Krooninen sairaus

tiivistelmä

Angiogeneesi on kriittinen tapahtuma kehittämisessä, etenemiseen ja leviämiseen erilaisten ihmisen syövissä, mukaan lukien keuhkosyöpä. Molecular mekanismeihin, jotka ovat monimutkainen sääntely angiogeenisten prosessien huonosti. Kuitenkin Yhä useammat todisteet osoittavat, miRNA tärkeitä säätelijöitä kasvaimen angiogeneesiä. Pihdit koepalat kerättiin kasvainkudoksen, ympäröivä kudos, ja ei-kasvainkudoksen 50 pienisoluista keuhkosyöpää. Lung kudosnäytteitä yksilöistä, joilla ei ole kliinistä näyttöä syöpä sairauden toimivat vertailuryhmänä. Immunohistokemiallinen värjäys tekijä VIII on käytetty arvioimaan mikroverisuonitiheys (MVD). TaqMan®-aluke-koetinsarjojen käytettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR-reaktioissa ilmentymistasojen määrittämiseksi anna-7b, miR-126, miR-9, ja miR-19a. Olemme osoittaneet, huomattavasti korkeampi MVD ja laski ekspressiotasot let-7b ja miR-126 kasvainkudoksessa ja ympäröivän kudoksen verrattuna vastaaviin ei-kasvainkudoksessa tai keuhkojen kudoksesta kontrolliryhmässä. Lisäksi mitään eroja MVD ja ekspressiotasot molempien miRNA välillä kasvainkudoksen ja ympäröivän kudoksen välillä NSCLC potilaita seurattiin. Alhainen ilmentyminen molempien miRNA korreloi korkea MVD ja huonommin ilman taudin etenemistä ja kokonaiselinaika. Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen samanlainen molekyyli alternations sisällä kasvainkudoksen ja ympäröivä kudos, joka käsittää tietyn mikroympäristön. Alhainen ilmentyminen let-7b ja miR-126 näyttää olevan mahdollista antiangiogeenistä rooli keuhkojen kasvainkudoksessa ja merkittävästi korreloi elinajan lopputulokset keuhkosyöpäpotilaita. Lisäksi sääntely anna-7b ja miR-126 ilmaisu voisi olla terapeuttista potentiaalia, koska se voi vähentää kasvaimen angiogeneesiä ja siten tukahduttaa kasvaimen kasvua keuhkosyöpäpotilaiden.

Citation: Jusufović E, Rijavec M, Keser D, Korošec P, Sodja E, Iljazović E, et ai. (2012) let-7b ja miR-126 alassäädetty kasvainkudoksessa ja korreloivat mikroverisuonitiheys ja Survival Outcomes in Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (9): e45577. doi: 10,1371 /journal.pone.0045577

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 05 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 22 elokuu 2012; Julkaistu: 24 syyskuu 2012

Copyright: © Jusufović et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä, suurin syy syöpään liittyvien kuolemia maailmanlaajuisesti, on usein diagnosoidaan sen pitkälle; Siksi kemoterapiaa yhdistettynä rintakehän sädehoitoa edustaa hoidon kulmakivi. Kuitenkin hoito, joka häiritsee tiettyjä molekyylikohteista erittäin lupaava parantamisessa kliinisessä tulosten keuhkosyövän hoidossa [1], [2].

kehitys, eteneminen, ja etäpesäkkeiden erilaisten ihmisen syöpien riippuvat voimakkaasti angiogeneesiä, fysiologinen prosessi tuottaa uusia verisuonia ennestään verisuoniston. Kehittyvä kiinteä kasvain on yleensä happea nälkään tai hypoksinen valtio, joka laukaisee ero ilmaus välittäjien, jotka joko edistävät tai tukahduttaa angiogeneesiä [3]. Angiogeenisten tekijöiden (esim perhe verisuonten endoteelin kasvutekijöiden [VEGFs] ja niiden reseptorien) ohjaamalla tämä monimutkainen prosessi on ollut keskittyä pyrkimyksiä tunnistaa uusia terapeuttisia kohteita sekä kehittää hoitostrategioita voidakseen estää angiogeneesiä ja estää hallitsematon leviäminen kehittää kasvaimia [2]. Siksi valaisemaan molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät angiogeneesiä voi olla suuri merkitys vähentämisessä syöpään liittyvää kuolleisuutta [3], [4].

MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä (keskimäärin 19-25 nukleotidia) sääntelyn RNA molekyylit, joiden ensisijainen tehtävä on vaiennettu geeniekspressiota, joka perustuu pääasiassa posttranskriptionaalisella tukahduttamisesta kohde mRNA tukahduta käännös- ja /tai edistämällä mRNA rappeutuminen [5], [6]. Aikuinen miRNA kontrolloivat lukuisten geenien, jotka säätelevät biologisia perusprosesseja lukien angiogeneesi [6]. Monet miRNA säädellä angiogeneesiä, vaikka niiden erityiset roolit angiogeenisen prosessin huonosti ominaista. Niiden mahdollinen kasvain heikentävän tai onkogeenisten rooli tässä prosessissa on ehdotettu erilaisissa ihmisen syövissä [7] – [11]. Lisäksi kertynyt näyttöä ehdottaa miRNA kuten houkuttelevia kohteita kehittää hoitostrategioita jotka saavuttaa parempia hoitotuloksia syöpäpotilailla [12] – [14].

Monet kirjoittajat ovat osoittaneet alentunut ilmentyminen anna-7 miRNA perhe, mukaan lukien anna-7b, joko kasvainkudoksessa tai kasvaimen solulinjojen verrattuna niiden normaaliin kollegansa [13], [15], [16] viittaa siihen, että jäsenet anna-7 perhe ovat ratkaisevia säätelijöitä solun prosessien taudin alkamisen ja etenemisen eri ihmisen syövissä. Ei-pahanlaatuisia soluja, anna-7b tukahduttaa käännös useiden proteiinien mukana keuhkosyöpä kehittämiseen, joista osa mahdollisen roolin angiogeneesissä (esim C-MYC ja K-RAS) [17], [18].

Toinen miRNA usein alassäädetty useissa ihmisen syövissä on miR-126 [9], [12], [19], joka on suunnattu ilmaus VEGFA ja muiden molekyylikohteista kanssa mahdollisen roolin verisuoni- muodostumista ( esim VCAM1, EGFL7, ja PIK3R2) [19] – [21]. Liu et ai. [12] löytyi vähentynyt ilmentyminen miR-126 ja lisääntyneen ilmentymisen VEGFA eri keuhkosyövän solulinjat, ja osoittivat, että käyttöönotto miR-126 kasvainsoluihin käyttäen lentivirusvektorilla voisi alas-säädellä ilmentymistä VEGFA.

jäsenet miR-17-92 klusterin tiedetään toimivan onkogeenit kehittämiseen keuhkosyövän [14], [22]. On osoitettu, että ilmentymisen miR-17-92 klusterin aktivoituu suoraan onkogeenien c-myc ja N-MYC [23], [24]. Siitä aiheutuvat korkeat ekspressiotasot sen jäsenen, miR-19a, havaittiin korreloivan vähentynyt ilmentyminen useiden anti-angiogeenisten tekijöiden, kuten trombospondiini-1 (TSP-1) ja sidekudoksen kasvutekijä (CTGF) [23], [25] .

tietoa roolista miR-9 keuhkosyöpää kehittämiseen ja angiogeneesin puuttuu edelleen. Käyttämällä mikrosiruanalyysi, alas-säätely miR-9 keuhkojen kasvainkudoksessa verrattuna vastaaviin ei-kasvainkudoksessa ilmoitettiin [15]. Toisaalta, ilmentyminen miR-9 näyttää säädellään ylöspäin rintasyövän, jos se vähentää E-kadheriinin ilmentyminen johtaa lisääntyneen ilmentymisen VEGFA ja angiogeneesin edistäminen [10].

tavoitteena tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, missä määrin vascularization määräytyy mikroverisuonitiheys sekä ilmentymisen valittujen miRNA (erityisesti, anna-7b, miR-126, miR-9, ja miR-19a) keuhko- kasvainkudoksessa, ympäröivä kudos, ja vastaavat ei-kasvainkudoksessa potilailla, joilla on okasolusyöpä keuhkosyöpä (SCC) ja keuhkon adenokarsinooma (ADC) sekä keuhkojen kudoksen verrokeilla ei ole kliinistä näyttöä pahanlaatuisen sairauden. Väliset suhteet miRNA ekspressiotasot ja eloonjäämisen tuloksiin (PFS ja OS) 1 vuoden seurannassa arvioitiin myös. Tulokset Tämän tutkimuksen voisi parantaa molekyyli lavastus keuhkosyövän ja voi tarjota arvokasta tietoa tunnistaa mahdolliset antiangiogeenisestä täsmähoitoihin keuhkosyövässä.

