Krooninen sairaus

tiivistelmä

Virtsarakonsisäinen Bacillus Calmette-Guerin (BCG), on osoitettu indusoivan tietyn immunologisen vasteen (

eli

, aktivaatio IL-2 ja efektori-T-soluja), kun taas prekliinisissä tutkimuksissa käyttäen ALT-803 (mutatoitunut IL-15 analoginen yhdistettynä IL-15Rα-Fc-fuusion) ovat osoittaneet lupaavia tuloksia pidentämällä agentin puoliintumisaika ja stimuloimalla CD8 + T-soluja. Näiden tulosten perusteella, me arveltu, että rakonsisäistä anto ALT-803 sekä BCG tuottaa immunologisen vasteen johtavat merkittäviin virtsarakkokasvain rasituksen vähentämistä. Käyttämällä vakiintunut karsinogeeni indusoidun rotan ei-lihas- invasiivisia virtsarakon syöpä (NMIBC) malli, tutkimme vaikutuksia rakkoon ALT-803 ja ilman BCG. Rotan kudosten arvioitiin dokumentoida hoitovastetta. Rakonsisäinen ALT-803 oli turvallinen ja hyvin siedetty yksin ja yhdessä BCG. Kertahoitona agentti, ALT-803 vähensi kasvainten taakkaa 35% kontrolliin verrattuna taas BCG yksin ainoastaan ​​vähensi kasvainten taakkaa 15%. Kuitenkin yhdistelmä ALT-803 plus BCG vähensi kasvainten taakkaa 46% kontrolliin verrattuna. Immuuni valvonta ehdotti, että kasvainten vastainen vaste tuotantoon liittyvät ja eritystä IL-1α, IL-1β ja RANTES, joka puolestaan ​​indusoi leviämisen ja NK-solujen aktivaation. Lopuksi kasvainten vasteet monimuotoiset hoitoon liittyi 76% vähennys angiogeneesiä, mikä on huomattavasti suurempi kuin silloin, kun arvioidaan kumpaakin annettaisiin erikseen. Parannettu terapeuttinen indeksi nähnyt tämän duplet perustelee kehittämistä tämän hoito tulevia kliinisiä kokeita.

Citation: Gomes-Giacoia E, Miyake M, Goodison S, Sriharan A, Zhang G, Sinä L, et al. (2014) Virtsarakonsisäinen ALT-803 ja BCG hoito vähensi kasvaintaakkaa on karsinogeeni aiheuttama virtsarakon syövän Rat Malli; Rooli sytokiinituotantoa ja NK Cell Expansion. PLoS ONE 9 (6): e96705. doi: 10,1371 /journal.pone.0096705

Editor: Robert Hurst, Oklahoma University Health Sciences Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 tammikuu 2014; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2014; Julkaistu 4. kesäkuuta 2014

Copyright: © 2014 Gomes-Giacoia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitti James ja Esther kuningas Biomedical Team Science Project 1KT-01 (CJ Rosser). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Seuraavat kirjoittajat muna, MM, SG, AS, GZ, ASP, KxC ja CJR ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa. LY, JOE, PRR ja HCW ovat työntekijöitä Altor biotieteiden Corp. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Virtsarakon syöpä (BCA) on viidenneksi yleisin maligniteetti Yhdysvalloissa, on diagnosoitu noin 74690 potilasta aiheuttaen noin 15580 kuolemantapausta vuonna 2014 [1]. Seitsemänkymmentä kahdeksankymmentä prosenttia potilaista BCA läsnä ei-lihas- invasiivinen virtsarakon syöpä (NMIBC), joka on syöpä rajoittuu virtsarakon limakalvolla [2], [3]. NMIBC hoidetaan höyläysleikkaus kasvainten jälkeen annetaan apuaineen rakkoon kemoterapiaa tai rakkoon Bacillus Calmette-Guerin (BCG), joka voi vähentää uusiutuminen ja pidentävät etenemisestä vapaan välillä [2] – [4]. Tästä huolimatta noin 50-60% NMIBC potilailla, joille tehdään resektion ja rakkoon hoito kokevat kasvaimen uusiutumisen [5]. Lisäksi kokevien toistumisen, noin 30% etenee ja periksi heidän sairautensa yli 15 vuoden aikana, kun taas toinen 50% kokevat suuria cystectomy yritetään kontrolloida heidän sairautensa [6]. Sinänsä avainkysymys alalla on edelleen tarve paremmin hoitovaihtoehtoja vähentää uusiutuminen, parantaa eloonjäämislukua ja tarpeettomiksi radikaaleja.

