Krooninen sairaus

tiivistelmä

epidermaalisen kasvutekijän (EGF) ja insuliinin kaltainen kasvutekijä I (IGF-I) ovat kriittisiä säätelijöitä solujen erilaistumista, selviytyminen, leviämisen ja muuttoliikkeen syövissä. Tässä tutkimuksessa todettiin, että ARNO (cytohesin-2), aktivaattori EGF ja IGF-I polkuja, oli korkeammin ilmaistu peräsuolen syövän kudoksen kuin hyvänlaatuinen vieressä peräsuolen kudokseen. Kun ARNO-siRNA tai kemiallisen inhibiittorin SecinH3 tukossa ARNO, alavirtaan EGF ja IGF-I reittejä väheni peräsuolen solulinjoissa HT29 ja HCT116. Tämä esto heikkeni soluproliferaatiota, invaasio, ja muuttoliike in vitro. Lisäksi EGF-reseptori (EGFR): sta riippuvainen peräsuolen tuumoriksenografteja nude hiiren kohdistama antiproliferatiivisia ja kasvun hidastuminen vaikutukset ruiskuttamalla secineH3. Nämä tiedot osoittivat, että estämällä cytohesins tai ARNO sytoplasmisina aktivaattoreita EGFR ja IGF-I peräsuolen syövän johti anti-leviämisen, vähensi invaasio, vähentynyt maahanmuutto, ja tukahdutti kasvua in vivo ja in vitro. Näin ollen, cytohesins tai ARNO voi olla mahdollinen hoito tavoite joidenkin peräsuolen syövän.

Citation: Pan T, Sun J, Hu J, Hu Y, Zhou J, Chen Z, et al. (2014) Cytohesins /ARNO: toiminto peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 9 (3): e90997. doi: 10,1371 /journal.pone.0090997

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu: 27 elokuu 2013; Hyväksytty: 06 helmikuu 2014; Julkaistu: 11 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Pan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National korkean teknologian tutkimus- ja kehittämisohjelma Kiina (nro 2012AA02A506), Zhejiangin maakunnan Natural Science Foundation of China (LD13H160015) ja Zhejiangin maakunnan Key tieteellisen ja teknologisen tutkimushankkeissa kansainvälisen yhteistyön (nro 2009C14010). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) jää kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä miehillä ja toiseksi naisilla huolimatta merkittäviä parannuksia sen ennustetta katsoneet edistysaskeleet diagnosoinnin ja hoidon yksityiskohdista. Yli 1,2 miljoonaa uutta syöpätapausta ja 608 700 kuolemantapausta kirjataan vuosittain [1]. Tehokasta hoitomuotojen paksusuolen syövän ovat leikkaus, kemoterapia, ja täsmähoitoihin. Edistysaskeleet tavanomainen kemoterapia on laajennettu käyttöikä, mutta tehokkuus monille potilaille on edelleen alhainen, etenkin niille, joilla on etäpesäkkeitä. Etsiminen tehokkaampia ja vähemmän toksisia hoitoja on synnyttänyt uuden sukupolven antituumoriaineista. Yleisin niistä on suunnattu biologisen tekijän [2]. Epidermaalinen kasvutekijä (EGF) reseptori (EGFR) ja liittyvät signaalintransduktioreitteihin ovat nousseet tärkeiksi molekyylitason terapeuttisia kohteita peräsuolen syöpä [3].

EGFR /erbb1 sekä Her2 /ErbB2, Her3- /ErbB3, ja ErbB4, kuuluu ErbB- perheen. EGFR /erbb1 säätelee elimistön luontainen immuunivaste [4] sekä solujen erilaistumiseen, selviytymistä, proliferaatiota, invaasio, ja muuttoliike. EGFR sisältää ekstrasellulaarisen ligandia sitovan domeenin, yhden kalvon läpi ulottuvan alueen, ja sytoplasminen tyrosiinikinaasidomeeni [5]; [6]. Ligandit sitoutuvat solunulkoisen domeenin aiheuttaa reseptorin dimerisaation, aiheuttaen siten konformaation muutoksen solunsisäisten fosforylaation komponentteja ja mahdollistaa alavirran signalointia [7].