Tulokset

mikroverisuonitiheys (MVD)

MVD kasvainkudoksessa (mediaani [alue]: 48 [17-123]) ja ympäröivä keuhkokudoksessa (mediaani [alue]: 49 [14-120]) oli merkitsevästi korkeampi verrattuna vastaaviin ei-kasvainkudoksessa ( mediaani [alue]: 26 [12-89]) tai kontrolli keuhkokudoksesta (mediaani [alue]: 34 [5-87], kuva 1). Mitään eroja MVD myöskään havaittu kasvainkudoksen ja ympäröivään kudokseen tai kun potilaat stratifioitiin sairauden vaiheessa, keuhkosyövän tai sukupuoli. Vastaavasti, ei ole eroja MVD havaittu sisällä kontrolliryhmän yksilöiden eri patologisia löydöksiä (tuloksia ei ole esitetty). Kuva 2 esittää edustavan tapauksessa MVD (tekijä VIII) immunovärjääminen FFPE kudosnäytteistä.

Data esitetään mediaani kanssa kvartiilivälejä.

Nuolet osoittavat verisuonia.

miRNA ilmaisun ja korrelaatiot mikroverisuonitiheys

Expression valittujen miRNA määritettiin kaikissa kudosnäytteitä ja normalisoitu näyte kontrolliryhmään. Mitään merkittäviä korrelaatioita ei havaittu ilmentyminen valitun miRNA ja joko kliinisessä vaiheessa tauti, keuhkosyövän tai potilaiden sukupuolesta.

Löysimme vähensi merkitsevästi ilmaus joko antaa-7b tai miR-126 kasvainkudoksessa ja ympäröivän kudoksen verrattuna vastaaviin ei-kasvain keuhkokudoksessa tai keuhkojen kudoksesta kontrolliryhmän (let-7b /miR-126:

p

0,001, kuviot 3A ja 4A, vastaavasti). Mitään eroja ilmentyminen joko antaa-7b tai miR-126 ei havaittu kasvainkudoksen ja ympäröivään kudokseen. Mitään eroja let-7b ilmentymisen todettiin myös muiden kuin kasvainkudoksen ja ohjaus keuhkokudoksesta. Toisaalta, merkittäviä eroja miR-126 ilmentyminen havaittiin molempien kudostyyppejä. Lisäksi löysimme korkea negatiivinen yhdistyksen välillä let-7b (kuva 3B-E) tai miR-126 lauseke (kuva 4B-E) ja MVD kaikissa kudosnäytteistä jossa yleinen r

S korrelaatiokerroin oli -0,784 ja – 0,752, tässä järjestyksessä.

Data esitetään mediaani kanssa valikoima ja kvartiilivälejä. Korrelaatio let-7b suhteellinen ilmentyminen ja MVD keuhkosyöpäpotilaiden ”kasvainkudoksen (B), ympäröivää kudosta (C), ja ei-kasvain keuhkokudoksessa (D), sekä keuhkokudosanalyysin verrokkiyksilöitä (E).

Data esitetään mediaani kanssa valikoima ja kvartiilivälejä. Korrelaatio miR-126 suhteellinen ilmentyminen ja MVD keuhkosyöpäpotilaiden ”kasvainkudoksen (B), ympäröivää kudosta (C), ja ei-kasvain keuhkokudoksessa (D), sekä keuhkokudosanalyysin verrokkiyksilöitä (E).

Toisaalta, ei merkittäviä muutoksia miR-9 ekspressiotasot kaikkien tutki kudosnäytteet havaittiin (kuvio 5A).

Data esitetään mediaani kanssa valikoima ja kvartiiliväliä .

havaittu merkittävästi pienempi ilmentyminen miR-19a kasvainkudoksessa verrattuna ohjata keuhkokudoksessa (kuvio 5B). Ekspression miR-19a oli suurempi ympäröivän kudoksen muodossa ADC potilailla verrattuna ympäröivään kudokseen SCC potilaista (

p

0,001; tuloksia ei ole esitetty).

