Krooninen sairaus

tiivistelmä

CRC syöpä on yksi tappavimmista taudeista länsimaissa. Jotta voitaisiin kehittää prognostisia biomarkkereita CRC (peräsuolen syöpä) aggressiivisuus, analysoimme takautuvasti 267 CRC potilaiden kautta romaani, moniulotteinen biomarkkereiden alustalla. Käyttämällä nanofluidic teknologiaa qPCR analyysiä ja määrällinen loisteputki immunohistokemiallisesti proteiinin analyysissa arvioitiin 33 MikroRNA, 124 mRNA: t ja 9 proteiiniantigeenejä. Analyysi tehtiin kunkin yksittäisen ulottuvuus (microRNA, geeni tai proteiini) käyttäen sekä monimuuttuja Coxin malli ja Kaplan-Meier-menetelmällä. Sen jälkeen olemme yksinkertaistaneet sensuroitiin Eloonjääntitulokset binary vastetiedot (aggressiivinen vs. muu aggressiivinen syöpä). Myöhemmin olemme integroineet tiedot diagnostisen pisteytä viipaloitu käänteistä regressio riittävä ulottuvuus vähentämiseen. Tarkkuus arvioitiin käyttämällä ala vastaanotin toimii ominaiskäyrä (AUC). Yhden dimensioanalyysi ansiosta on paljastunut Yksittäisten tekijöiden, jotka olivat merkittäviä ennustajia lopputuloksen. Näihin sisältyy seitsemän erityistä MikroRNA, neljä geenejä, ja yhtä proteiinia. Kun nämä tekijät määrällisesti yksittäin ennustajina aggressiivinen tauti, korkein osoitettavissa käyrän alapuolisen alueen (AUC) oli 0,68. Sen sijaan, kun kaikki tulokset yhdellä mitat yhdistettiin integroituja biomarkkereita, AUC lisääntyivät dramaattisesti arvoihin lähestyy ja jopa ylittää 0,9. Yhden dimensioanalyysi tuottaa tilastollisesti merkitsevä ennustavia, mutta niiden ennustava vahvuudet ovat optimaalisia kliinistä hyötyä. Romaani, moniulotteinen integroitu lähestymistapa voittaa nämä puutteet. Vasta johdettu integroitu biomarkkereiden on potentiaalia mielekkäästi ohjata valintaa hoitostrategioiden yksittäisille potilaille samalla valaisemaan molekyylitason mekanismeja ajo taudin etenemistä.

Citation: Mariani M, hän S, McHugh M, Andreoli M, Pandya D, Sieber S, et ai. (2014) Integrated Moniulotteinen analyysi vaaditaan Tarkka Prognostiset biomarkkerit sisään peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (7): e101065. doi: 10,1371 /journal.pone.0101065

Editor: John Souglakos, University General Hospital Heraklionin ja laboratorio kasvain solubiologian, School of Medicine, University of Kreeta, Kreikka

vastaanotettu: huhtikuu 15, 2014; Hyväksytty: 3 kesäkuu 2014; Julkaistu: 02 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Mariani et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ oli osittain tukee Grant päässä Ruth C. Donovan Cancer Research Program ja liberaali lahjoitus herra ja rouva Ruggles . Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

CRC on yksi tappavimmista taudeista maailmanlaajuisesti. Valkoihoisiin paikallisten, alueellisten tai etäpesäkkeitä omaavat 5 vuoden pysyvyys 66%, 44%, ja 4%: lla [1]. Tauti vaihe aikaan leikkaus on vakiintunut tärkeimmäksi ennustetekijä CRC. Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, kokonaiselinajan mediaani on kasvanut merkittävästi uusien sytotoksisten aineiden ja biologinen hoitoja. Vastaus tällaisia ​​hoitoja riippuu molekyyli- determinantit joiden selvittäminen on ollut kiivasta ja tuottavaa tutkimustyötä. Nyt tiedämme, että esimerkiksi syövät kätkeminen aktivoivat KRAS mutaatioita eivät reagoi anti-EGFR terapia [2]. Kuitenkin tavoite optimoida hoitomenetelmistä perustuu ainutlaatuiseen molekyylitason ominaisuudet yksilön kasvain ei edelleenkään tunneta. Kehittäminen uusien biomarkkereiden jotka voivat luotettavasti tunnistaa potilaat suuri riski taudin etenemiseen ja kuolemaan olisi erityisen hyödyllistä määritettäessä kliinisiä olosuhteita adjuvanttihoitoa on perusteltua. Kun taas käyttö antimetaboliittina 5-fluoriurasiili (5FU) on tavanomaista hoitoa potilaille, joilla on vaiheen III CRC, sen mahdolliset hyödyt verrattuna riskeihin II vaiheessa CRC potilailla on kiistanalaista ja keskustelua [3]. Koska vankan kliinisen ennustaja taudin tulos, päätös käsitellä tai ei käsitellä vaiheen II potilaat 5FU voi levätä objektiivisia ja yrityksen kriteerit. Aiemmin tunnistettu ennustava biomarkkereita, joka oli osoittautunut lupaavaksi tällä areenalla lukien telomeraasi, muuttaen kasvutekijät (TGFa ja TGF), orvaskeden kasvutekijät (erbB2 ja erbB3) ja musiinin (MUC1 ja MUC2) ovat pettyneitä tutkimuksissa kliininen hyöty [4].