Tarkkaa vaikutusmekanismia, jolla rakkoon BCG kykenee sen anti -tumorigenic vaikutuksia ei tunneta. On kuitenkin selvää, että BCG toiminta riippuu induktioon tulehdusvasteiden, joihin aktivointi useita erityyppisiä immuunisolujen. Aluksi, rakkoon BCG sitoutuu urothelial vuori ja sitten sisäistetään ja käsitellään normaalien ja pahanlaatuisten solujen, jotka laukaisevat monimutkaisen proinflammatoristen vasteen tunnusomaista vapautuminen IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α: n ja GM-CSF: n [ ,,,0],7], [8]. Sen jälkeen, erilaisia ​​immuunijärjestelmän soluja, mukaan lukien T-solut, luonnolliset tappajasolut (NK-solut), neutrofiilit ja makrofagit kulkeutuvat virtsarakon, jossa ne aktivoituvat ja tuottaa lisäksi proinflammatoristen sytokiinien ja kemokiinien [9], [10]. Tämä on tunnettu siitä, että ulkonäkö eri leukosyyttien ja sytokiinien virtsassa BCG-hoitoa saaneilla potilailla. Vaikka erityinen rooli, että erilaisia ​​solutyyppejä ja sytokiinien pelata urothelial karsinooma hoidossa ei ole täysin selvä, virtsan Th1 sytokiinien (

esim

, IFNy, IL-2 ja IL-12) on yhdistetty BCG vaste , kun taas Th2 sytokiinien (

esim

, IL-10 ja IL-6) korreloi BCG epäonnistumisen [9] – [16]. Kaiken kyky rakkoon BCG vuorovaikutuksessa uroteelin ja stimuloivat laajaa, kestävä Th1 tyypin immuunivaste on todennäköisesti kriittinen sen tehokkuuden. Tämän seurauksena, on ehdotettu, että lisäksi immunostimulatoristen aineiden, kuten sytokiinien, BCG hoito voisi lisätä näiden immuunivasteita ja tarjoamaan enemmän ja /tai kestävämpi antituumorivaikutukset. Tähän mennessä, 3. vaiheen kliiniset tutkimukset rakkoon BCG yhdessä IL-2 tai IFN-α2b ovat rajoittuneet vain yksi tutkimuksessa raportoitiin, joka ei osoittanut hyötyä yli BCG monoterapiana [17]. Siten optimaalinen strategioita maksimoimiseksi Immunoterapeuttisina tehoa rakkoon hoito NMIBC todennäköisesti vaativat uusia toimintatapoja.

IL-15 on kriittinen tekijä kehityksessä, leviämisen ja aktivointi efektorisolujen luonnollisten tappajasolujen ja CD8

+ T-solujen [18], [19] ja on listattu lupaavimmista agentti joukossa kaksitoista immunoterapia lääkkeitä, joilla on korkea potentiaali käytettäväksi hoidettaessa ihmisen syöpiä [20]. Olemme äskettäin eristetty uusi IL-15-mutantin, jossa on 4-kertainen nousu biologinen aktiivisuus [21]. Farmakokinetiikkaa (PK), biojakauma ja biologinen aktiivisuus Tämän IL-15 yliagonisti- (IL-15N72D) on edelleen parannettu vuorovaikutus liukoisen domeenin IL-15-reseptorin α-proteiinin (IL-15RαSu) luoda IL-15N72D /IL-15RαSu-Fc-fuusion kompleksi (kutsutaan ALT-803). Tämä monimutkainen on ainakin 25-kertainen

in vivo

biologista aktiivisuutta natiivin IL-15 [22], [23]. Olemme viime aikoina osoittaneet, että systeeminen ALT-803 käsittely indusoi kestävä ja suojaava immuunisolujen kasvaimen vastaisen vasteita useissa hiiren malleja hematologisia syöpiä [22], [23]. ALT-803 erottuu voimakas immunostimulantti joka pystyy samanaikaisesti aktivoimaan synnynnäistä ja adaptiivista käsivarret immuunijärjestelmän esiin sekä nopea ja pitkäikäinen suojaavia vasteita taudinaiheuttajia vastaan ​​tai neoplastisia haasteita isäntä [24].

