Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Notch signalointi on osallisena monenlaisia ​​syöpiä, mukaan lukien suun okasolusyöpää ( OSCCs). Kuitenkin rooli Notch signaloinnin kasvaimen mikroympäristössä ei ole vielä täysin ymmärretty. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet roolit NOTCH3 signaloinnin liittyvän syövän fibroblasteissa (valuuttalisiin) in OSCCs. Immunohistokemiallinen tutkimus 93 ihmisen kielen OSCC tapaukset osoittivat, että noin kolmannes OSCCs osoitti NOTCH3 ilmentymistä valuuttalisiin, ja että tämä ilmaus korreloi merkitsevästi kasvaimen koon. In vitro -tutkimus osoitti, että OSCC solulinjat, erityisesti HO1-N-1-soluja stimuloitiin NOTCH3 ilmentyminen normaaleissa ihmisen ihon fibroblasteissa (NHDFs) suoraan solu-solu kosketukseen. Immunohistokemiallinen ja morfometrisiin analyysillä käyttäen ihmisen OSCC näytteet osoittivat, että NOTCH3 ilmaisun valuuttalisiin korreloi merkitsevästi mikro-suonitiheys syövän strooman. In vitro angiogeneesi määrityksissä, joihin liittyy yhteistyötä kulttuurin NHDFs kanssa HO1-N-1 ja ihmisen napanuoran endoteelisoluja (HUVEC), ja NOTCH3 knockdown in NHDFs käyttämällä siRNA, osoittivat, että HO1-N-1-soluissa merkittävästi edistänyt putken muodostumiseen riippuu NOTCH3-ilmaisun in NHDFs. Lisäksi NOTCH3 ilmentyminen valuuttalisiin liittyi huonoon ennusteeseen on OSCC potilaista. Tämä työ tarjoaa uuden käsityksen rooliin Notch signaloinnin valuuttalisiin liittyy kasvaimen angiogeneesiin ja mahdollisuus NOTCH3 kohdistettujen molekyyli hoidon OSCCs.

Citation: Kayamori K, Katsube Ki, Sakamoto K, Ohyama Y, Hirai H, Yukimori A, et al. (2016) NOTCH3 indusoidaan Cancer-Associated fibroblasteja ja edistää angiogeneesiä in Oral Okasolusyöpä. PLoS ONE 11 (4): e0154112. doi: 10,1371 /journal.pone.0154112

Editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Tutkimuskeskus, Saudi-Arabia

vastaanotettu: 28 joulukuu 2015; Hyväksytty: 09 huhtikuu 2016; Julkaistu: 28 huhtikuu 2016

Copyright: © 2016 Kayamori et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Tietopaketti.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Japan Society for Promotion of Science: Grant-in-tukea nuorten tutkijoiden (B) (KAKENHI 26861543 on Kou Kayamori ) ja tieteellisen tutkimuksen (C) (20233760 Ken-ichi Katsube). Tätä työtä tukee myös Japanin Society for Promotion of Science: Grant-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (A) (KAKENHI 25253098 Akira Yamaguchi).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia edut ovat olemassa.

Johdanto

Pään ja kaulan alueen syöpä on peräisin ylemmästä aerodigestive suolikanavan lukien nenäontelon, sivuonteloiden, suuontelon, nielun ja kurkunpään. Histopatologisesti hallitseva maligniteetti pään ja kaulan alueen syöpä on okasolusyöpä (SCC).

Suun SCC (OSCC) on yleisin pään ja kaulan alueen syöpä. Mukaan viimeaikaisten GLOBOCAN arvioiden noin 300.000 uudella huuli /suuontelon syöpä potilailla diagnosoitiin vuonna 2012 maailmanlaajuisesti [1]. 5 vuoden eloonjäämisaste OSCC potilaiden yhä kerrallaan 40: sta 60% [2, 3]. Investigation molekyylitason mekanismi, joka säätelee pahanlaatuinen käyttäytymistä OSCC tarvitaan kehittämiseen hoitomenetelmät ja parantamiseen heikkoon ennusteeseen.

