Krooninen sairaus

tiivistelmä

kaperoni- nucleophosmin (NPM1) on yli-ilmentyy epiteelisolujen osastoon eturauhasen kasvaimia verrattuna viereiseen terveitä epiteelin ja voi edustaa yksi tärkeimmistä toimijoita, jotka tukevat kasvainilmiasua eturauhasen adenokarsinooma soluja. Silti mekanismit että taustalla NPM1 välittämä fenotyyppi jäädä hämäräksi eturauhasen. Jotta voitaisiin paremmin ymmärtää NPM1 toimintoja eturauhassyöpäsoluissa, pyrimme luonnehtia sen vaikutus syöpäsolujen käyttäytymistä ja tulkita mekanismeja, joilla se voi toimia. Tässä osoitamme, että NPM1 suosii eturauhaskasvainsolun muuttoliike, invaasiota ja pesäkkeitä muodostavien. Lisäksi pudotus on NPM1 johtaa lasku kasvuun LNCaP-johdettu kasvainten oksastettu Nude-hiirissä

in vivo

. Tällaiset onkogeeniset kaltaisia ​​ominaisuuksia löytyy yhdessä positiivisen sääntely NPM1 annetun ERK1 /2 (Solunulkoisilla signaali säätelemät kinaasien 1/2) kinaasin fosforylaation vastauksena EGF (epidermaalinen kasvutekijä) ärsyke, joka on kriittinen eturauhassyövän etenemisen käyttöönoton jälkeen itsenäisen tuotannon kasvutekijä. NPM1 voisi olla kohde sammuttaa nimenomaan ERK1 /2-reitin aktivaatio, jotta vähennetään tai estää syöpäsolujen kasvua ja muuttoliike.

Citation: Loubeau G, Boudra R, MAQUAIRE S, LOURS-Calet C, Beaudoin C, Verrelle P, et ai. (2014) NPM1 hiljentäminen Vähentää Kasvainkasvua ja MAPK merkinanto eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (5): e96293. doi: 10,1371 /journal.pone.0096293

Toimittaja: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 lokakuu 2013; Hyväksytty: 06 huhtikuu 2014; Julkaistu: 05 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Loubeau et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Centre National de la Recherche scientifique (CNRS) ja alueen Auvergne. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

eteneminen eturauhasen syöpä liittyy muutoksiin keskeisten geenien, jotka ohjaavat solun homeostaasin, niiden purkamista ja /tai vahvistusta mikä lisää solujen lisääntymistä ja invasiivisia valmiuksia. Olemme aiemmin tunnistettu

NPM1

(nucleophosmin 1) yhtenä geenejä, joiden ilmentyminen lisääntyy merkittävästi eturauhasen tuumorisoluissa verrattuna ei-kasvain viereiseen kudokseen [1], mikä osoittaa, että NPM1 voisi toimia tehostajana eturauhasen syövän etenemisessä. NPM1 on suuri monitoiminen fosfoproteiini kertynyt korkealla tasolla rakeinen alueella nucleolus ja pystyy välinen edestakainen nucleolus The nucleoplasm ja sytoplasmaan [2]. Koska sen nucleolar lokalisoinnin, sen luontainen RNaasi-aktiivisuus ja sen yhdessä erääntyvät valmiiksi ribosomaalisen ribonukleoproteiineissa, NPM1 on ollut ehdotti ensimmäisenä säännellä ribosomaalisen RNA: n transkription ja käsittely. Kuitenkin NPM1 on viime aikoina osoitettu, näyttää chaperoniproteiiniin toimintaan. Se sitoutuu histones, suosii DNA-histoni kokoonpano, välittää nukleosomin muodostumista ja rentouttaa chromatin [3] siten hallitsemaan geeniekspressiota. NPM1 myös vuorovaikutuksessa monenlaisia ​​maturating proteiinien indusoimaan niiden oikean laskostumisen aktiivisessa tilassa. Niistä proteiinit, on solujen kasvua säätelevät esimerkiksi onkoproteiinia MDM2 (Mouse Double Minute 2 homologi). Lisäksi NPM1 sitoutuu ja estää tuumorisuppressorigeenin proteiinit P53 ja Rb (retinoblastoomasolulinjassa) [4] korostetaan, että NPM1 voisi olla rooli kasvaimia synnyttävän prosesseissa. Osa NPM1 erityistä vuorovaikutusta solukierron sääntelyviranomaisten on jo selvitetty, mutta sen roolia käyttäytymisessä kiinteiden kasvainsolujen sekä sen integraatiota solussa signalosomi on vielä määrittelemättä. Täällä kysymystä siitä NPM1 voisi voimistaa proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota kapasiteetit eturauhasen syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa me raportoimme että taso NPM1 eturauhassyöpäsoluissa säännellään erityisesti EGF ilmaisun ja MAPK (Mitogeenillä aktivoitunut proteiini-kinaasien) signalointireitin. Samalla osoitetaan, että korkea NPM1 positiivinen vaikutus solujen lisääntymisen ja solujen vaeltaminen, mikä osallistuvat tarkastus- kasvaimen kasvua.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki eläimet pidettiin valvotussa ympäristössä ja eläinten hoito tehtiin noudattaen kansallinen standardi politiikkaa (C 63 014,19). Kaikki kokeet hyväksyttiin Auvergnen alueellinen eettinen komitea, Ranska (protokolla CE09-08).