Koska ekspressiotasot miR -9 ja miR-19a ei vaihdellut merkittävästi välillä kasvainkudoksen ja vastaavat ei-kasvainkudoksessa, edelleen korrelaatiot MVD ei arvioitu.

Survival analysoi

Only miRNA vahvojen tilastollisia eroja ilmaisun tasot kasvainkudoksessa verrattuna vastaavien muiden kuin kasvainkudoksen (anna-7b ja miR-126) sisällytettiin selviytyminen analyysiin.

mediaani PFS koko potilasryhmässä oli 154 päivää, kun taas mediaani oli 236 päivää. Mitään merkittäviä eroja PFS ja OS koko potilasryhmässä ei havaittu, kun potilaita stratifioitiin histologinen keuhkosyövän tai sairauden vaiheissa (tuloksia ei ole esitetty).

PFS ja OS mukaisesti joko MVD asemasta tai miRNA lauseke keuhkosyöpäpotilaita on esitetty taulukossa 1 ja kuvioissa 6-7. Lyhyesti, alhainen ilmentyminen let-7b, miR-126 tai molempien miRNA yhdistettynä korreloi lyhyt PFS tai OS koko ryhmässä keuhkosyöpäpotilaiden. Hyväksymällä merkitsevyystasolla 0,01, korrelaatiot pysyivät merkittävästi alaryhmässä SCC potilaista, kun taas suuntaus lyhyempiä PFS tai OS havaittiin alaryhmässä ADC potilaista.

etenemisestä vapaa elinaika koko ryhmässä NSCLC potilaiden (A), potilailla, joilla on levyepiteelikarsinooma keuhkosyöpä (B) ja adenokarsinooma (C). Kaiken hengissä koko ryhmässä pienisoluista keuhkosyöpää (D), potilailla, joilla on levyepiteelikarsinooma keuhkosyöpä (E) ja adenokarsinooma (F).

etenemisestä vapaa elinaika koko ryhmässä NSCLC potilaiden ( A), potilailla, joilla on levyepiteelikarsinooma keuhkosyöpä (B) ja adenokarsinooma (C). Kaiken hengissä koko ryhmässä pienisoluista keuhkosyöpää (D), potilailla, joilla on levyepiteelikarsinooma keuhkosyöpä (E) ja adenokarsinooma (F).

Keskustelu

Molecular mekanismeja että taustalla monimutkainen sääntely tuumoriangiogeneesin huonosti. Yhä suurempi todistusaineisto viime vuosina osoittaa miRNA tärkeinä säätelijöinä fysiologisten ja patologisten angiogeneesiä. Arvioidaan angiogeeninen rooli valittujen miRNA, niiden ekspressiotasot määritettiin ja korreloivat MVD NSCLC potilailla. Osoitimme merkittävästi vähentynyt ilmentyminen kahden miRNA (anna-7b ja miR-126) ja suurempaa MVD kasvainkudoksessa ja ympäröivään kudokseen verrattuna vastaaviin ei-kasvainkudoksessa. Mitään eroja ei havaittu MVD ja ekspressiotasot molempien miRNA välillä kasvainkudoksen ja ympäröivän kudoksen NSCLC potilaiden. Ilmaisu Molempien miRNA myös korreloi negatiivisesti MVD ja merkitsevästi yhteydessä sairauteen ennusteeseen. Nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen mahdolliseen antiangiogeenisten roolia let-7b ja miR-126 keuhkosyöpää kehittämiseen. Lisäksi sääntely anna-7b ja miR-126 ilmaisu voisi olla terapeuttista potentiaalia, koska se saattaa vähentää kasvaimen angiogeneesiä ja siten tukahduttaa kasvaimen kasvua keuhkosyöpäpotilaiden.

