Krooninen sairaus

tiivistelmä

Metnase fuusio geeni koostuu SET histoni metyylitransferaasiestäjiä domain ja transposaasientsyymin toimialue Mariner transposaasi. Tämä siirrettävissä elementti on mukana kromosomissa decatenation, parantaa DNA korjaus, edistää ulkomaisia ​​DNA integraatiota, ja auttaa topoisomeraasi II toiminto. Tämä tutkimus tutkii rooli Metnase paksusuolen syövän homeostaasin ja ylläpidon stemness fenotyyppi paksusuolen syövän kantasoluja (CSCS). Hiljentäminen Metnase suoritettiin ihmisen syöpäsolulinjoissa ennen ja jälkeen hoidon sisplatiinin ja paksusuolen CSCS. Myöhemmät muutokset geenien mukana korjausmekanismit, DNA-synteesi, topoisomeraasi II toiminta, ja etäpesäkkeiden samoin stemness transkriptiotekijöiden tutkittiin RT-qPCR kokeita. Cellular elinkelpoisuus ja apoptoosin arvioitiin virtaussytometrialla. Tulokset viittaavat siihen, että Metnase vaikuttaa ilmentymistä monien geenien mukana edellä mainituissa prosesseissa. Lisäksi Metnase määrä näyttää olevan vaikutuksia ilmaisua Nanog, Oct3 /4, ja Sox2. Tukahduttaminen Metnase johti myös apoptoosin lisääntyminen. Näin ollen, Metnase saattaa olla tärkeä rooli DNA: n korjaukseen, topoisomeraasi II: n funktio, ja ylläpito stemness aikana paksusuolen syövän kehittymisessä.

Citation: Apostolou P, Toloudi M, Kourtidou E, Mimikakou G, Vlachou I, Chatziioannou M, et al. (2014) mahdollista roolia varten Metnase transposaasi Fusion Gene Colon Cancer kautta asetuksen Key Genes. PLoS ONE 9 (10): e109741. doi: 10,1371 /journal.pone.0109741

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 18 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 08 syyskuu 2014; Julkaistu: 15 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Apostolou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki oleelliset tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Kaikki kirjoittajat ovat työntekijöitä Research Genetic Cancer Centre Ltd (R.G.C.C. Oy), ja sai palkkaa R.G.C.C. Ltd, joka rahoitetaan tässä tutkimuksessa. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kaikki laatijat ovat työntekijöitä Research Genetic Cancer Centre Ltd (R.G.C.C. Ltd). R.G.C.C. Ltd rahoitetaan tässä tutkimuksessa. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Metnase on fuusio geenin SET histoni metyylitransferaasiestäjiä domain ja Mariner transposaasi verkkotunnuksen. Useat päätoiminnot HsMar1 transposaasi jaetaan Metnase [1]. Metnase on ei-homologisen end-liittymällä (NHEJ) korjaus proteiini [2], ja on mukana monissa solun toiminnoissa kuten sovittelu vieraan DNA integraation kromosomiin decatenation [3], ja DNA: n korjaukseen [4] ja replikointi [5]. Metnase edelleen välittää resistenssiä topoisomeraasi-II-inhibiittorit kautta vuorovaikutuksen topoisomeraasi (DNA) II alfa (TOP2A) [6]. Nämä perustettu rooleja yhdistettynä viime kokeelliset tiedot viittaavat siihen, että Metnase voi olla keskeinen rooli syövän kehittymisessä ja etenemisessä, joita voidaan hyödyntää aikana syövän hoidossa.

peräsuolen syöpä on toiseksi suurin syy syövän naiset, kolmanneksi miehillä, ja neljänneksi yleisin syy syövän kuoleman yleinen [7]. Käyttö platinapohjaisen kemoterapia-tavallisiin hoito-. Kuitenkin monet potilaat joko omistavat tai kehittää resistenssin näille yhdisteille [8]. Lisäksi syövän kantasolut (CSCS) on kyky itsensä uudistamista ja ovat kestävyys kemoterapiaa ja sädehoitoa [9]. Siksi parannuksia nykyiseen hoitostrategioita tarvitaan.

