja käsiteltiin sitten oridonin 3 tuntia. Jälkeen oridonin hoito, solut kerättiin talteen, pestiin kolmen PBS: llä ja inkuboitiin DCFH-DA-liuosta 30 minuutin ajan pimeässä 37 ° C: ssa. Virtaussytometria (BD, USA) käytettiin havaitsemaan solunsisäinen ROS tason jälkeen solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa PBS: llä.

Cell apoptoosin havaitsemiseen

anneksiini V-FITC /PI apoptoosin havaitsemiseen kit havaitsemiseen käytettiin apoptoosin oridonin käsiteltiin KYSE-150-solut mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, joiden tiheys 1 x 10

5 solua /kuoppa 24 h ja niitä inkuboitiin eri konsentraation oridonin 24 tuntia. Sitomiseksi ROS tuottama oridonin solut esikäsiteltiin 2,5 mM NAC: ssa 1 tunti ja käsiteltiin sitten oridonin 24 tuntia. Sen jälkeen kun on inkuboitu oridonin, KYSE-150-solut otettiin talteen, pestiin kolmen PBS: llä, suspendoitiin anneksiini V: n sitoutumisen puskuriin, ja inkuboitiin FITC-leimatun anneksiini V: n ja PI 5 min ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Sitten näytteet analysoitiin välittömästi Virtaussytometriaa (BD, USA).

Mitokondrioiden kalvojännite analyysi

Rhodamine 123-pohjainen virtaussytometrialla käytettiin määrittämään muutokset mitokondrion kalvon potentiaali (MMP ) of KYSE-150-solujen upon oridonin hoitoa. Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, joiden tiheys 1 x 10

5 solua /kuoppa 24 h ja niitä inkuboitiin eri konsentraation oridonin 24 tuntia. Sitomiseksi ROS tuottama oridonin solut esikäsiteltiin 2,5 mM NAC: ssa 1 tunti ja käsiteltiin sitten oridonin 24 tuntia. Korjatut ja pestiin KYSE-150-soluja inkuboitiin rodamiini 123 60 minuutin ajan pimeässä 37 ° C: ssa. Virtaussytometria (BD, USA) käytettiin havaitsemaan fluoresenssisignaali rodamiini 123 jälkeen solut kerättiin ja pestiin kaksi kertaa PBS: llä.

AFM näytteen valmistus

AFM mittauksia, KYSE-150 solut kerättiin 0,25% trypsiiniä ja viljeltiin tiheydellä 5 x 10

4 solua /kuoppa lasipeitinlevyille on kuusi kuoppalevylle. Yön yli inkuboinnin jälkeen, oridonin lisättiin elatusaineeseen 24 tuntia stimulaation. Sitomiseksi ROS tuottama oridonin solut esikäsiteltiin 2,5 mM NAC: ssa 1 tunti ja käsiteltiin sitten oridonin 24 tuntia. Sen jälkeen solut pestiin kolminkertainen PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä liuoksessa 10 minuutin ajan, pestään kolminkertainen tislatulla vedellä ja kuivataan ilmassa morfologian kuvantaminen ilmassa tai heti käytettävä voiman mittauksia PBS-liuosta. Elävien solujen jäykkyyden mittaukset, KYSE-150-soluja käsiteltiin tai ilman oridonin ja NAC 24 tuntia, ja sitten pestiin PBS-puskurissa hävitä solut suspendoidaan väliaineessa. Sitten soluja käytettiin Youngin mittaukset DMEM AFM.

