Krooninen sairaus

tiivistelmä

tymidiinikinaasien (TK) on pidetty yhtenä potentiaalisia syövän vastaisen terapeuttista koska niiden koholla ilmaisuja syöpäsoluissa. Kuitenkin nucleobase analogeja kohdistaminen TKs ovat osoittaneet huonosta selektiivinen sytotoksisuus syöpäsoluissa huolimatta tehokas antiviraalinen aktiivisuus. 3′-deoksitymidiini phenylquinoxaline konjugaattia (dT-QX) suunniteltiin uusi nukleoemäs analoginen kohdistaa TKs syöpäsoluja ja estää solujen lisääntymisen kautta konjugoitu DNA-interkalatoivaa kinoksaliini-osa. In vitro solujen seulonta osoitti, että DT-QX valikoivasti tappaa erilaisia ​​syöpäsoluja kuten maksa- karsinooma, rinta adenokarsinooma ja aivojen gliooma soluja; vaikka se oli alhainen sytotoksisuus normaaleissa soluissa, kuten normaalin ihmisen maksasoluja. Syövän vastaisen aktiivisuuden dT-QX johtui Selektiivisenä DNA-synteesin saatiin runsaasti mitokondrioiden superoksidi stressi syöpäsoluissa. Osoitamme, että kovalenttisen sidoksen 3′-deoksitymidiini ainutlaatuisesti suunnattu sytotoksinen phenylquinoxaline osan enemmän kohti syöpäsoluja kuin normaalit solut. Alustava hiiri tutkimuksessa ihonalaisen maksakasvain malli osoitti, että DT-QX esti kasvainten kasvua. dT-QX on ensimmäinen molekyyli laatuaan erittäin parannettavissa ainesosia, jolla on tämä selektiivinen sytotoksisuus syöpäsoluissa.

Citation: Wei Q, Zhang D, Yao A, Mai L, Zhang Z, Zhou Q (2012 ) Design, Synthesis, ja in vitro ja in vivo biologista Studies of 3′-deoksitymidiini-konjugaatin, joka mahdollisesti osumalla Cancer Cells valikoivasti. PLoS ONE 7 (12): e52199. doi: 10,1371 /journal.pone.0052199

Editor: Kamyar Afarinkia, Univ of Bradford, Iso-Britannia

vastaanotettu: 02 elokuu 2012; Hyväksytty: 12 marraskuu 2012; Julkaistu: 26 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat National Basic Research Program of China (2011CB933100), perustutkimus rahastojen Central yliopistot (HUST: 2010ZD023), ja Important National Science Teknologia Erityishankkeet (2009ZX09301-014). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syövistä on johtava kuolinsyy maailmanlaajuisesti kehittää turvallisia ja tehokkaita syöpälääkkeiden edelleen kipeästi. Molecularly täsmähoitoihin on ollut viime aikoina painopiste syöpälääke kehittämiseen, kuten nähdään esimerkissä Sorafenibi [1], [2]. Sorafenibi on multi-tyrosiinikinaasi-inhibiittori, joka voi mahdollisesti minimoida haitalliset vaikutukset, kuten maksatoksisuutta aiheuttaneet muut syöpälääkkeiden, mukaan lukien 5-fluorourasiili ja doksorubisiini [3], [4]. Samanlainen tyrosiinikinaasit, tymidiinikinaaseja (TK) on otettu huomioon toinen mahdollinen syövänvastainen tavoite [5] – [8]. TK ovat ensimmäinen fosforylaatioreagenssin entsyymien tymidiinin pelastus polku muuntaa tymidiini sen 5′-fosfaatin muoto DNA-synteesiin. Normaalissa nisäkässolut, sytosolin TK ovat läsnä vain alhaisella tasolla S-vaiheessa olevien solujen; kun taas kohonnut TK on havaittu infektoituneissa soluissa ja nopeasti lisääntyviä syöpäsolujen [5] – [8], esimerkiksi keuhko- kasvainten ja rintasyövän kudoksissa [9], [10].

nukleoemäs analogeja kohdistaminen TKs kuten AZT ja asikloviiri on osoitettu olevan tehokkaita antiviraalista vaikutusta [11], [12]. Kuitenkin huono syöpään selektiivisyys ja vahva haittavaikutuksia on liittynyt nucleobase analogeilla kuten neutronikaappausvaikutusalat agentti 5-tymidiini boori konjugaatin ja radioisotooppisia jodatut deoksiuridiinista [13], [14]. Äskettäin yhdistelmähoidon avulla predelivered tymidiinikinaasi seurasi nucleobase analogeja on tutkittu maksasyövän potilaille, joilla on rajallinen saavutetut vaikutukset [15]. Tämä johtuu todennäköisesti että TKs suuntautunut nucleobase analogit, kuten AZT nopeasti poistetaan nucleobase korjautumisprosessit jälkeen kun ne on sisällytetty DNA-synteesiin syöpäsolujen kautta tymidiinin pelastus-reitin [16] – [18]. 5-fluoriurasiili, toinen tymiini analogi, on dihyrofolate reduktaasin estäjän ja aiheuttaa suoraan sytotoksisuus normaalissa hepatosyyteissä [3], [19]. Näin ollen, vaihtoehtoinen rakenne on tehokkaampi nukleoemäs analogien kohdistaminen TKs tarvitaan.