perinteinen lähestymistapa biomarkkereiden kehitys on riippuvainen yhden ulottuvuuden (microRNA, geeni tai proteiini) analyysi yritetään liittää yhden molekyylikokonaisuutena kasvaimen käyttäytymisen. Tämä menetelmä näyttää saavuttaneen huippunsa, joka on optimaalinen kliinisessä päätöksenteossa. Aiemmat moniulotteinen lähestymistavat ovat osoittaneet, että yhdistämällä biomarkkereita tulevat eri ulottuvuuksien parempi tietämys biologian CRC voidaan saavuttaa [5], [6], [7]. Yrittäessään tarjota enemmän yksilöllisiä vaihtoehtoja, olemme kehittäneet uuden menetelmän, joka edelleen edistää integraatiota ja sisältää useita molekyylikokonaisuuksiin kaikkien kolmen molekyylin ulottuvuuksista (microRNA, geenien ja proteiinien) samanaikaisesti tuottaa tarkkoja ennustavia lopputuloksen potilailla, joilla on CRC. Tuloksemme osoittavat selvästi paremmuuden tämän uuden, moniulotteinen lähestymistapa verrattuna perinteiseen työkaluja yhden dimensioanalyysi. Olemme toiveikkaita, että äskettäin löydetty moniulotteinen biomarkkerit antavat perustan menestyksekkäälle triage ja kerrostuminen potilaiden prospektiivisessa kliinisessä tutkimuksessa samalla paljastaen molekyyli- aineita ja reittejä pelaa näkyvä synkkää rooleja CRC taudin etenemistä.

Materiaalit ja menetelmät

Gene ja mikro-RNA ilmaisun arvioida nanofluidic teknologia

kliinisessä kohortin 267 paksusuolen syöpäpotilaiden analysoitiin tässä retrospektiivinen tutkimus. Hyväksymisen jälkeen Danbury sairaalan sisäinen Review Board (DHIRB) ja kerääminen kliiniset tiedot, FFPE näytettä otettiin paksusuolensyöpä tapauksissa, jotka oli säilytetty vuosien 2000 ja 2008. Protokollan mukaan tutkimuksen (DH-17/12 ) mukaan lukien täydellinen de-tunnistaminen potilastietoja, DHIRB luopua tarve tietoista suostumusta. FFPE näytteet leikattiin 10 um paksuuteen ja kaksi kudosleikkeitä pantiin 1,5 ml: n putkeen. Kuhunkin putkeen, yksi millilitra ksyleeniä lisättiin deparaffinization jälkeen sekoitetaan kahdesti nopea pyörre 3 minuuttia huoneen lämpötilassa. Kokonais-RNA sitten automaattisesti uutetaan QIAcube käyttäen miRNeasy FFPE (Qiagen, Valencia, CA) ja noudattamalla valmistajan protokollaa. RNA: n SW837 soluista automaattisesti uutetaan QIAcube käyttäen miRNeasy (Qiagen, Valencia, CA) ja noudattamalla valmistajan protokollaa. RNA määrä ja laatu arvioitiin Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Analyysi suoritettiin käyttäen 48.48 dynaaminen taulukko (Fluidigm Corporation, CA, USA) ja Biomark alustan noudattamalla valmistajan protokollan kuten aikaisemmin on kuvattu [8], [9].

