Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tutkimuksen tavoitteena

arvioimiseksi taajuudella MRE11 /RAD50 /NBS1 (MRN) sin, menetys proteiinin ilmentymisen kohdun limakalvon syöpiä (EY) ja onko menetys of MRE11 tekee syöpäsolujen herkkä Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) -inhibitory hoitoa.

Methods

MRN ilmentymistä tutkittiin 521 näytettä endometriumin karsinoomia ja 10 syöpäsolujen linjat. Oletettu mutaatio hotspot muodossa introni poly (T) alleeli MRE11 sekvensoitiin valikoiduissa tapauksissa (n = 26). Herkkyyttä PARP-estäjä, BMN673 testattiin pesäkkeenmuodostus määrityksissä ennen ja jälkeen MRE11 hiljentäminen avulla siRNA. Homologinen rekombinaatio (HR) DNA: n korjaukseen arvioitiin RAD51-pesäkkeitä muodostumisen määritys säteilytettäessä ja lääkehoitoa.

Tulokset

Menetys MRE11 proteiinin havaittiin 30,7%: EC kasvaimia ja merkittävästi liittyvät menetys RAD50, NBS1 ja yhteensopimattomuuden korjauksen proteiinin ilmentymiseen. Yksi kohdun limakalvon solulinja oli merkittävästi alentunut MRE11 ilmentymisen vuoksi homotsygoottinen poly (T) mutaatio MRE11 tekevät siten lisääntynyt herkkyys BMN673. MRE11 ehtyminen herkistää MRE11 ilmentävien EY solulinjojen hoidon BMN673. Lisääntynyt herkkyys PARP-inhibitio korreloi alentunut RAD51 pesäkkeitä iden muodostumiseen ionisoivan säteilyn MRE11-köyhdytettyä soluissa.

Johtopäätös

Menetys MRE11 proteiinin ennustaa herkkyyttä PARP-estäjä herkkyys in vitro, määrittelee sen ylimääräisen synteettinen tappava geeni PARP. Poikkeuksellisen korkea MRE11 menetys hankittua voidaan mahdollisesti hyväksi PARP estäjähoidossa. Lisäksi MRE11 proteiinin ilmentymisen käyttäen immunohistokemia voitaisiin tutkia, koska ennakoiva biomarkkeri PARP-inhibiittori hoidon.

Citation: Koppensteineria R, Samartzis EP, Noske A, von Teichman A, Dedes I, Gwerder M, et al. (2014) vaikutus MRE11 Hävikki PARP-estäjä Herkkyys endometriumsyöpään

In vitro

. PLoS ONE 9 (6): e100041. doi: 10,1371 /journal.pone.0100041

Editor: Sue Cotterill, St. Georges University of London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 10 marraskuu 2013; Hyväksytty: 21 toukokuu 2014; Julkaistu: 13 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Koppensteiner et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus osittain rahoittama Julius Müller Foundation ja Zurich Cancer League. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kohdun limakalvon syöpä (EY) on neljänneksi yleisin maligniteetti naisilla. Valtaosa hankittua diagnosoidaan varhaisessa vaiheessa ja niihin liittyy erittäin suotuisa yleinen ennuste [1]. Hoitovaihtoehtoja kuitenkin pitkälle, uusiutuva tai metastaattinen hankittua, ovat rajalliset ja koostuvat pääasiassa solunsalpaajahoito [1]. Mahdolliset kohdennetut hoidot ovat alle kliinisiä tutkimuksia, mutta ei ole vielä sisällytetty rutiininomaisesti kliinisessä käytössä [2].

