Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t) ovat ensisijaisia ​​ehdokkaita uusia syövän ehkäisyyn ja hoitostrategioihin. Etsimme ilmennetty eri GPCR: ien in imusolmukkeisiin mahakarsinoomat.

Menetelmät /Principal Havainnot

Differential ilmentymistä GPCR: ien kolmessa imusolmukkeisiin vs. kolme imusolmukenegatiivisista suoliston tyyppi mahakarsinoomat analysoitiin geenijärjestelyillä teknologiaa. Ehdokas geenit CXCL12 ja sen reseptori CXCR4 todensi reaaliaikaista käänteistranskriptiotuotteiden polymeraasiketjureaktio riippumattomalla joukko 37 mahakarsinoomat. Käännös tutkittiin immunohistokemia 347 mahakarsinoomat käyttäen kudossiruina sekä 61 matching imusolmukemetastaaseja. Proteiinin ilmentyminen korreloi kliinis potilasryhmät ja selviytymistä. 52 GPCR: t ja GPCR liittyviä geenejä ylös- tai alaspäin säädeltyjä imusolmukkeisiin mahasyövän, kuten CXCL12. Differential ilmentyminen CXCL12 varmistettiin RT-PCR: llä ja korreloivat paikallisen kasvaimen kasvua. CXCL12 immunopositivity oli negatiivisesti yhteydessä etäispesäkkeitä ja kasvaimen. Vain 17% mahakarsinoomat osoitti CXCR4 immunopositiivista kasvainsoluja, joka liittyi korkeampi paikallinen kasvain määrin. 29% mahakarsinoomat osoittivat CXCR4 kasvain pienten verisuonten. Vascular CXCR4 ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä korkeampaan paikallisen kasvaimen laajuutta sekä korkeammat UICC-vaiheissa. Kun ilmensivät sekä, CXCL12 kasvainsoluissa ja CXCR4 kasvaimen mikrosuonten nämä kasvaimet olivat myös erittäin merkitsevästi liittyy korkeampi T- ja UICC-vaiheissa. Kolme imusolmukemetastaaseja paljasti verisuonten CXCR4 ilme kun kasvainsoluissa puuttuivat kokonaan CXCR4 kaikissa tapauksissa. Ilmentyminen CXCL12 ja CXCR4 ollut vaikutusta potilaiden eloonjäämiseen.

Johtopäätökset /merkitys

tulokset perustelemaan merkitystä GPCR: biologiaan mahalaukun karsinoomien ja osoitettava, että CXCL12-CXCR4-reitin voi olla uusi lupaava antiangiogeeninen kohde hoitoon mahakarsinoomat.

Citation: Ingold B, Simon E, Ungethüm U, Kuban RJ, Muller BM, Lupp A, et al. (2010) Vascular CXCR4 Expression – Novel antiangiogeenisesti Target mahasyövän? PLoS ONE 5 (4): e10087. doi: 10,1371 /journal.pone.0010087

Editor: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 22 syyskuu 2009; Hyväksytty: 16 maaliskuu 2010; Julkaistu: 08 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Ingold et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Berliner Krebshilfe (Berlin Canceraid). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti, sijoitus neljänneksi yleinen esiintyvyys ja osuus yli 650000 kuolemantapausta vuosittain [1]. Kuolleisuus mahalaukun syövän vain menestyneet keuhkosyöpä. Varhainen mahasyövän aiheuttaa usein mitään erityisiä oireita. Puute ensioireita viivästyttää diagnoosia. Niinpä 80-90% Länsi sairastavilla potilailla mahalaukun syövän läsnä kehittynyt kasvaimia, kun paikallinen tai etäinen etäpesäkkeitä oli jo tapahtunut [1]. Imusolmuke tila, erityisesti suhde etäpesäkkeiden-positiivinen /metastaasi-negatiivinen imusolmukkeet, on vahvin ennustetekijä mahasyövän [2]. 5 vuoden eloonjäämisaste potilailla, joilla on 1-6 imusolmukemetastaaseja on 44% ja päätyen vain 11% potilailla, joilla oli yli 15 positiivisia imusolmukkeita. Osittain tai kokonaan gastrektomia yhdistettynä adjuvanttiin sädehoidon ja /tai kemoterapian kuten lupaa täydellinen parannuskeino vain potilaille, joilla on varhaisessa vaiheessa sairaus. Vuonna etäpesäkkeitä, nykyään käytetään sädehoitoon ja solunsalpaajahoitojen on huono teho ja käsittely kestävät taudin eteneminen johtaa kuolemaan muutamassa kuukaudessa [3]. Tähän mennessä ei ole olemassa erityistä ennustava markkeri kuten HER2 Rintasyövän, EGFR ei pienisoluisen keuhkosyövän tai K-RAS kolorektaalikarsinoomasta, joka mahdollistaa yksilöllisemmän terapeuttinen strategia. Siksi uusi molekyyli-kohdennettuja terapeuttisia lähestymistapoja tarvitaan.