motivoi pakottavia prekliinisiä tietoja, jotka liittyvät IL-15, testasimme terapeuttinen teho rakkoon ALT-803 yksin ja yhdessä BCG on vakiintunut jyrsijä karsinogeeni aiheuttamaa NMIBC malli. Tarkemmin, havaitsimme, että a) rakkoon ALT-803 oli turvallinen ja hyvin siedetty yksin ja yhdessä BCG, b) ALT-803 plus BCG vähensi kasvainten taakkaa 46% kontrolliin verrattuna, mikä oli korkeampi kuin kummallakaan aineella yksinään, c ) immuuni valvonta ehdotti, että kasvainten vastainen vaste nähdään yhdistelmä ALT-803 plus BCG liittyi tuotannon ja erityksen IL-1α, IL-1β ja RANTES, joka puolestaan ​​indusoi leviämisen ja NK-solujen aktivaation ja d ) kasvainten vasteet nähty yhdistelmällä ALT-803 ja BCG liittyi vähentää merkittävästi angiogeneesiä. Rohkaisevia tuloksia esitellään tässä raportissa tukee käsityksemme jatkokehityksen uusien terapeuttisten duplet hoidettaessa potilaita, joilla NMIBC.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet, reagenssit, ja kasvain malli

Yhdeksänkymmentä naaras Sprague Dawley kuudesta kahdeksaan viikon ikäisiä, saatiin Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). Eläinten hoito oli noudattaen suositusten

Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals

(National Research Council) ja hyväksyi paikallinen IACUC yliopistossa Central Florida. N-butyyli-N- (4-hydroksibutyyli) nitrosamiini (BBN) ostettiin TCI America (Portland, OR), jaettiin eriin ja liuotettiin 1% Tween. ALT-803 (IL-15N72D:IL-15RaSu /Fc) muodostettiin kuten aiemmin on kuvattu [21], ja laimennettiin steriilillä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). PBS toimi negatiivisena kontrollina. Lyofilisoitua BCG ostettiin Sanofi Pasteur Limited (Toronto, CA) ja liuotetaan ohjeiden steriilillä PBS: llä ja toimi positiivisena kontrollina. Sen jälkeen kun eläimet sopeutua meidän laitokseen yhden viikon, kaikki eläimet paitsi viisi saivat 0,05% BBN niiden juomavedessä jatkuvasti kahdeksan viikon indusoimalla NMIBC, joka on vakiintunut jyrsijä karsinogeeni aiheuttamaa BCA malli [25] – [ ,,,0],30], joilla on merkittävä molekyylimuutokset samankaltainen kuin ihmisen BCA [31]. 8 viikon BBN altistumisen, eläimet uudelleen vettä lisäämättä BBN. ​​

Virtsarakonsisäinen hoito

Kun BBN altistuksen (viikko 9), rotat satunnaistettiin yhteen neljästä hoitoryhmästä (ohjaus- PBS, ALT-803 1 ug /annos, BCG: 1,35 mg /annos [26], [27], tai ALT-803 1 ug /annos plus BCG 1,35 mg /annos). Jokainen ryhmä sisälsi 20 eläintä. Alustavat kokeet ALT-803 huomattava a) terapeuttinen vaste intravesikaalisen annos 1 ug ja b) parantaa terapeuttisen vasteen kanssa samanaikaisen käytön ALT-803 plus BCG verrattuna peräkkäiseen antamiseen näiden kahden aineen (tuloksia ei ole esitetty). Kaikki virtsarakon tiputtamista tehtiin 200 ul: ssa steriiliä PBS: ää. Rotat nukutettiin isofluraanilla sitten 22 gaugen Teflon angiocatheter (virtsaputken katetri) pantiin rakkoon virtsaputken kautta ja virtsan oli täysin tyhjennetty virtsarakon [32]. Seuraavaksi PBS, BCG, ALT-803, tai yhdistelmä ALT-803 plus BCG hoito toimitti transurethral tiputuksen kautta virtsaputkeen katetrin ja annettiin asua virtsarakossa 1 tunti tukkeuman virtsaputken kanssa kukkaro merkkijono ommelta. 1 tunnin kuluttua, kukkaro merkkijono ommel poistettiin ja rotat stimuloitiin karkottaa virtsarakon sisältö [32]. Rakonsisäistä hoito annettiin viikoittain yhteensä kuuden viikon matkia rakkoon BCG hoito ihmisellä [33]. Kaksi viikkoa päätyttyä intravesikaalisen terapian, eläimet tapettiin ja kudokset (

esim.

, Koko veri, seerumi, virtsa, virtsarakon ja perna), otettiin talteen ja käsitellään myöhempää analyysiä varten. Kuvio 1 esittää tutkimuksen hoidon kaava.