Quantitative loisteputki immunohistokemia

kvantitatiivinen loisteputki immunohistokemia suoritettiin proteiinin analyysiin. Kudosnäytteet valmistettiin Tissue Micro Array (TMA) muotoon: edustaja kasvain alueet saatiin Formaliini Kiinteät parafiiniin (FFPE) yksilöihin primaarikasvaimen, ja jopa kolme edustavaa jäljitellä 3 mm ydintä useilta kasvainkudospalasta otettiin jälkeen tarkistaa ja merkintä hematoksyliinillä ja eosiini värjätään levyihin board-sertifioitu patologeja (SS ja PF). Kaikkiaan 630 ydintä otettiin ja jaettu yli 16 diat 267 potilasta. FFPE kudoksiin käytettiin kontrolleina reaktion sisältyy normaali paksusuoli, munuainen, maksa, aivot, rinnan, imusolmukkeiden, kilpirauhanen, iho, nielurisojen, luurankolihaksiin ja rakon sekä rintasyöpä ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

TMA dioja poistettiin parafiini ksyleenillä ja sen jälkeen niihin lisätään peräkkäin laimennettu etanolilla ratkaisuja. Antigeeni haku suoritettiin kuumentamalla objektilasit höyrystimen 30 minuuttia liuoksessa, jossa oli Tris-EDTA, pH 8,0. Endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus estettiin käsittelemällä liukuu Peroxidazed reagenssia (Biocare Medical, Concord, CA) 5 minuutin ajan. Ei-spesifinen sitoutuminen vähennetään inkuboimalla tausta Sniper (biocare Medical, Concord, CA) 10 minuutin ajan. Objektilasit inkuboitiin ensisijainen kohde vasta-aineita ja epiteelin ja stroomasolulinja maski vasta laimennetaan Da Vinci Green vasta-laimenninta (Biocare Medical, Concord, CA) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Yksityiskohtaiset tiedot kaikista vasta käytetyt ovat taulukossa S1. Syaniini 5 (Cy5), konjugoitu suoraan tyramide (Perkin-Elmer, Boston, MA) 1:50 laimennosta käytettiin fluoresoivaa tunnistus kaikki tavoite antigeenejä.

Tilastollinen analyysi

single dimensioanalyysi, eloonjäämiseen laskettiin alkaen diagnoosi kuolinpäivästä tai päivästä viimeksi nähty. Mediaanit ja elämän taulukoita laskettiin käyttäen tuote-rajan arvio Kaplan ja Meier menetelmällä, ja Log Rank testi käytettiin vain arvioida tilastollisen merkittävyyden. Monimuuttuja-analyysi arvioi kliininen merkitys kunkin tekijän yhdistetä muihin kliinisiin (ikä, vaihe, luokittelua, kasvaimen tyyppi, ja sukupuoli), seuraavat Coxin suhteellisten riskien mallia. Yksinkertaistamaan kysymys sensuroidaan, poistamme potilaista sensuroitiin 3 vuoden kuluessa ja muutti Eloonjääntitulokset binary vastaus joko aggressiivinen tai ei-aggressiivinen. Kunkin tekijän osoittautunut olevan merkittäviä monimuuttujamenetelmin (p-arvo 0,05), alue käyrän alla (AUC) vastaanottimessa toimivat (ROC) käyrä käytettiin arvioimaan erottelukykyä.

moniulotteinen analyysi, aineisto oli satunnaisesti jaettu koulutukseen ja testaus subsets, 125 tapausta kussakin osajoukossa. Useita biomarkkerit yhdistettiin, jolloin saatiin diagnostisia pisteet, joka käytettiin ennustaja tuloksiin. Voit luoda pisteet, ensin käytetty viipaloitu käänteistä regressio [10], [11] tehdä riittävän suuria vähentäminen jolloin mitään tietoa ehdollinen jakauma tuloksesta katosi aikana ulottuvuus vähentäminen. Seuraavaksi skalaari diagnostinen pisteet laskettiin alemmasta mitoitustiedot syntyy ensimmäinen askel uskottavuussuhde tilastotieto, joka on osoittautunut optimaaliseksi kaikkien mahdollisten toimintojen useita merkkiaineita binary taudin tuloksia [12]. Tämä lähestymistapa mahdollisti hyödyntämisen tietoja useista markkereita samanaikaisesti ilman tarvetta tehdä oletukset jakaumat markkereita. Cox ja Kaplan-Meier malleja käytettiin arvioimaan tilastollinen merkitys moniulotteisten biologisten merkkiaineiden monimuuttujamenetelmin edellä kuvatulla tavalla.