G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t) ovat ylivoimaisesti suurin perheen solun pinnan molekyylejä, jotka välittävät signaaleja GTP-sitovaa proteiinia (G-proteiini- ) -initiated toisiolähetti- kaskadeja soluun [4]. GPCR: t säätelevät monet agonistit, mutta kaikki sellainen ominaisuus ydin koostuu seitsemästä transmembraanisen α-heeliksit, jotka liittyvät kolmen intra- ja kolme ekstrasellulaarista silmukkaa. Nämä reseptorit avainsalpalupa elintoimintojen, kuten neurotransmissiota, hormoni ja entsyymi vapautumista hormonitoimintaa ja avoeritysrauhasiin, immuunivasteet, lihasten supistumisen ja verenpaineen säätelyyn muutamia [4].

pahanlaatuiset solut usein kaapata normaalin fysiologisen toiminnot GPCR: hengissä, lisääntyä itsenäisesti ja kiertää immuunijärjestelmää. Lisäksi GPCR: t on keskeinen rooli kasvaimen angiogeneesin ja syövän etäpesäkkeiden. Monet kiinteät kasvaimet luottavat GPCR: ien herättämiseksi angiogeeninen vaste joko vaikuttamalla endoteelin tai peruskudoskomponentit suoraan tai sääntelyn vapauttamista tai aktiivisuuteen muiden angiogeenisten välittäjäaineiden, kuten verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) tai perus fibroblastikasvutekijä (bFGF) by strooman ja immuunijärjestelmän solut [5]. Syöpäsolut manipuloida GPCR: ien houkutella endoteelisolujen ja johtaa heidät hyökätä kasvain massa, jolloin muodostuu uusia aluksia tarjota ravinteiden ja happea. Monet syövät etäispesäkkeitä tiettyihin elimiin, mikä usein johtuu poikkeava ilmentyminen GPCR: ien syöpäsoluissa – varsinkin kemokiinireseptoreita – samanaikainen julkaisun kanssa kemokiinien sekundaarisesta elinten [6].

Lääkkeiden toimitus, kasvaimen kuvantamisessa ja biomarkkerit ennustamiseen maligniteetin ovat sovelluksia GPCR: ien korostaa: Radio-leimattu sitoutuvien peptidien GPCR: voisi olla laaja sovelluksia syövän diagnosoinnissa ja hoidossa [7]. Ligandit, jotka sitoutuvat GPCR: ien on myös konjugoitu sytotoksisten aineiden kohdistaa pahanlaatuisia soluja, jotka yli-ilmentävät näitä reseptoreita, mikä vähentää haittavaikutuksia, [8]. Lisäksi GPCR: t saattavat olla arvokkaita biomarkkereita syöpädiagnoosin kuten todistettu tutkimuksissa eturauhassyövän [9].

Siksi pyrittiin (i) arvioida eri tavalla ilmaistuna GPCR: ien in solmukohtien negatiivinen versus solmukohtien positiivinen suolen tyyppiä mahakarsinoo- by GeneChip- array tekniikka. (Ii) transkriptio kandidaattigeenejä validoitiin reaaliaikaista Käänteiskopiointia polymeraasiketjureaktio (reaaliaikainen RT-PCR). Arvioimme käännös ja histoanatomical jakelu kemokiinin CXCL12 ja sen vastaava kemokiinireseptori CXCR4 suuressa sarjassa 347 mahalaukun karsinoomanäytteistä immunohistokemiallisesti käyttäen kudosta microarray-teknologia sekä 61 matching imusolmukemetastaaseja tavanomaisten dioja (iii). Olemme korreloi translationaalinen ilmaisua kuvioita runsaasti joukko kliinis potilaan ominaisuudet, mukaan lukien potilaan eloonjääminen (iv).

Tulokset

Differential geeniekspression imusolmukenegatiivisista ja imusolmukkeisiin mahasyövän kudoksen

Ensinnäkin tutkimme ero ilmentymistä mRNA sarjassa 6 suoliston tyypin mahasyöpäpotilaista (3 ja 3 ilman imusolmukemetastaaseja) käyttäen GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Array alkaen Affymetrix joka havaitsee 47000 selostukset ja variantit sekä 38500 hyvin karakterisoitu ihmisen geenejä. mRNA uutettiin ja transkriboidaan vain kudosnäytteistä saatu ensisijainen kasvaimia. Kaikkiaan 115 selostukset todettiin olevan ylä- ja 219 on säädellä vähentävästi imusolmukkeisiin mahasyövän verrattuna imusolmukenegatiivisista syöpien (taulukko S1). Seuraavaksi etsittiin ilmentyvät eri GPCR: iä. Havaitsimme 52 GPCR: t ja GPCR liittyviä geenejä, jotka olivat ylös- tai alaspäin säädellään kertamuutos kertoimella 1,5 (taulukko S2).