EY on heterogeeninen sairaus, jossa erilliset histologisia ja molekyylitason ominaisuudet [2]. Toistaiseksi EY on luokiteltu tyypit I ja II. Tämä perustuu eri histologisia ominaisuuksia (endomet- vs. muu endomet-) ja kliinisestä ennusteeseen (suotuisa vs. huono) [2], [3]. Lisäksi erillinen molekyyli muutokset tapahtuvat ensisijaisesti joko tyypin I tai tyypin II EY (tarkistetaan [2]). Kun taas tyypin I kasvaimia on tunnusomaista mikrosatelliitti epävakaus (MSI) ja polymutations eri tyyppisiä geenejä, lähes kaikki tyypin II kasvainten satama mutaatioita tuumorisuppressorigeenin

TP53

[4]. Äskettäin uusi molekyyli alaryhmiä on kuvattu tapa muistuttaa rintasyövän [5]. Perustuen niiden mutaatio profiilin ja kopioi-numero muuttuu hankittua on luokiteltu: Tällä ultramutated The hypermuted, kopioluku alhainen ja kopioluvun korkea alaryhmä [5].

hypermutated alaryhmä sisältää enimmäkseen endomet- EY, kaikki kätkeminen mikrosatelliitti epävakaus (MSI). Nämä kasvaimet ovat tiedossa kehittää mutaatiot useita muita geenejä (hypermutated genomi), mutta myös niille, jotka osallistuvat DNA kaksinkertainen lohkon murtuma (DSB) kuntoutuskoneet [6]. Yksi yleisimmistä toistuva mutaatio löytyy

MRE11 geeni

, jonka tuote on osa MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) – kompleksi, joka on mukana havaitseminen ja korjaus DNA double-lohkon tauot (DSB: t) [7], [8].

MRE11

ituradan mutaatioita, jotka aiheuttavat tappava fenotyypin hiirissä [9] käytetään harvoin ihmisillä ja johtaa ataksia teleangiektasiaa kaltainen häiriö (ATLD) [10]. Somaattiset mutaatiot

MRE11

kuitenkin usein havaitaan kolorektaalisyövissä MSI ja on myös ehdotettu MSI-positiivisten hankittua [11]. Mutaatiot introni poly (T) sekvenssi

MRE11

välillä eksonien 4 ja 5 ovat yleisiä tapahtumia MSI positiivinen peräsuolen und EC [11], [12]. Vuonna EY, MSI on läsnä enemmän kuin 20% kasvaimista ja johtuu pääasiassa epigeneettiset hiljentäminen MMR-geenin

MLH1

[13]. Tämä johtaa muutoksiin useissa nukleotidin toistoja löytyy koodaus- ja ei-koodaavia elementtejä monia geenejä, kuten

MRE11

[14].

Synteettinen kuolleisuutta esiintyy, kun kaksi yksittäin esiintyviä mutaatioita, joilla ei ole vaikutus solujen elinkelpoisuuteen, mutta aiheuttavat solukuolemaa yhdistettynä [15], [16]. Esto synteettinen tappava kumppani geeni syöpäsoluissa esittää synteettisen tappava mutaatio voi osoittautua houkutteleva strategia kehittää erityisiä syöpälääkkeet mahdollisimman vähän sivuvaikutuksia terveessä kudoksessa. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että syöpiä lakkaa toimimasta

BRCA1

tai

BRCA2

osoittavat hieno herkkyyttä Poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) estäjät [17], [18]. Koska MRE11 on mukana DNA: n DSB korjaus kautta MRN-kompleksi, lakkaa toimimasta tämän monimutkaisen kautta inaktivoivat mutaatiot voivat johtaa herkkyyden PARP-inhibiittorit [19]. PARP1, DNA: n korjautumiseen entsyymiä, on liitetty korjaus DSB. PARP esto johtaa apoptoosin tai vanhenemista soluissa, joissa DNA: n korjaukseen homologisen rekombinaation (HR) on alentunut (synteettinen kuolleisuutta). Tässä tutkimuksessa käytimme voimakas selektiivinen PARP1-estäjä BMN673, joka on osoittanut hyvin rohkaisevia tuloksia vaiheen I /II tutkimuksissa [20].