AFM morfologia kuvantaminen ja kalvo ultrastruktuuri analyysi

AFM käytettiin tutkimaan topografiset ja Mikroskooppitutkimus (Bruker, saksa) muutokset KYSE-150-solujen aiheuttama oridonin hoitoon. Orgaanisista aineista on piinitridin vinkkejä käyttää kaikissa mittauksissa poistettiin ultraviolettisäteilyllä. Jousi vakioita AFM vihjeitä kalibroitiin käyttäen terminen kohina menetelmä toteutetaan Nanoscope ohjelmiston AFM. Ensinnäkin kalibrointi Poikkeutusherkkyys toteutettiin suojalasi luistaa pieni pystysuuntainen taipuma (~ 0 V) ​​ilmassa. Sitten lämpö virittää käyrä sovitettiin yksinkertaisella harmonisen oskillaattorin sopiva laskea jousivakio. Kaarevuus säde AFM vihjeitä (BudgetSensors, Bulgaria) käytettiin morfologian kuvantaminen oli 10 nm, ja jousivakio vihjeitä oli 0,51 ± 0,02 N /m painuu herkkyys 52.94 ± 0,96 nm /V. Morfologiset ja Mikroskooppitutkimus kuvia KYSE-150-solut saatiin ilmassa huoneenlämpötilassa kosketuksissa tilassa. Äärirakenteessa KYSE-150-solut saatiin lähialueiden ytimet ja topografiset kuvankäsittelyn ja data-analyysi suoritettiin käyttäen laitetta varustettu Nanoscope Analyysiohjelmisto. Ja tehdä Mittakaavapalkki, X-akseli etiketit ja Y-akselin tarrat AFM kuvien luettavampi, me uudelleen writed laajuuden baarissa ja etiketit X ja Y-akselin näissä kuvissa. Sillä ultrarakenteen parametri analyysi, 30 eri 2 x 2 um

2 ultrastruktuuri kuvia 15 eri KYSE-150 solua kussakin ryhmässä laskettiin. Ennen ultrastruktuuri parametri analyysi, AFM kuvia tuhosivat ensimmäisen Litistä järjestys Nanoscope Analysis ohjelmisto. Sen jälkeen koko ultrarakenteen kuva laskettiin korkeus jakelua ja karheus mukaan Nanoscope analyysin ohjelmisto.

AFM jäykkyys analyysi

biomekaaninen ominaisuudet elävien KYSE-150 solua mitattiin DMEM paljaat vihjeitä Force Volume tilassa kautta AFM (Bruker, saksa). Jousivakio piinitridin koettimia käytetään elävien solujen mittauksia (Bruker, saksa) kalibroitiin lämpö-kohina menetelmä puhtaassa kulttuuri astiassa PBS, joka oli 0,08 ± 0,01 N /m painuu herkkyys 16,23 ± 0,71 nm /V. Voimassa Volume tilassa kärki oli vuorotellen lähestyi solun pinnan ja sitten vedetään pois 16 x 16 pistettä yli 1 × 1 um

2 alue näytteen pinnalle, kun voima käyrät synkronoidusti kirjattiin. Elävien solujen meaurements, yli 15 eri paikkoihin 15 eri soluja kirjattiin Keski-alueella solujen kussakin ryhmässä. Kimmokerroin laskettiin voima käyrät perusominaisuudet Sneddon malli, joka on kuvattu käyttäytymistä tunnetun geometrian painauman kosketuksessa elastisen puoliavaruus paljon vähemmän jäykkä kuin booli esitetyn yhtälön (1) [22] 🙁 1 ) B

Jos υ, F, δ, E, ja α on Poisson-suhde, lastaus voima, sisennys, kimmomoduuli, ja toinen puoli avautumiskulma kartiomainen kärki, vastaavasti. Vuonna Sneddonin mallissa kohdistaman kuormituksen lävistin liittyy aiheutti sisennys syvyys, joka esittää suhdetta käytetyn voiman F ja syvennys δ tapauksessa kartiomaisen painauman. Poisson suhde 0,5 on sopiva soluja ja käytettiin täten seuraavassa analyysissa [23, 24].