In silico

analyysi

etsitään sitten

ENT- REZ

tietokanta on ”

National Center for Biotechnology Information (NCBI) B” varten merkinnät GPCR: ja GPCR-ligandien ja niiden otaksuttu rooli tuumoribiologiassa . Merkitys angiotensiini II tyypin 1-reseptorin mahasyövässä aiemmin varmistettiin oman ryhmän [10]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmaus Duffy veriryhmä kemokiinireseptori (DARC) korreloi käänteisesti esiintyvyys ja ennuste eturauhassyövän [11] – [13]. Eläinmallissa rintasyövän ilmentymisen EDG2 korreloi ilmaantuvuus keuhkometastaasien [14]. FPRs välittävät vaikutus anneksiini 1 solun liikkuvuus ja invaasiota, jotka ovat tärkeitä metastaattisen potentiaalin kasvainsolujen [15]. LGR5 äskettäin osoitettu olevan kantasolun markkerina solujen ohutsuolen ja paksusuolen ja kantasolun erityisiä menetys APC johtaa asteittain kasvava kasvaimiin, [16]. Yhdessä nämä tiedot todistaa, että lähestymistapamme tunnistettu GPCR: t ja GPCR-ligandeja, jotka voivat olla mukana mahasyövässä biologiassa. Koskevat kemokiinireseptoria ja kemokiinien ilmentymistä kemokiinien CCL2 ja CXCL12 korotettiin solmukohtien positiivisen mahasyövän verrattuna solmukohtien negatiivisten tapausten (täydentävä taulukko S2). Koska CXCL12-CXCR4 akseli on ollut näkyvä rooli tuumorigeneesiä, edistää angiogeneesiä ja kasvainsolujen vaeltamista ja metastaasien [17] – [19], valitsimme CXCL12 ja sen reseptori CXCR4 jatkotutkimuksiin.

transkriptio CXCL12 ja CXCR4 mahasyövän

ero ilmaus CXCL12- ja CXCR4-mRNA validoitu reaaliaikaisella RT-PCR riippumaton sarja 37 suolen tyyppiä mahakarsinoo- näytteitä. Vertasimme epäneoplastisis- limakalvon primaarikasvaimen sekä ensisijainen kasvaimia imusolmukenegatiivisista primaaristen kasvainten imusolmukkeisiin syöpiä.

CXCL12 ilmentyminen oli lisääntynyt mahakarsinoo- verrattuna ei-neoplastisten limakalvon (p = 0,033 ). Vahvistaminen array data, CXCL12 ilme oli myös säädellään ylöspäin solmukohtien positiivinen mahasyöpä verrattuna solmukohtien negatiivisia tapauksia. Tämä ero ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,132; kuvio 1a). Paikallisista kasvaimen kasvua, ei ollut merkittävää eroa CXCL12 ilmaisun pT1 /T2 vaiheessa kasvain versus pT3 /T4 kasvaimia. Mutta kiinnostavaa, CXCL12 ilme osoitti merkittävää yhdistyksen pT1 /pT2a versus pT2b /T3 /T4 (p = 0.049; kuvio 1b).

Boxplots kuvaava yleinen jakautuminen CXCL12 (a) solmukohtien negatiivinen versus solmukohtien positiivinen mahalaukun karsinoomat ja (b) pT1 /T2a versus pT2b /T3 /T4 mahakarsinoomat. Yleisjakauman CXCR4 (c) solmukohtien negatiivinen versus solmukohtien positiivisia mahakarsinoomat ja (d) pT1 /T2a versus pT2b /T3 /T4 mahakarsinoomat. Laatikko rajat: 25

th ja 75

th persentiilit; Yhtenäinen viiva: mediaani; whiskers: 10

th ja 90

th prosenttipisteet.

ei kuulunut ero CXCR4 ilmaisun mahakarsinoo- vs. ei-kasvainkudoksessa (p = 0,229) eikä solmukohtien negatiivinen versus solmukohtien positiivinen mahasyöpä (p = 0,22; kuvio 1 c). Vertaamalla CXCR4 ilmaisu paikallisen kasvain määrin CXCR4-mRNA-tasot kasvoivat paikallisten kasvaimen kasvuun (p = 0,079; kuvio 1 d).