Soluviljely ja vakaa transfektio

LNCaP (imusolmukemääritysmenetelmä karsinooma eturauhasen) soluja viljeltiin fenolipunaista Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640, Life Technologies, Saint-Aubin, Ranska), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) ja inkuboitiin vakio-olosuhteissa (37 ° C, 5% CO

2).

Solut infektoitiin mukaan valmistajan ohjeiden lentivi- hiukkaset sisälsivät joko kolme kohdespesifiset konstruktioita (shNPM1) tai jotka eivät liity sekvenssit (shScr, Srambled) (sc-29771-V, Santa Cruz, Heidelberg, Saksa). Infektion jälkeen, puromycine (1 ug /ml) lisättiin elatusaineeseen, jotta voitaisiin valita stabiilisti transdusoidut solut ja suorittaa monoklonaalisia valintaa.

Haavan paranemista migraatiokokeessa

Ohjaus LNCaP-soluja (shScr ) ja NPM1 tippuu alas LNCaP-soluja (shNPM1) ympättiin 24-kuoppaisilla levyillä ja kasvatettiin konfluenssiin 24 tuntia. Yksikerroksiset Sitten viljelmä kaavi-haavoittui steriilillä mikropipetin kärki luomiseksi aukon leveys on vakio. Solujäte pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella 1 × (PBS) (Life Technologies). Soluja seuraavaksi kasvatettiin RPMI 1640 10% FBS että korvattiin 12 tunnin kuluttua loukkaantumisesta ja sitten 24 tunnin välein. LNCaP solumigraation kuvattiin osaksi haavoittunut alueen 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua kaapimalla (100-kertainen suurennus) ja loput haavan alueet sitten määrällisesti ImageJ vapaita ohjelmistoja.

Boyden jaosto invaasiomääritys

solun migraatiokokeessa, 3 x 10

5 shScr ja shNPM1 LNCaP viljelty seerumittomassa RPMI 1640 ympättiin ylempään kuoppaan siirtokuoppaan kammion järjestelmää. Joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon. Kun oli inkuboitu 24-48 tuntia, ei-siirretyn solut poistettiin ylemmän hyvin. Solut, jotka vaelsivat pohjaan insertin pinta kiinnitettiin sitten metanolilla ja värjättiin 5% Giemsa liuosta. Viisi sattumanvaraisesti kentät valokuvattiin (200-kertainen suurennus) ja solut kvantitoitiin ImageJ ilmainen ohjelmisto keskiarvona ± SD pesäkkeiden kenttää kohden.

Soft agar pesäkkeiden muodostumisen määritykset

Six-kuoppaisilla levyillä valmistettiin 2 ml /kuoppa lämmintä 0,6% alhaisen sulamispisteen agaroosia (agaroosikromatografia Sea Plaque FMS tuotteen sulamispiste on alhainen, 50101, Lonza Ozyme, Montigny-le-Bretonneux, Ranska) RPMI 1640, 10% FBS. Kiinteytymisen jälkeen 5 x 10

3 shScr tai shNPM1 LNCaP-soluja maljattiin kuoppaa kohti liuosta, jossa oli 500 ui 0,3%: isessa RPMI 1640 elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää. Levyjä inkuboitiin sitten RPMI 1640: ssä, 10% FBS: ia, joka vaihdettiin joka 3-4 päivä. 2 viikon kuluttua, pesäkkeiden muodostumisen kvantifioitiin käyttäen ImageJ vapaa ohjelmisto: pesäkkeet valokuvattiin (100-kertainen suurennus) 5 eri aloilla ja suhteellisen pesäkeluvussa laskettiin keskiarvo ± SD n pesäkkeiden per kenttä.

klonogeeninen määritys

1 x 10

4 shScr ja shNPM1 LNCaP-soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille on RMPI 1640, 10% FBS: ia. Medium vaihdettiin joka 3 päivä. 2 viikon kuluttua väliaine poistettiin ja solut pestiin PBS: llä 1 x kiinnitetään sitten metanolilla ja värjättiin 5% Giemsa liuosta. Foci muodostumiseen arvioitiin ja pesäkkeiden muodostuminen mittaamaan ImageJ vapaa ohjelmisto: pesäkkeet valokuvattiin (100-kertainen suurennus) 5 eri aloilla ja suhteellisen pesäkeluvussa laskettiin keskiarvo ± SD n pesäkkeiden per kenttä.