Tilastot

Kaikki tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen ja esitettyjen tietojen ilmaistaan keskiarvo ± keskihajonta. tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä, paitsi että Youngin moduuli on suoritettu käyttäen Kruskal-Waillis testi, ja p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset ja keskustelu

Oridonin estävät KYSE-150 solujen elinkelpoisuuden ROS-välitteisen reitin

Oridonin on todettu olevan laajakirjoinen syöpää torjuvaa vastaisen toiminnan eri syöpäsolulinjoja [9-13, 25]. Anti-leviämisen vaikutuksia oridonin ihmisen ruokatorven syövän KYSE-150-soluja tutkittiin MTT-määrityksellä, joka osoitti voimakasta lisääntymistä inhibition vaikutukset 24 h oridonin hoidon KYSE-150-soluja, kuten on esitetty kuviossa 1A. Elinkelpoisuutta KYSE-150 solut laski 100,0 ± 6,3%: sta 90,6 ± 7,8%, 73,2 ± 11,9%, 54,8 ± 16,3%, 32,0 ± 15,3% ja 16,2 ± 5,6% 10 uM, 20 uM, 30 uM, 40 uM ja 50 uM oridonin hoitoa, vastaavasti (kuvio 1A). Edellisen teokset keskityttiin syövän vastaisen aktiivisuuden oridonin hiljaista että esto vaikutukset oridonin olivat aina mukana solunsisäisen ROS tason syöpäsoluissa [9-13]. Olemme myös päättäneet ROS tasolla KYSE-150 soluja, jotka osoittivat, että oridonin hoito voisi merkittävästi indusoida ylituotanto ROS annoksesta riippuvaisella tavalla ja ylituotantoon ROS aiheuttama oridonin voitaisiin eliminoida esikäsittelyssä solujen kanssa ROS scavenger NAC (kuvio 1 B). Suhteellinen solunsisäinen ROS tasolla KYSE-150 soluja kasvoi 100,0 ± 23,4% valvonnan solujen 125,5 ± 6,9%, 142,1 ± 18,2% ja 186,6 ± 15,8% 10 uM, 30 uM ja 50 uM oridonin käsiteltyjä soluja, tässä järjestyksessä (kuvio 1C). Kun esikäsittely 2,5 mM NAC 1 h, solunsisäinen ROS tasolla KYSE-150-solujen upon 50pM oridonin hoito laski 114,9 ± 14,8% ja esikäsittely NAC yksinään ei osoittanut merkittäviä vaikutuksia ROS tasolla KYSE-150-solut joiden keskimääräinen ROS tasoa 105,6 ± 2,8% (kuvio 1 C). Nämä tulokset ymmärtää, että oridonin voivat aiheuttaa yli-tuotanto ROS KYSE-150-soluja, jotka voidaan poistaa NAC esikäsittelyä.

(A) vaikutukset oridonin elinkelpoisuudesta KYSE-150-soluja. (B) DCFH-DA määritys vaikutusten NAC on oridonin indusoidun ROS tuotanto KYSE-150-soluja. (C) tilastollinen analyysi vaikutuksista NAC on oridonin aiheuttamaa ROS tuotanto KYSE-150 soluja. (D) Effects of ROS scavenger-NAC on oridonin esti elinkelpoisuudesta KYSE-150-solut, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

Määritä roolit ROS että syövän vastaisen aktiivisuuden oridonin, myös havaita vaikutuksia NAC on oridonin esti KYSE-150 solujen lisääntymistä. Kuten kuviossa 1D, elinkelpoisuutta KYSE-150-soluissa oli 14,6 ± 2,5%, kun 50 uM oridonin hoito, joka oli päinvastainen olevan 97,8 ± 1,9%: iin 1 h esikäsittelyn 2,5 mM NAC. Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen esto vaikutukset oridonin on KYSE-150 soluproliferaation ROS-välitteisen reitin.