Käännös CXCL12 mahalaukun karsinooma, korrelaatio kliinis parametrien ja selviytymisen analyysit

kääntäminen ja histoanatomical jakelu CXCL12 myöhemmin tutkittiin immunohistokemia 347 mahakarsinoo- näytteitä. 291 tapauksissa, CXCL12 immunoreaktiivisuus oli arvioitavissa. Syöpäsolut ilmaistu CXCL12 vuonna 244 291 (84%) näytteistä. Vahva soluliman ja membranous immunoreaktiotuotteet havaittiin 143 (49%) tapauksista ja heikko värjäytymistä 101 (35%). 47 kasvaimia (16%) puuttui CXCL12-immunoreaktiivisuus. Kaikki kasvain näytteet osoittivat selvä CXCL12 positiivisuus verisuonten endoteelisolujen, joka toimi sisäisenä positiivisena kontrollina (kuvio 2a-c). Tilastolliset analyysit osoittivat merkittävää korrelaatiota ilmentymisen CXCL12 kasvainsoluissa ja etäispesäkkeitä (p = 0,043) sekä kasvaimen (p = 0,0064). Kaikki muut kliinis parametrit eivät osoittaneet yhdessä CXCL12 ilmentymistä kasvainsoluissa (taulukko 1). Kun jakamalla kohortti kahteen ryhmään, eli suoliston tyyppi ja hajanainen tyyppi mahasyöpä ei korrelaatio löytyi CXCL12 ilme ja kaikki kliinis parametri kummassakaan ryhmässä (tuloksia ei ole esitetty). CXCL12 ilmentyminen kasvainsoluissa ei ollut vaikutusta potilaiden eloonjäämiseen (koko ryhmä: p = 0,830; suoliston tyyppi carcinoma: p = 0,766; hajanainen tyyppi carcinoma: p = 0,817).

Mahalaukun karsinoomanäytteistä paljastaen vahva (a ) ja heikko (b) CXCL12 immunoreaktiivisuus. Vain harvoissa tapauksissa olivat CXCL12 negatiivinen (c). Huomautus positiivinen CXCL12 värjäytyminen verisuonia (nuoli). Mahakarsinoo- yksilöt selkeässä soluliman ja membranous CXCR4 immunoreaktiivisuus oli harva (d). Muutama näytteistä löytyi heikko (e) CXCR4-värjäys, kun taas useimmat kasvainten puuttui CXCR4 ilmaisu (f). Valkosolut toimi sisäisenä positiivisena kontrollina (nuolet). Mitta-asteikko: a-f: 50 pm.

Käännös CXCR4 mahasyöpä korrelaatio kliinis parametrien ja selviytymisen analyysit

Käännös CXCR4 tutkittiin myös immunohistokemiallisesti. Immunoreaktiivisuus tuumorisoluissa oli arvioitavissa 293 kasvain näytteissä, joista vain 6 (2%) osoitti yksiselitteinen membranous värjäytymistä (luokka 2 +; kuvio 2d). Useimmat CXCR4 positiivinen kasvain yksilöitä vain paljasti heikottaa sytoplasmisen CXCR4 immunoreaktiivisuus (luokka 1+, 44 tapausta, 15%, kuvio 2e). Nuclear CXCR4 immunoreaktiivisuus ei havaittu missään tapauksessa ja minkä tahansa solu- tyyppiä. Ja kaikkiaan 83% (243 293) ja mahakarsinoomat olivat immunonegative varten CXCR4, useimmat osoittaa samanaikaisen CXCR4 positiivinen valkosolut sisäisenä positiivisena kontrollina (kuvio 2f). Mielenkiintoista on, kuten aikaisemmin on todettu ja peräsuolen karsinoomat, 86 293 mahakarsinoomat (29%) osoitti, CXCR4 positiivinen pienten verisuonten kasvaimen strooman vahva CXCR4 immunoreaktiivisuus endoteelisolujen (kuvio 3a). Verisuonten luonne herkkä rakenteet vahvistettiin CD34 immunovärjäyksellä (kuvio 3b).

mahalaukun karsinooma näytteet vahvassa verisuonten CXCR4 immunoreaktiivisuus tai puuttuu CXCR4 lauseke (a, c), joka on merkitty nuolilla. Verisuonten rakenteet vahvistettiin CD34 immunovärjäyksellä (b, d). Mitta-asteikko: a-d: 50 pm.

Kun korreloivat CXCR4 ilmentymistä kasvainsoluissa eri kliinis parametreja, CXCR4 ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä korkeampaan paikalliseen kasvaimen laajuutta (T-asema; p = 0,030). Kuitenkin enää yhteenliittymät kasvaimen CXCR4 ilmaisun ja muut kliinispatologiset muuttujia havaittiin (taulukko 2). Kun analysoidaan alaryhmä suolen tyyppiä mahakarsinoomat, ei yhdistysten löytynyt mitään kliinis-parametrin (tuloksia ei ole esitetty).

Sitten tutkittiin korrelaatio CXCR4 ilmentymistä endoteelisoluissa (verisuonten CXCR4 ilmaisu, vCXCR4 ) kasvaimen mikroverisuonten ja eri kliinispatologiset parametreja. Mielenkiintoista on, että ilmentyminen CXCR4 mikroverisuonten korreloi erittäin merkittävästi paikallista kasvaimen kasvua (T-luokka; p = 0,0001) sekä UICC-kasvaimen vaiheen (p = 0,0059). Jopa alaryhmien suolen tyyppiä ja hajanainen tyyppi mahasyöpä vCXCR4 ilmentyminen merkitsevästi liittyy paikallista kasvaimen laajuutta (suoliston type: p = 0,004; hajanainen tyyppi: p = 0,030) ja UICC-kasvain vaiheessa (suoliston type: p = 0,020) . Lisäksi vCXCR4 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä potilaan iän (p = 0,0148) koko ryhmän (taulukko 3).