Nykyään monet suunnattu biologisten aineiden tärkeä rooli EGFR-signalointireitin. Anti-EGFR-monoklonaalisia vasta-aineita ja EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittorit ovat osoittautuneet tehokkaasti inhiboimaan syöpien, erityisesti paksusuolen ja peräsuolen ja nenänielun syöpä [8]; [9]. Setuksimabi ja Panitumumabi, vasta-aineita EGFR, ovat laajalti käytetty hoitoon peräsuolen syöpä. Kuitenkin potilaat lopulta kehittää resistenssin näille aineille [10]. Yksi yleinen oletus Setuksimabi-vastus on EGFR tai alavirtaan molekyyli- mutaatio tuumorisoluissa, kuten hankittu EGFR ektodomeeni mutaatio S492R [10]. Lisäksi, jatkuva EGFR esto parantaa reittejä kuin EGFR-reitin, kuten Her2, Her3, insuliinin kaltainen kasvutekijä (IGF) -I-reseptori (IGF -IR) signalointireittejä [11] – [13].

IGF-I ja IGF-II pelata keskeinen rooli solun kasvuun, erilaistumiseen, selviytyminen, transformaatio, ja etäpesäkkeitä. Biologisia vaikutuksia IGF: t välittävät IGF-IR, reseptorin tyrosiinikinaasin kanssa homologinen insuliinin reseptoriin. Tutkijat äskettäin todettu, että vapauttaminen IGF-järjestelmä on keskeinen tekijä etenemistä useiden syöpien, IGF-IR aktivointi lisäämällä Tuumorigeenisuustutkimuksissa rinta-, eturauhas-, keuhko-, paksusuoli-, sekä pään ja kaulan okasolusyöpää [14 ]; [15].

Cytohesins aktivaattoreina ErbB-reseptorien on raportoitu Bill et al. [16]. He osoittivat, että cytohesins parantaa EGFR aktivointi suoraan vuorovaikutuksessa sytoplasmadomeeneista dimerisoidun reseptorit ja helpottamalla konformationaalinen uudelleenjärjestelyjä näillä aloilla. Cytohesins yli ilme parantaa EGFR signalointi ihmisen keuhkosyövässä, kun taas kemiallinen estoa tai knockdovvn cytohesins vähentää EGFR aktivointia. Vastaavasti aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että estämällä cytohesins jonka SecinH3 tai kaatamalla ARNO Arno-siRNA voi vähentää EGFR aktivaatio peräsuolen syövän solulinjoissa HT29 [17]. EGF ja IGF: t ovat kriittisiä säätelijöitä solujen erilaistumista, selviytyminen, leviämisen ja muuttoliikkeen syövissä. Ne ovat myös mukana apoptoosin, transformaatio, invasiivisia kasvun ja etäpesäkkeiden kasvainsolujen [15]. Cytohesins on ehdotettu uutena tehokas tavoitteen vähentää hyökkäystä, etäpesäke, ja Setuksimabi tai Panitumumabi-resistenttien solujen peräsuolen syöpäpotilailla. Mahdollisuus, että cytohesins voi olla uudet tavoitteet lääkeresistenttiä tai ennalta-vaiheen syöpäpotilasta on tutkittu. Niinpä tutkimme cytohesins tai ARNO uutena anti-peräsuolen syövän agentti tässä tutkimuksessa.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

Soluviljelyväliaineet 1640 ja McCoy S 5A hankittiin Gibco (Gibco, USA). Kani tai hiiri monoklonaalinen anti-humaani-vasta-aineita käytettiin ARNO (Abcam, ab56510), pEGFR (Py1068, Epitomics, 1138-1), pERK1 /2 (T202 /Y204, Bioworld, BS5016), EGFR (Cell Signaling, 3197), GAPDH (Bioworld, AP0063), IGF-IR (Abcam, ab39675), pIGF-IR (Abcam, ab39398), Pirs (Abcam, ab52167), Pakt (Abcam, ab106693), pIRS1 (Abcam, ab66153), pShc (Abcam, ab155170), ja Ki-67 (Cell Signaling, 9027). Muut reagenssit ja laitteet olivat seuraavat: SecinH3 (Merck-565725 /sc-203260), siRNA oligo (Genephama), MTT: tä (sigma, m5655), DMSO (sigma, D5879), ihmisen EGF (Peprotech, AF-100-15 ), ihmisen IGF-1 (Peprotech, AF-100-11), FBS (Gibco, USA), ja 0,25% trypsiiniä (Sigma), immunohistokemiallinen kit (Zhongshan, Kiina).