Oridonin aiheuttama ROS-välitteisen KYSE-150-solujen apoptoosin

induktio syöpäsolujen apoptoosin on laajalti tutkittu viime vuosikymmeninä, joten se on yksi yleisimmistä ja tärkeitä indikaattoreita, jotka on havaittu kehittämiseen syöpälääkkeiden. Selventää edelleen syövän vastaisen aktiivisuuden oridonin ihmisen ruokatorven syövän solujen apoptoosin KYSE-150-soluissa määritettiin anneksiini V-FITC /PI-määrityksellä. Kuten kuviossa 2A, oridonin voivat aiheuttaa apoptoosin KYSE-150-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla, ja esikäsittely NAC voi estää oridonin indusoimaa KYSE-150 solujen apoptoosin. Apoptoosin määrä KYSE-150-solujen määrä nousi 7,3 ± 1,5% säätökennoja 10,5 ± 1,9%, 24,8 ± 1,5% ja 52,4 ± 3,1% 10 uM, 30 uM ja 50 uM oridonin hoitoa, vastaavasti (kuvio 2B). Ja esikäsittely NAC, apoptoosin määriä KYSE-150-solut olivat 13,0 ± 1,3% ja 6,7 ​​± 1,6% ja ilman 50pM oridonin hoitoa, vastaavasti (kuvio 2B). Oridonin indusoi apoptoosia KYSE-150-soluissa oli enimmäkseen kaikki päinvastaiseksi NAC hoitoa, joka osoitti, että oridonin indusoi KYSE-150 solujen apoptoosin liittyy läheisesti ylituotantoa ROS aiheuttama oridonin.

(A) anneksiini V /PI-määritys vaikutuksia NAC on oridonin indusoi KYSE-150 solujen apoptoosin. (B) tilastollinen analyysi vaikutuksista NAC on oridonin aiheuttama KYSE-150-solujen apoptoosin, *** p 0,001.

Voit selvittää toimintahäiriön mitokondrioiden oli myös mukana oridonin aiheuttama KYSE- 150-solujen apoptoosin, tutkimme mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) vastauksena oridonin altistusta virtaussytometrialla käyttäen rodamiini 123 kuin fluoresenssi anturi. Tulokset osoittivat, että oridonin voivat aiheuttaa MMP häiriöitä KYSE-150-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla, ja NAC voi myös kääntää tämän vaikutuksen (kuvio 3A). Tilastollinen analyysi osoitti, että suhteellinen fluoresenssi signaali rodamiini 123 väheni 100,0 ± 1,6% kontrollisolujen 98,1 ± 4,7%, 93,4 ± 1,5% ja 77,0 ± 8,2% 10 uM, 30 uM ja 50 uM oridonin hoitoa, vastaavasti ( kuvio 3B). Esikäsittely NAC ei ollut merkittäviä vaikutuksia MMP of KYSE-150 soluja, jotka osoittivat suhteellinen arvo 99,96 ± 1,82% (kuvio 3B). Ja suhteellinen fluoresenssi signaali rodamiini 123 lisääntyi 97,7 ± 4,4%: n esikäsittely NAC ja käsittely 50 uM oridonin, mikä osoittaa, että oridonin voisi myös aiheuttaa MPP häiriöitä KYSE-150 solujen ROS-välitteisen tavalla. Lisäksi analyysi solusyklin jakelun myös osoittanut, että oridonin voisi myös aiheuttaa solusyklin pidätyksen KYSE-150 solujen G2 /M vaiheessa (kuvio A S1 File). Vaikka hinnat solujen G2 /M vaiheessa olleet ROS tasolla riippuvainen, mutta esikäsittely NAC voi myös kääntää oridonin indusoi solukierron pysähtymisen (kuvio A S1 File).

(A) rodamiini 123 määritystä vaikutukset NAC on oridonin aiheuttamaa mitokondrioiden kalvon potentiaalia KYSE-150 soluja. (B) tilastollinen analyysi vaikutuksista NAC on oridonin aiheuttamaa Mitokondrioiden kalvon potentiaalia KYSE-150-solut, ** p 0,01.

hoito oridonin lisäsi merkitsevästi ROS tasolla KYSE -150 soluja, ja yli-tuotettua ROS edelleen indusoi häiriöitä MMP, pidättämisestä solusyklin ja apoptoosin KYSE-150 soluja. Kun esikäsittely NAC, joka ei ollut merkittäviä vaikutuksia fysiologinen tila KYSE-150 soluissa, mutta voi poistaa ylituotantoa ROS, oridonin aiheuttama MMP häiriöitä, solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin KYSE-150 solut dramaattisesti päinvastainen. Nämä tulokset viittasivat vahvasti siihen, että syövän vastaisen toiminnan oridonin in KYSE-150-solut olivat pääasiassa välittämä solunsisäisen ROS taso KYSE-150-solujen aiheuttama oridonin.