Hoito PBS, BCG, ALT-803, tai ALT-803 plus BCG aloitetaan viikon kuluttua loppuun kahdeksan viikkoa altistumisen 0,05% N-butyyli-N- ( 4- hydroksibutyyli) nitrosamiinia juomavedessä. Rotat jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään ja käsiteltiin viikoittain kuuden peräkkäisen viikon aikataulun mukaisesti. Rotat tapettiin ja niille tehdään ruumiinavaus kaksi viikkoa myöhemmin. CTRL, kontrolli.

Ultraääni kuvantamistutkimukset

Koko tutkimuksen rakonsisäinen kasvaintaakkaa tarkkailtiin

in situ

by transabdominaalinen kaikukuvaukseen käyttäen Vevo 2100 kuvantamisjärjestelmä kanssa MS550D 22-55 MHz käsikäyttöisen MicroScan array -anturilla (Visualsonics, Toronto, ON, Kanada). Lyhyesti, rotat nukutettiin isofluraanilla sitten 200 ul: aan steriiliä PBS: ää tiputettiin rakkoon kuten edellä on kuvattu yhtenäisen kuvan kaikkien rakkojen visualisoidaan. Intraluminaaliset kasvaimia havaittiin ja digitaaliseen otetut kuvat. Virtsarakon seinämän paksuus (millimetreinä), korvike kasvaimen taakkaa, mitattiin Vevo 2100 mittauksen ominaisuus.

histopatologia tuumorisektioiden

resektoitiin rakot alunperin punnittiin sitten 12 rakot kustakin ryhmästä täytettiin 200 ul: lla 10% neutraaliksi puskuroituun formaliiniin. Rakko kaulaa sidottiin ja koko näytteet sijoitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin. Rakot formaliiniin upotettiin parafiiniin, leikattiin (5 um) ja asetetaan Superfrost plus Micro dioja (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Loput kahdeksan rakot kunkin ryhmän täytettiin 200 ul: lla O.C.T. upottamisen yhdistettä (Andwin Scientific, Schaumburg, IL) ja virtsarakon kaulaa ligoitiin. Rakkulat oli uppoamaan Tissue-Tek O.C.T. yhdiste (Ted Pella, Inc., Redding, CA) on cryomolds ja jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Rakot jäädytetty O.C.T. leikeltiin (5 um), lämmitettiin huoneen lämpötilassa 5 minuuttia, kiinteä jääkylmässä metanoli 10 minuuttia, ja pestään PBS: llä ennen immunohistokemiallista värjäystä. Parafiini ja jäädytetty osaa kustakin rotasta tehtiin hematoksyliinillä ja eosiinilla tahra histologista arviointia varten. Lisäksi, parafiini poistettiin kalvot käsiteltiin 1% vetyperoksidia 100% metanolia endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi aktiivisuus seurasi sitruunahapon antigeenin haku. Laseja inkuboitiin yön yli vasta-aineita CD3

+ (BD Biosciences, G4.18, hiiri monoklonaalinen vasta-aine, laimennus 1/250), CD8a

+ (BD Biosciences, OX-8, hiiri monoklonaalinen vasta-aine, laimennus 1 /10), CD161

+ (AbDSerotec, 10/78, hiiri monoklonaalinen vasta-aine, laimennus 1/100) (havaitsemiseksi NK-soluja), CD163

+ (AbDSerotec, ED2, hiiri monoklonaalinen vasta-aine, laimennus 1/50) ( havaitsemiseksi makrofagit), Ki-67 (Dakota North America Inc .; MIB-5, hiiri monoklonaalinen vasta-aine, laimennus 1/50) tai pilkkoa kaspaasi 3 (Cell Signaling Technology, 5A1E, kani monoklonaalinen vasta-aine, laimennus 1/1 500). Jääleikkeet inkuboitiin yön yli vasta-aineiden CD4

+ (BD Biosciences, OX-35, hiiren monoklonaalinen vasta-aine, laimennus 1/250) tai CD31 (Santa Cruz Biotechnology, H3, hiiri monoklonaalinen vasta-aine, laimennus 1/250). Seuraavaksi parafiini ja jääleikkeitä inkuboitiin biotinyloidun anti-hiiri- tai anti-kani-IgG (H + L) -vasta-aineita on 10 ug /ml (Vector Laboratories INC., Burlingame, CA). Myöhemmin leikkeet värjättiin käyttäen Ultra-Sensitive ABC Mouse IgG -värjäyspakkausta (EMD Millipore, Billerica, MA) tai biotiini /streptavidiini immuunivärjäysmenetelmällä Kit (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Kaikki värjätyt leikkeet kuvattiin käyttämällä Nikon Eclipse E400 valomikroskoopilla (Nikon Inc., Melville, NY) kanssa QIClick digitaalinen CCD-kamera (QImaging, Surrey, BC, Kanada) ja Nikon NIE-elementit Basic Research kuvankäsittelyohjelma.