Solulinjat ja viljely

paksu- ja peräsuolisyövän solulinjoissa HT29 ja HCT116, joka tunnistettiin ilman mutaatiota KRAS ja BRAF, saatiin Key Laboratory of Cancer Prevention ja interventio, Cancer Institute, toinen Affiliated sairaala, School of Medicine, Zhejiang University, Kiina. Käytetyt soluviljelmät olivat seuraavat: HT29 solulinjassa 1640 (10% FBS + 1% streptomysiiniä /penisilliini) ja HCT116 solulinjassa McCoy ’s 5A (10% FBS + 1% streptomysiiniä /penisilliini). Kaikkia solulinjoja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa ja siirrostettiin 0,25% trypsiiniä (Sigma) 0,2 M fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS).

Kasvaimen Näytteet

Ennen ihmisen kasvain näytteet tutkimus, potilaiden tietoisen suostumuksen on oli saatu. Olimme esitti lausuman meidän sairaalassa eettisen komitean ja sai hyväksynnän tutkimuksen. Kaikki kasvain näytteet johtuvat Biopankkiverkosto klo Key Laboratory of Cancer Prevention ja interventio, Cancer Institute, Zhejiangin yliopisto, Kiina. Kaikki kasvaimet kliinisesti ja patologisesti tunnistettu olevan ensisijainen ja ainoa kasvainleesioksi ja luokitellaan Maailman terveysjärjestön (WHO) luokittelu kasvaimet Ruuansulatuskanavan (2010).

immuunivärjäytyminen

immunovärjäystä, käytimme kanin monoklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​ARNO (Abcam, ab56510), hiiren vasta-aineita vastaan ​​pEGFR (Py1068, Epitomics, 1138-1), kanin polyklonaalisia vasta-aineita vastaan ​​pIGF-IR (Abcam, ab39398) ja kanin monoklonaalisia vasta-aineita Ki-67 (Cell Signaling, 9027) ensisijaisena vasta-aineita. Ennen käyttöä, kaikki vasta-aineet laimennettiin (Primary vasta-aineet laimennettiin 1:100, kaikkien muiden toissijaisten vasta-aineet laimennettiin 1:200) PBS: ssä (150 mM NaCl, 10 mM Na

2HPO

4, 10 mM NaH

2PO

4, pH 7,4). Immunohistokemia suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Värjäytymisvoimakkuuksia yksilöllisesti arvioitiin kolmen riippumattoman tarkkailijan käyttäen nelitasoista pisteytysjärjestelmä, kuten on kuvattu [18].

MTT

HT29 tai HCT116-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 3000 solua /kuoppa. Soluja viljeltiin 1% FBS: ää ja reagenssit (50 ng /ml EGF: ää tai 25 ng /ml IGF-1, SecinH3 eri pitoisuus (0 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM)) 24, 48, ja 72 h 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Sitten 5 mg /ml MTT lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tuntia. Sitten 200 ui DMSO: ta lisättiin määrätietoinen MTT alustaan, ja absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä käyttäen Spectra MAX mikro levynlukijaa (Bio-Rad, USA) B

Western blot-analyysi

Soluja kerätään ja uutetaan eukaryoottisolu lyysipuskuria mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Proteiinit erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja blotattiin nitroselluloosamembraanille märkä siirtolaitteen (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Blotatun membraanit blokattiin 10% rasvatonta maitoa PBS Tween-20: ssa 1 h. Pesun jälkeen kalvoja kolme kertaa Tris-puskuroidulla suolaliuoksella Tween-20 (TBST), niitä inkuboitiin primääristen vasta-ainetta laimennettuna 1:1000 huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan ja sitten inkuboitiin HRP-leimattua sekundaarista vasta-ainetta laimennettiin 1:10 000 huoneen lämpötilassa 1 tunti. Huuhtelun jälkeen kalvoja, visualisointi suoritettiin tehostetun kemiluminesenssin Western blot-analyysi (Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK), ja solut altistettiin röntgenfilmille (Kodak). GAPDH-proteiinia käytettiin sisäinen kontrolli. Pultit havaitaan ja analyysi ohjelmistojen Alpha Imager EP (Version: 3.2.2.0).