ROS-riippuvainen morfologisia vahinkoja KYSE-150-solujen

viime vuosina AFM on tullut tehokas työkalu nanomittakaavan morfologian kuvantaminen ja pico-newtonin herkkyys voimamittausvahvistimen solujen eri fysiologinen tila [26-29]. Supertarkkuuszoomausasetuksesta ja korkea voima herkkyys AFM osoittavat myös erittäin laaja sovelluksia havaitsemiseksi syöpäsolun apoptoosin kun lääkehoitoa, joka tarjoaa joitakin uusia tietoja solujen morfologia, solu- biomekaniikan ja kalvo reseptoritoimintojen [16, 18, 28]. Sellaisten solujen morfologian liittyy läheisesti solujen fysiologinen tila ja toimintoja. -Solujen apoptoosin liittyy aina paljon tyypillisiä morfologisia muutoksia, kuten tiivistymistä ytimen, kupliminen kalvon ja kutistumisen solun kehosta.

ratkaisemiseksi tarkka morfologiset muutokset KYSE-150-solujen indusoima oridonin hoidon ja roolit ROS oridonin indusoi morfologiset muutokset KYSE-150-solut, korkearesoluutioisia AFM operoitiin tutkimiseen KYSE-150 soluja. Kuten on esitetty kuviossa 4A, hallita KYSE-150-solut osoittivat tyypillisiä soikea muoto ja solut tiiviisti kosketukseen muihin soluihin. Sen jälkeen käsiteltiin 10 uM oridonin 24 tuntia, ei ollut mitään merkittäviä muutoksia morfologiassa KYSE-150-soluissa (kuvio 4B). 24 tunnin kuluttua hoidon 30pM oridonin, KYSE-150-solut osoittivat tyypillisiä morfologisia ominaisuuksia apoptoosin, mukaan lukien kutistunut solun elinten ja lyhennettyä sytoplasmassa (kuvio 4C). Ja 50 uM oridonin käsitelty KYSE-150 soluja, enemmän tyypillisiä morfologisia ominaisuuksia apoptoosin voitiin havaita, kuten kutistuvuus solun elinten soluliman tiivistyminen, tiivistyminen ja pirstoutuminen tuma, syntyminen apoptoottisten elin (jota kuvaavat vihreät nuolet) ja vahingoittuneen pseudopodium rakenteet solun yhteyksien (kuvio 4D). Osoittaa roolia solunsisäinen ROS tasolla oridonin indusoi morfologiset muutokset KYSE-150-solujen morfologia KYSE-150-solujen esikäsittely 2,5 mM NAC: ssa 1 tunti ja 50 uM oridonin 24 tuntia tutkittiin myös AFM. AFM kuvat (kuvio 4E) merkitsi, että KYSE-150 solua ei ollut merkittävää morfologisia muutoksia upon 50pM oridonin hoidon esikäsittelyn ansiosta 2,5 mM NAC. Ja esikäsittely NAC ei myöskään ollut merkittävää vaikutusta morfologiasta KYSE-150-soluissa (kuvio 4F). Lisäksi olemme myös havainneet, että ohjaus KYSE-150 solut aina osoitti selkeän nucleus alueet (merkitty sinisillä nuolilla kuvassa 4), joka myös katosi oridonin hoidon ja korjaantuu esikäsittely NAC. Nämä korkean resoluution AFM kuvia ehdotti, että oridonin voivat aiheuttaa morfologisia vahingot KYSE-150 soluja ja nämä morfologisia vahingot voitaisiin myös käänteinen NAC esikäsittely, mikä osoittaa, että AFM voidaan käyttää laadullista nanotool määrittämään ROS välittämiä solun morfologisia muutoksia syöpäsolujen apoptoosin. Kuitenkin tämä morfologinen kuvantaminen perustuva menetelmä AFM rajoittuu laadullisen analyysin ROS-välitteisen syöpäsolujen apoptoosin, ja ei sovi kvantitatiivista analyysiä.