Tulokset

Expression Analyysi mikroRNA

Tärkein kliininen parametrit n 267 CRC potilaat osallistuivat tähän retrospektiivinen analyysi on esitetty taulukossa 1. Kaikki näytteet kerättiin ensimmäisen leikkauksen ennen minkäänlaista käsittelyä. Kuten odotettiinkin tärkein kliininen tekijä ennustaa lopputulos oli sairauden vaiheesta. Potilaille vaiheessa IV etenemistä oli nopea mediaani eloonjäämisprosentti 11 kuukautta, kun taas potilaat aiemmissa vaiheissa lopputulos oli parempi (Fig. 1). Kaikki potilaat hoidetaan sitten parasta saatavilla hoitoa ja tämä tutkimus keskittyy puhtaan prognoosi- ennustavia eikä hoitovastetta ennustavat erityisiä hoitoja. Ensimmäisessä vaiheessa, me seulotaan sarjan 33 MikroRNA tunnistamaan mahdolliset ennustavia lopputuloksen Monimuuttuja-analyysissä kuten ikä ja vaihe Cox mallissa. MikroRNA valittiin lukumäärän mukaan sitaattien PubMed käyttäen avainsanoja termejä ”peräsuolen syöpä” ja ”microRNA”. Kymmenen MikroRNA (MiR-532-3p, Mir-200a, Mir-17, Mir-106a, MiR-193a-5p, MiR-145, MiR-375, Mir-29a, MiR-18a ja Mir-200B) olivat tilastollisesti merkitseviä jossa arvojen alue riskisuhde (RR) alle 1 kutakin, eli korkea ilmentyminen liittyvät hyvään lopputulokseen (taulukko 2). Tukemaan edelleen tulokset Cox analyysin, tiedot arvioitiin myös käyttämällä Kaplan-Meier-menetelmällä. Viisi viidennes cutoffs (25, 33, 50, 67 ja 75) käytettiin ositusta potilaiden korkea ja matala ilmentymisen kunkin mikroRNA ja log-rank testi palvelee havaita, jos erot lopputulos olivat merkittäviä. Viidennes sulku tarjoaa alimman p-arvoon log-rank-testiä käytettiin erotin (taulukko 2). Seitsemän MikroRNA (Mir-200a Mir-17, Mir-106a, MiR-375, Mir-29a, MiR-18a ja Mir-200B) varmistettiin olevan merkittävä käyttäen Kaplan-Meier menetelmä ja vastaavat käyrää kuvassa . 2.

punainen vaiheen I-II (n = 176), vihreä vaiheen III (n = 82) ja sininen vaiheessa IV (n = 8).

Kaplan-Maier-analyysi suoritettiin jakamalla potilaille korkea (vihreä) ja alhainen (punainen) asetus. Survival aikataulu on kuukausiin. Kaikki erot olivat suuria ja p-arvot raportoidaan taulukossa 2 (Log-rank-testi).

Expression analyysi geenien

Nanofluidic teknologia tarjoaa etu, että analyysin MikroRNA ja niiden kohdegeenien (targetome) samassa RNA-näytettä vähäisen tilavuuden kunkin yksittäisen qPCR analyysi. Suorittaa näitä määrityksiä, käytimme useita ohjelmistosovelluksia (www.miRbase.org) [13] valmistelemaan luettelon geenejä, jotka saattavat olla kohdistettavaksi mukaan 33 MikroRNA tässä tutkimuksessa. Luetteloa priorisoidaan toimiva verkko, joka saadaan DAVID ohjelmisto (https://david.abcc.ncifcrf.gov) [14], jotta rikastuttaa altaan käytännöllisiä tavoitteita ja master sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen ja apoptoosin. Sen jälkeen ensimmäisen analyysin 180 ehdokasta, keskityimme 79 geenejä, joiden ilmentyminen oli havaittavissa suuri määrä CRC syöpäpotilailla. Kuusi geeniä (MiD1, INHBA, OSBPL3, BGN, DICER1 ja FAP) ovat ennustavia in Yksiulotteisissa analyysi (tietoja ei esitetä), mutta vain MiD1 säilyi merkitsevänä jälkeen monimuuttuja korjauksen ja Kaplan-Meier-analyysi (taulukko 3 ja Fig. 3). Toisena toimenpiteenä mahdollisesti lisätä kandidaattigeenien, analysoimme julkisen aineisto GSE14333 raportointi transcriptome analyysi 290 CRC syöpäpotilaiden [15]. Kunkin yksittäisen geenin, analysoitiin, ja lasketaan monimuuttuja Coxin mallin, kuten on kuvattu edellä (taulukko 4). Ennakoiva kyky vahvistettiin Kaplan-Maier-analyysi käyttäen useita menettelyä kvintiilin valinta cutoff kuten edellä on kuvattu. 45 geenit alin p-arvot monimuuttujamenetelmin arvioitiin meidän alusta nanofluidic geenin ilmentymisen. Vain 3 out of 45 (7%) geenien vahvistettiin ennustajina toteutumaan vuosina GSE14333 ja meidän hoitopaikassa monimuuttuja Coxin ja Kaplan-Meier-analyysi (ANO1, KANK4 ja IGFBP3, taulukko 4 ja Fig. 3).

