Krooninen sairaus

tiivistelmä

selenoprotein glutationiperoksidaasi-2 (GPx2) näyttää olevan kaksoisrooli syövän synnyssä. Vaikka se suojasi hiiriä paksusuolen syövän malli tulehduksen laukeavan karsinogeneesin (azoxymethane ja dekstraaninatriumsulfaatti hoidon), se edistää kasvua Ksenosiirretyn syöpäsoluja. Siksi olemme analysoineet vaikutuksia GPx2 hiirimallissa matkii satunnaista kolorektaalisyövän (azoxymethane-käsittely vain). GPx2-Knockout (KO) ja villin tyypin (WT) hiiret oikaistiin joko marginaalisesti puutteellinen (-Se), riittävä (+ Se), tai supranutritional (++ Se) seleeni tila ja käsiteltiin kuusi kertaa azoxymethane (AOM ) aiheuttavan kasvainten kehittymiseen. Vuonna -Se ja ++ Se ryhmiä, kasvainten määrä oli merkitsevästi pienempi GPx2-KO kuin vastaavissa WT-hiirissä. On + Se ruokavalio, määrä dysplastic kryptissa pienennettiin GPx2-KO hiirillä. Tämä saattaa johtua enemmän tyvi- ja AOM aiheuttama apoptoottisen solukuoleman GPx2-KO hiirten joka eliminoi vaurioituneet tai premaligneja epiteelisolujen. WT dysplastic crypts GPx2 oli säädelty verrattuna normaaleihin crypts jotka saattavat yrittää tukahduttaa apoptoosin. Sen sijaan, että + Se ryhmät kasvaimen numerot olivat samanlaiset sekä genotyyppien, mutta kasvaimen koko oli suurempi GPx2-KO-hiirissä. Jälkimmäinen liittyy tulehduksellinen ja kasvaimen edistävää ympäristöä ilmeistä soluttautunut tulehdussolujen suolen limakalvolla GPx2-KO hiirillä jopa ilman hoitoa ja luonnehtia matala-asteista tulehdusta. WT hiirillä kasvainten määrä oli yleensä pienin + Se verrattuna -Se ja ++ Se ruokinta osoittaa, että seleeni voisi hidastaa kasvainten synnyssä vain riittävän tilan. Lopuksi rooli GPx2 ja oletettavasti myös seleenin riippuu syövän vaiheessa ja näkyvin osallistumista tulehduksen.

Citation: Müller MF, Florian S, Pommer S, Osterhoff M, Esworthy RS, Chu FF , et ai. (2013) poistaminen glutationiperoksidaasi–2 Estää azoxymethane aiheuttama Colon Cancer Development. PLoS ONE 8 (8): e72055. doi: 10,1371 /journal.pone.0072055

Editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, Singapore

vastaanotettu: 03 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 08 heinäkuu 2013; Julkaistu: 19 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Müller et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Saksan Research Foundation (Br 778 /8-1). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat länsimaissa. Epidemiologiset tutkimukset, jotka liittyvät optimaalista seleeniä tila lisääntynyt riski kehittää CRC [1]. Tämä on merkitystä väestön Pohjois-Amerikan ulkopuolella, kuten Euroopassa, jossa keskimääräinen plasman seleeni tasot ovat 90 mikrog /l (tarkistetaan [2]). Erot alkutilanteen plasman seleeni tasot osallistuvat aiheiden saattanut osaltaan epäjohdonmukainen tulokset interventiotutkimuksissa sitoutuneet tutkimaan otaksuttu anti-syöpää aiheuttavia ominaisuuksia seleeniä täydentämistä. Näin ollen molemmat Nutritional Prevention of Cancer (NPC) ja seleeni ja E-vitamiini Cancer Trial (SELECT) paljasti, että osallistujat tulevat tutkimuksessa plasman seleeni tasot ≥120 mikrog /l ei hyötyä ravintolisistä [2]. Koska selenoprotein P, herkin merkkiaine seleenin tila [3], on tyydyttynyt 120 ug /L plasman seleeni, on ehdotettu, että seleeni-välitteisen syövän ehkäisyyn riippuu optimaalisen selenoprotein ilmaisun [2].