Tässä raportoidaan uuden 3′-deoksitymidiini phenylquinoxaline konjugaattia (dT-QX, kuvio 1), joka selektiivisesti tappaa erilaisia ​​syöpäsoluja, mutta ei normaali maksasoluissa. Rakenteellisesti dT-QX on 3′-triatsoli-3′-deoksitymidiini liitetty DNA-interkalatoivaa kinoksaliini-osa. dT-QX suunniteltiin kohdistamaan tymidiinin pelastus polku perustuu siihen, että 3′-triatsoli tymidiinijohdannaisten tunnistaa ihmisen tymiini kinaasien [20], [21]. Tarkoituksena lisäämällä kinoksaliini-osan osaksi dT-QX rakenne oli estää solujen poistamisen tymidiinianalogeja [16] – [18] kautta tunkeutumiseen DNA-DNA-synteesissä syöpäsoluja, koska kinoksaliini osa on tunnettua DNA-interkalaattori [22]. Lisäksi kinoksaliini rakenne voidaan helposti syntetisoida yhdessä vaiheessa kondensoimalla diketoniyhdistettä 1 [23], ja orto-fenyleenidiamiini (kuvio 1). Vielä tärkeämpää on, kinoksaliini rakenne on erittäin muutettavissa ja kemiallisia modifikaatioita, joilla on erilaisia ​​substituentteja pitkälle rakenteen ja aktiivisuuden tutkimus optimoimiseksi biologista aktiivisuutta. Syövän vastaista aktiivisuutta dT-QX arvioitiin sitten käyttäen paneelia syöpäsoluja. Vaikutukset dT-QX estoon DNA-synteesiä ja indusoivan solujen oksidatiivisen stressin tutkittiin myös. Lopuksi, kasvaimen kasvun inhibition, jonka dT-QX arvioitiin hiirissä, jotka kantoivat ihonalaisen maksakasvain.

Materiaalit ja menetelmät

Synthesis

Kaikki kemikaalit hankittiin Sigma-Aldrich (WI, USA), J K Scientific Ltd (Peking, Kiina), tai Sinopharm Chemical Reagenssi Co, Ltd (Shanghai, Kiina) ja käytettiin ilman lisäpuhdistusta. NMR-spektrit rekisteröitiin Bruker Avance-400 NMR spektrometri (Madison, WI, USA). Käytetyt lyhenteet jaetun malleja protoni-NMR signaalit ovat: singletti (s), dubletti (d), tripletti (t), kvartetti (q), kvintetti (qui), multipletti (m) ja leveä signaali (br). Sähkösumutusionisaatioon massaspektroskopia (ESI-MS) analyysi suoritettiin Thermo Fisher TSQ Quantum Max Triple Stage Quadrupole massaspektrometriä (MA, USA). Yhdiste 1 saatiin, kuten aiemmin on raportoitu [23].

6-bromi-

N

– (prop-2-ynyyli) heksaaniamidi (2).

Liuokseen 6-bromiheksaanihaposta lähtemällä (694 mg, 3,56 mmol) kuivassa CH

2CI

2 (50 ml), lisättiin propargyyliamiinia hydrokloridia (300 mg, 3,28 mmol), trietyyliamiinia (332 mg, 3,28 mmol) ja 1- (3-dimetyyliaminopropyyli) -3-etyylikarbodi-imidihydrokloridia (630 mg, 3.28mmol). Reaktioseosta sekoitettiin N

2 16 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Saatu liuos uutettiin CH

2CI

2 (150 ml x 3). Orgaaniset kerrokset kerättiin, pestiin suolavedellä (250 ml), kuivattiin MgSO

4 ja konsentroitiin. Flash-kromatografinen erottaminen (0-40% EtOAc heksaanissa), jolloin saatiin 2, kuten 1:01 syn /anti-amidi seos värittömänä öljynä (390 mg, 1,68 mmol) 51%: n saannolla.

1H-NMR (CDCI

3, 400 MHz, 01:01 syn /anti):

δ

= 5,71 (br s, 1 H, NH), 4,05 (dd,

3J

(H, H) = 5,2 Hz,

4J

(H, H) = 2,5 Hz, 2 H, CH

2), 3,53 (t,

3

J

(H, H) = 6,6 Hz, 1 H; 0.5CH

2), 3,40 (t,

3

J

(H, H) = 6,7 Hz, 1H; 0.5CH

2), 2,24-2,19 (m, 3H, CH, CH

2), 1,87 (qui,

3J

(H, H) = 7,2 Hz, 1H; 0.5CH

2), 1,79 (qui,

3J

(H, H) = 7,0 Hz, 1H; 0.5CH

2), 1,67 (qui,

3J

(H, H) = 7,52 Hz, 2 H, CH

2), 1,50-1,41 ppm (m, 2 H, CH

2);

13C-NMR (CDCI

3, 100,6 MHz, 01:01 syn /anti):

δ

= 172,3, 172,2, 79,5, 71,6, 44,8, 36,1, 36,1, 33,5, 32,4, 32,2 , 29,1, 27,7, 26,4, 24,7, 24,5 ppm (kuva S1); HRMS laskettu C

9H

15BrNO [M + H]

232,0337 ja [M + 2 + H]

234,0316, löydetty 232,0324 ja 234.0413.

N

-(Prop-2-ynyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-9,10-dioxo-4b,5,6,7,8,8a,9,10-octahydrophenanthren-2-yloxy)hexanamide (3).