Cell muuttoliike määrityksiä

Cell muuttoliike analyysit suoritettiin käyttäen 24-kuoppaista Tran turvota levyjen (8 um huokoskoko koko, Costar). Noin 1 x 10

4 (HT29 tai HCT116) ladattiin yläkammiot. Alakammioissa täytettiin keskipitkän (1640 plus 1% FBS) puuttuessa (DMSO 0,2%) tai läsnä SecinH3 (10, 20 tai 40 uM). Tran turvota Sitten levyjä inkuboitiin 37 ° C, 5% CO 2-inkubaattorissa 48 tuntia. Puhdistuksen jälkeen solut yläpuoli polykarbonaattikalvon ja värjäys hematoksyliini-eosiinilla, polykarbonaatti kalvo leikattiin ja asetettiin mikroskoopin objektilasille, kansi putosi, ja tutkitaan mikroskoopilla. Kokonaismäärä siirretty solujen määrä ja prosenttiosuus sitten laskettiin.

Vieraslajisiirteen kasvainmuodoista

Kaikki eläin menetelmät suoritettiin noudattaen Zhejiangin yliopistossa Lait eläinsuojelulaki ja hyväksynyt Zhejiangin yliopistossa eläinsuojelun komitea . Kasvaimet syntyvät ihonalainen ruiske 5 x 10

6 HT29 osaksi nu /nu kateenkorvattomia uroshiirillä mukaan Ullrich et al. [19]. Todettuaan kasvaimet (noin 6 mm halkaisijaltaan), neljätoista hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään. Hiiret SecinH3 ryhmässä käsiteltiin päivittäin injektoimalla intraperitoneaalisesti SecinH3 (100 ui, 2,5 mM; 75%: n glukoosiliuosta (5%) /25% DMSO: ta). Hiiret kontrolliryhmässä käsiteltiin samalla tilavuudella 75% glukoosiliuosta ja 25% DMSO: ta, kunnes 14. päivänä. Hoidon aikana, mittasimme suurin tuumorin halkaisija välein 2 päivää ultraäänellä ja lopetettiin sitten hiiret kerätä kasvaimia. Suoritimme sitten immunohistokemiallinen värjäytyminen Ki-67 tunnistaa leviämisen estäminen SecinH3 että ksenografti- kasvainmuodoista. Yhteenlaskettu Ki-67 positiivinen solu määrä ja prosenttiosuus sitten laskettiin.

Tilastot

Tulokset annetaan keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Tilastollinen ohjelmisto SPSS16.0 käytettiin tilastolliseen analyysiin. Pariksi vertailuja tehtiin Studentin

t

-testi. Pearsonin korrelaatio analyysi tehtiin, jossa

p

0,05 (merkintä ”*”) ja

p

0,01 (merkitty ”**”) katsotaan merkittävästi erilaiset tai korreloi merkitsevästi.

tulokset

ARNO yli-ilmentyminen korreloi EGFR ja IGF-IR tasot paksu- ja peräsuolisyövän kudos

EGFR ja IGF-IR signalointi kriittisiä rooleja monissa syöpätyypit [16 ] ja ryhmämme havaitsi, että ARNOn ja muut cytohesins parantaa EGFR aktivaatio peräsuolen syövän solut [17]. Niinpä pohti ARNO oli ohi ilmaistaan ​​potilaan syöpä kudoksiin ja yli-ilmentyminen korreloi EGFR ja IGF-IR signalointi. Siksi käytimme immunohistokemia tutkimaan ensisijaisen paksu- adenokarsinoomia vasta-aineella havaitsemiseksi ARNO, pEGFR (pY1068), ja pIGF-IR (pY1185). Tulokset osoittivat, että normaali peräsuolen kudokseen tai hyvänlaatuinen vieressä peräsuolen kudos oli vain tausta (30/36) tai heikkoa värjäytymistä (6/36). Lisäksi kaikki karsinoomat osoitti ARNO positiivista värjäytymistä, 93,1% oli kohtalainen tai vahva. Löysimme erittäin merkitsevä (

r

= 0,712,

p

= 0,012 varten pEGFR;

r

= 0,684,

p

= 0,031 varten pIGF- IR,

n

= 36) välistä korrelaatiota ilmentymisen tason ARNOn ja pEGFR tai pIGF-IR (kuva 1). Aikaisemmat tutkimukset roolista ARNO kolorektaalisyövässä kudoksissa ovat paljastaneet vahvasti yhteydessä pEGFR ja pIGF-IR, mikä viittaa siihen, että ARNO mahdollisesti parantaa aktivointia ja signalointi EGFR ja IGF-IR.