Survival analyysi osoitti, että CXCR4 ilmentymistä kasvainsoluissa mahalaukun karsinooma sekä kasvaimen mikrosuonten ei ollut vaikutusta eloonjäämiseen.

samanaikainen CXCL12 /vCXCR4 ilmentymisen mahakarsinoo-

Koska CXCL12-CXCR4 akseli on osoitettu olevan osallisena syövän etenemistä [17] – [19], me tutki korrelaatio samanaikaisen ilmentymisen CXCL12 ja vCXCR4 kanssa kliinispatologiset parametreja. Todellakin, CXCL12-vCXCR4 positiivisia kasvaimia liittyy korkeampi paikallinen kasvain määrin (p = 0,0014) ja korkeampi UICC vaiheista (p = 0,017). Kuitenkaan ollut vaikutusta potilaan selviytymistä, jopa alaryhmien suoliston ja hajanainen tyyppi mahakarsinoo-.

Expression malli CXCL12 ja CXCR4 kohtaannon imusolmukemetastaaseja

CXCL12-CXCR4 akseli on raportoitu olevan mukana metastaattisen prosesseissa eri kasvaimen yhteisöihin. Sen vuoksi me tutkimme CXCL12 ja CXCR4 immunoreaktiivisuus osajoukko 61 vastaavia imusolmukemetastaaseja. CXCL12 ilmentymiskuvio oli käytettävissä 46 etäpesäkkeitä. Kaiken kaikkiaan 4 imusolmukemetastaaseja olivat CXCL12 negatiivisia kuin niiden vastaavat primaarikasvaimen. 40 imusolmukemetastaaseja osoitti selvästi CXCL12 positiivisuus mukaan primaarikasvaimen. Värjäytymisintensiteettiä oli hyvin heterogeeninen osoittavat vahvasti positiivisia kasvainsoluja vieressä heikosti värjätään kasvainsolun klustereita. Kuitenkin kaksi etäpesäkkeitä paljasti CXCL12 immunoreaktiivisuus, vaikka ei CXCL12 ilmentyminen on havaittu primaarikasvaimen.

CXCR4 immunoreaktiivisuus arvioitiin 54 imusolmukemetastaaseja. Mielenkiintoista, mikään niistä ei esiintynyt CXCR4 ilmaisua. Nekin kasvain (n = 6), osoittaa heikko CXCR4 positiivisuuden primaarikasvaimen, puuttui CXCR4 ilmaisu vastaavana imusolmukemetastaaseja. Kuitenkin kaikki imusolmukemetastaaseja paljasti selvästi CXCR4-positiivisten lymfosyyttien, joka toimi sisäisenä positiivisena kontrollina. Mielenkiintoista on, että kolmessa tapauksessa intratumoraalisesti CXCR4 positiivinen mikrosuonten olivat havaittavissa.

Keskustelu

G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien muodostavat suurimman perheen läpäisevien reseptoreihin. Viisi prosenttia kaikista ihmisen geenit koodi yli 800 erilaista GPCR: t ja noin 80 eri ligandit tunnistettiin asti [20]. GPCR: t ovat yleisimpiä farmakologinen tavoitteet lääke, eli lähes 30% kaikista lääkkeiden on suunnattu GPCR: iä. Todisteet kasvaa että GPCR: ien voi myös olla lupaavia kohteita syövän hoidossa. Tässä tutkimuksessa pyrittiin löytämään GPCR: iä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti imusolmukkeisiin syöpien ja näin ollen voidaan pitää tulevaisuuden tavoitteet mahalaukun syövän hoitoon. Löysimme 52 GPCR: t ja GPCR liittyviä geenejä, jotka ovat ylä- tai säädellä vähentävästi imusolmukkeisiin ensisijainen mahasyövän kudosta verrattuna imusolmukenegatiivisista syöpä. Useat GPCR: aiemmin olivat osoitettu liittyvän kasvaimen biologia, kuten AT1R, EDG2, DARC, ja FPR1 [10], [11], [14], [15]. Mitä mielenkiintoisinta, lista myös LGR5 [16], joka on äskettäin osoitettu olevan kantasolun markkeri ohutsuolessa ja paksusuolessa. Lisäksi erityistä menetys APC LGR5-positiivisten solujen tuloksia progressiivisesti kasvavilla neoplasioihin. Siten

in silico

validoineen tietojen tukivat hypoteesia, että GPCR: t ovat mukana tuumoribiologiassa mahasyövän.