Kaplan-Maier-analyysi suoritettiin jakamalla potilaille korkea (vihreä) ja alhainen (punainen) asetus. Survival aikataulu on kuukausiin. Kaikki erot olivat suuria ja p-arvot raportoidaan taulukossa 3 (Log-rank-testi).

Expression analyysi proteiinien

Tehdään analyysi proteiini tasolla, päätimme 9 tekijät (TUBB3, ELAVL1, OSBPL3, IGFBP3, ANO1, HGF, Gli3, PPP2CA ja ARNT2). TMA valmistettiin samalla parafiiniblokit käytetään geenien ja microRNA analyysi. Kolmena kappaleena ytimet kulloinkin sisällytettiin TMA kaapata klonaalisen heterogeenisyys, ja kukin TMA analysoitiin kolmena kappaleena Multipleksoituja, kvantitatiivinen loisteputki immunohistokemia. Tumat värjättiin DAPI (sininen kanava), ja strooman ja epiteelin solut värjättiin anti-vimentiinista (vihreä kanava) ja anti-sytokeratiini (keltainen kanava), tässä järjestyksessä. Antigeenit kohteisiin hankittu punaisen kanavan, ja edustava kuva analyysi IGFBP3 ja ANO1 on esitetty kuvassa. 4A. Kunkin proteiinin ilmentyminen kvantifioitiin AQUA ohjelmisto, joka käyttää valvomatta algoritmia määrällisesti ilmaisun määritelty subsellulaarisia osastoissa tai ”maskeja”. Tutkimuksessamme olemme valittu neljä naamarit: kasvain (sytokeratiini- +), strooman (vimentiinistä +), kasvaimen ytimet (DAPI + /sytokeratiinia +) ja kasvaimen sytoplasmassa (DAPI- /sytokeratiini +). Kunkin 3 mm ydin, ainakin kolme sähköisen alaosia (histospots) analysoitiin. Koska rinnakkaisten analyysin, keräsimme jopa 18 AQUA tulokset kullekin potilaalle, jotka sitten keskiarvo. Gli3, ARNT2 ja HGF osoittivat pääasiassa tumavärjäystä joissakin syöpäsoluissa, kun taas toisissa, värjäytyminen oli pääasiassa sytoplasmista. Voit hyödyntää tätä ilmiötä, hakemisto luotiin jakamalla ydinvoiman yli sytoplasmista ilmaisua. Arvo 1 oli tyypillistä voimakas tumavärjäystä, kun taas arvo 1 osoitti pääasiassa sytoplasmista rakenteessa ilmaisun. Expression kaikkien proteiinien ja indeksin analysoitiin Coxin monimuuttuja regressioanalyysiä. Vain ilmaus ANO1 (syöpäsoluissa ja ytimet syöpäsolujen) oli merkittävä monimuuttujamenetelmin (taulukko 5 ja kuvio. 4B).

V: ylhäältä alas seuraavien signaalien ovat edustettuina: antigeeni korko (punainen kanava), solutumissa (DAPI), kasvainsolujen (sytokeratiini-), stroomasolut (vimentiinista) ja yhdistetyn kuvan. B: Kaplan-Maier analyysi 267 potilasta mukaan ilmaus AQUA tulokset ANO1 sisällä kasvaimen maskin (ANO1_AQUA) ja tumassa syöpäsolujen (ANO1_Nuclear_AQUA). Kaplan-Maier-analyysi suoritettiin jakamalla potilaille korkea (vihreä) ja alhainen (punainen) asetus. Kaikki erot olivat suuria ja p-arvot raportoidaan taulukossa 5 (Log-rank-testi).

laskeminen Ennakoiva Tarkkuus

Jaoimme potilaat kahteen kliinisessä ryhmiä kiinnostava, jotta yksinkertaistamisen sensuroitiin tiedot binary vastausta. Ne elossa alle kolme vuotta diagnoosista leimattiin olevan aggressiivinen tauti, kun taas elossa enemmän kuin kolme vuotta katsottiin olevan enemmän veltto, ei-aggressiivinen tauti. Kunkin yksittäisen tekijöiden kolme ulottuvuutta edellä (microRNA, geeni tai proteiini) testattiin ennustajana taudin aggressiivisuuteen käyttäen ROC-käyrät AUC laskentaan. Vaikka jotkut tekijät olivat tilastollisesti merkitseviä Monimuuttuja-analyysissä suurin AUC saada mistä tahansa yksittäisen biomerkkiaineen yhdessä ulottuvuus oli vain 0,68 (ADAMTS5). Hyödyntämällä niin heikko ennustaja potilaiden hoitamiseen olisi hyväksyttävää, koska se on epätarkka (joko vääriä positiivisia tai esiintyminen negatiivinen) noin kolmanneksessa tapauksista.