Tässä osoitamme, että MRN on usein menetetty EY, mikä johtaa lisääntyneeseen PARP-inhibiittori herkkyys. Tämä voidaan hyödyntää hoidettaessa potilaita, joilla EY kätkeminen menetys MRN-kompleksin. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena on osoittaa taajuus menetyksen MRE11 ja MRN-kompleksia EY ja onko tämä johtaa lisääntynyt herkkyys PARP-inhibiittorit hyödyntämällä

MRE11

mahdollisena synteettinen tappava geeni.

Materiaalit ja menetelmät

kudossiruina

kudossiruina (TMA) formaliinilla kiinnitettyä ja parafiiniin kohdun limakalvon karsinooman rakennettiin aiemmin [21]. Kaksi ikäluokat alkaen Institutes of Surgical Pathology, yliopistollisen sairaalan Basel ja Zurich (Sveitsi), joka sisälsi 339 (Basel-TMA) ja 182 (Zurich-TMA) syöpä näytteet mukana tässä tutkimuksessa. Kliiniset ja patologiset ominaisuudet otettiin kliinisestä tietokannoista ja patologian kirjaa. Rutiini hematoksyliinillä ja eosiinileikkeissä tehtiin histopatologista arviointia. Vaiheessa kasvainten arvioitiin mukaan International Federation of Naistenklinikka ja synnytysten (FIGO) ja TNM lavastus järjestelmä. Histologinen alatyyppi ja kasvaimen määriteltiin mukaan WHO: n luokituksen 2003. Follow-up data tunnetaan 480 potilasta. Mediaani seuranta-aika oli 31,5 kuukautta (vaihteluväli, 1-184) ja Baselin kohortin ja 45 kuukautta (vaihteluväli, 1-124) varten Zurich kohortin. Potilaat, joilla oli paikallinen sairaus hoidettiin kohdun ja kahdenvälisiä salpingectomy (tai ilman lantion ja paraaortic imusolmukkeiden). Emättimen sädehoitoa oli leikkauksen jälkeen annettiin, kun hyökkäys myometrium tai kasvaimen 3 oli ilmeinen. Tutkimus hyväksyttiin molempien ikäryhmien paikallinen tieteellinen eettisen komitean (KEK-ZH-NR: 2010-0358). Lähtötason ominaispiirteet potilailla, joilla on EY yhteenveto taulukossa 1.

immunohistokemia

Kun antigeeni haku, levyt inkuboitiin seuraavilla vasta-aineilla: MRE11 (klooni 31H4, solujen signalointi, ei . 4847, 1:500), RAD50 (13B3 /2C6, Abcam rajoitettu, ei. ab89, 1:500), NBS1 (solusignalointia, no. 3002, 1:50), MLH1 (G168-15, PharMingen, Becton Dickinson , 1:100), MSH2 (25D12, Novocastra Lab. Ltd, 1:100), PMS2 (A16-4, PharMingen, Becton Dickinson, 1:300), ja MSH6 (44, BD Biosciences, 1:500). Kun oli inkuboitu 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, värjäytymistä MRE11, RAD50, ja NBS1 suoritettiin edelleen kanssa Ventana Benchmark automatisoitu järjestelmä (Ventana Medical Systems, USA) käyttäen Ventana reagensseja sekä UltraMap DAB havaitseminen kit. Vasta-aineet vastaan ​​yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmä proteiineja inkuboitiin 30 minuuttia ja värjäys menettely suoritettiin automatisoidulla Leica BOND-systeemiä käyttäen Bond Polymer Tarkenna Detection Kit (Leica Biosystems). Ilmaisu analyysi suoritettiin kaksi patologit (AN, KI). Ydin- immunoreaktiivisuus MRE11, RAD50, ja NBS1 pisteytettiin: negatiivinen (0), heikko (1), kohtalainen (2) ja vahva (3). Proteiinin ilmentyminen yhteensopimattomuuden korjausjärjestelmän geenien katsotaan positiiviseksi, kun tuman värjäytymisen oli ilmeinen. Stroomasolujen esittää tumavärjäystä käytettiin positiivisena kontrollina.