Liuokseen, jossa oli 2 (390 mg, 1,68 mmol) kuivassa DMF: ssä (50 ml), lisättiin 1 (355 mg, 1,30 mmol) ja kaliumkarbonaattia (1,8 g, 13,0 mmol). Reaktioseosta sekoitettiin N

2 16 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja tehtiin sitten happamaksi pH-arvoon 5 5 N HCI: lla. Saatu liuos uutettiin CH

2CI

2 (150 ml x 3). Orgaaniset kerrokset kerättiin, pestiin suolavedellä (250 ml), kuivattiin MgSO

4 ja konsentroitiin. Flash-kromatografinen erottaminen (0-40% EtOAc: llä heksaanissa) antoi 3 keltaisena öljynä (320 mg, 0,76 mmol) 58%: n saannolla.

1H-NMR (CDCI

3, 400 MHz):

δ

= 7,53 (d,

4J

(H, H) = 2,9 Hz, 1H; CH ), 7,35 (d,

3J

(H, H) = 8,8 Hz, 1 H, CH), 7,21 (dd,

3J

(H, H) = 8,7 Hz,

4J

(H, H) = 2,7 Hz, 1 H, CH), 5,94 (br s, 1 H, NH), 4,04 (dd,

3J

(H, H) = 5,3 Hz,

4J

(H, H) = 2,6 Hz, 2 H, CH

2), 4,00 (t,

3J

(H, H) = 6,4 Hz, 2H; CH

2), 2,65 (s, 1 H, CH), 2,53 (d,

3J

(H, H) = 14,3 Hz, 1H, CH), 2,24 (t,

3J

(H, H) = 7,6 Hz, 2H; CH

2), 2,21 (d,

4J

(H, H) = 2,5 Hz, 1 H, CH), 1,82-1,70 (m, 4H, 2CH

2), 1,56-1,31 (m, 7H; 3CH

2, CH), 1,18 (s, 3H, CH

3), 0,95 (s, 3H, CH

3), 0,38 ppm (s, 3H, CH

3);

13C-NMR (CDCI

3, 100,6 MHz):

δ

= 199,0, 181,3, 172,4, 158,1, 142,6, 134,6, 126,1, 124,2, 112,6, 71,7, 68,9, 68,1, 41,9, 39,2, 39,0, 36,3, 36,3, 35,5, 31,4, 29,7, 29,2, 28,9, 25,7, 25,2, 24,3, 18,8 ppm (kuvio S2); HRMS laskettu C

26H

34NO

4 [M + H]

424,2488, löydetty 424.2487.

N

-(Prop-2-ynyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-4b,5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo[a,c]phenazin-2-yloxy)-hexanamide (4).

Liuokseen, jossa oli 3 (320 mg, 0,76 mmol) tolueenissa (25 ml) lisättiin

o

-fenyleenidiamiinia (103 mg, 0,95 mmol) ja silikageeliä ( 300 mg). Reaktioseosta refluksoitiin N

2 18 tuntia ja konsentroitiin sitten. Flash-kromatografinen erottaminen (0-40% EtOAc: llä heksaanissa) tuotti yhdistettä 5 keltaisena kiinteänä aineena (230 mg, 0,46 mmol) 61%: n saannolla.

1H-NMR (CDCI

3, 400 MHz):

δ

= 8,09-8,07 (m, 3H, 3CH), 7,73-7,67 (m, 2H, 2CH), 7,30 (d,

3J

(H, H) = 8,8 Hz, 1H, CH), 7,02 (dd,

3J

(H, H) = 8,4 Hz,

4J

(H, H) = 2,8 Hz, 1 H, CH), 5,71 (br s, 1 H, NH), 4,14-4,06 (m, 4H, 2CH

2), 2,88 (s, 1H, CH), 2,56 (br d,

3J

(H, H) = 14 Hz, 1 H, CH), 2,28-2,23 (m, 3H, CH

2, CH) , 1,89-1,73 (m, 4H, 2CH

2), 1,59-1,47 (m, 7H; 3CH

2, CH), 1,02 (s, 3H, CH

3), 0,99 (s, 3H; CH

3), 0,16 ppm (s, 3H, CH

3);

13C-NMR (CDCI

3, 100,6 MHz):

δ

= 172,4, 158,0, 154,8, 148,4, 141,9, 141,3, 137,6, 134,8, 129,2, 129,1, 129,0, 128,6, 125,0, 118,1, 111,2, 79,6, 71,6, 67,7, 59,7, 42,0, 37,3, 36,3, 36,1, 36,0, 34,8, 31,5, 29,2, 29,1, 25,8, 25,3, 22,1, 19,0 ppm (kuva S3); HRMS laskettu C

32H

38N

3 O

2 [M + H]

496,2964, löydetty 496.2964.

N

-((1-(2-(Hydroxymethyl)-5-(5-methyl-2,4-dioxo-3,4-dihydropyrimidin-1(2H)-yl)-tetrahydrofuran-3-yl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)-6-(4b,8,8-trimethyl-4b,5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo[a,c]phenazin-2-yloxy)hexanamide (DT-QX).