Generation moniulotteisen biomarkkereiden

arveltu, että , yhdistämällä tietoja eri ulottuvuuksia (microRNA, geeni ja proteiini), voisimme merkittävästi lisätä ennakoivaa tarkkuutta. Kuitenkin moniulotteisuus synnyttää merkittäviä laskennallisia monimutkaisuutta ja haasteita. Kun taas yhden dimensioanalyysi määrä pidetään muuttujien meidän tapauksessamme on melko rajoitettuja 188, moniulotteinen analyysi kaksi ja kolme muuttujaa tuottaa 17578 ja 1089836 yhdistelmiä, tässä järjestyksessä. Hallinta tyypin 1 virheet ristivalidointi on kriittisen tärkeä kuin muuttujien määrä nousee. Tästä syystä kun ilman 17 potilasta puutteellisten tietojen me satunnaistetusti jäljellä 250 potilasta joko koulutusta tai testausta setti (Tab. 1). Ensimmäisessä vaiheessa, me satunnaisesti valitsimme joko kaksi tai kolme muuttujaa kaikilta MikroRNA, geenejä ja proteiineja, jotka me harkita. Riittävän ulottuvuus vähentäminen, muuttujat yhdistettiin uuteen diagnostinen pisteet, joka sisälsi kaikki tiedot on vanhemman tekijöistä. Laskenta osoitti selvästi, että lisäämällä määrää tietoja eri ulottuvuuksia, lasketun AUC lisääntyi harjoitussarjassa (Kuva. 5A). Sen jälkeen kun laskenta kaikista 1089836 moniulotteinen ennustavia, valitsimme yhdistelmät, joilla on korkein sijoitusta AUC. Sitten lisäsimme yhden lisäbiomarkkeria kerrallaan, joka on microRNA, geeni tai proteiini, osaksi nykyistä yhdistelmät kun otetaan huomioon kaikki mahdolliset yhdistelmät, ja laski AUC uudelleen harjoitussarjassa (Fig. 5B). Tämä prosessi toistettiin kunnes AUC saavutti huippunsa ja ei lisätä merkittävästi lisäämällä ylimääräisiä ennustajia olemassa olevaan yhdistelmiä. Nämä maksimit saavutettiin kun määrä muuttujia sisäkkäin yhdistelmä saavutti 10. harjoitussarjassa (Fig. 5B). Sen jälkeen olemme analysoineet alkuun yhdistelmien testauksessa asettaa ja löysimme 15 moniulotteisen biomarkkerit (MB), joka osoitti AUC-arvot 0,83 koulutuksessa ja testaus sarja (koostumus on esitetty taulukossa 6, 7 ja 8) tukee käsitystä siitä, että moniulotteinen biomarkkerit ovat tarkempia kuin yksittäiset yhden ulottuvuuden ennustaja. Tästä luettelosta, valitsimme 4 tarkin moniulotteisen biomarkkerit (MB1 ja MB4), joissa jokaisessa on AUC on noin 0,9 sekä koulutuksen ja testi sarjaa (Fig. 6A). Niiden koostumus on esitetty graafisesti kuvassa. 6B. Nämä biomarkkerit olivat myös erinomaisia ​​ennustajia tulos Kaplan-Meier-analyysi (Fig. 6C).

boxplot, alhaalta ylös, ne ovat Q1-1.5 * IQR, Q1, mediaani, Q3, ja Q3 + 1,5 * Q3 jossa Q1 on ensimmäinen kvartiili (25

persentiilin), Q3 on kolmas kvartiili (75

persentiilin), ja IQR on neljännespisteiden (eli Q3-Q1). A analyysi on tehty yhdellä muuttujalla, kaikki mahdolliset kahden (n = 17578) ja kolme muuttujaa (n = 1089836). B analyysi suoritetaan lisäämällä yksi uusi muuttuja (geeni, microRNA tai proteiini) edellisen päälle yhdistelmät.

graafinen kaavio kokoonpanosta MB1-4 (B). Sininen, vihreä ja punainen proteiinia, geenejä ja microRNA raportoidaan. Kaplan-Maier analyysi koulutuksen ja testauksen mukaisesti asetettujen ilmentymisen alkuun 4 MB (C). Kaikki erot olivat erittäin merkitseviä (Log-rank-testi) ja on esitetty taulukossa 7 ja 8 koulutus- ja testaus asettaa vastaavasti.