selenoproteome koostuu koodaamien proteiinien 25 geenien ihmisillä [4]. Joukossa on viisi seleeni riippuvia hydroperoksidi vähentävää glutationiperoksidaasit (GPX), nimittäin GPx1-4 ja GPx6. GPx1-4 ilmaistaan ​​hiiren suoliston epiteelin [5], mutta vain GPx2 on pääasiassa sijaitsee crypt pohjan [6], [7], jossa myös suoliston kantasolut sijaitsevat. Lisäksi, GPx2 ilmentyy vahvasti Kolorektaalituumorien [6], [8], [9]. Rooli GPx2 aikana CRC kehitys on vielä epäselvä. Toisaalta, GPx2 vähentynyt tuumorin numerot tulehdukseen laukaisee paksusuolen karsinogeneesin malli soveltamisen jälkeen azoxymethane (AOM) ja dekstraaninatriumsulfaatti (DSS) vaikuttamalla anti-inflammatoriset [10]. Tämä on sopusoinnussa spontaani ileocolitis ja suoliston syövän GPx1 /GPx2 double-hiirten [11], [12]. Molemmat voidaan lähes täydellisesti pelastaa yksi WT alleelin GPx2 muttei GPx1 [13]. Toisaalta, GPx2 näyttää tukevan leviämisen. Kasvaimet tuottanut AOM /DSS hoitoa olivat pienempiä GPx2-KO kuin WT hiirillä [10] olivat tuumoriksenografteja johdettu GPx2 puutosta HT-29-solujen verrattuna kontrolliin soluihin [14]. Lisäksi GPx2 on up-säännellään β-kateniinin [7], [15] ja ΔNp63 [16], sekä indusoimaan.

tavoitteet Nykyisessä tutkimuksessa oli analysoida roolia GPx2 ja seleeni on malli, jossa CRC aiheutetaan yksinomaan AOM, siten matkien satunnaista paksusuolen syövän syntymistä ihmisessä [17]. Kasvainten kehittymistä seurattiin GPx2-KO ja WT hiirillä ruokittu kohtalainen seleeni-puutosta (-Se), -adequate (+ Se) tai -supranutritional (++ Se) ruokavaliota. Koska AOM indusoi aktivoivat mutaatiot β-kateniinin (tarkistetaan [18]), kolokalisaation ydin- β-kateniinin ja parannettu GPx2 ilmentyminen analysoitiin.

Methods

Eläimet ja kokeelliset

C57BL /6J WT ja GPx2-KO hiiret, generoidaan C57BL /6J; 129SV /J hybridi oli takaisinristeytettiin C57BL /6J hiiriä viiden sukupolven [19] ennen tutkimusta kuin littermates. Eläimiä pidettiin yksittäin ilmanvaihto häkeissä tietyissä-patogeenivapaissa olosuhteissa, joissa on 12 h pimeä-valon sykli ja vapaa pääsy ruokaan ja veteen. Hiiriä ruokittiin torulahiiva perustuva ruokavalio (Nro C1045, Altromin, Lage, Saksa), jonka pohjapinta seleenipitoisuus 0,054 mg per kg ravinto (-Se). + Se ja ++ Se ruokavaliot tuotettiin lisäämällä L (+) – selenometioniinia (ACROS Organics, Geel, Belgia) päästä lopulliseen seleeniä 0,15 mg (+ Se) ja 0,6 mg (++ Se) per kg ravinto, vastaavasti [20]. Seleenipitoisuus mitattiin fluoro- kuten aiemmin on kuvattu [21]. Vastavieroitettu hiiriä ruokittiin koedieettejä 4 viikkoa säätää seleeni tila ennen AOM-hoitoa ja sen jälkeen koko kokeen (Fig. 1A). 10 mg /kg kehon paino AOM (Sigma, Steinheim, Saksa), tai sama tilavuus suolaliuosta (Sigma) ruiskutettiin intraperitoneaalisesti kerran viikossa kuuden viikon ajan. Akuutit vaikutukset AOM analysoitiin 5 hiirtä 8 h kuluttua ensimmäisestä AOM injektio (lyhytaikainen kokeilu). Kasvaimet analysoitiin 16 viikkoa kuluttua viimeisestä AOM injektio (pitkäaikainen kokeilu). 20 AOM-käsitellyn ja 10 suolaliuoksella käsitellyillä hiirillä ryhmää kohti analysoitiin kasvaimien synnyn ja vielä 5 eläintä käytettiin histologiaa varten. Tutkimukset hyväksynyt hallitusten Animal eettisen komitean (MLUV 32-2347 /4 + 68). Kaikki pyrittiin minimoida kärsimyksen. Hiiret nukutettiin Isofluran® ja tapettiin saattamalla kaula sijoiltaan. Pernan painot määritettiin ja kudosnäytteet jäädytettiin nopeasti nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa.