Liuokseen, jossa oli 4 (100 mg, 0,2 mmol) 5 ml: ssa DMF: a ja 10 ml: ssa CH

2CI

2 lisättiin 3′-atsido-3′- deoksitymidiini (54 mg, 0,20 mmol) ja vesiliuosta natriumaskorbaattia (40 mM, 15 ml). Reaktioseos huuhdeltiin N

2 10 minuutin ajan, ja CuSO

4 · 5H

2O (8 mg, 0,03 mmol) lisättiin. Reaktioseosta sekoitettiin sitten N

2 huoneenlämpötilassa 12 tuntia. Saatu liuos uutettiin CH

2CI

2 (150 ml x 3). Orgaaniset kerrokset kerättiin, pestiin suolavedellä (200 ml), kuivattiin MgSO

4 ja konsentroitiin. Flash kromatografisella erotuksella (0-7% MeOH CH

2CI

2) saatiin dT-QX valkoisena kiinteänä aineena (114 mg, 0,15 mmol) saannon ollessa 75%.

1H-NMR (DMSO

d

6

, 400 MHz):

δ

= 11,35 (s, 1H, OH), 8,34 (t,

3

J

(H, H) = 5,5 Hz, 1 H, CH), 8,14-8,11 (m, 2H, 2CH), 8,06-8,04 (m, 1 H, CH), 7,96 (d,

4

J

(H, H) = 2,8 Hz, 1H, CH), 7,79 (m, 3H, 2CH, NH), 7,39 (d,

3

J

(H, H) = 8,7 Hz, 1H, CH), 7,11 (dd,

3

J

(H, H) = 8,5 Hz,

4

J

(H, H ) = 2,8 Hz, 1 H, CH), 6,40 (t,

3

J

(H, H) = 6,6 Hz, 1 H, CH), 5,36-5,33 (m, 1 H, CH), 5,28 (t,

3

J

(H, H) = 5,2 Hz, 1 H, NH), 4,31 (d,

3

J

(H, H) = 5,5 Hz, 2 H, CH

2), 4,18 (m, 1 H, CH), 4,06 (t,

3

J

(H, H) = 6,4 Hz, 2 H, CH

2), 3,67-3,60 (m, 2H, CH

2), 2,85 (s, 1 H, CH), 2,67-2,57 (m, 2H, CH

2), 2,16 (t,

3

J

(H, H) = 7,4 Hz, 2 H, CH

2), 1,79-1,62 (m, 5 H, CH

3, CH

2), 1,56-1,43 (m, 10H, 5CH

2), 0,93 (s, 3H, CH

3), 0,91 (s, 3H, CH

3), 0,07 ppm (s, 3H, CH

3 );

13C-NMR (DMSO

d

6

, 100,6 MHz):

δ

= 172,0, 163,6, 157,4, 154,2, 150,4, 147,5, 145,2, 141,1, 140,9, 137,1, 136,1, 134,1, 129,5, 129,4, 128,9, 128,4, 125,3, 122,4, 117,7, 110,8, 109,5, 84,4, 83,8, 67,4, 60,6, 59,0, 58,5, 41,2, 37,0, 36,8, 35,5, 35,1, 34,9, 34,4, 34,0, 31,3, 28,5, 25,2, 24,9, 21,6, 18,5, 12,2 ppm; HRMS laskettu C

42H

51N

😯

6 [M + H]

763,3932, havaittu 763,3959 (kuviot S4 ja S5).

4b, 8, 8-trimetyyli-9,10-diokso-4b, 5,6,7,8,8a, 9,10-octahydrophenanthren-2-yyli-4-metyyli-piperatsiini-1-karboksylaattia (5).

liuokseen, jossa oli 1 (650 mg, 2,39 mmol) DMF: ssä (30 ml), lisättiin 4-metyyli-1-piperatsiinikarbonyylikloridihydrokloridia (630 mg, 3,16 mmol) ja kaliumkarbonaattia (3,4 g, 24 mmol). Reaktioseosta sekoitettiin N

2 18 tuntia ja tehtiin sitten happamaksi pH-arvoon 5 5 N HCI: lla. Saatu liuos uutettiin CH

2CI

2 (150 ml x 3). Orgaaniset kerrokset kerättiin, pestiin suolavedellä (250 ml), kuivattiin MgSO

4 ja konsentroitiin. Flash-kromatografinen erottaminen (0-25% EtOAc: llä heksaanissa) antoi 5 keltaisena öljynä (730 mg, 1,83 mmol) 77%: n saannolla.

1H-NMR (CDCI

3, 400 MHz):

δ =

7,86 (s, 1 H, CH), 7,49 (s, 2H, 2CH), 3,71 (br s, 2H; CH

2), 3,61 (br s, 2 H; CH

2), 2,69 (s, 1 H, CH), 2,58 (d,

3

J

(H, H) = 13,3 Hz, 1 H, CH), 2,49 (br s, 4H, 2CH

2), 2,37 (s, 3H, CH

3), 1,47-1,42 (m, 5H; 2CH

2, CH ), 1,23 (s, 3H, CH

3), 0,98 (s, 3H, CH

3), 0,41 ppm (s, 3H, CH

3);

13C-NMR (CDCI

3, 100,6 MHz): δ 198,2, 180,6, 152,5, 149,8, 147,4, 134,6, 129,4, 126,3, 122,5, 68,7, 53,7, 53,6, 41,7, 39,5, 38,7, 36,2, 36,1 , 35,5, 31,2, 26,9, 24,2, 24,2, 18,7 ppm (kuvio S6); HRMS laskettu C

23H

31N

2O

4 [M + H]

299,2284, havaittu 299,2294.