Potilaiden kolorektaalisyövissä tai hyvänlaatuinen viereiseen kudokseen peräkkäistä leikettä värjättiin ARNO (a), pEGFR (b), ja pIGF-IR (c). Edustavia kuvia normaalin peräsuolen kudosten (vasen sarake) ja kohtalainen (oikea sarake) ARNO lauseke esitetään (alkuperäinen suurennos x 100). Kaaviossa (a) esittää osa ja taajuudet kasvainten tausta (-), heikko (+), kohtalainen (++), tai vahva (+++) värjäyksiä ARNO. Piirroksissa (b) ja (c) kuvaavat korrelaatio fosforylaation tasoja vastaavien proteiinien kanssa ARNO pisteet (

p

= 0,012 varten pEGFR,

p

= 0,031 varten pIGF-IR

n

= 36). Se paljastaa, että ARNO yli ilmentyminen korreloi parannettu EGFR ja IGF-IR.

Chemical eston cytohesins ja knockdovvn ARNO pienentää soluviestitykseen

havaitsemiseksi toiminnon cytohesins tai ARNO EGR koulutusjakson paksusuolen syövän soluja, SecinH3 ja ARNO-siRNA (valitaan ensisijainen kokeita) estävät cytohesins /ARNOn HT29 [17]. Määrityksessä, HT29-soluja viljeltiin 35 mm: n lasi-bottom ruokia merkitty ryhmä A, B, tai C. Kaikki soluja viljeltiin 1% FBS: ää elatusaineeseen. SecinH3 (20 uM tai seos 100 pmol ARNOn-siRNA 5 ui Lipofectamine 2000) lisättiin astioihin ryhmästä B, kun solut oli levinnyt kattaa 70% astiat 10 tuntia. Samalla, 0,2% DMSO: ta (tai 5 ui Lipofectamine 2000) lisättiin astioihin ryhmien A ja C kontrollina, ja sen jälkeen 50 ng /ml EGF: ää, lisättiin ruokia ryhmiin A ja B 5 min. Western blot-analyysiä käytettiin testaamaan ilmentymistä EGF-reittiin liittyvät molekyylit, mukaan lukien ARNO, EGFR, pEGFR, pIRS1, pShc, ja pERK1 /2. Tulokset osoittivat, että kun SecinH3 tukossa cytohesins tai ARNO estettiin ARNO-siRNA, ARNO ilmentyminen väheni HT29. Lisäksi, fosforyloidun molekyylit EGF-reitin, kuten pEGFR, pShc, ja pERK1 /2: ta säädeltiin vuonna HT29 (Fig. 2).

(a ja b) SecinH3 ja ARNOn-siRNA vähentää EGFR-reseptorin signalointia. Western blot-analyysi HT29 käsiteltiin SecinH3 (a) tai ARNO-siRNA (b) ja stimuloitiin EGF on esitetty. Fosforylaatiota ilmoitettu proteiinien määritettiin immuunidetektio käyttämällä fosfospesifiselle vasta-aineita. Glyceraldehydes fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) toimi latauskontrollina. Piirrokset näyttävät suhteelliset fosforylaation tasojen normalisoinnin jälkeen GAPDH. Käsittelemättömän ligandi-stimuloituja soluja asetettiin 3 (

n

= 3). Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. *

p

0,05, **

p

0,01.

havaitsemiseksi toiminnon cytohesins tai ARNOn IGF koulutusjakson, SecinH3 ja ARNO -siRNA [17] HCT116-soluissa esti cytohesins /ARNO. Määrityksessä, HCT116-soluja viljeltiin 35 mm: n lasi-bottom ruokia merkitty ryhmä A, B, tai C. Kaikki soluja viljeltiin 1% FBS: ää elatusaineeseen. SecinH3 (20 uM tai seos 100 pmol ARNOn-siRNA 5 ui Lipofectamine 2000) lisättiin astioihin ryhmästä B, kun solut oli levinnyt kattaa 70% astiat 10 tuntia. Samalla, 0,2% DMSO: ta (tai 5 ui Lipofectamine 2000) lisättiin astioihin ryhmien A ja C kontrollina, ja sen jälkeen 25 ng /ml IGF-1 lisättiin ruokia ryhmiin A ja B 5 min. Western blot-analyysiä käytettiin ilmentymisen testaamiseksi IGF-reittiin liittyvät molekyylit, mukaan lukien ARNO, IGF-IR, pIGF-IR, Pirsistä ja Pakt. Tulokset osoittivat, että kun cytohesins blokattiin SecinH3 tai estävät ARNO-siRNA, ARNO ilmentyminen väheni HCT116-soluissa. Lisäksi, fosforyloitu molekyylit IGF reitin mukaan lukien pIGF-IR ja Pakt oli vaimentua in HCT116-soluissa (Fig. 3).