Syöpä strooman muodostuu erilaisten solujen, kuten fibroblastit, immuunisolujen, perisyyteissä ja endoteelin solut. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että nämä solut ja niiden tuotteet luo asianmukaiset mikroympäristöihin syövän leviämisen, invaasio, angiogeneesi, etäpesäke, ja chemoresistance [4, 5]. Erityisesti syöpään liittyvä fibroblasteja (valuuttalisiin), jotka ovat tärkeimmät syövän strooman komponentteja, on ratkaiseva merkitys syövän etenemisen erityyppisiä syöpiä [6]. Niiden alkuperä on ajateltu olevan joko kudosta asuva fibroblastit, mesenkymaaliset kantasolut rekrytoidaan luuytimestä tai syöpäsolut koki epiteelin-mesenkymaalitransitioon [7]. Useissa tutkimuksissa on raportoitu, että valuuttalisiin stimuloivat syöpäsoluinvaasiota [8-10] tai lisääntymistä [11] ja korreloi huonon ennusteen OSCCs [12, 13].

Notch signalointi on evoluutiossa konservoitunut, joka säätelee solujen lisääntymistä , apoptoosin ja erilaistumisen [14]. Notch signalointi aloitetaan sitomalla Notch-ligandi-reseptori, joka välittää solu-solu kosketukseen. Ihmisillä on neljä reseptorien (NOTCH1-4), ja viisi ligandit (JAGGED1, 2 ja DLL1, 3 ja 4). Ligandin sitoutuminen reseptoriinsa johtaa lohkominen ja vapautumisen solunsisäisen domeenin loven reseptorin (NICD). NICD translokoituu solukalvolta tumaan, joka aloittaa transkription loven kohdegeenien [15]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että dysregulaatio Notch signalointi on osallisena erilaisia ​​sairauksia, mukaan lukien erilaisia ​​syöpiä [16, 17]. Korjauksilla Notch signalointi syöpäsoluissa sisältävät voitto tai toimintakyvyn menetystä mutaatioita, ja reseptori /ligandi yliekspressio [18]. Olemme aiemmin osoittaneet Notch1 downregulation syöpäsoluissa in OSCC microarray ja immunohistokemiallisella -tutkimukset ihmisen OSCC näytteitä [19], ja viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Notch1 toimii tuumorisuppressori OSCC synnyssä [20-22].

Vaikka sekä valuuttalisiin ja Notch signalointi on tärkeä rooli syövän etenemisen Notch signaloinnin valuuttalisiin, toisin kuin syöpäsoluihin, ja sen osuutta pahanlaatuinen käyttäytyminen ei ole täysin selvitetty. NOTCH3 on fysiologisesti ilmaistaan ​​sileän lihaksen solujen pienissä valtimoissa ja säätelee erilaistumisen ja kypsymisen näissä soluissa. Loss-of-function mutaation NOTCH3 on osoitettu aiheuttavan aivojen autosomaalinen hallitseva valtimotauti kanssa subkortikaalinen infarktien ja leukoenkefalopatia (CADSIL), joka on ominaista rappeutumista tai menetyksestä sileän lihaksen soluissa median paksuuntuminen verisuonen seinämän ja talletukset rakeinen osmiofiilisen materiaalit (GOM) lähellä solun pinnalle sileän lihaksen soluissa tai perisyyteissä [23]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että NOTCH3 indusoidaan fibroblastien suoraan solu-solu-kontaktissa HUVEC ja edistää aluksen muodostumisen [24, 25]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että NOTCH3 on keskeinen merkitys angiogeneesin säätelyyn.

Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet analyysiin NOTCH3 vuonna valuuttalisiin tutkia sen osuus OSCC etenemistä. Osoitimme NOTCH3 ilmentymistä valuuttalisiin immunohistokemiallisen tutkimuksen näytteitä 93 tapauksissa ihmisen kielen OSCC ja havaitsi, että NOTCH3-positiiviset valuuttalisiin edistää kasvaimen angiogeneesiä, kun läsnä on eri syöpäsolulinjoissa

in vitro

. Lisäksi tämä NOTCH3 induktio valuuttalisiin korreloi huonon säilymisen OSCC potilaista. Nämä tulokset viittaavat siihen, hyödyllisyyttä NOTCH3 kohdistettujen molekyyli hoidon OSCCs.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