myöhemmät validointitutkimuksissa käyttäen ryhmän riippumattomia potilaiden osoitti, että GPCR- ligandi CXCL12 ilmentyy kasvainsoluissa enemmistön mahakarsinoomat. Lisäksi CXCL12 ilme on negatiivisesti liittyy etäispesäkkeitä ja kasvaimen. Päinvastoin vain 17% mahakarsinoomat osoitti CXCR4 immunopositiivista kasvainsoluja, joka liittyi korkeampi paikallinen kasvain määrin. Mielenkiintoista, noin kolmannes mahakarsinoomat osoittivat CXCR4 kasvain pienten verisuonten. Vascular CXCR4 ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä korkeampaan paikallisen kasvaimen laajuutta sekä korkeammat UICC-vaiheissa. Kun ilmensivät sekä, CXCL12 kasvainsoluissa ja CXCR4 kasvaimen mikrosuonten nämä kasvaimet olivat myös merkitsevästi liittyy korkeampi T- ja UICC-vaiheet, tukeva rooli CXCL12-CXCR4 akseli neoangiogeneesiin mahasyövän.

Niistä GPCR: iä, kemokiinin järjestelmä edistää merkittävästi taudin etenemiseen kautta modulaatio paikallisen tulehdusreaktion, kasvainsolujen proliferaatiota, migraatiota ja selviytymistä sekä neoangiogeneesiin [4]. Kemokiinireseptori CXCR4 aluksi todettiin säädellä ohjautumisen lymfosyyttien tulehduksen ja edustaa yhdessä reseptori ihmisen immuunikatoviruksen (HIV) [21]. Fysiologisesti CXCL12-CXCR4 akseli on mukana kulkeutumista alkion solujen keskushermostoon, luuytimessä ja sydän [22], [23]. Se on keskeisessä asemassa metastaattisen prosesseissa, kuten on esitetty rintasyövän [24], [25], munasarjojen [26] ja eturauhassyövän [27] ja CXCL12 ilmenee vahvasti elimiä, jotka ovat usein sivustoja kaukaisten etäpesäkkeitä kuten keuhkot, maksa ja imusolmukkeiden solmut [28]. Mahalaukun syöpä, koskevat tiedot CXCL12-CXCR4-reitin harvassa [29]. On olemassa jonkin verran näyttöä siitä, että CXCR4 ilmentävät mahakarsinoomat todennäköisemmin kehittää vatsakalvon leviämisen kasvain, ja maligni askites sisältää korkeita pitoisuuksia CXCL12 [30].

Vertaamalla meidän geenijärjestelyillä tietojen kanssa saatiin RT-PCR: llä ja immunohistokemia, se oli mielenkiintoista huomata, että ero ilmentymistä CXCL12 solmussa positiivinen mahakarsinoo- vahvistettiin transkriptionaalisen muttei translaation tasolla. Tässä immunohistokemiallinen havaitseminen CXCL12 kasvainsoluissa korreloivat vain etäispesäkkeitä ja kasvaimen mutta ei solmukohtien levitä. Kuitenkin CXCL12 havaittiin ei vain kasvainsoluissa, mutta myös endoteeli- ja stroomasolujen [31], ja ilmaisee yleisesti koko kudoslokeron on vaikea arvioida immunohistokemialla. Päinvastoin, meidän transkription tutkimuksissa käytetty kudoshomogenaateista joka yhdistää kaikki CXCL12 ilmentävien solujen kasvain kudosta. Kuitenkin on pidettävä mielessä, että geenin transkriptio ei aina korreloi mRNA käännös ja että kasvaimen biologista vaikutusta CXCL12 voi riippua myös läsnä ja histoanatomical jakelu CXCR4. Vuonna Tämän väitteen tueksi pystyimme osoittamaan, että samanaikainen ilmentyminen CXCL12 kasvainsoluissa ja CXCR4 kasvaimen mikrosuonten korreloivat paikallisen kasvaimen kasvua ja UICC-kasvain vaiheessa.