Cancer Cell Lines ja kasvuolosuhteet

ETY solulinjat Hec-108 [22] ja Hec-116 [22] kasvatettiin MEM, HEC 1A (ATCC) McCoyn, EFE-184 (DSMZ) RPMI, AN3CA (ATCC) DMEM, ARK-II [23] DMEM, SNG-II [24] DMEM, ECC-1 [25] RPMI 1640, ja oli lahja Uwe Schirmer, DKFZ. HEC6-ST3 [22], kasvatetaan MEM, ja KLE (ATCC), kasvatettiin DMEM /F-12, oli lahja Jaqueline kaljaasi, UCSF. Media oli täydennetty 10% (väliaine ECC-1 5%) (v /v) naudan sikiön seerumia, ja joko penisilliiniä (100 U /ml) /streptomysiiniä (60 mg /ml) tai antibioottia-antimykoottia, ja ylläpidetään 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO2: ta. Kaikki soluviljelmässä materiaali hankittiin Gibco mukaan LifeTechnologies.

immunoblottauksella

Koko-solu-proteiini-uutteet valmistettiin soluista lyysattiin SDS-lyysipuskuria. Western blotting suoritettiin ensisijainen vasta-aineita MRE11 (D151, lahja Steve Jackson, Cambridge), RAD51 (kanin polyklonaalinen vasta-aine, Santa Cruz Biotechnology), NBS1 (hiiren monoklonaalinen vasta-aine, GeneTex), beeta-tubuliinia (hiiren monoklonaalinen vasta-aine, Sigma) . Inkubaatio primaarisen vasta-aineen jälkeen inkuboimalla HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (anti-hiiri-anti-kani-HRP Sigma, anti-lammas HRP SantaCruz) ja kemiluminesenssiosoitusta proteiinien (Amersham).

MRE11 mutaatioanalyysi

Kolmetoista MRE11 immunohistokemia (IHC) positiivinen ja 13 IHC negatiiviset näytteet valitaan Zurich kohortin varten

MRE11

mutaation analyysi. Kolme kudossylintereitä (halkaisija 0,6 mm) lävistettiin kustakin parafiiniblokkiin DNA: n eristämiseksi. Genomi-DNA uutettiin käyttäen DNeasy Veren Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Saksa). Pitoisuuksien saatu nukleiinihappojen mitattiin käyttäen Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu (Grannini et al., 2002) pienin muutoksin. Vain 50 ng genomista DNA: ta PCR-amplifioitiin. DNA: n sekvensointi suoritettiin käyttämällä BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). Saadut sekvenssit analysoitiin mutaatioita poly (T) 11 toista aluetta ihmisen sisällä

MRE11

introni 4 (taulukko 2).

Colony Formation määritykset

Pitkäaikainen eloonjäämisen määritykset suoritettiin aikaisemmin kuvatulla [26]. Lyhyesti, solut siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille kolmena kappaleena pitoisuutena 300-2000 solua per kuoppa ja käsiteltiin inhibiittorin 24 tunnin jälkeen, on jatkuvasti alttiina lääkkeen (10-11 10-6 M) liuotettiin dimetyylisulfoksidi (DMSO) (kontrolli: DMSO). Media ja huumeiden korvattiin välein 3-5 päivää. Sen jälkeen, kun 10-15 päivä, solut kiinnitettiin TCA: lla 10% ja värjättiin sulforodamiini B (SRB) (Sigma), ja kolorimetrinen määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [26]. PARP-estäjä BMN673 oli lahja BioMarin Pharmaceuticals, USA. Mirin ostettiin Calbiochemistä.

siRNA Ja transfektoinneilla

kaataa ihmisen

MRE11

käytimme kolmea eri siRNA: t (Microsynth, Sveitsi) käyttäen RNAimax (Gibco by LifeTechnologies) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kohdesekvenssien (sense) olivat: GCUAAUGACUCUGAUGAUATT [27], GAGCAUAACUCCAUAAGUATT [28], ja GAUGCCAUUGAGGAAUUAGTT [29]. Kontrollina solut transfektoitiin siRNA vastaan ​​lusiferaasin (sense): CGUACGCGGAAUACUUCGATT. Solut ympättiin 48 tuntia transfektion jälkeen ja hoidon aloittamista 72 tuntia transfektion jälkeen (PARP estäjä, säteilytys).