4b, 8,8-trimetyyli-4b, 5,6,7,8,8a-hexahydrodibenzo [a, c] phenazin-2-yyli-4-metyylipiperatsiini-1-karboksylaattia (Pip-QX).

liuokseen, jossa oli 5 (330 mg, 0,83 mmol) tolueenissa (25 ml) lisättiin

o

-fenyleenidiamiinia (100 mg, 0,92 mmol) ja silikageeliä (300 mg). Reaktioseosta refluksoitiin N

2 18 tuntia ja konsentroitiin sitten. Flash kromatografisella erotuksella (0-3% MeOH CH

2CI

2) saatiin Pip-QX keltaisena öljynä (310 mg, 0,66 mmol) 79%: n saannolla.

1H-NMR (DMSO

d

6

, 400 MHz):

δ

= 8,14-8,05 (m, 3H, 3CH), 7,81-7,79 (m, 2H , 2CH), 7,49 (d,

3

J

(H, H) = 8,4 Hz, 1H, CH), 7,29 (dd,

3

J

(H , H) = 8,4 Hz,

4

J

(H, H) = 2,4 Hz, 1 H, CH), 3,63 (br s, 2H, CH

2), 3,46 (br s , 2H, CH

2), 2,88 (s, 1 H, CH), 2,58 (m, 1 H, CH

2), 2,38 (br s, 4H, 2CH

2), 2,16 (s, 3H; CH

3), 1,51-1,38 (m, 5 H; 2CH

2, CH), 0,96 (s, 3H, CH

3), 0,90 (s, 3H, CH

3 ), 0,06 ppm (s, 3H, CH

3);

13C-NMR (DMSO

d

6

, 100,6 MHz):

δ

= 154,4, 153,3, 150,5, 147,5, 142,3, 141,6, 134,7, 130,2, 130,2, 129,4, 129,0, 125,7, 125,2, 119,3, 58,9, 54,7, 54,6, 46,2, 44,6, 44,0, 41,6, 37,7, 36,1, 35,4, 34,7, 31,8, 22,2, 19,0 ppm (kuva S7); HRMS laskettu C

29H

35N

4O

2 [M + H]

471,2760, havaittu 471,2767.

biologisia tutkimuksia

Eläin protokolla hyväksyttiin tarkistaminen komitean College of Life Science ja Technology Huazhong tiede ja teknologia. Syöpäsolulinjoissa HepG2, Hep3B, MCF-7 ja C6 saatiin ATCC: ltä (VA, USA). Ihmisen maksasolut HL-7702 ja hiiren maksan syöpäsoluja H22 olivat Shanghai Institute of Life Science Cell Culture Center (Shanghai, Kiina). Soluja ylläpidettiin runsaasti glukoosia DMEM tai RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, CA, USA), johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamiinia, 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja, 1,0 mM natriumpyruvaattia, 50 U /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Kantaliuoksia dT-QX, Pip-QX tai AZT valmistettiin DMSO: hon, ja doksorubisiinin hydrokloridisuola liuotettiin suoraan veteen. Kaikki biologiset kemikaalit saatiin yhtiöltä Sigma Aldrich (WI, USA) ellei toisin mainita. Kaikki kokeet itsenäisesti toistettiin vähintään kolme kertaa.

Solujen elinkelpoisuus MTT-määritystä.

Soluja (5000 per kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille elatusaineeseen yön yli ennen jokaista hoitoa triplikaatteina. dT-QX, Pip-QX tai AZT oli loppukonsentraatioksi 0, 0,1, 1, 10, 20, 50, 100 tai 200 uM yhteensä DMSO alle 0,2%. Doksorubisiinia käytettiin vertailun loppupitoisuudeksi 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 tai 2,0 uM. 72 tunnin kuluttua MTT-määritys suoritettiin, kuten on raportoitu [23]. Solujen elinkelpoisuus kunkin hoidon piirretty GraphPad Prism-ohjelma, ja IC

50-arvot saatiin käyttämällä sigmoidaalista annos-vaste-analyysi, jonka ohjelmiston (versio 4.00, GraphPad Software, CA, USA).

anti-BrdU fluoresenssimääritys.

Hep3B, HepG2 tai HL-7702-solujen (50000 per kuoppa) ympättiin kasvualustan yön yli 48-kuoppalevyille ja käsiteltiin 0, 10 tai 50 uM dT-QX varten 5 h. Anti-BrdU-määritys suoritettiin valmistajan suositusten (BD Biosciences, NJ, USA). Lyhyesti, BrdU-liuosta (0,1 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 h. Solujen elatusaine poistettiin ja solut kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä PBS: ssä. Solut läpäiseviksi 0,1% Triton-100 PBS: ssä ja blokattiin 3% FBS PBS liuokseen. Solujen DNA denaturoitiin DNaseI (0,3 mg /ml) PBS-liuosta. Sisällytetty BrdU värjättiin Alexa Fluor®488 anti-BrdU monoklonaalisen vasta-aineen (BD Biosciences, NJ, USA). Tumat vasta Hoechstilla 33342 ratkaisu. Cell kuvia Jokaisen käsittelyn oli taltioinut Olympus IX71 -käänteismikroskoopissa varustettu digitaalikameralla sopivissa valot. Vaikutukset Pip-QX ja AZT DNA-synteesiä Hep3B arvioitiin samalla tavalla kuin edellä on kuvattu.