(A) vastavieroitettu hiiriä ruokittiin kokeellinen ruokavalio, joka oli joko seleeni-köyhiä (-Se), -adequate (+ Se) tai -supranutritional (++ Se) vähintään 4 viikkoa ennen AOM injektiota. AOM ruiskutettiin kerran viikossa kuuden viikon ajan ja hiiret tapettiin 16 viikkoa kuluttua viimeisestä AOM injektio (pitkäaikainen kokeilu). Tutkia akuutti AOM vaikutuksia, hiiret tapettiin 8 h kuluttua ensimmäisestä AOM injektio (lyhytaikainen kokeilu). (B) Yhteensä GPX aktiivisuus määritettiin 8 h kerta fysiologista suolaliuosta (kontrolli ryhmien lyhyen aikavälin kokeilu) tyhjäsuolessa ja maksan GPx2-KO ja WT hiirillä. Arvot ovat keskiarvoja + SD, n = 5. merkitys laskettiin 2-tie ANOVA Bonferronin testin jälkeen. *** P≤0.001 vs. WT,

# P≤0.05,

## P≤0.01, ja

### P≤0.001 vs. + Se.

histopatologia Colon kasvaimet ja esineoplastiset vauriot

tunnistaa kasvaimet ja preneoplastiset vauriot, paksusuoli avattiin pitkittäissuunnassa, litistetty suodatinpaperille ja kiinnitettiin 4% fosfaattipuskuroidussa formaliinilla pH 7,0 (Roth, Karlsruhe, Saksa). Tunnistamiseen kasvaimia ja poikkeavien crypt pesäkkeitä (ACF), paksusuolen värjättiin 0,1% metyleenisiniä [22]. Jälkeenpäin musiinigeenit köyhdytettyä pesäkkeitä (MDF) tunnistettiin samalla paksusuolikudos peräkkäisellä värjäys korkea-rauta diamiini (HID) ja 1% Alcian sininen (AB). Näytteet analysoitiin käyttäen stereo mikroskoopilla (Olympus SZH10, Olympus, Tokio, Japani). Sijainti ja halkaisija vaurioiden määrä ja kryptissa sisällä ACF tai MDF (crypt moninaisuus) kirjattiin. Kaikki MDF jotka koostuvat useammasta kuin kahdesta kryptat ja kaikki kasvaimet irrotettiin ja varmistettiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 1:8.000), anti-ki-67 (M7249, Dako, 1:60), anti- lisääntyvien solun tuma-antigeenin (PCNA, # 2714-1, Epitomics, Burlingame, CA, USA, 1:20.000), anti-p53 (NCL-p53-CM5p, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle Upon Tyne, UK, 1:1.600), anti-GPx2 antiseerumia [23] (1:12.000), ja anti-F4 /80 (MCA497, Serotec, Kidlington (Oxford), Iso-Britannia, 1:8.000). Toissijainen vasta-aineita tai sarjat (N-Histofine® Mousestain Kit, N-Histofine® Simple Stain Mouse MAX PO hiiren kudoksissa, anti-rotan tai anti-kani, kaikkea Nichirei Biosciences, Tokio, Japani), levitettiin 30 min huoneen lämpötila. Vasta-aineen sitoutuminen visualisoitiin diaminobentsidiinillä (Dako). Immunoreaktiivisuus pisteytettiin sokkona. Pituus PCNA-positiivisten alue ja koko krypta pituus mitattiin Mirax Viewer Software (Version 1.12.22.0, Carl Zeiss, Göttingen, Saksa) 100 crypts eläintä kohti. F4 /80-positiivisia soluja lamina propriassa pitkin halkaistiin kryptissa pisteytettiin 10 crypts eläintä kohti.