Angiogeneesi voidaan arvioida eri menetelmiä. Tutkimuksessamme käytimme MVD indikaattorina angiogeenisen potentiaalin kudosnäytteistä. Tuloksemme osoittavat korkea MVD kasvainkudoksessa ja ympäröivään kudokseen verrattuna ei-kasvain kudosta pienisoluista keuhkosyöpää tai kontrolliryhmään. Emme ei havaittu huomattavia eroja kasvainkudoksen ja ympäröivään kudokseen. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia, vaikka ne eivät ole suoraan vertailukelpoisia havaintoja muista tutkimuksista, mikä viittaa siihen, että microenvironment ympäröivään kudokseen saa aikaan merkittäviä mahdollisuuksia kasvainten kehittymiseen, ylläpito, ja etenemiseen [26] – [28]. Tähän mennessä useat tutkimukset ovat raportoineet korkeat ekspressio joko pro-angiogeenisten tekijöiden (esim transkriptiotekijä HValitse-1α, kasvutekijöitä VEGF ja bFGF) tai tekijöistä, jotka verisuonten kehitystä ja uudelleenmuodostus (esim endogliini CD105) kasvaimissa ja /tai ympäröivän kudos [26], [28] – [30]. Erilaisia ​​stroomasolujen, kuten endoteelisolut, sileän lihaksen solut, fibroblastit, ja infiltroituvat solut immuunijärjestelmän sisällä kasvaimen mikroympäris- on havaittu tuottaa näitä angiogeneesiä välittäjiä, mikä edistää ratkaiseva tapahtumia kasvaimen kasvua ja angiogeneesiä [27 ], [31], [32].

Tämä tutkimus osoitti merkittävästi pienempi ilmentyminen let-7b ja miR-126 kasvainkudoksessa verrattuna joko ei-kasvain kudos pienisoluista keuhkosyöpää tai keuhkojen kudoksen kontrolliryhmään. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​muiden julkaistujen tutkimusten, jossa vähennetään ilmentyminen let-7 perheensä let-7b [13], [15], [16] tai miR-126 [9], [12], [15], [ ,,,0],19], [20], [33] kasvainkudoksessa tai kasvaimen solulinjojen erilaisten ihmisen syöpien on raportoitu. Ekspressiotasoja sekä anna-7b ja miR-126 oli myös merkittävästi pienempi ympäröivään kudokseen, jossa ei kasvainsolut olivat läsnä. Tietääksemme suora vertailu antaa-7 tai miR-126 ilmentymisen tasojen kasvainkudoksen ja ympäröivän kudoksen ei ole raportoitu. Perusteella tulostamme, voidaan päätellä, että samanlaisia ​​molekyylitason muutokset ovat läsnä kasvainkudoksen ja sitä ympäröivän kudoksen. Lisäksi voimakas negatiivinen korrelaatio MVD, indikaattori kudoksen angiogeeninen potentiaali ja ilmentyminen anna-7b tai miR-126 kaikkiaan tutkittiin kudosnäytteistä havaittiin, voimakkaasti mikä niiden rooli tukahduttamaan angiogeenisten prosessien. Lisäksi nämä havainnot osoittavat jälleen suurta merkitystä kasvaimen microenvironment syövän kehitys ja sen kasvaimen angiogeneesiä.

Lisäksi selviytyminen analyysi molempien miRNA osoittivat, että NSCLC potilaat, joilla on alhainen ilmaus joko yksittäisten miRNA tai molempia miRNA yhdistetty (anna-7b ja miR-126) olivat erittäin liittyy huono eloonjäämisen tuloksiin (PFS ja OS). Kuitenkin yhteydet olivat merkittävästi alaryhmässä SCC potilaista, vaikka ADC potilaalla on matala ilme molempien miRNA kasvainkudoksessa yleensä lyhyempi PFS tai OS. Tämä voimakas vaikutus let-7 tai miR-126 ilme taudin ennusteeseen on raportoitu muiden tutkijaryhmien [13], [15], [34] – [36]. Useat tutkimukset korreloivat alennettu ilmentyminen let-7 kasvainkudoksessa huono selviytyminen tuloksia keuhkosyöpäpotilaiden [13], [15]. Samoin suhde matalan miR-126 ilmentymistä kasvainkudoksessa ja huonompi taudin ennusteen on raportoitu glioblastoma [34], rintasyöpä [35] ja mahalaukun syövän potilaille [36]. Vastakohtana tuloksemme, Donnem et al. [37] osoittivat, että korkea miR-126 ilmentyminen Tuumorinäytteissä korreloi lyhyempi selviytymisen NSCLC potilaiden, erityisesti niillä, joilla okasolusyöpä. Vielä mielenkiintoisempaa, positiivinen korrelaatio miR-126 ja VEGFA ilmentymistä havaittiin, mikä viittaa mahdolliseen myönteinen säätelevän roolin miR-126 kasvaimen angiogeneesissä [37].