Fluoresenssi tutkimus mitokondrioiden superoksidituotantoa.

Hep3B tai HL-7702-solujen (50000 kuoppaa kohti ) ympättiin kasvualustan yön yli 48-kuoppaisilla levyillä. Soluja käsiteltiin 0 tai 50 uM dT-QX: ssa 8 tuntia ja sitten väliaine poistettiin. Liuosta, jossa oli MitoSOX Red mitokondrion superoksidi-ilmaisin (Invitrogen, CA, USA) PBS: ssä ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 20 min. Sen jälkeen solut pestiin kerran PBS: llä ja vasta-värjättiin Hoechst 33342 ratkaisu. Fluoresenssikuvia otettiin kiinni Olympus IX71 käänteismikroskooppi sopivissa valot. Tutkimus 100 uM Mn (III) tetrakis (1-metyyli-4-pyridyyli) porfyriinin tetratosylate hydroksidia (MnTmPyP, EMD Chemicals, Inc., USA) positiivisena kontrollina on Hep3B-soluissa tehtiin samalla tavalla.

ihonalainen maksakasvain hiirillä.

Hiiren maksan syöpäsoluja H22 alun perin pidettiin RPMI-1640-elatusainetta ja sitten kasvaa BALB /c-hiiriä (Hubein maakunnan Laboratory Animal Center, Kiina) intraperitoneaalisesti. Hiiret lopetettiin 4 päivän kuluttua ja H22 solut kerättiin PBS ratkaisu. H22 solut pestiin kerran steriilillä PBS: llä ja injektoitiin ihon alle (3×10

6 solua per hiiri) klo alaselän naiivi BALB /c-hiirissä. Kun kasvaimet saavuttivat keskimääräisen koon (8×8 mm, 340 mm

3), yhdeksän hiiret jaettiin sattumanvaraisesti kolmeen ryhmään (3 per ryhmä) ja injektoitiin 100 ui fysiologista suolaliuosta (0,1% DMSO), AZT (50 uM steriilissä PBS: ssä, jossa oli 0,1% DMSO) tai dT-QX (50 uM steriilissä PBS: ssä, jossa oli 0,1% DMSO: ta), on kasvaimen päivänä 1 ja päivänä 7. kasvaimen kasvua ja kehon painoa tarkkailtiin päivittäin. Päivänä 12 ja sen jälkeen ensimmäisestä injektiosta kaikki hiiret lopetettiin ja kuvat kasvainten kirjattiin. Tilastollinen analyysi (yksisuuntainen ANOVA Tukeyn moninkertainen vertailutesti) hoidoille suoritettiin käyttäen GraphPad Prism-ohjelmiston.

Tulokset ja keskustelu

synteesi dT-QX saatiin aikaan liittämällä AZT kanssa phenylquinoxaline 4 kautta kupari (I) -catalyzed click reaktion (kuva 2). Välituote 3 saatiin nukleofiilinen substituutio bromoalkyne 2 hapettuneen terpenone 1. Phenylquinoxaline 4 saatiin kondensoimalla

o

-diaminobenzene ja silikageeliä refluksoiden tolueenissa, jossa oli paljon parempi kuin asetonitriilissä, DMF: ssa tai etanolissa. Konjugaatio AZT kanssa phenylquinoxaline 4 dT-QX saatiin aikaan 75%: n saannolla käyttämällä in situ vähentäminen kupari (II) askorbaatin [20], [21]. Phenylquinoxaline 4, viittaus molekyyli, havaittiin olevan niukkaliukoinen 1% DMSO: ta vesiliuosta ja sitä muutettiin

N

metyylipiperatsiini johdannainen Pip-QX, kuten on esitetty kuviossa 2. Pip-QX syntetisoitiin Samalla tavalla kuin dT-QX kautta muuntaminen 1 piperatsiinin johdannaisen 5, jota seuraa kondensaatio

o

-diaminobenzene kokonaissaannolla 61%. Pip-QX toimi yhtenä viitteenä yhdisteiden seuraavissa biologisia tutkimuksia. Useita eriä dT-QX ja ohjaus yhdisteet syntetisoitiin, ja kaikki erät toteutetaan johdonmukaisesti paitsi kemiaa vaan myös biologisiin tutkimuksiin.

biologista aktiivisuutta dT-QX arvioitiin aluksi käyttäen solujen elävyyden assay paneelin syöpäsolulinjoja, mukaan lukien ihmisen maksan karsinooma HepG2 ja Hep3B, hiiren maksan karsinooma H22, rinta- adenokarsinooma MCF-7, ja rotan aivojen gliooma C6-soluissa. Ihmisen maksan HL-7702 solulinjaa käytettiin edustavana normaalien solujen tutkimuksessa. HL-7702 transformoidaan ihmisen normaalia maksasoluissa alhainen ilmentyminen syövän merkkiaineiden [24]. Hoito HL-7702, jossa dT-QX ei aiheuttanut merkittäviä sytotoksisuuden pitoisuuksina jopa 200 uM (kuva 3a). N