Soluproliferaatiomääritys

Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen Solujen lisääntyminen ELISA BrdU (bromodeoksiuridiini) kolorimetrinen kit (Roche) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti 5 x 10

3 shScr tai shNPM1 LNCaP-soluja kuoppaa kohti ympättiin 96-kuoppaiseen levyyn. Ne viljeltiin 24 tuntia RPMI 1640-väliaineessa, 10% FBS: n läsnä ollessa ilman EGF: ää (E9644, Sigma). Sitten BrdU merkintöjä lisättiin lopullisena pitoisuutena 10 uM 2,5 tuntia. Kiinnityksen jälkeen soluja inkuboitiin anti BrdU-POD-liuoksella 1 tunnin ajan, ja absorbanssi mitattiin 655 nm: ssä.

Western-blottaus

Proteiinit uutettiin käyttämällä HEPES 20 mM, NaCl 0,42 M , MgCl

2 1,5 mM, EDTA 0,2 mM, ja Nodinet P-40 1% täydennetty fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) 1 mmol (Sigma), proteaasinestäjät (Complete 1X, Roche), NaF 0,1 mM, ja Na

3Vo

4 0,1 mM (Sigma). Neljäkymmentä ug kokonais-proteiinit alistettiin sitten denaturoivalla SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosalle Hybond-ECL-kalvolle (GE Healthcare Life Sciences, Velizy-Villacoublay, Ranska). Havainnot tehtiin käyttämällä vasta-aineita vastaan, β-aktiini (A2066, Sigma), NPM1 (sc-6013-R, Santa Cruz, Heidelberg, Ranska), EGFR (epidermaalisen kasvutekijän reseptori, NB100596, Novus), fosfori-EGFR-Tyr 1068 ( 2236S, Cell Signaling, Ozyme), ERK1 /2 (M5670, Sigma, Saint-Quentin Fallavier, Ranska), fosfori-ERK1 /2 p42 /44 (9101S, Cell Signaling, Ozyme) AKT (9272, Cell signalointi, Ozyme), fosfo-AKT Ser 473 (2118-1 Epitomics) ja paljasti peroksidaasikonjugoidulla anti-kani-IgG (immunoglobuliini G, PARIS, Compiègne, Ranska) käyttäen Western Lightning System kit (PerkinElmer, Villebon sur Yvette, Ranska). Signaalin kvantitointi suoritettiin käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad).

promoottorikonstruktiin, transfektio ja Lusiferaasimäärityksiä

ihmisen EGF promoottorifragmentti (-392 /+ 123) tuli seuraavin alukkeita: 5′-GATCAAGCTTGGGCTGAAGGTGAACTATCTTTAC-3 ’(eteenpäin) ja 5′-GATCCTCGAGGACAGAGCAAGGCAAAGGCTTAGA-3’ (taaksepäin), sitten kloonattiin Hindlll /Xhol-restriktiokohtien on pGL3-perusvektoriin (Promega, Charbonnieres, Ranska). Konstitutiivisesti aktiivinen MAP-kinaasin kinaasi kinase1 (caMEKK1) ekspressioplasmidin oli ystävällinen lahjoitus tri Dirck BOHMANN (University of Rochester Medical Center, Rochester, USA). shScr ja shNPM1 LNCaP-solut transfektoitiin 24 h ymppäyksen jälkeen pGL3-hEGF ja /tai caMEKK1 plasmidien OPTI-MEM käyttäen Metafectene transfektantti mukaisesti valmistajan ohjeiden (Biontex, Martinsried-Planegg, Saksa). Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut lyysattiin osaksi Reporter hajotuspuskuria 1 × (Promega) ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin käyttäen Genofax lusiferaasianalyysissä Kit (Yelen, seurata la Redonne, Ranska).

valmistaminen RNA ja reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

Yhteensä-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Life Technologies), ja cDNA syntetisoitiin 200 U Moloney-hiiren leukemiaviruksen-käänteistranskriptaasia (Promega), 5 pmol satunnaisia ​​alukkeita ( C1181, Promega), 40 U RNAsin (Promega), ja 2,5 mM deoksinukleotiditrifosfaatti. mRNA kvantitoitiin on Mastercycler ep Realplex (MasterCycler2, Eppendorf, Le Pecq, Ranska) kanssa Mesagreen QPCR Mastermix Plus SYBR (Promega). Alukkeiden sekvenssit ovat seuraavat: NPM1, 5′-ATGGAAGATTCGATGGACATGG-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CGAGAAGAGACTTCCTCCACTGC -3′ (taaksepäin); PCNA, 5’-TGCCTTCTGGTGAATTTGCACGT-3 ’(eteenpäin) ja 5′-ACCGTTGAAGAGAGTGGAGTGGC-3′ (taaksepäin), Actin, 5’-CGCGAGAAGATGACCCAGATC-3 ’(eteenpäin) ja 5’TCACCGGAGTCCATCACGA-3’ (taaksepäin) (Eurogentec, Angers , Ranska). Ihmisen EGF, alukkeet ostettiin Qiagen (PPH00137B-200, Qiagen, Courtaboeuf, Ranska).