Vielä tärkeämpää, Takamizawa et al. [13] osoittaa, että kasvua keuhkosyövän soluja voitiin estää ottamalla käyttöön ekspressiorakenne yli-ilmentävät anna-7. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot voidaan mahdollisesti käyttää kehittää uusia syövän hoitomuotoja kehitettäessä, jotka rajoittaisivat sivuvaikutuksia, myöhemmin parantaa elämän laatua ja pidentää kokonaiselossaolo hinnat.

Tässä tutkimuksessa ei havaittu huomattavia eroja miR-9 ekspressiotasot kaikkien tutkitaan kudosnäytteitä Ne eivät edusta MVD. Kuitenkin suurempia tutkimuksia perusteltua määrittää tarkka rooli miR-9 ilmaisun kasvainangiogeneesissä, koska vain rajoitettu määrä tutkimuksia keuhkosyövän on julkaistu tähän mennessä [15], [38].

tulokset osoittavat, alempi ilmaus miR-19a kasvainkudoksessa verrattuna muihin kudosnäytteistä. Nämä havainnot ovat ristiriitaisia ​​ja vastustaa angiogeneesiä roolia miR-19a raportoimat Useimmissa tutkimuksissa toistaiseksi julkaistu [14], [23], [25], [39], [40]. Kuitenkin useat kirjoittajat kertoivat, että yksittäiset jäsenet miR-17-92 klusteri, kuten miR-19a, voi olla erilaisia ​​toimintoja syöpäsolujen kasvua ja angiogeneesiä [14], [39], [40]. Lisäksi, TSP-1, joka on kuvattu yksi tärkeimmistä tavoitteista miR-19a, voidaan joko vähentää [23], tai sen jälkeen, kun sitoutumisesta solun pinnan reseptoreihin integriinit, jopa edistää angiogeneesiä [41]. Kuitenkin lisätutkimuksia yksittäisten jäsenten miR-17-92 klusterin ja niiden osallistuminen angiogeenisten prosessien tarvitaan.

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että merkittävästi vähentynyt ilmentyminen let-7b ja miR-126 kasvaimen kudos vaikuttaa ennusteeseen NSCLC potilaiden. Nämä havainnot voivat tarjota meille tärkeä askel kohti ymmärrystä monimutkaisia ​​reittejä tarpeen kehittymistä ja etenemistä keuhkosyöpään. Lisäksi miRNA on ehdotettu houkuttelevia kohteita kehittää hoitostrategioita jotka saavuttaa parempia hoitotuloksia syöpäpotilailla. Kuitenkin esillä olevat tulokset tarjoavat ainoastaan ​​johtopäätöksiä kiinnekohta analyysiin ja lisävalidointia kautta mekaaniset tutkimukset näyttää pakollista.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaiden ja kudosnäytteiden

Tämä moni- keskeinen tutkimus aloitettiin sen jälkeen, kun se hyväksyttiin Tutkijavoimavarojen eettinen komitea Bosnia ja Hertsegovinan ja vastaava organisaatio Serbiassa ja kaikki potilaat antoivat tietoisen kirjallisen suostumuksensa. Kerääminen ja myöhempi säilyttäminen (formaliini kiinnittymisestä parafiinivalu) kudosnäytteitä osallistuvien potilaiden ja verrokkien sekä immunohistokemiallista arviointia tehtiin General Hospital Tešanj (Bosnia ja Hertsegovina) sekä klinikan keuhkosairauksien Kruševac (Serbia). Molecular laboratoriomenetelmät lukien RNA, käänteistranskriptio ja reaaliaikainen PCR ilmentymisen analyysi kudosnäytteitä tehtiin yliopistollisessa sairaalassa Golnik (Slovenia).