50 dT-QX kaikissa syöpäsolujen todettiin vaihtelevan 6,6-42,1 uM. Voimakkain sytotoksisuus havaittiin ihmisen maksasyövän Hep3B soluja yli 80% solukuolema 20 uM, jonka jälkeen rinta adenooma MCF-7 ja aivojen gliooma C6-soluissa. Täydellisenä vastakohtana Pip-QX ei-valikoivasti tappoi kaikki solulinjojen HL-7702 50 uM (kuva 3b). Toinen viite yhdiste, AZT kuten 3′-deoksitymidiini analoginen, havaittiin olevan alhainen sytotoksisuus näistä solulinjoista (kuvio 3c), kun taas yhdessä hoito AZT plus Pip-QX myös ei-selektiivisesti tappoi kaikki solulinjat (kuvio 3d ), samanlainen kuin Pip-QX hoito yksinään. Nämä tulokset viittaavat siihen, että selektiivinen tappaminen syöpäsolujen yli normaali maksan soluihin dT-QX johtui ainutlaatuinen kovalenttisen konjugaation sytotoksisten phenylquinoxaline osa, jossa 3′-deoksitymidiini. Vertailun vuoksi syöpälääke doksorubisiinin havaittiin erittäin myrkyllisiä kaikki nämä solut. Itse asiassa, doksorubisiini oli vieläkin myrkyllisiä kohti normaali maksan 7702 soluja kuin maksasyövän Hep3B tai H22 solujen pitoisuus on yli 0,5 uM (kuvio 3e).

Paneeli syöpäsolulinjois- (musta väri) ja normaali maksan hepatosyyttisolulinjasta (punainen väri) käsiteltiin a) dT-QX; b) Pip-QX; c) AZT; d) Pip-QX plus AZT ja e) doksorubisiini, vastaavasti. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin 72 tunnin kuluttua inkuboinnin MTT: llä. Prosentuaalinen elinkelpoisuus laskettiin ja varustettu annos-vaste käyrät käyttäen GraphPad Prism-ohjelmiston. Kaikki käsittelyt suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

edelleen ymmärtää selektiivinen sytotoksisuus dT-QX syöpäsolujen, ensin tutkitaan solujen lisääntymisen käyttäen anti-BrdU fluoresenssin määritystä. BrdU (5-bromi-3′-deoksiuridiinin) on tymidiinianalogi, joka on sisällytetty genomiin, koska se jäljittelee [25]. Siten taso BrdU in solun tumassa kuvastaa tasoa solunjakautumisen ja lisääntymistä. Edellä esitetyn solujen elinkykyä tuloksia, ihmisen HL-7702, HepG2 ja Hep3B solut tutkittiin edustajina normaalien ja syöpäsolujen. Anti-BrdU-määritys suoritettiin 5 tunnin kuluttua dT-QX hoito jää riittävästi kertymistä yhdisteen soluissa ja määrittää sen vaikutus solujen DNA-synteesin. Taso BrdU solutumissa mitattiin käyttäen fluoresoivaa anti-BrdU-konjugaatti [25] (vihreä) kanssa soluytimet vasta- värjätään Hoechst 33342 (sininen väri) kuten kuvassa 4.

BrdU määritys suoritettiin sen jälkeen, kun solut on käsitelty yhdisteiden 5 tuntia. Sisällytetty BrdU värjättiin anti-BrdU Alexa Fluor®488 monoklonaalinen vasta-aine (vihreä) kanssa soluytimet counter Hoechstilla 33342 (sininen väri). a) BrdU HL-7702, HepG2 tai Hep3B soluja käsitellään DMSO tai dT-QX; b) BrdU inHep3B soluja käsitellään DMSO, AZT tai Pip-QX.

Normaalissa ihmisen HL-7702-soluissa, hoitoja DMSO ja dT-QX johti samantasoista BrdU solutumissa , joka osoitti, että läsnä dT-QX eivät häirinneet solujen jakautumista ja lisääntymistä. Kuitenkin merkittävä heikkeneminen havaittiin vihreän fluoresenssin syöpäsoluissa HepG2 ja Hep3B solujen dT-QX kohtelu verrattuna DMSO-kontrollin (kuva 4a). Nämä tulokset osoittivat, että dT-QX selektiivisesti inhiboi solun DNA synteesiä HepG2 ja Hep3B soluja alkuvaiheessa hoidon seurauksena valikoiva tappaa molemmat syöpäsoluja. Estyminen BrdU oli paljon selvempi on Hep3B-solujen täydellinen menetys vihreän fluoresenssin solutumissa (kuvio 4a). Tämä oli yhdenmukainen solujen elävyyden tulokset dT-QX oli tehokkaampi tappamaan Hep3B kuin HepG2-soluissa. Selvempiä sytotoksisuus Hep3B solujen kuin HepG2 voi johtua siitä, että Hep3B on peräisin hepatiitti B [26].