In vivo

Nude hiiren ksenograftimallissa

ShScr ja shNPM1 LNCaP solut kasvatettiin konfluenssiin suspendoitiin sitten matrigeeliä (BD matrigeeliä tyvikalvon matriisin fenolipunaista, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Ranska) pitoisuuteen 9 x 10

6 solua /ml. Kolmesataa ui solususpensiota (noin 3 x 10

6 solua) injektoitiin ihon alle 6 viikkoa vanha Nude-hiiriä (Swiss nu /nu, Charles River, L’Arbresle, Ranska). Sairauden etenemistä seurattiin päivittäin, joka perustuu joukko yleistä hyvinvointia asettamat kriteerit eläinten hoito komitea, ja painoindeksi kirjattiin kolmesti viikossa, kunnes ennalta määrätty päätepiste saavutettiin. Päätetapahtumia olivat: nestehukka ja /tai laihtuminen yli 10%, mitään todisteita hengitysvaikeuksia, kehon painon nousu yli 5 g keskimääräisestä. Kasvaimet mitattiin kolmesti viikossa sähköisellä jarrusatula koska palpoitavissa kasvaimia olivat havaittavissa. Hiiret tapettiin murtamalla niska alle kaasun anestesiassa. Ksenografteja poistettiin sitten, painotettu ja pikajäädytettiin nestetyppeen RNA: n ja proteiinin analyysit.

Tilastollinen analyysi

Kaikki määritykset tehtiin vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Keskivirheet laskettiin kunkin keskiarvo, ja tilastollisia eroja ryhmien välillä määritettiin Studentin

t

testissä tai ei-parametriset Mann Whitney U-testi käyttäen Prism-ohjelmiston. Pituussuuntaista analyysejä, satunnainen-vaikutus malli (sekoitettu malli) pidettiin tutkia kiinteiden vaikutusten ryhmä (NPM1 lauseke), aika-pisteitä ja vuorovaikutus ryhmässä × ajalla ottaen huomioon välillä ja sisällä vaihtelu (satunnaisvaikutusten kulmakerroin ja leikkauspiste).

tulokset

NPM1 säätelee klonogeeniset ja proliferatiivista kapasiteettia eturauhaskasvainsoluissa

jotta analysoida vaikutuksia NPM1 eturauhasen kasvainsoluproliferaation päätimme knockdown strategiaa ja syntyy LNCaP solujen alalinjoja, jotka ekspressoivat stabiilisti ohjaus (shScr) tai NPM1 erityisiä shRNA (shNPM1). Kuten kuviossa 1 a, NPM1 mRNA alenee yli 50%, ja NPM1 proteiinin ilmentyminen yli 30% shNPM1 soluissa, mutta tämä ei liity muutoksia solujen morfologia. Kuitenkin NPM1 Knockdown muuttaa kykyä LNCaP muodostaen pesäkkeitä, kun kylvö alhaisilla konfluenssilla (kuvio 1 b). Tämä lasku klonogeeniset kapasiteetin osuu väheneminen soluproliferatiivi- potentiaali (kuva 1c). Todellakin, alas-säätely NPM1 johtaa 30%: n lasku BrdU ja tähän liittyy 60%: n lasku mRNA tasolla PCNA (proliferoivan solun tuma-antigeeni), keskeinen markkeri solujen lisääntymistä (kuvio 1 d). Mielenkiintoista, NPM1 knockdown ei muuta solujen selviytymistä arvioituna PARP (poly (ADP-riboosi) polymeraasin) pilkkominen analysoi Western blottauksella (kuvio S1), mikä osoittaa, että tämä lasku leviämisen nopeus ei liity kasvua apoptoosin. Nämä tulokset näin ollen osoittavat, että NPM1 on mukana proliferaation kasvun ja klonogeenisten valmiuksia eturauhaskasvainsoluissa.