Tässä tutkimuksessa tarkastellaan suhdetta Metnase geenien ilmentyminen ja peräsuolen syövän kehitystä. Kuten siirrettävissä geneettiset elementit sekaantuneet genomissa uudelleenjärjestely, ne voivat säädellä monia transkriptiotekijöitä. Nämä tekijät voivat puolestaan ​​säätelevät geenit, jotka osallistuvat vastus, etäpesäkkeitä, tai apoptoosin. Arviointi komplementtiin geenejä, jotka ovat alttiita Metnase sekä niiden vastaavuus perus solujen toimintaa voidaan parantaa tietämystämme Metnase vaikuttaa syövän kehittymisen. Tällainen tieto voisi myös osaltaan parantaa syövän hoito-ohjelmiin.

Tutkimuksessa tarkastellaan ekspressiotasot useiden geenien tärkeä solujen kehitystä ja DNA-synteesin ja korjaus ennen ja jälkeen knockdovvn Metnase siRNA. Nämä geenit olivat DNA Leikkauskorjauksessa proteiinia (ERCC1), dipeptidyylipeptidaasi IV (CD26), Met proto-onkogeenin (cMET), TOP2A, topoisomeraasi (DNA) II beta (TOP2B), tymidylaattisyntaasia (TYMS) ja DNA (sytosiini-5-) -methyltransferase 1 (DNMT1). Vaikutus Metnase hiljentäminen tutkittiin myös peräsuolen syövän solulinja sisplatiinikäsittelyn jälkeen. Vaikka oksaliplatiinia käytetään pääasiassa kliinisissä, tässä halusimme tutkia roolia Metnase vastustuskykyisessä solulinjassa. Kokeiden mukaan, jotka oli aiemmin suoritettiin HCT-116-solulinja, olemme havainneet, että enemmän vastarintaa mekanismit kehittävät sisplatiinikäsittelyn jälkeen. Lopuksi mahdollinen suhde Metnase ja ylläpito stemness fenotyypin paksusuolen CSC tutkittiin hiljentäminen Metnase ja mittaamalla tasoja Nanog, POU-luokan 5 homeobox1 (Oct3 /4), ja SRY (sex määrittävä alue Y) -box2 (Sox2) , joilla kaikilla on keskeinen rooli ylläpitämiseksi stemness [10], [11].

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen paksusuolen CSCS (36112-39P ; Celprogen, CA, USA) ja HCT-116 ihmisen paksusuolen karsinoomasoluja (91091005, ECACC, UK) viljeltiin sopivassa kasvatusväliaineessa (M36112-39PS, Celprogen, ja D5546, Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa), jota oli täydennetty 10% FBS (10270-106, Gibco, NY, USA) 25 cm

2-pulloja (E36102-29P-T25, Celprogen, ja 430639, Corning, NY: USA) 37 ° C: ssa 5% CO

2 ympäristössä. HCT-116-soluja käsiteltiin myös 1 ug /ml sisplatiinia (P4394, Sigma-Aldrich) yli 10 kohtia ja viljeltiin samalla tavalla.

siRNA transfektion

aikana räjähdysmäinen kasvu vaiheen, solut maljattiin 24-kuoppaisille levyille (E36112-39, Celprogen, ja 831,836, Sarstedt, Nümbrect, Saksa) ja transfektoitiin Metnase-spesifisten siRNA käyttäen Lipofectamine 2000 Reagent (11668-027, Invitrogen, CA, USA), mukaan valmistajan ohjeiden. SiRNA (5′-UAAAACCUCACCAGCAUAUUU-3 ’) suunniteltiin sääntöjen mukaisesti Reynoldsin et al. [12] ja sille tehtiin BLAST-analyysi spesifisyyden varmistamiseksi. Seuraavat 48 tunnin inkuboinnin jälkeen solut otettiin talteen trypsinoimalla (25200-072, Invitrogen). Ajoneuvo-alone ja epäspesifisiä siRNA kontrollia sisällytettiin. MRNA Knockdown laskettiin suhteessa ei-kohdistuksen ohjaus siRNA kussakin kokeessa. Kokeet toistettiin kolme kertaa kolmena kappaleena. Ilmentymistason mielenkiinnon kohteena olevan geenin, ja prosenttiosuus pudotus laskettiin käyttäen vertailevaa Ct menetelmä:

arviointi solujen

Solut arvioitiin solu- ja molekyylitason määrityksissä. Cellular määritykset perustuivat kykyyn CSCS muodostaa mikropalloja. Viljelmiä on aiemmin arvioitu geenin ilmentymisen analyysi erityisten transkriptiotekijöiden, niin todentaminen solulinjojen tehtiin mittaamalla lyhyen tandem-toisto-profiili ja vertaamalla valmistajan profiilia. Viljely CSCS tehtiin yli 30 kohtia sulkea pois mahdollisuutta sisällyttää alkion kantasolut (ESC) kokeissa, koska CSCS ovat kuolemattomia toisin talous- ja sosiaalineuvostoa.

Molecular Analyysit

RNA soluviljelmistä uutettiin käyttäen RNeasy mini kit (74105, Qiagen, Hilden, Saksa). RNA-näytteet arvioitiin sekä spektrofotometrisesti ja agaroosigeelielektroforeesilla visualisointi 18S-28S bändejä. Genomi-DNA poistettiin käyttäen RNase-free DNase (79254; Qiagen) .Subsequently, 1 ug tätä RNA: ta käytettiin templaattina cDNA-synteesiä varten, jossa on iScript cDNA-synteesi kit (1708891; Bio-Rad, CA: USA). Reaaliaikainen PCR, suoritettiin käyttäen iTaq Universal SYBR Green Supermix (+1.725.124; Bio-Rad), jossa kunkin näytteen kolmena kappaleena. Spesifisiä alukkeita kunkin markkerin ja endogeeninen kontrolli geeni (18S rRNA) suunniteltiin Genamics Expression 1.1 ohjelmisto [13] – [16]. Alukesekvensseissä analysoitiin BLAST jättää niille, jotka monistettiin-toivottuja geenejä. Taulukossa 1 on esitetty sekvenssit alukkeiden.

PCR-reaktio oli seuraava: alkudenaturaatio 95 ° C: ssa, 50 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 10 sekunnin ajan, jota seuraa hehkutus 59 ° C 30 sekuntia. Lopullinen pidennys vaihe suoritettiin 72 ° C: ssa 10 min, minkä jälkeen sulamiskäyräanalyysillä. Tiedot analysoitiin menetelmällä, ja Livak ja Schmittgen [17]. Kaikissa PCR-reaktioissa, asianmukaista valvontaa käytettiin. Positiivinen kontrolli oli cDNA Universal Human Reference RNA (740000-41, Agilent, CA, USA) ja negatiivinen kontrolli oli no-mallia, ei-entsyymiä määräysvalta sekä ihmisen genomista DNA: ta (G304A, Promega, WI, USA). Lopuksi ei-käänteistranskriptio kontrolli käytettiin cDNA-synteesi. Standardi käyrät kaikkien alukkeiden on esitetty kuvassa S1.

Virtaussytometria

Solut värjättiin PE anneksiini V ja 7-amino-Actinomycin (559763, BD Biosciences, CA, USA) 15 min jälkeen ne suspendoidaan uudelleen 0,5 ml suojanesteeseen (8546859; Beckman Coulter, Nyon, Sveitsi) ja virtaussytometria analyysi yli 50000 tapahtumaa. Aineisto analysoitiin FCS Express Software (Denovo). Kussakin tapauksessa sopiva positiivinen ja negatiivinen kontrolli käytettiin.