Yksityiskohtainen histopatologisten analyysi neoplastisten vaste rakkoon hoito suoritettiin jokaisessa virtsarakon kaksi kokenutta, riippumattomien tarkkailijoiden (MM ja AS). Lyhyesti, CD3

+, CD4

+, CD8a

+ T-solut, NK-solujen ja makrofagien laskettiin vähintään neljä satunnaisesti valittua kenttää per suuritehoiset kenttä (HPF) kussakin näytteessä. Tulokset pisteytettiin laskemalla määrä infiltroituvien immunovärjäyksellä soluja.

Lisäksi kasvaimen angiogeneesiä tutkittiin objektilaseille värjättiin anti-CD-31 monoklonaalista vasta-ainetta ja mikroverisuonitiheys (MVD, pienten suonten /mm

2) oli arvioitiin, kuten aiemmin on kuvattu Weidner

et al.

[34]. Yhden endoteelisoluja tai klustereiden endoteelisolujen positiivisia CD-31 pidettiin alus. Neljä aloille, joilla on pienten suonten pitoisuus kustakin näytteestä tunnistettiin 4 x suurennus ja kuvat otettiin kvantitoimiseksi MVD 200 ×. Kaksi riippumatonta tarkkailijaa lasketa määrä pienten verisuonten kunkin histologisen kenttään. MVD Näytteen arvioitiin keskimäärin alusten vähintään neljä histologista kenttiä. Lisäksi, värjäys liukuu monoklonaalisen vasta-aineen suunnattu Ki-67 arvioitiin leviämisen. Ki-67 immunovärjäyksellä laskettiin vähintään neljä satunnaisesti valittua kenttiä kustakin hoitoryhmässä 200 x suurennus. Solut, joissa kyseenalainen tumavärjäystä diskontattu. Tarkkailijat teki tuloksia arvioimalla prosenttiosuus kasvainsolujen osoittaa ominaisuus tumavärjäystä (proliferatiivinen indeksi). Lopuksi, värjäys liukuu monoklonaalisen vasta-aineen suunnattu katkaistun kaspaasi-3: arvioidaan apoptoosin. Lohkaista kaspaasi-3-immunovärjäyksellä laskettiin minimaalinen 3000 soluja kustakin hoitoryhmässä 200-kertaisella suurennuksella. Kaksi tarkkailijaa sijoitettiin tulokset arvioimalla prosenttiosuus kasvainsolujen esittää ominaista solujen värjäytymistä (apoptoottisten indeksi).

virtaussytometrinen analyysi PMBC ja pernan T-solut, NK-solut ja makrofagit

Rat perifeerisen veren mononukleaariset solut kerätään koko verinäytteet EDTA-putkiin värjättiin suoraan inkuboimalla fluoresoivasti leimattuja vasta-aineita CD3:

+ (eBioscience), CD4

+ (BD Biosciences), CD8a

+ (eBioscience) , NKG2D-positiivinen (eBioscience) (havaitsemiseksi NK-soluja), F480-PE (eBioscience) (havaitsemiseksi makrofagit), tai isotyyppikontrollivasta-aineiden (eBiosciences, San Diego, CA) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen punasolujen hajoamista käyttämällä BD FACS-lyysausliuosta (BD Biosciences, San Jose, CA) huoneenlämpötilassa 3-5 minuuttia. Solut pestiin tämän jälkeen kahdesti PBS: llä, joka sisälsi 1% naudan sikiön seerumia. Värjätään solut analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä (BD Biosciences) ja tiedot kerättiin 10000 tapahtumaa /näyte. Analyysi kerättyjen suoritettiin käyttäen Cyflogic ohjelmistoa (CyFlo LTD, Turku, Suomi). Lisäksi, yhden solun suspensiot rottien pernat syntyy varovasti homogenoimalla kudos petrimaljaan ja sitten kulkee Cellector Tissue Sieve (Bellco Glass, Vineland, NJ). Punaiset verisolut poistettiin rotan pernasoluja BD FACS-lyysausliuoksella, inkuboimalla 3-5 minuutin ajan huoneen lämpötilassa, jota seurasi sentrifugointi nopeudella 1200 rpm 5 minuutin ajan. Pelletoidut pernasolut pestiin kahdesti PBS: llä, joka sisälsi 1% naudan sikiön seerumia, jota seuraa suora immunofluoresenssivärjäys kuten edellä on kuvattu.