(a) NPM1 pudotus ei muuta LNCaP-solujen morfologia. LNCaP-solut transfektoitiin stabiilisti ohjaus shRNA (shScr) tai erityiset NPM1 shRNA (shNPM1). NPM1 mRNA ja proteiini tasot analysoitiin RT-qPCR ja western blotting vastaavasti. Morfologia solujen havaittiin käänteinen mikroskoopilla ja valokuvataan. (B) NPM1 Knockdown estää LNCaP kyky muodostaa klooneja. Solut ympättiin alhaisilla yhtymäkohdassa yli viikon, sitten kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 5% Giemsa sininen ennen mikroskooppista havainnointia. Kuvia edustavat kolmen erillisen kokeen kanssa yhdenmukaisia ​​tuloksia. Käyrä edustaa lukumäärää solukloonien ( 50 solut) shNPM1 kunnossa, laskettu keskiarvona ± SD lukumäärästä kloonien laskettiin per kenttä, 5. satunnainen kenttiä käyttäen ImageJ vapaa ohjelmisto ja ilmaisi suhteellisen numeroon kloonien lasketa ohjaus kunnossa. (C, d) NPM1 valvonnan leviämisen eturauhasen syöpäsoluja. Viisi tuhatta solua siirrostettiin kuoppa 96-kuoppaiseen levyyn ja viljeltiin 48 tunnin ajan. (C) Sitten soluja inkuboitiin BrdU merkintöjä liuosta 2,5 tuntia ja BrdU-inkorporaatio mitattiin densitometrisellä analyysi 655 nm: ssä. (D) Lisääntyminen analysoitiin myös RT-qPCR määrityksessä arvioimalla PCNA suhteellinen mRNA-tasolla kertyminen normalisoidaan käyttäen β-aktiini-mRNA tasolla. Kaikki tiedot edustavat vähintään kolme riippumatonta kolmena kokeiluja ja BrdU kuin keskiarvoa kolmesta kokeissa 96 pistettä. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD.

NPM1 vaikutus proliferaatioon liittyy maahanmuuton hallinnalle, invaasio, kolmiulotteinen kasvu valmiuksia eturauhassyöpäsolujen ja kasvaimen kasvua

edellä esitetyt tulokset osoittavat, että NPM1 kohdistaa valvontaa klonogeeniset valmiuksia eturauhassyöpäsolujen ja ehdottaa, että lisäksi sen vaikutus soluproliferatiivi- nopeudella, se voi myös edistää sekä kasvaimen kasvua ja aggressiivisuus. Arvioida tarkemmin roolin NPM1, tarkastelimme hyökkäyksen ja muuttoliike kapasiteetit shNPM1 LNCaP. Knockdovvn NPM1 vähensi hyökkäyksen LNCaP kautta Matrigel päällystettyjä suodattimia 40% (kuvio 2a). Olemme edelleen arvioinut LNCaP muuttoliikettä kyky fyysisesti haavoittaen solut levitettiin soluviljelmän levyt. Kuten on esitetty kuviossa 2b, 72 h sen jälkeen, kun on pesty, shNPM1 solut eivät kyenneet recolonize Denuded vyöhykettä nopeammin kuin teki kontrollisoluihin. Voit testata, onko lasku muuttoliikkeen ja invaasion kapasiteetin mukana on lasku kolmiulotteinen kasvu kyvyt shNPM1 LNCaP,

in vitro

testeissä pehmeässä agarissa tehtiin (kuvio 2c). Vähennys NPM1 LNCaP-soluissa lähes poistetaan niiden kyky muodostaa 3-D pesäkkeitä. Nämä tulokset

in vitro

määrityksissä vahvasti siihen, että NPM1 säätelee muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia eturauhassyöpäsolujen.

(a) NPM1 ohjaa muuttoliike kapasiteetin LNCaP. Solut ympättiin yhtymäkohdassa, jotta voidaan luoda haavan 24 tuntia myöhemmin. Haavan recolonization jälkeen havaittiin 72 tunnin kulttuurin ylösalaisin mikroskoopilla ja valokuvataan. Histogrammit osoittavat haavan alueella määrällisesti käyttäen ImageJ ja kuvat edustavat kolmen erillisen kokeen kanssa yhdenmukaisia ​​tuloksia. (B) NPM1 pudotus estää invasiivisen mahdollisuuksia syöpäsolujen. shScr ja shNPM1 LNCaP-solut ympättiin konfluenssiin RPMI 1640 seerumivapaassa Matrigelillä päällystetty mikrohuokoinen kalvo. 48 tuntia myöhemmin, vaeltaneet solut läsnä vastakkaisella puolella kaivoa kiinnitettiin ja värjättiin 5% Giemsa sinistä ja havaitaan mikroskoopilla (200-kertainen suurennus). Kaavion määrä solujen shNPM1 kunnossa, laskettu keskiarvona ± SD solujen määrä laskettiin per kenttä, 5 satunnaisesti kentät, käyttäen ImageJ vapaa ohjelmisto ja ilmaisi suhteen solujen määrä laskettiin kontrolliryhmän kunnossa . (C) NPM1 vaikutukset kolmiulotteinen kasvu eturauhasen syöpäsoluja. Ohjaus tai NPM1 kaatanut soluja ympättiin alhaisilla konfluenttisuuden agaroosigeeleil- /RPMI 1640 10% FBS 2 viikkoa. Lukumäärä ja koko kehittyvien kloonien jälkeen tarkasteltiin käänteismikroskooppi (x100) ja valokuvataan. Käyrä edustaa lukumäärää solukloonien ( 50 solut) shNPM1 kunnossa, laskettu keskiarvona ± SD lukumäärästä kloonien laskettiin per kenttä, 5. satunnainen kenttiä käyttäen ImageJ vapaa ohjelmisto ja ilmaisi suhteellisen numeroon kloonien lasketa ohjaus kunnossa. (D, e, f, g) NPM1 knock-down kumoaa tumourigenicity LNCaP soluja injektoidaan nude-hiirissä. shScr (n = 14) ja shNPM1 (n = 14) LNCaP-solut subkutaanisesti oksastettu nude-hiiriin, ja tuumorin tilavuus mitattiin joka 2 päivää siirrostuksen jälkeen (d). Kuvaajan (e) on kvantitointi shScr ja shNPM1 johdettujen kasvainten tilavuus päivänä 24 injektion. NPM1 suhteellinen ilmentymistaso arvioitiin western blotting kasvaimia hiiret tapettiin (f), ja tuumorin paino mitattiin (g). Tiedot edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen, ja ne ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD.