Analyysi RAD51 Foci Formation

Nuclear RAD51 pesäkkeet tehtiin näkyviksi ja kvantitoitiin kuten aiemmin on kuvattu [26 ] ja käytettiin sijaismarkkereiden induktioon DNA: n DSB: itä ja pätevän HR DNA korjaukseen, vastaavasti. Lyhyesti, soluja kasvatettiin peitinlaseilla (12 mm, Thermo Scientific) ja altistettiin 10 Gy IR. 4-6 tunnin kuluttua elpyminen, solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin ja immunovärjättiin ensisijaisen vasta-aineita RAD51 (polyklonaalinen kani-vasta-aine, Santa Cruz) ja havaitaan Alexa jauhoja 488 (Invitrogen). Tumat vastavärjättiin 4 ’, 6-diamidino-2- fenyyli-(DAPI). Läsnäolo RAD51 pesäkkeitä arvioitiin vähintään 100 solua kolmen erillisen kokeen automaattisella käänteinen fluoresenssi mikroskooppi (LEICA-DMI6000 B).

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen arviointi suoritettiin SPSS ohjelmiston versio 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Pisteytys tiedot MRE11, RAD50, ja NBS1 oli kaksijakoinen osaksi ”negatiivinen” (ei lauseke) ja ”positiivinen” (heikko, kohtalainen tai voimakas ilme). Tilastollinen merkitys yhdistyksen näiden molekyylien, ja epäsuhta korjaus proteiinin ilmentymisen sekä kliinis parametreja arvioitiin Chi

2 testi trendejä ja Fisherin testiä. Lisäksi Spearmanin korrelaatio käytettiin arvioimaan yhdistyksen välillä MRE11, RAD50, NBS1, ja yhteensopimattomuus korjaus proteiineja. Todennäköisyys eloonjäämiseen kuin ajan funktiona määritettiin Kaplan-Meier-menetelmää. Erot eloonjäämiskäyrien vertailtiin log rank-testi. Herkkyys käyrät laskettiin GraphPad Prism Version 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, USA) ja tilastolliset erot IC50-arvot määritettiin käyttäen F-testejä. Yleensä p-arvot pienemmät 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

MRN-kompleksin Expression ja yhdistyksen kanssa täsmää Korjaus Protein tila ja kliinis tekijät

immunohistokemiallinen analyysi MRE11 , RAD50, ja NBS1 oli onnistunut 456, 466, ja 458 kohdun limakalvon karsinoomat, vastaavasti, koska ei ole kasvainkudoksen joissakin TMA paikkoja. Kaikki molekyylit osoittivat tumavärjäystä kuvio. Niistä 521 kohdun limakalvon karsinoomien potilailla 30,7% (132/430) osoitti täydellinen menetys MRE11 (Fig. 1A, ja taulukko 1). Expression menetys MRE11 korreloi merkitsevästi proteiinin menetys muiden MRN-kompleksin jäsentä RAD50 ja NBS1. Menetys tahansa MRN-kompleksi proteiini myös merkitsevästi yhteydessä mismatch korjaus proteiinin ilmentymisen sekä FIGO vaiheessa ja histologista arviointia (taulukko 3). Kaplan-Meier-analyysi, FIGO vaiheessa histologinen alatyyppi, luokittelua ja potilaan iän olivat ennustetekijöitä (log rank p-arvo 0,0001 kaikkien parametrien). Kuitenkin proteiinin ilmentymistä MRE11 (log rank p = 0,867), RAD50 (log rank p = 0,986) ja NBS1 (log rank p = 0,991) ei liittynyt yleistä selviytymistä. Lisäksi sekvensointi poly (T) 11-alleelin

MRE11

perimän DNA EY kasvain (n = 26, taulukko 2) osoittivat, että mutaatiot olivat yleisempiä kasvaimissa menetyksen MRE11 kuin niissä ilmentävät MRE11 , mutta mutaatio asema ei ollut prediktiivisille proteiinia tilan MRE11.