Valaistaan ​​joka chemophore dT-QX oli vastuussa DNA-synteesin estoa, anti-BrdU fluoresenssin määritys suoritettiin AZT tai Pip-QX on Hep3B-soluissa (kuvio 4b). Hoito AZT ei johtanut merkittävästi DNA-synteesin inhibitio, kun taas Pip-QX inhiboi merkittävästi DNA-synteesin soluissa, samanlainen kuin dT-QX, osoittaa phenylquaxinoline chemophore oli vastuussa DNA-synteesin estoa havaittu. Yhdessä solujen elinkelpoisuuden tuloksia, se ehdotti, että konjugaatio 3′-deoksitymidiini yksilöllisesti muokattu sytotoksista phenylquinoxaline chemophore jotta se olisi valikoiva kohti syöpäsoluja kuin normaalisti hepatosyyteissä. Nämä tulokset vahvistavat myös, että konjugoimiseksi kinoksaliini osa, jossa 3′-triatsoli-3′-deoxythymine johti valikoivasti kohdistamista syöpäsolut estämällä niiden DNA-synteesi.

selektiivinen esto tuman DNA-synteesin dT-QX syövässä solut johti hypoteesiin, että dT-QX voi selektiivisesti inhiboida mitokondrio-DNA-synteesin ja aiheuttaa mitokondrioiden samoin. Valitettavasti anti-BrdU fluoresenssimäärityksellä ei ollut riittävän herkkä tarkkailla tällaisia ​​esto soluissa. Vaihtoehtoisesti mitokondrioiden johtuen DNA ehtyminen mukaan nukleosidianalogeja on raportoitu esiintyvän samanaikaisesti kohonnut superoksidi tasolla mitokondrioita hoidon jälkeen 4 päivää [27]. Siksi vaikutus dT-QX on mitokondrioiden toimintaan arvioitiin käyttämällä fluoresenssiin perustuva mitokondriaalisen superoksidi kuvantaminen määrityksessä. Hep3B solut tutkittiin edustajana syöpäsolun mallin vuoksi voimakas estämällä DNA-synteesin varhaisessa vaiheessa dT-QX havaitut anti-BrdU määrityksessä (kuvio 4a).

Huomattava punainen fluoresenssi osoittaa superoksidituotantoa havaittiin Hep3B-soluissa hoidon jälkeen 50 uM dT-QX 8 h verrattuna DMSO: hon (kuvio 5). Sytosolin läsnäolo punainen värjäys superoksidi varmistettiin vasta-värjäys soluytimet kanssa Hoechstin värillä. Todettiin myös, että hoito Hep3B solujen dT-QX lyhyemmän ajan, kuten 3 tai 5 tuntia ei aiheuttanut merkittävää punaista fluoresenssia, mikä viittaa tuotannon mitokondrioiden superoksidi oli kertyviä ja todennäköisesti johtuu estää solun DNA-synteesin. Lisäksi positiivinen kontrolli, jossa on Mn (III) -chelator toimii NADPH /GSH: O

2

– oksidoreduktaasi soluissa [28] johti samantasoiset punaisen fluoresenssin Hep3B soluissa, jotka käsiteltiin dT-QX (katso kuva S8). Sitä vastoin, alhainen tausta punainen fluoresenssi havaittiin ihmisen normaalia HL-7702-soluja käsiteltiin dT-QX, samanlainen kuin käsiteltiin DMSO: iin (kuvio 5). Täten nämä tulokset viittaavat siihen, että dT-QX voi aiheuttaa mitokondrioiden indusoimalla mitokondrioiden superoksidi stressiä syöpäsoluissa jälkeen DNA-synteesin inhibitio.

Cancer solulinja Hep3B tai normaali HL-7702-soluja käsiteltiin DMSO: lla tai 50 uM dT-QX 8 tuntia. Taso mitokondrioiden superoksidi havaittiin MitoSOX mitokondrio superoksidi (punainen väri). Solujen tumat counter Hoechstilla värillä (sininen väri).

Alustava kasvaimia in vivo torjuvaa tutkimuksessa dT-QX suoritettiin hiirimallissa. Ihonalainen kasvaimia perustettu hiiren H22 maksan syöpäsoluja [29]. Kasvainten annettiin saavuttaa keskimäärin kokoa 8,8 x 8,8 mm. Suhteellinen alhainen liukoisuus dT-QX PBS liuokseen rajoittanut antoreitti olevan sisäisen kasvaimen injektiota. Siten AZT tai dT-QX (100 ui × 50 uM kutakin) ruiskutettiin suoraan kasvaimiin päivänä 1 ja päivänä 7. Riippumatta hoitoja, ei hiiret kuolivat myöskään ollut olemassa huomattava laihtuminen havaittu 12 vuorokauden tutkimuksessa. Kasvain kasvu profiilin yli 12 päivän kuluttua ensimmäisestä injektiosta on esitetty kuviossa 6a. Kasvaimia hiirissä, joita hoidettiin AZT kasvoi nopeasti, samanlaisia ​​kuin negatiivisen kontrollin (suolaliuos); kun taas kasvainten kasvua estyi merkittävästi dT-QX käsitellyissä hiirissä (kuvio 6a). Päivänä 12 ensimmäisen injektion jälkeen, minkä kokoisia kasvaimia hiirissä injektoitiin dT-QX olivat selvästi pienempiä kuin AZT tai suolaliuoksella (kuvio 6b). Tilastollinen analyysi vahvisti myös, että hoito dT-QX oli merkittävästi erilainen kuin kaksi muuta (

P

0,01). Nämä tulokset viittaavat siihen, että sisäisen kasvaimen injektion dT-QX alhaisella annostuksen (vastaa 0,13 mg /kg hiiri) oli varsin tehokas estämään kasvua ihon alle kasvaimien hiirimallissa.

ihonalainen kasvain oli todettiin injektoimalla H22 solun alaselän BALB /c-hiirten ihon alle (3 x 10

6 solua hiirtä kohti).