edelleen merkityksen määrittämiseksi NPM1 eturauhassyövän, olemme analysoineet tuumorigeneesiä on shNPM1 LNCaP ja shScr LNCaP eturauhas- syöpäsolun linjat

in vivo

ihonalaisen injektion kylkeen nude-hiirissä. ShNPM1 solut tuottavat pienempiä kasvaimia (kuvio 2d, e) ja, toisin kuin shScr LNCaP-solut, ovat todennäköisesti tuota kasvaimen lainkaan, kun oksastetut (kuvio 2e). Yksityiskohtaisesti, kasvaimet aloitetaan LNCaP ohjaus solut näyttävät 22 päivää injektion taas kasvaimet peräisin LNCaP shNPM1 solut ovat havaittavissa vain 24 päivää injektion. Lisäksi kasvukäyrät koskaan saada paralleled jälkeenkin 29 päivää (kuvio 2d). Siten kasvaimet aloitetaan NPM1 tippuu alas solut pysyivät pienempi kuin ohjaus kasvaimia 85%: n lasku on kasvaimen keskimääräinen tilavuus (kuvio 2e). Tämä tärkeä laskua kasvaimen tilavuuden johtaa 95%: n lasku kasvaimen paino LNCaP shNPM1 soluista (kuvio 2g). Tämä lasku on epätodennäköistä johtuen menetyksen ilmaisun anti-NPM1 shRNA koska kaikki shNPM1 kasvaimet säilyttää 90%: n lasku NPM1 kertymiseen (kuva 2 f). Yhdessä nämä tiedot osoittavat selvästi, että NPM1 on mukana eturauhasen kasvaimen kasvua

in vitro

ja

in vivo

.

NPM1 osallistuu valvontaan EGR ilmaisun

jotta voidaan paremmin ymmärtää, kuinka NPM1 voivat edistää eturauhasen syöpäsolun käyttäytymistä, teimme qPCR array analyysi (RT2 ProfilerTM array, PAHS-121A-2, Qiagen) ja määritetään luonne geenit, joiden transkription tasot moduloidaan knockdovvn NPM1 (tuloksia ei ole esitetty). Niistä 84 geenit bongattiin array, epidermaalisen kasvutekijän (EGF) mRNA kertyminen oli kaikkein merkittävästi vähentynyt LNCaP shNPM1 soluissa. Tämä modulaatio EGF ilmaisua ei johdu maailmanlaajuinen estävä vaikutus geeni-ilmentymisen koska useimmat geenit ovat ennallaan tai jopa säädelty kun NPM1 on vähentynyt (tuloksia ei ole esitetty). Tämä tulos vahvistettiin RT-qPCR määrityksissä EGF mRNA kertymistä vähenee 40% LNCaP shNPM1 soluissa (kuvio 3a). Lisäksi testata suhteellinen aktiivisuus EGF promoottorin n geenin aktiivisuus LNCaP shSCR ja shNPM1 soluja, transfektoimme nämä solut phEGF-lusiferaasireportteriplasmidi. Knockdovvn NPM1 aiheuttaa vähenemistä EGF-promoottorin aktiivisuuden, mikä osoittaa, että vaikutus NPM1 todennäköisesti kohdistuu transkriptionaalisella tasolla (kuvio 3b). Nämä tulokset viittaavat siihen, että NPM1 hallitsee suoraan tai välillisesti EGF ilme. EGF: n tiedetään spesifisesti aktivoida EGF-reseptorin (EGFR), tutkimme, onko aktivointi EGFR monimutkaisia ​​sekä aktivoinnin sen loppupään efektorien, ERK1 /2 ja AKT, moduloidaan NPM1 ilmentymisen tasolla. Analyysiin perustuen niiden fosforylaation tila, me osoitamme, että aktivointi EGFR (pEGFR) ja ERK1 /2 (pERK1 /2) on dramaattisesti vähentynyt tai lähes poistettava, kun ilmentymisen NPM1 estyy (kuvio 3c). Mielenkiintoista on, että AKT fosforylaatio on vähemmän herkkä tällaiselle inhibition, mikä viittaa siihen, että NPM1 erityisesti vaikuttaa MAPK-reitin (kuva 3c). Nämä vaikutukset NPM1 EGF ilmaisun ja ERK1 /2 polku vahvasti siihen, että NPM1 voisivat osallistua asettamiseen EGR itsesäätelyn silmukka.