, negatiivinen (täydellinen menetys MRE11 proteiinin ilmentymisen); B, + (heikko ydinvoima lauseke); C, ++ (väli ydinaseiden lauseke); D, +++ (vahva ydinvoima lauseke).

menettäminen MRE11 liittyy Suuri herkkyys PARP esto

joukossa paneelia EY solulinjojen, AN3CA näytteillä lähes täydellinen MRE11 proteiinin menetys sekä selvästi alenemisesta RAD50 ja NBS1 (Fig. 2A). Sekvensointi introni alueen MRE11 tässä solulinjassa vahvisti aikaisemmin kuvattu homotsygoottinen poly (T) 9-mutaatio AN3CA (Fig. 2B) [11]. Kun PARP-estäjä hoidon BMN673, AN3CA näyttää korkeimman herkkyyden joukossa paneeli endometriumsyövän testatuista solulinjoista (kuvio. 3C).

, Western blot osoittaa ilmentymisen aseman MRE11, NBS1 ja RAD50 10 endometriumin karsinooma solulinjat. Vain solulinja AN3CA satamiin mutaatio MRE11, joka johtaa huomattavasti vähentää ilmentymistä MRE11. Tubuliinia käytettiin latauskontrollina. B, Pesäkkeenmuodostusta määritykset osoittavat herkkyyttä PARP-estäjä (BMN673) 10 kohtukarsinooma solulinjat: kaikki solulinjat käsiteltiin kolmena rinnakkaisena ja 14 päivää. Survival on edustettuna prosentteina ohjaus (DMSO käsitelty). Solun pesäkkeet kvantitoitiin käyttäen kolorimetristä menetelmää (SRB).

A, tehokkuus siRNA: iden eri aikapisteissä transfektion jälkeen esitetään western-blottauksella. B, herkkyys määrityksessä (kolorimetrinen SRB): kaikki solulinjat käsiteltiin PARP estäjä (BMN673) kolmena kappaleena 14 päivän ajan. Survival on edustettuna prosentteina ohjaus (DMSO käsitelty). Knock alas MRE11 kolme erilaista siRNA: iden johtaa lisääntyneeseen herkkyyttä PARP esto endometriaalisessa sinoomasolulinjoja HEC1A (8-kertainen, p 0,0001) ja HEC-116 (6-kertainen, p = 0,0006). C, Solulinjat hoidettiin MRE11-estäjä miriniä lopulliseen 30 uM kolmena kappaleena ja 10 päivää. Survival arvioitiin kolorimetrisellä herkkyyden määritys (SRB) ja näkyy prosentteina ohjaus (DMSO käsitelty). Hoito MRE11-estäjän miriniä lukemiin herkempi PARP eston kummassakin, HEC1A (2,6-kertainen, p = 0,001) ja HEC-116 (17-kertainen, p 0,0001).