Virtsan ja seerumin tulehduksellinen sytokiini-ELISA-määrityksessä

Mitätöity virtsan kustakin rotasta kerättiin putki jäällä, joka sisältää konsentroidun virtsan lointiaineliuosta (2 M Tris-HCI [pH 7,6], 5% BSA: ta, 0,1% natriumatsidia, ja COMPLETE mini-inhibiittorin tabletti (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)). Virtsa sentrifugoitiin ja supernatantti säilytettiin -80 ° C: ssa. Vastaavasti, seerumi kerättiin putkiin, jotka sisälsivät EDTA: ta, sentrifugoitiin 10000 x g 15 minuuttia ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Virtsa ja seerumin näytteet altistettiin profilointiin 12 inflammatoristen sytokiinien käyttäen ELISA-määritystä (RAT Sytokiini multi-analyytin ELISArray, SABiosciences, San Diego, CA). Lyhyesti, virtsan ja seerumin näytteitä inkuboitiin 96-kuoppaisilla mikrolevyillä päällystetty anti-rotta-ensisijainen vasta-aineita 12 inflammatoristen sytokiinien (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL -12, IL-13, IFN-γ: n, TNF-α, GM-CSF, ja RANTES), ja kehitettiin sitten sekundaarisen vasta-aineita on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin. Lisäämisen jälkeen substraatille ja pysäyttää liuosta, Fluostar Optima Reader (BMG LABTECH, Ortenberg, Saksa) käytettiin mittaamaan absorbanssi 450 nm: ssä.

Tilastot

Koetulokset ilmaistiin keskiarvona ± SEM , ellei toisin ole mainittu. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen epäparametrinen Kraskal-Wallisin testiä seurasi post-hoc Dunnet testi virtsarakon paino, virtsarakon seinämän paksuus, immunovärjäystä virtsarakon, virtsateiden sytokiinien ja seerumin sytokiinien. Parametrinen ANOVA testi seurasi post-hoc Bonferronin testi suoritettiin liittyvät tiedot lymfosyyttien sisällä perna ja lymfosyyttien sisällä ääreisverenkierron.

p

0,05 pidettiin merkittävänä. Kaikki tilastolliset analyysit ja luvut tehtiin käyttämällä GraphPad Prism-ohjelmiston 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA).

Tulokset

Antituumoriaktiivisuus BCG, ALT-803 ja Alt- 803 plus BCG NMIBC kärsivien rottien

jyrsijä karsinogeeni aiheuttama NMIBC malli, rutiiniseurantaa kasvainten suoritettiin sarja kaikukuvaukseen kanssa Vevo 1200 järjestelmään. Kasvaimet olivat havaittavissa jo 3 viikkoa altistumisen jälkeen 0,05% N-butyyli-N- (4-hydroksibutyyli) nitrosamiini juomavedessä. Kuten käy ultraäänikuvantamisen ja vahvisti histologista tutkimusta, 100% eläimistä todettiin kehittyä kasvaimia. Ei eläimiä oli käsin kosketeltava, kehittynyt kasvaimia. Sen määrittämiseksi, kaikukuvaukseen voitaisiin seurata ja arvioida kasvaintaakkaa, rakkoja oli kuvattu ja virtsarakon seinämän paksuus (korvike tuumorikuorma raportoitu mm) määritettiin. Myöhemmin rakot resekoitiin, punnittiin ja histopatologisesti tutkittiin. Totesimme positiivinen korrelaatio (Spearman R = 0,55,

p

0,0001) välillä virtsarakon seinämän paksuus ja virtsarakon painot /virtsarakon kasvain, joten raportoimme ensimmäistä kertaa, että ei-invasiivisen

in situ

seuranta jyrsijän n virtsarakkokasvain voidaan a) vahvistaa kasvain ottaa ja b) raportoivat terapeuttinen kasvaimeen rasituksen vähentämistä.

Rotat laakeri rakkokasvaimista hoidettiin rakonsisäisenä 6 peräkkäisen viikon ajan PBS, BCG, ALT -803 tai ALT-803 plus BCG. Muu kuin niukka verivirtsaisuus totesi (kenties katetroinnin ja /tai BCG), rakkoon hoitoja olivat hyvin siedettyjä eikä merkittävää toksisuutta huomattava.