(a) NPM1 ohjaa EGR ilme. Suhteellinen EGF mRNA-tasot verrattuna p-aktiini analysoitiin RT-qPCR LNCaP soluissa, jotka ilmentävät ohjaus (shScr) tai NPM1 erityiset shRNA (shNPM1). (B) NPM1 ohjaus EGF promoottorin aktiivisuutta. shScr ja shNPM1 LNCaP-solut transfektoitiin phEGF-lusiferaasireportteriplasmidi. EGF-promoottorin aktiivisuus arvioitiin mittaamalla lusiferaasiaktiivisuus 24 tuntia myöhemmin. Määrityksen tulokset olivat standardoituja käyttäen CMV-promoottorin, kuten ohjaus- ja ilmaistuna fold-induktion aikana ohjaus-soluja (shScr). (C) NPM1 ohjaa aktivointi EGF /EGFR-reitin loppupäässä efektoreja. Proteiinit, uutetaan shScr ja shNPM1 LNCaP-soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä 10% FBS: ää, suoritettiin elektroforeesi SDS-PAGE: lla. Siirretty kalvot immunoblotattiin osoitti vasta-aineita. Histogrammit osoittavat bändi määrällisesti raportoidaan β-aktiini tasolla. Blots edustavat kolmen erillisen kokeen kanssa yhdenmukaisia ​​tuloksia. Tiedot edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD.

NPM1 nimenomaan voimistaa MAPK-reitin aktiivisuuden edistämiseksi proliferaatio ja migraatio valmiuksia eturauhassyöpäsolujen

edellä mainitut tulokset osoittavat, että NPM1 on mukana kontrolli EGF ilmaisun, kasvutekijä, joka ohjaa MAPK-reitin ja edistää tuumorigeenisen käyttäytymistä eturauhasen syöpäsoluja. Joten mietimme jos se oli syy shNPM1 LNCaP-solut osoittavat laski tuumorigeenisiä käyttäytymistä. Meillä on siis tutkittava, onko eksogeenista saanti EGF voisi pelastaa aktivoitumisen EGF /EGFR-reitin effektorit ja myöhemmin lisääntyy LNCaP proliferaatio ja migraatio. Ohjaus (shScr) tai NPM1 kaatanut (shNPM1) LNCaP-soluja ilman ravintoa, jotta sammuttaa signalointireittejä ja käsitellään sitten EGF.

Western blot analyysit osoittavat, että eksogeeninen EGR lisäravinteen johtaa fosforylaatioon,

eli

, aktivointi sekä EGF-reseptorin, ja yksi sen alavirrassa oleva kohde, AKT, sekä shScr ja shNPM1 soluja. Päinvastoin, ja mielenkiintoisinta, fosforylaatiota ERK1 /2 on erityisesti alentunut shNPM1 soluissa (kuvio 4a). Yhteisymmärryksessä tähän tulokseen, lisäämättä eksogeenistä EGF ei pysty palauttamaan muuttoliikettä ja hyökkäys valmiuksia shNPM1 LNCaP vastaavassa määrityksissä (kuvio 4b, c). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että NPM1 on nimenomaisesti vaatii aktivoinnin MAPK signalointireitin ja että voimistumista tämän transduktioreitin osallistuu valvontaan proliferaatio ja migraatio valmiuksia eturauhasen syöpäsoluja.

(a) NPM1 alassäätöä estää EGF indusoi ERK1 /2-reitin aktiivisuutta. shScr ja shNPM1 LNCaP-soluja käsiteltiin 100 nM EGF ja fosforylaation EGF /EGFR-reitin efektorien analysoitiin Western-blottaus. Histogrammit osoittavat bändi määrällisesti raportoidaan β-aktiini tasolla. Täplää edustaa kolmen erillisen kokeen kanssa yhdenmukaisia ​​tuloksia. (B) Huolimatta EGF hoito, muuttoliike kapasiteetit LNCaP laskivat NPM1 ei palautettu. Haavan analysoitiin 72 tunnin kuluttua potilaan jatkuvaan 100 nM EGF. Soluja tarkasteltiin käänteismikroskooppi ja valokuvataan. Histogrammit osoittavat haavan alue kvantifiointi käyttäen ImageJ. (C) EGF käsittely ei pelasta lisääntymistä NPM1 knockdown LNCaP. BrdU Määritys suoritettiin shScr ja shNPM1 LNCaP 24 tunnin kuluttua 100 nM EGF hoitoon. Densitometria mitattiin 655 nm: ssä. Tiedot edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD.