Keskustelu

CRC syöpä on edelleen kesken tappavin syöpäsairauksia. Kliiniseen hallintaan, erityisesti vaiheen II ja III sairaus, useita hoitovaihtoehdot ovat nyt käytettävissä. Kuten havaitaan myös meidän kliinisessä tutkimuksessa lopputulos on useimmiten ohjaavat kliinisessä vaiheessa diagnoosin kanssa vaiheessa IV potilailla vakavasta ennustetta. Kuitenkin myös potilailla, joiden aikaisemmissa vaiheissa lopputulos ei ole ainoastaan ​​suotuisa, joilla on merkittävä taudin uusiutumista. Löydöt tehokas biomarkkerit joka voi ohjata terapeuttisia päätökset kunnianhimoisesti etsitään toiveet saavuttaa parhaat mahdolliset tulokset, minimoi ei tarvita ja myrkyllisiä menettelyjä. Joukko tutkimuksia on tehty kohti tätä varten [2], [16], [17]. Ihanteellinen biomarkkereiden ajaa kliinisiä hoitoja pitäisi olla merkittävä monimuuttujamenetelmin kun ottaa vankka ennustava tarkkuus muutamia vääriä positiivisia ja vääriä negatiivisia tuloksia. Jonkin verran menestystä on saatu suhteen valinnassa erityistä terapeuttista hoito mukaan myrkyllisyys ja tehokkuus [2]. Kuitenkin suurin osa näistä lupaavia yksittäisten biomarkkerit ovat jääneet kliinisissä kokeissa [18]. Monimutkaisemmat biomarkkerit on luotu, vaikkakin yhdellä ulottuvuus. Yksi 12-geenin paneeli oli tehokas riskin ennustamisessa toistuminen ja hoitovasteen suuressa kliinisessä tutkimuksessa 1436 potilasta vaiheen II ja III CRC potilaille [19]. Kuitenkin myöhemmin validointitutkimukset ei toistamaan samoja tuloksia [20], koska akilleenkantapää tämän teknologian edelleen epätarkkuus riippumattomien validointitutkimuksissa. Meidän tutkimuksen aiomme ulottuvuuden luonne muuttujan, joka microRNA, geenin tai proteiinin. Uskomme, että epätarkkuus on oltava riippuvainen ainakin osittain siitä, että 12-geeni allekirjoitusta saatiin vasta geenin ulottuvuus, mikä supistaminen mahdollisesta roolista, että muut tekijät, kuten microRNA ja proteiini voi olla ennakoivaa valmiudet geenien. Tämä aikaisempi kokemus sai meidät uudelleen, miten ennakoivan biomarkkereiden rakennetaan. Syöpä aggressiivisuus on monimutkainen piirre useimmissa tapauksissa. Se on kuin monitekijäinen yhtälö. Jotta kuvio monimutkaisempia, kuten useita tekijöitä ovat peräisin eri ulottuvuuksia, kuten geenien, proteiinien, DNA-sekvenssit ja eri solualaryhmän (syöpä ja strooman). Ajatuksenamme oli keskitys ennustuksen integroituun analyysimenetelmää lukien enemmän ulottuvuuksia ja useamman samanaikaisesti. Uskomme, että vain integroitu lähestymistapa voi päästä lähemmäksi ratkaisua monitekijäinen yhtälö. Tulokset esitämme tässä tutkimuksessa tukevat hypoteesia. Meidän kohortin CRC potilailla, ensin analysoidaan suuren paneeli mahdollista yksittäisten ennustavat tulevat kunkin kolmen yksittäisen mitat (microRNA, geeni tai proteiini). Olimme todellakin pystyy tunnistamaan tilastollisesti merkitsevä ennustavia lopputuloksen määritettynä Coxin monimuuttuja-analyysi ja Kaplan-Meier-menetelmällä. Jotkut näistä ennustavat ei ole laajasti tutkittu CRC tasalla. Esimerkiksi ilmaus ANO1 (anoctamine 1) todettiin olevan tilastollisesti merkitsevä-geenin ja -proteiinin taso, uudelleen valvoa viime tulevan datan analyysin aineisto GSE14333 [15]. Kuitenkin AUC ANO1 meidän analyysi ei ollut suurempi kuin 0,65, mikä tarkoittaa, että kuljettajana kliinisten päätösten ANO1 olisi misclassify johdonmukainen määrä potilaita. Siten tilastollista merkittävyyttä ei välttämättä mahdollista kliinistä hyötyä. Laiminlyönti tunnustaa tämä tosiasia voi selittää paljon pettymys yksittäisten biomarkkerit peräisin yhdestä ulottuvuudesta [4], [20].