Ensisijainen kieli okasolusyöpä näytteet kerättiin 93 potilasta, joilla oli käsitelty klo Dental sairaalan Tokion Lääketieteen ja hammaslääketieteen University. Yhdeksän ensisijainen ikenen SCC, 10 poskeen SCC ja 9 SCC lattian suun kerättiin myös. Kaikki fiksoitiin 10% neutraaleja puskuroituun formaliiniin ja upotettiin parafiiniin mukaan laboratorion protokollia. Kaikki kokeelliset menetelmät suoritettiin mukaisesti muutetun Helsingin julistuksen ja hyväksynyt eettinen komitea Tokion Lääketieteen ja hammaslääketieteen University (Registry nro 1063). Käytimme kirurgisesti resektoitiin, formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin upotetut ihmisen OSCC kudosten immunohistokemiallisella tutkimuksessa. Vaikka kirjallinen suostumus ei saatu potilaista, eettinen komitea hyväksyi luopumista tietyn tietoisen suostumuksensa mukaisesti muutettu eettisiä ohjeita Kliiniset tutkimukset tarjoamat terveys-, Labour and Welfare of Japan (31 heinäkuu 2008). Tämä tutkimussuunnitelma on esitetty julisteen muodossa poliklinikalla suun kirurgian osasto varmistaa, että potilaalla oli mahdollisuus kieltäytyä tutkimuskäyttöön niiden patologisten näytteiden, mikä korvaa kirjallinen tietoon perustuvan suostumuksen eettinen komitea hyväksyi tämän lupamenettelyssä.

immunovärjäys

immunohistokemiallisella värjäyksellä, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut ihmisen OSCC kudosleikkeiden käytettiin. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat seuraavat: anti-NOTCH3, kanin polyklonaalinen, 1: 200 (ab23426, Abcam, CA, USA); anti-SMA, hiiri monoklonaalinen, 1: 100 (M0851, Dako, Glostrup, Ruotsi). Antigeeni haku suoritettiin valmistajan protokollan. EnVision + Dual Link (Dako) käytettiin sekundaarista vasta-ainetta, ja värjäytyminen suoritettiin diamino-bentsidiinin alustaan. For immunofluore- kaksinkertainen värjäys anti-NOTCH3, 1: 200 (Abcam), SMA, 1: 100 (hiiren monoklonaalinen, M0851, Dako tai kanin monoklonaalisia, Clone SP171, Spring Bioscinece, CA, USA), CD34: ää, 1: 100 ( hiiren monoklonaalinen, NCL-L-END, Leica Biosystems, Wetzlar, Saksa) ja sytokeratiinivasta, 1: 100 (hiiren monoklonaalinen, Clone AE1 /AE3, M3515, Dako) käytettiin ensisijaisena vasta-aine. Antigeenin haku, leikkeet käsiteltiin Tris-puskuria (pH = 7,4), joka sisälsi 0,1 mg /ml trypsiiniä 30 min ajan 37 ° C: ssa CD34-vasta-aine. Alexa Fluor 488 vuohen anti-kani-IgG (A11008, Invitrogen, CA, USA) ja Alexa Fluor 594 vuohen anti-hiiri-IgG (A11005, Invitrogen) käytettiin sekundaarisena vasta-aineena. DAPI käytettiin tumavärjäystä. Immunofluoroscent kuvat otettiin kiinni ja analysoitiin Axioskop2 plus mikroskooppia (Carl Zeiss, Jena, Saksa).

arviointi immunohistokemiallinen analyysit

Immuunihistokemialliset tulokset NOTCH3 ja α-SMA arvioitiin perustuen värjäytymisen intensiteetti ja osuus positiivisten fibroblastisia solujen syövän strooman kahdella patologit ilman aiempaa tietoa potilaan kliinis tiedot. Värjäytymisintensiteettiä jaettiin neljään ryhmään: negatiivinen, heikko, kohtalainen ja vahva. Tapaukset, joilla on kohtalainen tai voimakas intensiteetti yli 30% fibroblastien syövän strooman katsottiin positiivisiksi ilmaisun kunkin proteiinin.