Kerrottiin, että kasvaimia CXCR4 positiivisuus merkittävästi korreloi kehittämisen kanssa vatsakalvon carcinomatosis [30]. Lisäksi vahva CXCR4 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä imusolmukemetastaaseja, korkeammat UICC vaiheet ja alennettu 5 vuoden pysyvyys [32]. Tuloksemme näyttävät poikkeavat aiemmista tutkimuksista. Kun arvioidaan CXCR4 immunoreaktiivisuus tuumorisoluissa, alhainen ilmentyminen oli havaittu. Vain 17% kasvain näytteet osoittivat enimmäkseen heikko CXCR4 immunoreaktiivisuus. Lisäksi kaikki 61 vastaavat imusolmukemetastaaseja puuttui CXCR4 ilme. Tämä värjäyskuviosta saattaa selittää, miksi esimerkiksi suoliston tyyppi mahakarsinoomat, CXCR4 ilme vain oli merkitsevästi yhteydessä paikallisen kasvaimen kasvua (T-luokka), mutta ei muiden kliinis tekijät kuten aikaisemmin on kuvattu. Käytimme perusteellisesti tunnettu siitä, CXCR4-vasta-aine, jolla on suurempi spesifisyys kuin kaupallisesti saatavilla vasta-aineilla, kuten on esitetty Fisher ja kollegat [33]. Tämä ero spesifisyys voisi palvella eri värjäyskuviot. Esimerkiksi ydin- CXCR4 ilme, joka oli raportoitu liittyvän imusolmukemetastaaseja kolorektaalisyövässä, ei nähty meidän sarjassa [34]. Lisäksi emme koskaan havainneet CXCR4 positiivisuuden stroomasoluissa kuvatulla tutkimus Saigusa ja työtovereiden [35]. Selventää, jos CXCR4-CXCL12 polku lopulta edistää sukupolven etäpesäkkeiden mahasyöpä erityisesti imusolmukemetastaaseja, tarvitaan lisätutkimuksia.

Noin kolmannes tutkituista mahakarsinoomat osoitti CXCR4 positiivinen tumour- ympäröivän mikrosuonten . Syöpäsolut vaativat riittävästi happea ja ravinteita pitämään hengissä. Vaikka geneettinen poikkeavuuksia että dysregulate kasvua ja selviytymistä yksittäisten solujen kasvaimia ei voi suurentaa yli 1-2 mm

3 ilman vaskularisaationsa ja hypoksian aiheuttama solukuolema tapahtuu. On osoitettu, että CXCR4: ää ilmentävät endoteelisolut ja stimulointi CXCR4 jonka CXCL12 on proangiogeeninen vaikutus [36]. Lisäksi CXCR4 on hypoksian indusoituva geeni, säätelee hypoksian indusoiman tekijän 1α (HIF1α). Kun happi on niukasti kuten nopeasti kasvava kasvaimia, HIF1α parantaa ilmaisun CXCR4 [37]. Lisääntynyt ilmentyminen CXCR4 endoteelisolujen havaittiin meidän kasvain kollektiivinen saattaa olla osa integroitua hypoksinen vaste kasvavaan kasvain, joka mahdollistaa sukupolven uusia verisuonia. Tutkimuksessamme ryhmässä verisuonten CXCR4 ilmaisu korreloi merkittävästi laajuuden kanssa paikallisen kasvaimen kasvua. 8%: T1 /pT2a kasvaimet (4 52) ja 34% T2b /T3 /pT4 kasvaimet (81 239) CXCR4 positiivinen mikrosuonten olivat havaittavissa. T2b /T3 /T4-vaiheen mahakarsinoomat todennäköisemmin satama niukkahappiseen mikroympäristön kuin T1 /T2a vaiheen kasvaimista ja näin saattaa aiheuttaa CXCR4 geeniekspressiota ja angiogeneesiä. Detection of CXCR4 positiivinen pienten verisuonten suuri imusolmukemetastaaseja ( 9 mm halkaisijaltaan) tukevat näitä havaintoja. Lisäksi olemme aiemmin osoittaneet vastaavia tuloksia kolorektaalikarsinoomasta [38]. Lisäksi, kuten on esitetty glioblastoma multiforme [39], kasvain näytteet paljastaen molemmat, CXCL12 positiivisia kasvainsoluja ja CXCR4 positiiviset mikrosuonten olivat erittäin merkitsevästi yhteydessä korkea paikallinen kasvaimen laajuutta ja korkea UICC vaiheissa, mikä edelleen tukee merkitystä toiminnallisen CXCL12-CXCR4-akselilla mahasyöpä biologia.

Yhteenvetona, me osoitamme, että GPCR: ien ilmentyvät differentiaalisesti mahasyövän kudosten ja voi myötävaikuttaa kasvaimen biologiaan: ilmentävien kasvainten molemmat, CXCL12 kasvainsoluissa ja CXCR4 kasvaimen ympäröivän mikrosuonten, osoittavat erittäin merkittävää yhteyttä paikalliseen kasvaimen kasvua ja UICC vaiheissa. Nämä tulokset yhdessä aiempien tietojen kolorektaalikarsinooma, jotka tukevat roolia CXCL12-CXCR4 akselin kasvaimia neoangiogeneesiin ruoansulatuskanavan kasvaimet. CXCL12-CXCR4 reitti voi olla uusi lupaava antiangiogeeninen kohde hoitoon mahakarsinoomat.