(a ja b) SecinH3 ja ARNOn-siRNA vähentää IGF-IR-reseptorin signalointia. Western blot-analyysi HCT116-soluja käsiteltiin SecinH3 (a) tai ARNO-siRNA (b) ja stimuloitiin IGF-1 on esitetty. Fosforylaatiota ilmoitettu proteiinien määritettiin immuunidetektio käyttämällä fosfospesifiselle vasta-aineita. Glyceraldehydes fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) toimi latauskontrollina. Piirrokset näyttävät suhteelliset fosforylaation tasojen normalisoinnin jälkeen GAPDH. Käsittelemättömän ligandi-stimuloituja soluja asetettiin 3 (

n

= 3). Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. *

p

0,05, **

p

0,01.

Esto cytohesins vähensi proliferaatio ja migraatio paksusuolen solujen

immunohistokemia potilaiden syövän kudoksissa paljasti, että ARNO yli ilmentyminen korreloi parannettu EGFR ja IGF-IR. Tämä havainto sai meidät ajattelemaan mahdollisuus pienentää leviämisen tai migraation EGFR /IGF-herkkien solujen kun ARNO on estetty. Valitseminen EGFR /IGF-herkkä solulinjoissa, suoritimme MTT-määritystä viljelemällä kolorektaalisyöpä solulinjoissa HT29, SW620, SW480, HCT116, ja LOVO 1% FBS EGF tai IGF. Olemme havainneet, että HT29 oli EGFR-riippuvaa solulinjaa ja HCT116 oli IGF herkkiä (tuloksia ei ole esitetty). Molemmat solulinjat havaittiin villityypin KRAS ja BRAF (tietoja ei ole esitetty). Havaita suhdetta ARNO solujen proliferaatio ja migraatio kolorektaalisyövässä, lisäsimme sesinH3 viljelyalustaan ​​ja todennut sen voi vähentää leviämisen (MTT-määritystä SecinH3 in 0 (DMSO), 10, 20, ja 40 uM 24, 48, ja 72 h) (Fig. 4b), ja muuttoliike (Tran paisua SecinH3 in 0 (DMSO), 10, 20 ja 40 uM 48 tuntia) HT29 ja HCT116-solut (Fig. 4a). Se osoittaa, että SecinH3 voi estää soluttautuminen ja muuttoliike HT29 ja HCT116-soluissa. Ja vaikutukset ovat verrannollisia pitoisuus SecinH3 ja aika toiminnan.

Vasen sarake kaavio (a) ovat edustavat kuvat Tran turvota määrityksen HT29 ja HCT116-solut käsiteltiin SecinH3 in 0, 10, 20 ja 40 uM. Vasemmalle kuvat ovat seurausta HT29 ilman SecinH3 (DMSO 0,2% 48 tuntia) ja SecinH3 (20 uM 48 h) (n alkuperäinen suurennos x 100). Näyttää siltä, ​​että SecinH3 voi estää migraation HT29 ja HCT116-soluissa. Tulokset ovat korrelaatio pitoisuus SecinH3 ja aika. Kaaviot (b) esittävät solujen suhteellinen määrä HT29 ja HCT116 määritettiin MTT-määrityksellä, kun läsnä on SecinH3 on 0, 10, 20, ja 40 uM 24, 48, ja 72 h. Näyttää siltä, ​​että SecinH3 voi estää soluttautumista HT29 ja HCT116-soluissa. Tulokset ovat myös korrelaatio pitoisuus SecinH3 ja aika. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. * P 0,05, ** p 0,01 (

n

= 5).