Tilastollinen analyysi

kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (qPCR) tulokset arvioitiin mukaisesti Kolmogorov-Smirnov testi; kaikki näytteet oli normaalijakaumaa. Mediaani arvoja käytettiin analyysiä varten. Mann-Whitney on myös suoritettu kokeita on qPCR tietoja [18], [19]. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena kolme kertaa. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Gene Expression

vaiennettu Metnase ilmentymisen siRNA oli jopa 65% tehokas HCT-116-soluissa, 52 % in HCT-116-solujen sisplatiinia, ja 40% paksusuolen CSCS (kuviot 1-3). Tukahduttaminen Metnase HCT-116-solut johti kasvuun CD26-geenin ilmentymisen ja lasku ilmentymisen kaikkien muiden geenien mitattu Tämä lasku oli suurempi TOP2A, TOP2B, ERCC1, TYMS, ja DNMT1, jotka vaihtelevat 25-35%, kun taas pieni lasku 5-10% cMET ilmentymistä havaittiin (kuva 1). ERCC1 on mukana DNA: n korjaukseen prosesseihin, ja sen ilme on yhteydessä herkkyys tämän solulinjan platinayhdisteille [20].

suhteellinen geenin ilmentymistä transkriptiotekijöitä Colon CSCS seuraavissa Metnase knockdown. Prosenttiosuus Metnase pudotus saavuttaa 40%. ΔΔCt menetelmää käytetään suorittamaan analyysin. Kukin pylväs keskiarvo Ct-arvoja. Kokeet suoritettiin kolmena kappaleena ja p-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. Kontrollinäytteessä keskimääräinen arvo on 1,00 osoittaa, että ei ole muutosta geenien ilmentyminen. Arvot 1 osoittavat kasvua geenien ilmentyminen, kun arvot 1 osoittavat laskua geenien ilmentyminen. Edellytykset myöhemmissä kokeissa olivat samat.

suhteellinen geeniekspression transkription tekijöitä HCT-116-solut seuraavat Metnase pudotus. Prosenttiosuus Knockdown saavutti 65%.

suhteellinen geenin ilmentymistä transkriptiotekijöitä HCT-116-solujen sisplatiinia, kun Metnase knockdown. Prosenttiosuus Knockdown saavutti 52%.

Havaitsimme samankaltaisia ​​tuloksia HCT-116-solujen sisplatiinia. Parannettu lasku topoisomeraasi II geeniekspression nähdään seuraavat Metnase hiljentäminen HCT-116-solujen sisplatiinia verrattuna ei hoideta on myös merkittävä. TYMS ja DNMT1 ilmentyminen väheni jopa 60%, kun taas TOP2B ilmentyminen väheni 18-35% ja cMET lähes 40%. ERCC1 tasot eivät vaikuttaneet, mikä osoittaa, että käsittely sisplatiinin kanssa monissa kohdissa johtaa resistenssin kehittymisen mekanismien (kuvio 2).

jälkeen hiljentäminen Metnase paksusuolen CSCS, ainoa geeni mitattu, että havaittu olevan ekspressio oli CD26. Väheneminen havaittiin, että TYMS ja TOP2A geenit, kun taas ekspressio ERCC1, cMET, ja TOP2B ilmestyi vaikuta (kuvio 3). Nämä tulokset osoittivat, että CSCS ovat vastustuskykyisempiä kemoterapeuttisia kuin eriytetty syöpäsoluja. Kaiken ekspressiotasot geenien pitää stemness transkriptiotekijöiden laskivat seuraavat hiljentäminen Metnase ilmentymisen CSCS. Tämä lasku ilmentyminen oli jopa 60% ja Sox2, 40% Oct3 /4 ja 45% ja Nanog (kuvio 4).