Knock-down ja estäminen MRE11 herkistää solut on BMN673 heikentyneen HR

Koska menetys MRE11 ilmaisun AN3CA liittyi merkittävä herkkyys PARP eston, kysyimme ehtyminen MRE11 siRNA olisivat johtavat yleensä ja lisääntynyt herkkyys PARP-inhibiittorin BMN673. Tämän testaamiseksi käytimme paneelia EY solulinjoja ilmaistuna normaalin MRE11 (Fig. 2A) ja olivat resistenttejä myös PARP eston (Fig. 2C). Tehokkuus siRNA hoidon arvioitiin Western-blottauksella. Molemmissa solulinjoissa, transfektio MRE11 siRNA tehokkaasti köyhdytettyä endogeenisen MRE11 (Fig. 3A). Me seuraavaksi arvioidaan PARP inhibiittori herkkyyttä MRE11 vaje solujen pesäkkeiden muodostumista. Kun ehtyminen MRE11, me jatkuvasti havaittiin merkittävä lasku solujen elinkelpoisuuden läsnä ollessa BMN673 (Fig. 3B). Jotta voidaan testata, jos MRE11 nukleaasiaktiivisuus tarvitaan PARP-inhibiittorin vastus, me viljeltiin kahden solulinjojen läsnä ollessa MRE11 inhibiittorin miriniä ja käsiteltiin ne BMN673 (Fig. 3C). Molemmissa tapauksissa miriniä oli negatiivinen vaikutus solujen elinkykyyn vastauksena PARP eston, mikä viittaa vahvasti siihen, että MRE11 nukleaasia aktiivisuutta tarvitaan PARP estäjän resistenssin. Sen vahvistamiseksi, että kaataa of MRE11 johtaa heikentynyt HR, päätimme solujen kyky muodostaa RAD51 pesäkkeitä vastauksena ionisoiva säteily (IR) (ks. 4A). Todellakin, kun vaimentaminen

MRE11

vähemmän RAD51 pesäkkeitä solua kohti voitiin havaita (Fig. 4B). Capan-1 haiman solulinja, jonka tiedetään olevan HR puutteesta johtuen mutaatiosta

BRCA2

toimi kontrollina (tuloksia ei ole esitetty).

A, Immunofluorescence kuvia, joissa on näkyvissä DAPI-värjätty ytimet (sininen) ja RAD51 pesäkkeet (vihreä) edustavissa aloilla HEC-1A ja HEC-116 kohtukarsinooma soluja. Sekä villityypin MRE11 ilmentävät solulinjat joko käsiteltiin kolme erilaista siRNA: iden ja MRE11 tai siRNA lusiferaasin (siLuc) kontrollina. Transfektoidut solut altistetaan sitten 10 Gy Säteilytyksen tai ei altistettu, kuten on osoitettu. B, RAD51 pesäkkeitä muodostuminen on esitetty prosentteina RAD51 pesäkkeitä positiivisten solujen (yli 5 pesäkkeitä solua kohti arvioitiin positiivisiksi) ilman hoitoa, ja 6 tunnin kuluttua 10 Gy säteilytyksen. Vähintään 100 solua laskettiin määrittämiseksi RAD51 pesäkkeitä muodostuminen taajuudella kolmen erillisen kokeen. ** P≤0.01, *** P≤0.001.

Keskustelu

Tämä on ensimmäinen raportti osoittaa, että ei ainoastaan ​​proteiinin ilmentymistä MRE11 mutta myös ilmaus muiden jäsenten MRN-kompleksi, RAD50 ja NBS1, menetetään merkittävä osa ECS. Lisäksi havaitsimme merkittävää yhdistyksen välillä proteiinin menetys kaikkien MRN jäsenet sekä yhteensopimattomuuden korjauksen proteiini asema tässä suuressa aineisto. Proteiinin ilmentyminen MRN-kompleksi ei vielä ole tutkittu EY kasvaimia. Virtsarakon syöpä, MRE11 on osoitettu olevan ennustava ominaisuuksia sädehoidon [30]. Lisäksi täydellinen menetys MRN-kompleksin MSI positiivinen kolorektaalisyövissä on usein tapahtuma [31], kun taas menetys MRE11 vuonna rintasyövistä löytyy vain 9%: ssa tapauksista [32].

Vaikka selvä korrelaatio välillä mutaatiostatuksesta riippumatta ja tappio proteiinin ilmentymisen ei löydy tässä tutkimuksessa, on merkillistä, että korkea korrelaatio proteiinia menettänyt kaikki MRN jäsenet sekä MSI tila todettiin tässä suuressa aineisto. Sekoittavia tuloksia mutaation tilan MRE11 polyT (11) alleeli saattaa liittyä vaikeuksiin, sekvensointi MRE11 polyT (11) alleeli johtuen mispairing polymeraasin entsyymin [33].