50 joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) , kuten SCC ja ADC (taulukko 2), ja 45 iän ja sukupuolen haun yksilöiden ole kliinistä näyttöä pahanlaatuisen taudin (kontrolliryhmä) sisällytettiin (taulukko 3).

sillä patologinen tutkimus, immunohistokemia, ja miRNA analyysi, pihdit koepaloja kasvainkudoksen, ympäröivä kudos (2 cm säteellä primaarikasvaimen kudoksen ilman pahanlaatuisia soluja), ja potilaiden ei-kasvain keuhkojen kudosta otettiin potilailta, joilla keuhkosyöpä. Diagnoosi SCC tai ADC kaikissa kasvain kudosnäytteistä vahvistettiin kokenut patologi ennen tutkimukseen osallistumiseen. Olemme mukana kasvain kudosnäytteitä ainakin 70% kasvainkudoksen, mikä vahvistetaan pathohistology, ja ympäröivään kudokseen sekä ei-kasvain keuhkojen kudosta ilman patologisia laulaa mitään solun pahanlaatuinen muutoksia. Yksi pihdit biopsia otettiin verrokeilla ilman kliinistä näyttöä syöpä tauti (kontrolliryhmä). Kudosnäytteet välittömästi formaliinilla ja kuin parafiiniin käyttäen standardimenetelmiä.

immunohistokemia

Jaksot 5 um leikattiin parafinoidut kudosblokeista. Jokaisesta kudosnäytteestä, kohdat värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla käytettiin morfologinen tarkastelu ja laadun arviointiin. Immunohistokemiallinen analyysi vaskularisaation suoritettiin käyttäen Analysis System, ja monoklonaalinen vasta-aine tekijä VIII (DAKO, Glostrup, Tanska). Lyhyesti, 5 um: n paksuinen FFPE leikattiin, sijoitettiin objektilaseille päällystetty 3-trietoksisilyylipropyyliamiinilla (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), ja kiinteät 37 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen deparaffinizing ksyleenissä ja rehydrating kautta arvostellaan alkoholit, diat inkuboitiin H

2O

2 estää endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus. Sitten leikkeitä inkuboitiin 1 tunti ensisijainen monoklonaalinen vasta-aine tekijä VIII (laimennus 1:1200) huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin biotinyloidun vuohen anti-kani-immunoglobuliinin (laimennus 1:300; Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornia, USA), pestiin jälleen, ja lisäyksen jälkeen 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla peroksidaasin tehtiin näkyväksi. Hematoksiliini käytettiin laskuri tahra.

aste vascularization mitattiin keskimäärin tekijä VIII-positiivinen pienten verisuonten kolmella eri alueilla 200-kertainen suurennus ja kirjataan mikroverisuonitiheys (MVD). Lyhyesti, tekijä VII värjätyt leikkeet tarkistetaan aluksi pienellä teholla (100-kertainen suurennus) ja alueilla, joilla on korkein määrä mikroverisuonten (hot spots), valittiin. Myöhemmin pienten suonten laskenta tehtiin kolmella eri alueilla 200-kertainen suurennus ja keskiarvo käytettiin lisäanalyysiä. Jokainen selvästi värjätään endoteelisoluja tai soluklusterien pidettiin yhtenä numeroituva pienten suonten koskien läsnäolo ontelon ja suurten alukset automaattisesti pois analyysistä.

Tiettyjen varusteiden valinta miRNA angiogeneesiin liittyvien

valitseminen miRNA osallisina syövän angiogeneesi sääntelyn saatavilla julkaisuja ja useita kohde ennustusohjelmia /tietokannoista etsittiin myös Miranda (https://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl), TargetScan (http: //www.targetscan.org/), PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/), ja miRbase (https://microrna.sanger.ac.uk/). Näiden tulosten perusteella, neljä miRNA (erityisesti, anna-7b, miR-9, miR-19a, ja miR-126) valittiin. Valitut miRNA osoitettiin olevan rooli angiogeneesissä, joko suoraan tai epäsuorasti tukahduttaa käännös ratkaisevan angiogeenisten tekijöiden, kuten VEGFA, TSP-1, CTGF, verisuonten adheesiomolekyyli 1 (VCAM-1), fibroblastikasvutekijä (FGF), E -cadherin (CDH1), MMP: t (metalloproteinaasien), ja kasvaimen kasvutekijän (TGF).