kvantifiointi apoptoottisten solujen suoritettiin avulla morfologisten kriteerien hematoksyliinillä värjätyt leikkeet distaalisen paksusuolen 200 pitkittäin avattu kryptissa eläintä kohti kuvatulla [20]. Tunnistaa MDF kudosleikkeissä, musiineilla visualisoitiin peräkkäisellä värjäystä 1% AB, pH 2,5 ja Periodic Acid-Schiff (PAS) ja counterstaining hematoksyliinillä. Serial leikkeet värjättiin PAS /AB, H 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

GPx2-KO hiiret kehittävät vähemmän AOM aiheuttama kasvaimet kuin WT hiiret Under Molemmat, seleeni-köyhä ja -supplemented ruokavalio

Kun ruokinta hiirillä -Se ja ++ Se ruokavalion, tyhjäsuolen ja maksan GPX aktiivisuus väheni huomattavasti ja lisäsi vastaavasti verrattuna + Se ryhmiin (Fig. 1 B). Korkeampi GPX aktiivisuus havaittiin tyhjäsuolessa GPx2-KO verrattuna WT hiiret ++ Se ruokavaliota (Fig. 1 B), oletettavasti aiheuttama korvaava säätely ylöspäin GPx1 kuten aikaisemmin on kuvattu sykkyräsuolen ja paksusuolen [20]. Suoliston lokalisointi GPx2 analysoitiin IHC paksusuolessa WT-hiirissä (Fig. S1A). GPx2 oli korkeimmillaan krypta emäksiä ja havaita ylempään kolmannes kryptissa. Samantasoista GPx2 proteiinia havaittiin paksusuolessa WT hiirien + Se ja ++ Se ruokavalion, kun taas GPx2 ilmentyminen alassäädetty on -Se ruokavalioita.

Jotta testata vaikutusta on GPx2- KO kasvainten kehitystä, hiiret altistettiin kuudesti AOM ja analysoitiin 16 viikkoa sen jälkeen, kun viimeinen AOM sovellus. Vaikka kasvaimen esiintymistiheys ei ollut merkitsevää eroa kokeelliset ryhmät, -Se ja ++ Se GPx2-KO hiirillä oli merkitsevästi pienempi kasvain numeroita kuin WT hiirillä samalle ruokavalion (Fig. 2A). Vaikka kasvain luvut oli pieni GPx2-KO hiiret riippumatta seleeni tila (-Se: 5, + Se: 5, ++ Se: 3), kasvain numerot WT hiirillä olivat korkeammat -Se ja ++ Se ryhmien kuin + Se ryhmä (-Se: 14 ja ++ Se: 13 vs. + Se: 7). Seleeni tila ei vaikuttanut merkitsevästi kasvaimen esiintymistiheys tai täydellinen kasvaimen numero. Kaikki kasvaimet ei-invasiivisia adenoomia sijaitsee päässä poikittaisen paksusuolen peräsuoleen [25].