SecinH3 vähensi kasvua paksusuolen HT29 tuumoriksenograftien

voimakas ilmaus ARNO kolorektaalisyövässä kudosten ja sen merkittävää korrelaatiota pEGFR ja pIGF-IR sai meidät miettimään, esto cytohesins in vivo voivat estää kasvainsolujen proliferaatiota. Tämän tutkimiseksi hypoteesin, HT29, jotka ovat korkeammat ilmaus EGFR kuin muiden peräsuolen syövän soluja [17], valittiin tekemään ksenografti hiirimallissa. Joten me ihon alle injektoidaan HT29 paljaisiin hiiriin tuottaa tuumoriksenograftien. Kun -tuumoriksenografti koko saavutti 6-7 mm hiirillä, jotka oli injektoitu HT29-solujen lähes viikon, hiiret alkoivat hoitoon tai ilman SecinH3. Kasvaimet on SecinH3 ryhmän estyivät kasvu ilmeisesti hoidon jälkeen SecinH3 yli viikon. Nämä kaksi ryhmää olivat ilmeisiä eroja, kunnes 11 päivää käsittelyn jälkeen (kuvio. 5a). Immunohistokemiallinen värjäys solujen lisääntymistä markkeri Ki-67 in resektoidun kasvaimissa vahvisti alennettu solujen lisääntymistä. Yhteenlaskettu Ki-67 positiivinen solu määrä ja prosenttiosuus sitten laskettiin. Olemme löytäneet erittäin merkittävä eri ilmentymistason välillä käsiteltyjen hiirten kanssa tai ilman SecinH3 käsittelyn jälkeen 14 päivää (p = 0,0083, n = 7) (Fig.5b, c, d). Western blot-analyysiä käytettiin testaamaan ilmentymistä EGF-reittiin liittyvien molekyylien kasvaimia hiirissä, joita hoidettiin 2 viikon ajan, mukaan lukien ARNO, pEGFR. Tulokset osoittavat, että kun SecinH3 tukossa cytohesins, ARNO ja pEGFR ilmaisun vähenivät HT29 ksenografteissa. (Fig.5e).

halkaisija ksenograftin kasvaimen perustettu hiirillä mitattiin ultraäänellä 2 päivän välein hoidon aikana (kaavio a). T

1 oli kontrolliryhmä. T

2 oli SecinH3 ryhmä. Kasvaimia on SecinH3 ryhmän inhiboi kasvua luonnollisesti sen jälkeen, kun päivittäin intraperitoneaalisesti injektoimalla SecinH3 yli viikon. Oli merkittävää eroa kahden ryhmän 11 ​​

th, 14

th päivän kuluttua hoidon. Kaavio (b) ja (c) edustavat immunohistokemiallinen straining tulokset Ki-67 kasvaimen hiirillä sen jälkeen, kun käsiteltiin (b) tai ilman SecinH3 (c) 14 päivää, (alkuperäinen suurennos x 200). Se saumat, että SecinH3 vähentää ilmentymistä Ki-67 HT29 ksenografteissa. Kaavio (d) kuvaa positiivisen ekspression määrä Ki-67 kasvaimissa hiirillä, HT29 vierassiirrännäiset 14

päivänä hoidon jälkeen tai ilman SecinH3. Kaavio (e) kuvaa positiivisen ekspression ARNO, pEGFR kasvaimissa hiirillä, HT29 ksenografteja hoidon jälkeen tai ilman SecinH3 varten 2 viikkoa. Arnon ja pEGFR ilmentyminen kahdella ryhmällä on merkittävä ero. Piirrokset näyttävät suhteelliset fosforylaation tasojen normalisoinnin jälkeen GAPDH. Tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. *

p

0,05, * *

p

0,01, n = 7

Keskustelu

EGF ja IGF ovat kriittisiä sääntelyviranomaisten biologisia ominaisuuksia solujen, erityisesti syöpien [20]. Aikaisemmat tutkimus on osoittanut, että ARNO on tärkein cytohesin ja on yli ilmaistaan ​​peräsuolen syövän solulinjoissa aktivaattorina, joka on keskeinen rooli EGFR koulutusjakson signalointi [17].

Voit tarkistaa hypoteesi, että ARNO on liittyvät peräsuolen syövän aktivoimalla EGF ja IGF, suoritimme immunohistokemialla resektoidun paksu- adenokarsinoomia värjätään ARNO, pEGFR ja pIGF-IR. Verrattuna normaaliin peräsuolen kudokseen tai hyvänlaatuinen vieressä peräsuolen kudokseen, ARNO, pEGFR ja pIGF-IR oli yli ilmaistu adenokarsinooman. Olemme myös löytäneet erittäin merkittävä korrelaatio ekspressiotasot ARNOn ja pEGFR tai pIGF-IR.