Suhteellinen geenin ilmentymisen analyysi stemness transkriptiotekijöiden Nanog, Oct3 /4, ja Sox2 seuraavat Metnase pudotus.

elinkykyyn-apoptoosi

solujen lukumäärä apoptoosin määritettynä virtaussytometrialla on kaksinkertaistui tukahduttaminen Metnase ilmentymisen sekä HCT-116 ja HCT- 116 + sisplatiini soluja. Nostamalla kuolleiden solujen havaittiin myös. Kuitenkin solujen elinkelpoisuutta ei merkittävästi muuttunut. Paksusuolen CSCS, solujen elinkelpoisuus väheni seuraavan Metnase vaiennettu, mutta mitään muutosta solujen määrä apoptoosin havaittiin. Väestön kuolleita soluja oli suurempi HCT-116-solulinja kuin kahdessa muussa. Tämä voi johtua resistenssimekanismeja joka kehittyy sisplatiinin saaneilla solulinja, tai tällaiset mekanismit voivat natiivisti esiintyä CSCS. Taulukko 2 esittää tiedot kustakin solulinjasta.

Keskustelu

Metnase fuusio geeni metyloi histoni H3 lysiinin 36 ja hallussaan monia ominaisuuksia transposaasientsyymin, mukaan lukien päätteen käänteinen jakson uusinta-specific DNA: n sitoutuminen ja DNA kiehkura [21]. Kuitenkin, se ei voi suorittaa osaksi reaktioita. Kautta metylaatio toimintaa, Metnase on sekaantunut DNA: n korjaukseen, jonka NHEJ reitin. Tämä korjausaktiivisuus vaatii vuorovaikutusta Pso4 [22]. ERCC1 proteiini on mukana läpi nukleotidin Leikkauskorjauksessa [23]. Tämä tutkimus viittaa siihen, että on olemassa suhde ERCC1 ilmaisun ja Metnase. Erityisesti, tukahduttaminen Metnase vähensivät ilmentymisen korjaava geeni, mutta tämä lasku oli vähemmän selvä, kun soluja käsiteltiin sisplatiinin kanssa. Tämä edelleen tukee rooli ERCC1 sisään sisplatiiniterapiaa.

TOP2A on ensisijainen decatenation entsyymi, ratkaista sotkeutunut tai katenoida kromatidia [24]. Tämä tutkimus vahvistaa myös, että Metnase välittää resistenssiä topoisomeraasi II α estäjiä, joissa geenin ilmentyminen TOP2A vaikuttaa enemmän kuin muiden geenien seuraavat Metnase knockdown. Tämä lasku oli parannettu soluissa sisplatiinia ja CSCS. Lisäksi tukahduttaminen sekä TOP2A ja TOP2B havaittiin, mikä osoittaa, että Metnase voisi olla tavoite yhdistelmä kemoterapiaa topoisomeraasi II estäjien.

Expression of dipeptidyylipeptidaasi IV (CD26) korreloi paksusuolen syövän etenemisessä ja CD26 + CSCS on löydetty ihmisen peräsuolen syöpä. Täällä, CD26-geenin ilmentyminen kasvoi kaikissa tapauksissa Metnase knockdown. Tämä entsyymi liittyy immuuni asetus, signaalitransduktion ja apoptoosin. Tämä osoittaa, että Metnase on mukana apoptoosin säätelyyn, kenties kautta vuorovaikutuksessa CD26 [25].

cMET esikasvaintekijän koodaa hepatosyyttikasvutekijän reseptorin ja liittyy läheisesti syövän kehittymisen. Poikkeava aktivaatio cMET johtaa kasvaimen kasvua, angiogeneesiä ja lopulta etäpesäke. Toisin kuin normaalit kantasolujen CSCS ilmaista cMET, helpottaa syöpä pysyvyys ja levitä [26]. Negatiivinen palaute sääntely MET-riippuvaisen invasiivista kasvua Notch on osoitettu Drosophila [27], ja Notch geenit säätelevät myös MET ihmisellä [28]. Tämä tutkimus kuitenkin löytänyt yhdistys cMET tasolle kuin Metnase transposaasientsyymiä.