16 viikkoa kuluttua viimeisestä AOM injektio WT ja GPx2-KO hiiret analysoitiin kasvaimen esiintymistiheys ja koko kasvaimen määrä per ryhmä ( A) ja ACF koostuvat 4 crypts (B) tai ≥4 crypts (C) metyleenisininen värjäystä. MDF (D) laskettiin HID /AB värjätään paksusuolen. ACF ja MDF numerot näkyvät hajottaa pistekuvioita keskiarvolla. Kasvaimen halkaisija on kuvattu laatikon ja viikset välillä min max (E). P-arvot (A) laskettiin Fisherin testiä. Voit testata merkitys koko kasvaimen määrä, kasvaininsidenssiä painotettu kasvaimen numero. P-arvot (B-E) laskettiin käyttämällä paritonta Studentin t-testiä. * P≤0.05 ja ** P≤0.01 vs. WT,

# P≤0.05 vs. -Se. Ei ACF, MDF: stä tai kasvaimia ei havaittu suolaliuoksella käsiteltyihin kontrolleihin (n = 10).

määrällisesti ACF ja MDF, jotka molemmat ovat kuten preneoplastiset markkereita [26]. Me eriytetään ACF alhaisella ( 4) ja korkea (≥4) krypta moninaisuus koska jälkimmäinen on tarkoitus olla parempi biomarkkeri kasvainten kehittymiseen kuin entinen [26]. Numerot ACF ei vaikuttanut seleenin ruokavalioita (Fig. 2B ja C). Vaikka -Se WT hiiret yleensä (p = 0,06) on vähemmän ACF alhainen krypta moninaisuus kuin vastaavat GPx2-KO hiirten (Fig. 2B), -Se WT hiirillä oli merkitsevästi enemmän ACF korkea krypta moninaisuus kuin GPx2-KO hiiret (kuvio . 2C). Olemme myös määrällisesti MDF, joille on ominaista muutokset solun koostumus crypt menetetään pikarisolujen. Toisin kuin ACF, MDF aina koostuvat dysplastisia kryptissa todennäköisesti kehittyy kasvaimia [26], [27]. Vain + Se WT hiirillä oli merkitsevästi enemmän MDF verrattuna GPx2-KO hiirten (Fig. 2D) taas -Se ja ++ Se WT hiirillä oli enemmän kasvaimia kuin GPx2-KO hiirten (Fig. 2A). Siten seleeni-riittävyyttä eroa genotyyppien vasta havaitaan MDF tasolla. Kasvain luvut olivat yhtä pieni sekä genotyypit alle + Se mikä saattaa sotkea että edellytykset kasvainten kehittymiseen olivat tarkoituksenmukaisempi -Se ja ++ Se WT ryhmiä.

Tuumorin läpimitta mitattiin muuttujana kasvaimen kasvua. GPx2-KO ja WT hiiret päälle -Se ja ++ Se ruokavalion oli samanlainen kasvaimen kokoa, kun taas kasvaimet olivat merkittävästi suurempia + Se GPx2-KO kuin + Se WT hiirillä (Kuva. 2E). ++ Se GPx2-KO hiirillä oli pienempi kasvaimia verrattuna -Se GPx2-KO hiirillä. WT ryhmät, ravinnon seleeniä ei merkittävästi vaikuttanut kasvaimen kokoa.

GPx2 ja β-kateniinin oli kohonneet esiuudiskasvuisissa Vauriot

GPx2 ilmentyminen lisääntyy varsinkin alkuvaiheessa neoplastisen transformaation ihmisen suolessa [6], joka saattaa välittyä β-kateniinin [7]. Sen testaamiseksi GPx2 ilmentyminen on myös lisääntynyt esiuudiskasvuisissa vauriot AOM-käsiteltyjen hiirten, GPx2 analysoitiin IHC in + Se WT hiirillä 16 viikkoa sen jälkeen, kun viimeinen AOM sovellus. PAS /AB värjäystä tunnistettu 67 MDF viisi hiirtä. Serial osat värjättiin β-kateniinin, GPx2, ja ki-67. p-kateniinin immunoreaktiivisuus kasvoi 85% (57/67) ja MDF verrattuna ympäröivään terveeseen kudokseen kanssa julkaistujen tietojen [27]. GPx2 immunoreaktiivisuus kasvoi 67% (45/67) ja MDF verrattuna normaaliin crypts.