NPM1 toimii ylävirtaan MEK1 ja alavirtaan EGFR aktivoida MAPK-reitin valvomiseksi EGF self -regulation loop eturauhassyöpäsoluissa

Koska fosforylaatio ERK1 /2 on nimenomaan heikentynyt shNPM1 soluissa vaikka läsnä EGF, se ehdottaa, että MAPK-reitin, NPM1 toimii ylävirtaan ERK1 /2. Tunnistaa efektori (t) EGFR aiheuttaman signalointireitin johon NPM1 voi toimia, ja onko NPM1 kanteen suoraan tai EGR-geenin promoottori, suoritimme transfektiokokeissa kanssa konstitutiivisesti aktiivisen muodon MEKK1 (caMEKK1) : caMEKK1 fosforyloi ERK1 /2 kinaasi MEK1 /2, ja siten, konstitutiivisesti aktivoi ERK1 /2 puuttuessa MEK1 /2-estoon. Vuonna shScr LNCAP-soluissa, caMEKK1 transfektio indusoi fosforylaation ERK1 /2. Vuonna shNPM1 LNCaP caMEKK1 transfektio indusoi samanlaisen vaikutuksen, mikä pelastaa EGFR-signalointireitin (kuva 5a). Tämä tulos viittaa siihen, että NPM1 kohdistettu MAPK-reitin loppupään EGFR mutta ylävirtaan MEK1 /2 sääntelemiseksi ERK1 /2. Lisäksi kotransfektio on caMEKK1 rakentaa kanssa phEGF-lusiferaasireportteriplasmidin myös pelastaa EGR-promoottorin aktiivisuutta (kuva 5b) LNCaP-soluissa tippuu alas varten NPM1. Nämä tulokset osoittavat, että 1- on epätodennäköistä, että NPM1 suoraan transaktivoi EGR promoottori eturauhasen syöpäsoluja. 2- NPM1 voi pikemminkin stimuloida MAPK signalointireitin parantaa transkription EGR-geenin. 3- fosforylaatiomääritys tiedot AKT ja ERK1 /2 viittaavat vahvasti siihen, että NPM1 toimii tasolla MEKK1 tai Ras /Raf tässä reitin.

(a) ERK1 /2 aktivointi pelastaminen caMEKK1. shScr ja shNPM1 LNCaP-solut transfektoidaan konstitutiivisesti aktivoitua konstrukti MEKK1 (caMEKK1) ja ERK1 /2-fosforylaation taso analysoitiin western-blottauksella. (B) ERK1 /2-reitin aktivaatio palauttaa EGF promoottorin aktiivisuus LNCaP vaimentua varten NPM1. LNCaP shSCR ja shNPM1 solut ohimenevästi kotransfektoitiin phEGF-luc ja caMEKK1. EGF-promoottorin aktiivisuus arvioitiin mittaamalla lusiferaasiaktiivisuus 24 tunnin kuluttua. Määrityksen tulokset olivat standardisoituja ohjaus reportteriaktiivisuutta CMV-Luc ja ilmaistuna taitettava induktio yli säätökennoja (shScr). Tiedot edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD.

Keskustelu

NPM1 on keskeinen rooli solujen kasvun ja lisääntymisen. Muun muassa se suosii solusyklin etenemistä, ribosomien biogeneesiä ja sentrosomimäärän päällekkäisyyksiä [5] – [7]. Siten korrelaatio lisääntynyt NPM1 ekspressiotasot ja syövän etenemistä on perustettu laaja joukko kiinteitä kasvaimia erilaisten histologisten alkuperää kuten Mahalaukun [8], [9], paksusuolen [9], munuaisen [10] tai munasarjojen syövistä [11]. Kuitenkin useissa tutkimuksissa kävi ilmi, että paradoksaalisesti NPM1 pystyy sekä toimia tuumorisuppressorina ja sen proto-onkogeenin aikana tuumorigeneesiä [12]. Toisaalta, NPM1 osallistuu ylläpitämiseen kromosomin vakauden ja säätelee ARF toimintaa [13], ja toisaalta, NPM1 edistää inhibitio useiden tuumorisuppressoreilla lukien P53 ja Rb, ja aktivointi proto-onkogeenin c-Myc parantaa sen muunnoksen toimintaa [14]. Edellisessä Tulokset osoittavat, että molekyyli kaperoni NPM1 on yli-ilmentynyt eturauhassyöpä kudoksessa, verrattuna kontrolliin viereiseen kudokseen, jossa se stimuloi androgeenista riippuvaisen transkription [1]. Nyt halusimme tarkemmin tutkimaan, onko tämä vapautuminen NPM1 ilmentyminen voi toimia eturauhaskasvainsoluissa invasiivisia ja muuttoliike valmiuksia.