Lisäksi, käytimme siRNA ja SecinH3-inhiboi ARNOn /cytohesins kolorektaalisyövässä solulinjoissa tutkia aktiivisuuden ARNO ja sen yhdessä EGFR ja IGF-IR merkinantojärjestelmän. Sitten havaittiin loppupään EGFR ja IGF-IR yhdessä peräsuolen syövän ilmaantuvuus. Kun me esti cytohesins tai ARNO, loppupään molekyylejä EGF reitin peilattiin alennettu aktivointi pEGFR, pIRS1, pShc, ja pERK1 /2. Todisteet ehdotti, että estämällä cytohesins tai ARNO voisi vähentää EGR reitin järjestelmään. Kaikkina aikoina, havaitsimme IGF-reitin loppupään lukien IGF-IR, pIGF-IR, Pirsistä ja Pakt. Nämä molekyylit olivat säädeltiin kun ARNO estyi kemiallisesti tai siRNA. Nämä alas määräykset osoittivat, että signaalin vahvistus ja tioreittien oli estää tehokkaasti [21]; [22]. Siten cytohesins tai ARNO oli vahvasti korreloi EGF ja IGF-reitin aktivaatio kolorektaalisyövässä [23].

solun yhteydessä käytimme ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän solulinjoissa HT29 ja HCT116 tunnistaa ilman mutaatiota KRAS ja BRAF . Kun ARNO-siRNA tai SecinH3 tukossa ARNO tai cytohesins, leviämisen peräsuolen syövän solut vähennetty MTT. Lisäksi leviämisen väheneminen korreloi positiivisesti kanssa SecinH3 pitoisuus. Jotta hyökkäys ja migraatiokokeessa, Tran turvota määritys suoritettiin. Huokoset Tran aallokossa membraanit blokattiin geeliä (matrigeeliä), joka koostuu soluväliaineen matkia tyypillinen matriisit, että kasvaimen solut kohtaavat invaasion aikana prosessin in vitro. Sijoittamalla ja peräsuolen solujen ylä- puolella geelin houkutellaan korkeampi seerumipitoisuus toisella puolella hyvin, invaasio määritettiin laskemalla ne solut, jotka olivat kulkeneet solu- kalvon, jotka ovat tunkeutuneet ja siirtynyt kohti korkeampaa pitoisuus seerumissa. Tässä kokeessa, huomasimme, että estämällä cytohesins jonka SecinH3 vähensi hyökkäyksen ja migraatio peräsuolen syövän soluja. Tutkijat ovat äskettäin raportoitu vastaavia vähennyksiä keuhko- ja eturauhassyövän [6]; [19]; [24]. Vähennys voi edistää alas säätely EGF ja IGF-I-reitin signaalin vahvistus ja transduktio. In vivo tutkimuksessa olemme ruiskutetaan SecinH3 päivittäin sen jälkeen, kun HT29 tuumoriksenografteja syntyi nude-hiirissä. Olemme havainneet, että kasvainsolujen kasvua ilmeisesti inhiboi jälkeen 9 päivää on SecinH3 injektion. 14 päivän jälkeen hoidon, kasvaimen leviämisen hiirillä oli myös estetty.

Äskettäisessä tutkimuksessa on löytää että ARNO ilmenee vahvasti peräsuolen syövän, ja ilmaisu on korreloi EGFR ja IGF-IR reittejä . ARNO esto voi vähentää signaloinnin ja johtuminen näiden reittien sekä vähentää leviämistä, invaasio, ja migraatio peräsuolen syövän solujen in vivo ja in vitro. Ludovini [25] kertoi, että jos molemmat IGF-IR ja EGFR ovat erittäin co ilmaistu resektoidun kuin pienisoluinen keuhkosyöpä, potilaat saattavat saavuttaa lyhyempiä tautivapaan elinajan. Choi et ai. [26] osoitti, että yhdistettyä esto IGF-IR signalointi parantaa kasvua estävä ja apoptoosin indusoiva vaikutus EGFR estäjä. Kuitenkin syöpäsolut aina paljon signaalikanava tapoja jäljentää, ja EGFR ja IGFR ovat vain kaksi näistä tavoista. Vaikka ARNO voi olla uusi hoito tavoite joidenkin peräsuolen syövän soluja, korkeampi pitoisuus ARNO syöpäsoluissa kuin normaaleissa soluissa voi johtua muista syistä, kuten lisääntymistä ja koskemattomuus. Mekanismi siirtyminen voi myös liittyä integriinin β [27]. Kaikki nämä hypoteesit on tutkittu tulevaisuudessa.

Kiitokset

Kiitämme Dr Zhou Jiaojiao ja tohtori Tan Chunwen niiden solulinjojen (HT29, HCT116), ja me myös kiittää tuesta ja innostusta. Haluamme anteeksi niiltä tekijät, joiden korvaamatonta työtä ei mainita, ja mainittu yllä.