MDF karakterisoitiin edelleen perustuu niiden grade dysplasia ja crypt moninaisuus onko GPx2 ja β-kateniinin kolokalisoituvat . MDF pieni luokka dysplasia oli lähes normaali krypta morfologia, alhainen useita, joitakin jäljellä pikarisoluja (Fig. 3A-I), ja normaali jakauma ki-67-positiivisia soluja (kuvio. 3A-IV). Nämä MDF esiintyi enemmän kalvo-lokalisoitu β-kateniinin, joka pääasiallisesti havaittiin luminal osassa (Fig. 3A-II sininen nuoli) krypta tai koko kryptissa verrattuna normaaliin crypts. GPx2 immunoreaktiivisuus hieman kasvoi krypta pohjan näiden MDF verrattuna normaaliin kryptat ja laajennetaan kohti luminaalipuolella (Fig. 3A-III musta nuoli). Siksi MDF pienin dysplasia GPx2 ja β-kateniinin ovat koholla eri epiteelisoluissa.

Serial IHC värjäys paksusuolen Sveitsin telojen suoritettiin PAS /AB, β-kateniinin, GPx2, ja ki-67 viisi + Se WT hiirillä 16 viikkoa sen jälkeen, kun viimeinen AOM-hoitoa (A-C). Edustavia värjäykset on MDF ominaista vähäinen luokan dysplasia ja pieni crypt moninaisuus (A), MDF kehittyneitä dysplasia ja suurempi moninaisuus (B), ja yksi microadenoma (C). Florid tulehduksen AOM-käsitelty, -Se GPx2-KO-hiiret tunnistettiin PAS /AB, F4 /80, ja H Fig. 4B ja C) -Se ja + Se GPx2- KO verrattuna WT hiirillä. Vain GPx2-KO hiirillä on suurempi määrä lisääntyvien solujen tällä alueella. Korkeammalla tyvi- ja AOM aiheuttaman apoptoosin GPx2-KO hiiret tarkoitus poistaa tehokkaasti AOM-aloitettu soluissa. WT hiirillä, dysplastisia kryptissa on ominaista lisääntynyt GPx2 tasot (Fig. 3A ja B), jotka oletettavasti tukahduttaa apoptoosin. In GPx2-KO dysplastic crypts parannetun nopeus apoptoosin voisi torjua pahanlaatuisia etenemistä. Näiden tulosten perusteella, GPx2 ilmeisesti pystyy parantamaan syövän kehittymisen estämällä apoptoosin, joka muutoin eliminoi vahingoittuneita tai transformoituja soluja.

Kasvaimen koon ja edistäminen

Yllättäen, kasvaimet olivat suurempia + Se GPx2- KO kuin WT hiirillä (Kuva. 2E). Tämä ei sovi pro-proliferatiivinen funktio GPx2 kuin oletettujen alkaen ksenograftimallia siRNA-välitteisen knockdovvn GPx2 [14] ja AOM /DSS-käsitellyn GPx2-KO hiiret [10], mikä olisi johtanut suurempien kasvaimia WT pikemminkin kuin GPx2-KO. Esillä olevassa tutkimuksessa, kasvaimen koko oli yhtä -Se ja + Se GPx2-KO hiiret ja laski merkittävästi ++ Se (Fig. 2E). Tämä korreloi määrä soluttautunut tulehdussolujen (Fig. 6) käsittelemättömän GPx2-KO paksusuoli, joka oli vain lisääntynyt -Se ja + Se ei kuitenkaan ++ Se GPx2-KO verrattuna WT hiirillä. Joilta puuttuu sekä GPx1 ja GPx2 kehittävät spontaanisti ileocolitis [11] ja DSS-indusoidun koliitin on vakavampi hiirissä, joilta puuttuu GPx2 [10]. Tässä osoitamme, että kiistämätön GPx2-KO-hiiret on matala-asteista koliitti, tunnettu siitä, että pernan paino (kuvio. 3E), tulehdussolujen (Fig. 6), ja crypt venymä (Fig. 5A). Lisäksi plasman TNFa-tasot olivat lisääntyneet + Se GPx2-KO hiiret (julkaisematon havainto).