AFM morfologia kuvantaminen (A) kontrolli, (B) 10gM oridonin käsitelty, (C) 30 uM oridonin käsitelty, (D) 50 uM oridonin käsitelty, (E) 2,5 mM NAC + 50 uM oridonin käsitelty ja (F) 2,5 mM NAC käsiteltiin KYSE-150 soluja. (A1-F1) Topografia kuvia ja (A2-F2) niiden vastaava 3D-kuvia KYSE-150-solut; (A3-F3) laajentuneessa topografia kuvat (A1-F1) ja (A4-F4) niiden vastaava 3D-kuvia KYSE-150-solut, asteikko bar: 20 pm.

ROS-riippuvainen kalvo Mikroskooppitutkimus muutokset KYSE-150-solujen

Solukalvojen ultrastruktuuri on myös laajalti käytetty arvioimaan apoptoosin syöpäsolujen AFM koska muutokset kalvon komponentteja, kuten lipidilautan, kalvoproteiinit ja fosfolipidiä, olivat myös liittyy solujen apoptoosin [16, 18, 28, 30, 31]. Kun suuri kuvantamispalvelut AFM, jotkut kuvaavia parametreja omaisuutta solukalvon voitiin uuttaa AFM ultrarakenteen kuvat selventää muutokset solukalvon apoptoosin aikana. Vaikutukset oridonin kalvolla hienorakenteet KYSE-150-solut määritettiin myös AFM-analyysi tutkia yksityiskohtaisempi morfologiset muutokset oridonin indusoidun KYSE-150 solujen apoptoosin. Laajentuneet kuvantaminen solukalvon tuman ympärillä alueet, kalvo Mikroskooppitutkimus parametrit voidaan uuttaa kvantitatiiviseen analyysiin oridonin aiheuttama KYSE-150 solujen apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa 5, muutokset kalvo rakenne oli vaikea selventää, että suora havainnointi kalvon hienorakenteet kuvia KYSE-150-soluja. Kuten kuviossa 5A4-5F4, korkeus jakelun solukalvon ja karheus solukalvon (mukaan lukien Rq ja Ra) kasvoi sen jälkeen, kun oridonin hoidon, jotka sitten päinvastainen esikäsittely NAC.

AFM morfologia ja kalvo hienorakenteet kuvantaminen (A) ohjaus, (B) 10 uM oridonin käsitelty, (C) 30 uM oridonin käsitelty, (D) 50 uM oridonin käsitelty, (E) 2,5 mM NAC + 50 uM oridonin käsiteltiin ja (F) 2,5 mM NAC käsitelty KYSE-150 soluja. (A1-F1) Topogrphy kuvia KYSE-150-solut, asteikko bar: 20 pm; (A2-F2) laajentuneessa kalvo ultrastruktuuri kuvia (A1-F1) ja (A3-F3) niiden vastaava 3D-kuvia KYSE-150-solut, asteikko bar: 500 nm; (A4-F4) Korkeus jakelua ja karheus solun pinnan ultrastruktuuri analysoitu (A2-F2).