Materiaalit ja menetelmät

Kasvaimen näytteet

kudosnäytteitä mahasyövän saatiin kirurgisesti at Charité yliopistollisen sairaalan Berlin (1995-2008). Tuore kudoksen tapauksessa 6 suoliston tyypin mahakarsinooman käytettiin GeneChip- analyysiä (solmukohtien negatiivinen: 3 potilasta, solmukohtien positiivinen: 3 potilasta, nainen-mies-suhde: 01:02). Riippumaton sarja pariksi syöpä- ja kasvaimen vieressä normaaleissa kudoksissa 37 suolen tyyppiä mahakarsinoomat tutkittiin reaaliaikaisella RT-PCR (solmukohtien negatiivinen: 12 potilasta, solmukohtien positiivinen: 25 potilasta, nainen-mies-suhde: ~1:1 , yksityiskohtaisia ​​potilasryhmät katso taulukko S3). Immunohistokemiallista analyysejä, potilaan kohortin 347 peräkkäisen potilailla mahalaukun syövän tutkittiin, käsittäen 194 suoliston tyyppi ja 122 hajanainen tyyppi karsinoomat mukaan Laurén luokitusta. 31 näytteet osoittivat muita histologisia alatyyppejä (ts mucinous, putkimainen, eriytymättömiä). Lyhyesti, kohortti koostui 220 miestä ja 127 naista. Keski-ikä potilaiden aikaan diagnoosi oli 64 vuotta. Survival tietoja oli saatavissa 196 näistä potilaista. Seuranta tietoja muista potilaista puuttui, koska nämä potilaat eivät asuneet sairaalan lähellä ja menetettiin seurata. Out of 196 potilasta, 124 kuoli seuranta-aikana. Seuranta-ajan mediaani niille potilaille elossa päätepisteessä analyysi oli 33 kuukautta. 61 potilasta, kudosten vastaavia imusolmukemetastaaseja oli saatavilla (27 suolen tyyppi, 26 hajanainen tyyppi, 8 muuta histologinen alatyyppi). Vain Histologisesti vahvistettu mahasyövän ja riittävä kudoksen käytettävissä olivat mukana. Potilaat, joilla neoadjuvantly käsitelty mahakarsinoo- tai muita tunnettuja maligniteettia suljettiin pois tutkimuksesta. Projektin hyväksyi paikallinen eettinen komitea (vrt. Numero EA1 /06/2004).

GeneChip- analyysi

Yhteensä-RNA eristettiin fenoli-kloroformilla käyttämällä Mirvana ™ miRNA Isolation Kit ( Ambion, Austin, USA). Kontaminoivien DNA poistettiin DNaasikäsittely (Turbo DNAfree kit; Ambion, Austin, USA) 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Käytimme GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 paneelit (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) valmistajan protokollan analysoida mRNA ekspressiotasoja. Affymetrix GeneChip® Operating Software (GCOS 1,4) automatisoi valvonnan GeneChip® Fluidics asemat ja GeneChip® Scanner 3000.

Bioinformatics

Mittaustulosten analysoitiin Affymetrix GeneChip- Operating Software (GCOS 1,4) . Havaitseminen p-arvo transkriptio määrittelee havaitsemiseen puhelun, joka ilmaisee, onko transkripti havaitaan luotettavasti (p 0,05, läsnä) tai ei havaita (poissa). Jotta vertailu sirujen tiedot on skaalattu maailmanlaajuinen intensiteetti 500. Data Mining Tool 3.0 (Affymetrix) ja GeneSpring ohjelmisto 7.2 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) käytettiin keskimääräisiä tuloksia eri otoksista ja suorittaa tilastollisia analyysi vertailla välillä mahasyövän kanssa (N1) ja ilman (N0) imusolmukemetastaaseja. Aineisto on kuusi paneelit normalisoitiin huomioon vaihtelu hybridisaatio- koettimen parien ja muut hybridisaatio esineistöä. Normalisoituminen koostuu seuraavista kolmesta vaiheesta: ensimmäinen, datan muunnos (set mittaukset alle 300,0-300,0); Toinen, per siru (normalisoida kunkin sirun 50. prosenttipiste mittausten otettu että siru); ja kolmas, per-geeni (normalisoida kunkin geenin keskiviivan mittausten että geeni). Taitteen muutos laskettiin kullekin geenin aritmeettinen keskiarvo normalisoidut ilmaisun arvoja N1 jaettuna aritmeettinen keskiarvo normalisoidut ilmaisun arvoja N0. Raakatiedot microarray kokeita ladataan Gene Expression Omnibus Database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=pzmjlcoscakugfc acc=GSE17187).

Real-time RT-PCR

cDNA-synteesi, 2 ug kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen Omniscript RT Kit (Qiagen). Geeni-alukkeet suunnitellut BioTeZ Berlin-Buch GmbH (Berliini, Saksa). Alukesekvensseissä olivat seuraavat: CXCR4 5 ’CAG CAG GTA GCA AAG TGA CG, 3’ CAG GGT TCC TTC ATG GAG TC; CXCL12 5 ’CGA TTC TTC GAA AGC CAT GT, 3’CAC TTG TCT GTT GTT GTT CTT CAG;