Yhdenmukainen kehittämiseen

in situ

kasvaimia, virtsarakon painot kasvoi 49% eläimillä, jotka saivat BBN verrattuna normaaliin (ei BBN) verrokkieläimiin (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin kuuden viikon rakkoon hoidon BCG, ALT-803 tai ALT-803 plus BCG vähensi tuumoritaakka rakot on BBN-käsiteltyjen rottien (Fig. 2). Virtsarakon paino (keskiarvo +/- SEM) ilmoitettiin olevan: PBS: llä 0,2 +/- 0,012 g, BCG- 0,17 +/- 0,012 grammaa, ALT-803- 0.15 +/- 0,0091 grammaa ja ALT-803 plus BCG- 0.14+ /-0.0054 grammaa. Lisäksi ennen niiden uhraamista viikolla 16, 200 ul: aan steriiliä PBS: ää tiputettiin kunkin rakon yhtenäisyyden varmistamiseksi koko ja useita poikittaisia ​​sagittaalinen ultraääni kuvat saatiin. Virtsarakon seinämän paksuus (keskiarvo +/- SEM) ilmoitettiin olevan: PBS: llä 1 +/- 0,11 mm, BCG- 0,7 +/- 0,05 mm, ALT-803- 0,65 +/- 0,077 mm ja ALT-803 plus BCG- 0,54 +/- 0,083 mm. Näin ollen näiden kuvien, olemme huomanneet BCG hoito 30%: n vähennys keskimääräinen virtsarakon seinämän paksuus, mikä vastasi 15%: n vähennys virtsarakon painon muutos verrattuna PBS hoitoon. ALT-803 hoito yksinään todettiin olevan 25%: n vähennys keskimääräinen virtsarakon seinämän paksuus ja vastaavasti 35%: n vähennys virtsarakon painon muutos verrattuna PBS hoitoon. Mielenkiintoista on, että suurin vähennys virtsarakon seinämän paksuus ja virtsarakon paino nähtiin, kun ALT-803 yhdistettiin BCG johtaa 30%: n vähennys virtsarakon seinämän paksuus ja vastaavasti 46%: n vähennys virtsarakon painon muutos verrattuna PBS hoitoon (Fig. 2a -2C). Kaikki tulokset vahvistettiin myöhemmin yksityiskohtainen histologista tutkimusta (Fig. 2d), jossa H 0,05, **,

p

0,01, ***,

p

0,001.

Rakonsisäinen ALT-803 plus BCG edistää ainutlaatuinen lymfosyyttitunkeutumisella

rakkoja hoidettujen rottien värjättiin myös immuunisolujen (CD3

+, CD4

+, CD8a

+ T-solujen , NK-solut ja makrofagit) infiltraatit (Fig. 3 ja taulukko S1). Määrä CD3

+ T-solujen määrä oli lisääntynyt ALT-803 yksinään verrattuna PBS ja BCG yksin. Yhdistelmä ALT-803 plus BCG ei parantavat määrä soluttautua CD3

+ T-solujen verrattuna ALT-803 yksin, mutta verrattuna BCG yksin, määrä soluttautua CD3

+ T-soluissa oli merkitsevästi korkeampi yhdistelmä ryhmässä. CD4

+ T- soluja ei vaikuta millään ryhmässä verrattuna PBS (

tuloksia ei ole esitetty

). CD8a

+ T-solut lisääntyneet huomattavasti BCG yksin, ALT-803 yksin ja ALT-803 plus BCG verrattuna PBS. Yhdistelmä ALT-803 ja BCG ei ollut suurempi vaikutus kuin BCG yksin tai ALT-803 yksin. Seuraavaksi lukumäärä NK-solujen ei noussut BCG yksin tai ALT-803 yksinään verrattuna PBS, mutta määrä NK-solujen lisääntyi, kun ALT-803 lisättiin BCG. Lisäksi yhdistelmä ALT-803 plus BCG lisännyt soluttautua NK-soluissa verrattuna BCG yksin tai ALT-803 yksin. Ei merkittävästi muutokset makrofagien tunkeutuminen havaittiin kaikissa hoitoryhmissä.

Kasvaimen infiltraatio positiivisten solujen CD3

+, CD8a

+, CD161 (NK-solujen), tai CD163 (makrofagi) (200 x) havaittiin. Ei muutoksia havaittiin CD4

+ T-solut (

tuloksia ei ole esitetty

). ALT-803 yksinään lisäsi kasvaimen CD8a

+ ilmentävien solujen, kun taas ALT-803 plus BCG lisääntynyt kasvaimen ilmentymistä NK-solujen (katso taulukko S1).

Lisää

, vasen paneeli positiivisena kontrollina rotan perna ja oikea paneeli negatiivisen kontrollin rotan perna ilman primaarista vasta-ainetta.