Laskemalla 30 eri paikkakunnalla 15 eri soluissa kussakin ryhmässä, keskimääräinen korkeus, Rq (root -mean-squared karheus) ja Ra (keskiarvo karheus) on esitetty kuvassa 6. keskipituus KYSE-150 solukalvon kasvoi 28,9 ± 9,9 nm valvontaa solujen 37,1 ± 14,5 nm, 52,7 ± 25,7 nm ja 73,7 ± 31,0 nm 10 uM, 30 uM ja 50 uM oridonin käsiteltiin KYSE-150-soluissa, vastaavasti (kuvio 6A). Dramaattinen kasvu kalvo partcle koko KYSE-150 soluissa, sen jälkeen 50 uM oridonin hoito voitaisiin myös eliminoida esikäsittely NAC, joka osoitti keskimääräinen korkeus 29,3 ± 9,0 nm (kuvio 6A). Ja keskimääräinen korkeus NAC käsitellyn KYSE-150-soluissa oli 29,0 ± 10,5 nm, joka osoitti merkittäviä vaikutuksia kalvon korkeus jakautuminen KYSE-150-soluissa (kuvio 6A). RQ-arvot KYSE-150 soluissa lisääntyi, 8,9 ± 2,8 nm valvontaa solujen 10,99 ± 0,69 11,0 ± 3,7 nm, 13,87 ± 1,02 13,9 ± 5,4 nm ja 22,6 ± 9,5 nm 10 uM, 30 uM ja 50 uM oridonin käsiteltiin KYSE-150-soluissa, vastaavasti (kuvio 6B). Ja jos solut esikäsiteltiin NAC, Rq arvot olivat 9,6 ± 2,7 nm ja 9,1 ± 2,7 nm ja ilman 50pM oridonin hoitoa, vastaavasti (kuvio 6B). Samoin Ra-arvo oli 7,1 ± 2,3 nm valvontaa soluja, ja nousi 8,6 ± 2,8 nm, 10,7 ± 4,1 nm ja 18,0 ± 7,7 nm jälkeen 10gM, 30 uM ja 50 uM oridonin hoitoa, vastaavasti (kuvio 6C). Merkittävä lisääntyminen Ra KYSE-150 soluissa, sen jälkeen 50 uM oridonin hoito voitaisiin myös päinvastainen esikäsittelyyn NAC osoittamaan Ra-arvo 7,5 ± 2,1 nm (kuvio 6C). Ja NAC esikäsitellyt KYSE-150-soluilla ilman oridonin hoitoa osoitti Ra-arvo on 7,2 ± 2,1 nm (kuvio 6C). Nämä tulokset osoittivat, että samanlainen solunsisäisen ROS tasolla, sekä kalvo korkeus jakelua ja kalvon karheus KYSE-150-solujen määrä nousi, kun oridonin hoidon annoksesta riippuvaisella tavalla, ja lisääntynyt kalvon korkeus jakelu- ja kalvon karheutta voidaan myös kumota NAC esikäsittelyä.

(A) korkeus jakelu, (B) root-mean-squared karheus (Rq) ja (C) keskimääräinen karheus (Ra) analysoitiin 2 x 2 um runko hienorakenteet kuvia KYSE-150-solut, n = 30, * p 0,05, *** p 0,001.

on hyvin tunnettua, että solukalvon ultrastruktuuri vaikuttavat useat ympäristö- ja subcellular valtion tekijät, kuten liikkuvuuteen, tarttuvuus, ja solunsisäinen kontakti, jolloin voitaisiin kehittää erittäin hyviä indikaattoreita terveyden tai epänormaalissa tilasta solujen [32]. Korkeus jakelu- ja karheus solukalvon määritetään AFM ovat kuvaavia parametreja rakennetta solukalvon. Kasvanut kalvon korkeutta jakelu voitaisiin katsoa johtuvan yhdistäminen kalvon biomolekyylien. Kuten raportoitu, reikä kaltaisia ​​rakenteita johtaisi karkeampi solujen pinnalla [18]. Ja yleensä lisää molekyylien sijaitsee solukalvojen, suurempi karheus solun pinnan olisi havaita AFM [33]. -Solujen apoptoosin liittyy altistumiseen sisemmän kalvon fosfolipidiä solun pinnalla, mikä tuottaa näin ollen integroitu muutoksia potentiaalihäviön ja nesteytys ulko pakkausselosteessa solukalvon [34]. Ja ROS-välitteisen apoptoosin, korkeat solunsisäiset ROS tasot ovat myös todettu vaikuttavan rakenteeseen tai kuvaamaan joitakin tärkeitä kalvon komponentteja kuten transmembraaninen kanavia, reseptoreita ja lipidilautan [35-37].