Havaitsimme suhde Metnase ja kahdesta geenistä tärkeitä DNA homeostaasiin, TYMS ja DNMT1. Geenien ilmentyminen Molempien väheni kaikissa solulinjoissa seuraavat vaiennettu Metnase ilmaisun. TYMS luo tymidiinimonofosfaattia, joka on sittemmin fosforyloituu tymidiinitrifosfaatin käytettäväksi DNA-synteesin ja korjaus [29]. DNMT1 on entsyymi osallistuu säätelyyn metyloitu sytosiinitähteiden, ja sen poikkeava metylaatio liittyy syövän kehityksen [30]. Tämä alenemiset TYMS ja DNMT1 on parannettu soluissa sisplatiinia. Siksi Metnase voidaan osallisina syövän kehittymisessä ja perustaminen vuorovaikutuksessa tai vaikuttaa useiden entsyymien, joilla on keskeinen rooli syövän.

Tutkimme myös suhdetta Metnase ja transkriptiotekijöiden tärkeää säilyttää stemness. CSCS määritellään kyky itse uudistaa, erottaa, ja lisääntyä. CSCS ilmaista monet transkriptiotekijän markkereita, mutta tärkeimmät ovat Nanog, Oct3 /4 ja Sox2 geeni. Nanog ilmaistaan ​​talous- ja sosiaalineuvostojen ja on keskeinen rooli ylläpitää pluripotentti-. Sen yli-ilmentyminen aiheuttaa itseuudistumisen in talous- ja sosiaalineuvostojen, mutta sen puuttuminen johtaa erilaistumiseen [31], [32]. Ylläpitää stemness, läsnä kaksi muuta transkriptiotekijöiden, Oct3 /4 ja Sox2 tarvitaan. Oct3 /4 ilmentyminen liittyy myös erittelemätön vaiheessa ja itseuudistumisen muodostaen heterodimeerin Sox2 ja yhdessä nämä kaksi proteiinia sitoutumaan DNA: han. Sox2 on transkriptiotekijä tärkeää säilyttää pluripotenssia, mutta sen ektooppinen ilmentyminen voi olla mukana epänormaali erilaistuminen ja peräsuolen syövän soluja, [33], [34]. Knockdovvn Metnase vähensivät geenin ilmentymisen kaikki transkriptiotekijöiden, mikä osoittaa, että Metnase voi olla osallisena syövän laitoksessa sekä syövän kehitystä ja edistystä.

Cellular elinkelpoisuus ilmestyi vaikuta Metnase pudotus. Sisplatiini saaneista solulinjan näytti olevan vähemmän kuolleita soluja verrata ei-käsitellyn solulinjassa. Samanlaisia ​​havaintoja saatiin käyttäen paksusuolen CSCS. Tämä tukee edelleen vastarintaa kemoterapiaa havaittu CSCS. Kuitenkin Metnase hiljentäminen teki vaikutus solujen lukumäärä apoptoosin. Näitä voitaisiin selittää kehittämällä vaihtoehtoisia apoptoosin-kiertämästä mekanismeja kehittymässä CSCS verrattuna käsitellyn solulinjan.

Tässä tutkimuksessa määritetään, että Metnase fuusio geeni on vahvasti mukana DNA korjausmekanismit, DNA-synteesi, topoisomeraasi II vastus, apoptoosin, ja ylläpito stemness fenotyyppi paksusuolen syöpä. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään yksityiskohtia näiden vuorovaikutusten.

tukeminen Information

Kuva S1.

Standardikäyrien – Standard käyrät kaikkien käytetyt alukkeet. V: 18S rRNA, B: Metnase, C: ERCC1, D: cMET, E: CD26, F: TOP2A, G: TOP2B, H: TYMS, I: DNMT1, J: Nanog, K: Oct3 /4, ja L: Sox2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0109741.s001

(TIF) B