Ei tyytyväinen AUC alle 0,7 ja toiveet kehittää vankempi ennustavia, pyrimme yhdistämään tietojemme uusilla tavoilla. Tässä käsikirjoitus, tarjoamme yksityiskohtia moniulotteinen alustan, joka yhdistää nanofluidic tekniikka määrällisiä loisteputki immunohistokemia luoda biomarkkerit kanssa AUC lähestyy ja jopa ylittää 0,9. Vaikka määrä muuttujia, jotka on analysoitava on valtava, tämä voimakas työkalusarja voi kerätä moniulotteisia tietoja kohtuullisin reagenssi kustannukset FFPE näytteiden ($ 0,20 geeni /microRNA analyysi, $ 0,85 proteiinia).

Beyond ennustavat kliinisen tulos, meidän määritys voi korostaa molekyyli- kuljettajia aggressiivisuus. Esimerkiksi IGFBP3 näkyy kaikissa neljässä alkuun moniulotteisen biomarkkereita. Tämä antigeeni on tunnettu tutkijoille CRC, vaikka ristiriitaiset tiedot ovat läsnä kirjallisuudessa jonka vaikutuksista [21]. Tällä geeniekspression tasolla sekä GSE14333 ja meidän tietokokonaisuus, korkea ilmentyminen IGFBP3 liittyi huonoon lopputulokseen. Tämä on sopusoinnussa muiden aikaisempien tutkimusten [21], [22], [23]. Todisteet varmasti syytöksiä tämän geenin näkyvästi kuljettaja CRC syövän aggressiivisuudesta huolimatta olento ristiriidassa aikaisemmista tutkimuksista kytkemällä IGFBP3 ilmaisun antiproliferatiivista vaikutusta kasvuun koolonkarsinoomasoluissa (tarkistetaan [24]).

Only kaksi muuttujaa olivat läsnä 3 ulos 4 alkuun moniulotteinen biomarkkereita: ADAMTS5 ja HGF indeksi. ADAMTS5 on jäsenenä ADAMTS (a disintegriini- ja metalloproteinaasi kanssa trombospondii- motiivien) proteiinin perheen. Entsyymi tämän geenin koodaaman sisältää kaksi C-terminaalista TS motiiveja ja toiminnot kuin aggrekanaasin pilkkomaan aggrekaani, suuri proteoglykaani ruston [25]. Kuten yksittäinen tekijä, että aineisto GSE14333, korkea ilmentyminen liittyy huono lopputulos useita koettimia. Kuitenkin meidän analyysi, tämä seikka ei osoittanut merkittävää kehitystä monimuuttujamenetelmin kuin yksittäinen tekijä. Kirjallisuutta ADAMTS5 CRC syöpä on erittäin rajoitettu ainoastaan ​​yhden tutkimuksen ilmoittamassa geenin yksi hypermetyloitunut kasvain verrattuna ympäröivän normaalin paksusuolen limakalvo [26]. Toinen muuttuja, HGF (hepatosyyttikasvutekijää) indeksi, edustaa polku, joka tiedetään aktivoidaan aggressiivinen CRC. HGF on laajasti tutkittu mahdollisena uusi tavoite (tarkistetaan [27]). Vaikka HGF ilmentyminen immunoperoksidaasivärjäystä näkyy selvästi soluliman kuvio CRC syöpäsoluissa [28], meidän immunofluoresenssimäärityksellä osoittanut ydin- kuvio, joka oli kliinistä merkitystä. Samanlainen ydinvoiman reseptorin paikallistaminen HGF c-Met, on raportoitu rintasyövän soluissa, jos yli-ilmentyminen liittyi lisääntynyt metastaattisen potentiaalin ja aggressiivinen tauti [29].

Yhteenvetona, CRC syöpä aggressiivisuus on monimutkainen piirre, jota ei voida ennustaa sopivalla tarkkuudella käyttämällä yksilön, yksi kolmiulotteinen tekijä (microRNA, geeni tai proteiini). Sen sijaan moniulotteinen integroitu lähestymistapa, jossa käytetään tietoja microRNA, geeni- ja proteiini-analyysi voi tuottaa tarkkoja ennustavat biologista käyttäytymistä, edistää paremmin kliinisen hoidon CRC, ja loistaa valokeilaan molekyylejä ja molekyylien polkuja, jotka liittyvät ja mahdollisesti syy huonon lopputuloksen.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Luettelo vasta, toimittajien ja lopullinen pitoisuus käytetty.

doi: 10,1371 /journal.pone.0101065.s001

(DOCX) B

Kiitokset

Tätä työtä on omistettu muistiin Renato Andreolin joka kuoli ja peräsuolen syövän iässä 57.