PBMC kokoverestä rotista käsitellään tätä protokollaa kerättiin heti eläimet tapettiin ja alistettiin virtaussytometria-analyysi läsnä CD3

+, CD4

+, CD8a

+ T-solujen, NKG2D-positiiviset solut ja makrofagit. Ei merkittäviä muutoksia huomattiin CD3

+ ja CD4

+ T-solujen, kun taas CD8a

+ T-solujen havaittiin selvästi kohonneet vain BCG yksin ryhmä. Kaikki ryhmät (BCG yksin, ALT-803 yksinään ja ALT-803 plus BCG) osoitti merkittävän kasvun NKG2D-positiivisten solujen verrattuna kontrolliin. Lopuksi määrää verenkierrossa makrofagien väheni merkittävästi ALT-803 yksin ja ALT-803 plus BCG, mutta ei pelkästään BCG (Fig. 4a). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin analyysi rotan pernan kudoksissa. Tarkemmin, tuntuvia muutoksia havaittu CD3

+, CD4

+ ja CD8a

+ T-solujen joukossa hoitoryhmässä. Kuitenkin määrä NKG2D-positiivisten solujen oli merkittävästi lisääntynyt pernan rotista kaikissa ryhmissä (BCG, ALT-803 ja ALT-803 plus BCG) verrattuna kontrolliin. Yhdistelmä ALT-803 plus BCG ei huomata kasvua määrän NKG2D-positiivisten solujen verrattuna BCG yksin tai ALT-803 yksin. Lisäksi makrofagien määrä sisällä perna väheni merkittävästi ALT-803 yksin, kun sitä verrattiin PBS: ään ja pelkästään BCG: llä. Makrofagien määrä palasi lähtötasolle, kun ALT-803 lisättiin BCG (Fig. 4b). Nämä tiedot tarjoavat vakuuttavia todisteita siitä, että yhdistelmä ALT-803 plus BCG liittyy stimulaatio NKG2D-positiivisten solujen, joka oli todennäköisesti efektorisoluvasteen välittävä kasvainregressio aikana rakkoon yhdistelmä immunoterapian.

A) Perifeerisen veren mononukleaarisia solut (PBMC) eristettiin ja analysoitiin virtaussytometrialla ilmentämiseen CD3

+, CD4

+, CD8a

+ T-solujen, NKG2D- positiivinen (NK-solujen) ja F480 ekspression soluihin (makrofagit). ALT-803 yksin, samoin kuin Alt-803 plus BCG johti lisääntymiseen NKG2D-positiivisissa soluissa ja väheneminen makrofageissa verrattuna PBS. B) Pernasoluja eristettiin ja analysoitiin virtaussytometrialla ilmentämiseen CD3

+, CD4

+, CD8

+, NKG2D-positiivisia ja F480 ilmentymistä soluissa. Samanlainen PBMC tuloksiin, ALT-803 yksin, sekä, ALT-803 plus BCG johti lisääntymiseen NKG2D- positiivisissa soluissa ja väheneminen makrofageissa verrattuna PBS. *,

p

0,05, **,

p

0,01, ***,

p

0,001.

Virtsarakonsisäinen anto ALT-803 plus BCG helpottanut ainutlaatuinen sytokiiniprofiilia

Sera rotista käsitellään tämän protokollan kerättiin ja välittömästi varastoitiin -80 ° C: ssa. Sytokiinin analyysia, seeruminäytteet sulatettiin ja alistetaan sitten analyysi rotan tulehduksellisten sytokiinien usean analyytin ELISArray määrityksessä. Yhdessä leviämisen ja NK-solujen aktivaation edellä todettiin, rakonsisäistä anto ALT-803 yhdistettynä BCG liittyi lisääntynyt seerumin tulehdus- ja immuunivasteen sytokiinien, IL-1α ja IL-1β 52% ja 52%, vastaavasti, verrattuna PBS kontrolliryhmään. Lisäksi lisääntyminen IL-1α: n ja IL-1β pidettiin kun ALT-803 plus BCG verrattiin pelkästään BCG: llä ja ALT-803 yksinään (Fig. 5a). Seuraavaksi virtsaa rotilla, joita hoidettiin tämän protokollan kerättiin ja säilytettiin -80 ° C välittömästi sen jälkeen, kun eläimet tapettiin. Kun valmis analysoitavaksi, virtsanäytteet sulatettiin ja alistettiin rotan tulehduksellisten sytokiinien usean analyytin ELISArray määrityksessä. Jälleen kerran, sytokiinit, IL-1α, IL-1β ja RANTES korotettiin 437%, 437% ja 196%, vastaavasti, virtsassa ALT-803 plus BCG käsitellyillä rotilla verrattuna PBS kontrolliryhmään.