Aiemmassa tutkimuksessa paljasti tiheä korjauksilla DSB korjaus geenien MSI positiivinen EC: issä, jossa MRE11 ja RAD50 näytteillä heterotsygoottinen ja homotsygoottinen mutaatioita 51% ja 17%, vastaavasti, tutkimatta vaikutuksen menetys proteiinien [6]. Mutaatiot MRE11 polyT (11) alleeli ovat pääasiassa heterotsygoottinen mutaatioiden ja on ehdotettu, että vain ne, joilla mutaatioita kahden tai useamman nukleotidin sekä homotsygoottinen mutaatiot on toiminnallinen vaikutus kannalta toimintakyvyn menetystä [11], [12] , [34], [35]. Tässä raportissa, emme voi vahvistaa tiheä introni mutaatioiden vaan osoittamaan, että MRE11 proteiini on menetetty huomattava osa hankittua. Viime aikoina on osoitettu, että koko eksonin sekvensointi MRE11 paljasti mutaatioita 1,9% (2 107) ja n kasvaimia eksonit [36]. Kuitenkin Introniset mutaatioita ei ole arvioitu, miksi taajuus

MRE11

mutaatioita on raportoitu olevan alhainen paitsi tutkimuksessa Price et al. [36], mutta myös äskettäin yhdessä The Cancer Genome Atlas Research Network [5].

PARP-inhibiittorit ovat osoittaneet huomattavaa herkkyyttä BRCA1 /2-puutosta kasvainmuodoista

in vitro

samoin kuten kliinisissä tutkimuksissa kantajia

BRCA1 /2

ituratamutaatiot. Edelleen kehittyvä todisteet kuitenkin viittaavat siihen mahdollisuus soveltaa laajemmin varten PARP inhibitioaktiivisuudesta [16]. Itse asiassa EY olemme aiemmin ehdottanut menetys PTEN ilmaisun mahdollisena biomarkkeri hoidon PARP-inhibiittorit perustuvat prekliiniset tiedot [26] sekä kliinisestä tapauksesta raportin [37]. Muut tutkimukset kuitenkin voitu kyseenalaistaa roolia

PTEN

HR, mikä viittaa siihen, että tämä voisi olla solulinja erityinen ilmiö [38], [39]. Kuitenkin tarkka mekanismi osallistumista

PTEN

HR DNA: n korjaukseen vielä selvittämättä.

Menetys MRE11 ilmaisun on ehdotettu herkistää peräsuolen [35], [38], [ ,,,0],40], rintojen [41] ja hematologiset [42] syöpäsolujen linjojen PARP-inhibiittorit heikentyneen HR DNA korjaukseen. Meidän raportissa ehdotetaan, ensimmäistä kertaa, mahdollista käyttöä PARP estäjien kohdun limakalvon syövän perustuu prekliinisen havainnoista. On yhä enemmän todisteita siitä, että potilaat kärsivät kohdun limakalvon syöpä ja jotka eivät ilmennä MRE11 voitaisiin hoitaa BMN673. Tämä kannattaa käyttää MRE11 koska ennakoiva biomarkkeri PARP hoitoon.

Yhteenvetona tämä tutkimus osoittaa, että i) täydellinen menetys MRN kompleksi on yleinen tapahtuma EY, ii) menetys MRE11 ilmaisun samoin kuten geenien ja farmakologinen esto nukleaasiaktiivisuus johtaa herkkyyden PARP-eston

in vitro

, ja iii) menetys MRE11 liittyy puutteellinen HR DNA korjaukseen osoitti säteilytettäessä. Näiden tulosten perusteella ehdotamme, että MRE11 ilmaisua voidaan käyttää mahdollisena ennustavan biomarkkeri tehokkuuden PARP estäjähoidon endometriumin syöpiä MSI.

Kiitokset

Kiitämme Martina Storz, André Fitsche ja Sonja Brun-Schmid erinomaista teknistä tukea, ja Markus Rechsteiner varten hyödyllisiä keskusteluja. Kiitämme Steve Jackson tarjota julkaistu reagenssien ja BioMarin Pharmaceuticals lahjasta niiden PARP-estäjä BMN673.