RNA käänteistranskriptio, ja reaaliaikainen PCR

Kokonais-RNA uutettiin 10 FFPE kudosleikkeet 5 um: n paksuinen käyttäen miRNeasy FFPE Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yhteensä RNA-pitoisuus arvioitiin käyttämällä Quanti-IT RNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kaksivaiheinen reaaliaikainen PCR käytettiin ekspression analysoimiseksi valitun miRNA. Ensimmäisessä vaiheessa kokonais-RNA käänteiskopioitiin käyttäen miRNA-spesifisiä RT-alukkeita (RNU6B, HSA-let-7b, HSA-miR-9, HSA-miR-19a, ja HSA-miR-126) ja TaqMan® MicroRNA Käänteistranskriptio Kit (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA). RT-reaktio suoritettiin 10 ul: n tilavuudessa, joka sisälsi 1 ui Taqman RT-puskuria (10 x), 0,10 ui 100 mM dNTP: itä, 0,67 ui MultiScribe käänteistranskriptaasia (50 U /ul), 0,13 ui RNaasi-inhibiittoria (20 U /ul), 2 ui erityisiä miRNA pohjamaali, 3,33 ui RNA, ja nukleaasin vapaata vettä niin, että lopullinen tilavuus 10 ui. Tuotteet RT reaktion käytettiin reaaliaikaisessa PCR-reaktiossa TaqMan miRNA määritykset (Applied Biosystems) ja TaqMan Universal Master Mix II, no UNG (Applied Biosystems), mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1,33 ui cDNA: ta sekoitettiin 5 ui TaqMan Universal Master Mix II, ei UNG (2 x), 0,5 ui TaqMan miRNA kokeessa ja 3,17 ui nukleaasitonta vettä. Kaikki näytteet ajettiin kolmena kappaleena. RNU6B (Applied Biosystems), käytettiin endogeeninen kontrolli normalisoinnin kohde miRNA ja näyte kontrolliryhmän käytettiin kalibraattori. Suhteellinen ekspressio laskettiin käyttäen ΔΔCt menetelmää. RQ määritettiin 2

-ΔΔCt, jossa ACt = (keskiarvo kolmena kappaleena Ct

Target miRNA-keskiarvoa kolmena Ct

RNU6B) ja ΔΔCt = (ACt

Sample-ACt

Näyte kontrolliryhmä). Reaaliaikainen PCR suoritettiin ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System (Sequence Detection System väline varustettu SDS version 1.3.0 ohjelmistot; Applied Biosystems).

Tilastolliset analyysit

jakautuminen data määritettiin käyttämällä D’Agostino ja Pearson omnibus normaalius testin. Vahvuus yhdistyksen välillä miRNA ekspressiotasot, MVD ja muita kliinisiä muuttujia analysoitiin Mann-Whitneyn U-testi, parittomia t-testi tai Fisherin testiä tarvittaessa. Spearmanin testiä käytettiin selvittääkseen, missä määrin lineaarisen välillä MVD ja suhteellinen ilmentyminen yksittäisten miRNA. Potilaat kahtia ryhmiin korkea /matala MVD tai korkea /matala ilmentymisen valitulle miRNA kasvainkudoksessa mukaan cut-off-arvot (mediaani MVD tai mediaanin suhteellinen ilmaisu, vastaavasti). Kaikki potilaat mukana tässä tutkimuksessa havaittiin 1 vuosi; Tämän jälkeen eloonjäämisen todennäköisyys (PFS ja OS) laskettiin päivänä diagnoosin aikaan tapahtuman (edistymisen tai kuolema, vastaavasti) tai tappio seurata käyttämällä Kaplan-Meier menetelmällä ja log-rank-testiä käytettiin vertailla eri luokkiin. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen GraphPad Prism 5 -ohjelmaa (San Diego, Kalifornia, USA) ja todennäköisyys arvot

p

0,01 hyväksyttiin merkittäviksi mukaan Bonferroni korjaus 5 testejä. Tilastollisesti merkitseviä eroja esitetään: **

p

0,01; ***

p

0,001.

Kiitokset

Olemme kiitollisia kaikille potilaille, jotka osallistuivat tähän tutkimukseen ja I. Kern (University Clinic Golnik) hänen ammattitaitoista apua ja arvokasta neuvoja pathohistological menettelyjä.