Cell Culture

Seuraavat kahdeksan pään ja niskan levy- cell carcinoma solulinjoja, HO1-N-1, SAS, BHY, Ca9-22, HSC3, HSC4, HSC5 ja SKN3 käytettiin. Nämä linjat olivat peräisin suuontelon paitsi HSC5, joka oli peräisin poskiontelon. Kuusi syövän solulinjat ovat peräisin ei-suun haavaumat, HeLa alkaen kohdunkaulan SCC, A549 alkaen keuhkoadenokarsinooma, MCF-7 rinta- adenokarsinooma, MKN74 mahalaukun adenokarsinoomaa, HCT-15 paksusuolen adenokarsinooma ja Panc-1 haiman adenokarsinooma, olivat käytetään myös. Kaikki syöpäsolulinjat viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [26]. HO1-N-1, SAS, Ca9-22, HSC3 ja HSC5, ja SKN3 ostettiin Japani Collection of Research Bioresources (Osaka, Japani). BHY saatiin tohtori Masato Okamoto (TELLA Inc, Tokio, Japani). HSC4 perustettiin tohtori Momose departementissa suu- ja leukakirurgian Tokiossa Lääketieteen ja hammaslääketieteen yliopiston kuvattua edellisessä raportissa [27]. Pancin-1 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC). HeLa, A549, MKN74 ja HCT-15 hankittiin RIKEN Bioresource Center (Tsukuba, Japani). MCF-7 tarjosi Cell Resource Center for Biomedical Research (Tohoku University, Miyagi, Japani). Ensisijainen normaalin ihmisen ihon fibroblasteista (NHDFs) aikuiselta luovuttajalta ostettiin Promocell (C-12302, Heidelberg, Saksa) ja ensisijainen ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) ostettiin Lonza (CC-2517, Tokio, Japani).

yhteisviljelmä analyysit syöpäsolujen ja NHDFs

NHDFs (5 x 10

4 solua /kuoppa) ympättiin 24-kuoppalevyille, niitä inkuboitiin Fibroblast Growth Medium 2 Kit (C-23120 , Promocell) 48 tuntia, ja sitten viljellään eri syöpäsolulinjoissa (5 x 10

3 solua /kuoppa) inkuboimalla α-MEM 72h. Tämän jälkeen NHDFs eristettiin käyttäen seuraavaa menetelmää ja arvioitiin käyttäen reaaliaikaista PCR-analyysiä. Western blot -analyysiä varten, NHDFs (20 x 10

5 solua /kuoppa) ja syöpäsolulinjoissa (2 x 10

4 solua /kuoppa) viljeltiin yhdessä käyttäen 6-kuoppaisilla levyillä.

NHDF eristäminen alkaen keraviljelmiin

NHDFs eristettiin keraviljelmien käyttämällä magneettista aktivoitua solun erottelua (MACS), jossa antifibroblastimikrohelmiä (130-050-601, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) ja MS-pylvääseen ( 130-042-201, Miltenyi Biotec) mukaisesti valmistajan protokollan.

siRNA transfektio

Ennen yhteisviljelmä, NHDFs transfektoitiin siRNA: lla ihmisen NOTCH3 käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. Stealth siRNA ihmisen NOTCH3 ostettiin Invitrogen. Sekvenssi plus-juosteen dsRNA oli 5′-UCAAUGCUGUGGAUGAGCUUGGGAA-3 ’.

pienten suonten Arviointi

mikroverisuonitiheys (MVD) ihmisen OSCC näytteiden osalta laskettiin kahden ryhmän, SMA (+) NOTCH3 (-) valuuttalisiin ryhmä ja SMA (+) NOTCH3 (+) valuuttalisien ryhmä. Käyttämällä kaksinkertaisen immunofluoresenssivärjäyksellä SMA tai NOTCH3 ja CD34, CD34-positiivisten pienten alusten SMA (+) fibroblastisia syöpä strooman arvioitiin entisessä ryhmässä, ja CD34-positiivisten pienten alusten NOTCH3 (+) fibroblastisia syövän strooman laskettiin jälkimmäisessä ryhmässä. Ennen laskemalla mikroverisuonten, me tutki ensin kunkin osan alhaisella teholla suurennus tunnistamaan alueella korkein mikroverisuonitiheys, ja valittu kolme kenttää kussakin tapauksessa. Kolme micrographs suurella suurennuksella (x 200) tehtiin. CD34-positiivisten pieniä aluksia laskettiin ja SMA (+) /NOTCH3 (+) fibroblastisia ala analysoitiin kvantitatiivisesti käyttämällä Axioskop2 plus mikroskoopilla ja AxioVsion suht 4.8 ohjelmisto (Zeiss). Kokonaismäärät CD34-positiivisten mikrosuonten per yhteensä kvantitatiivisesti SMA (+) /NOTCH3 (+) fibroblastisia alueen kolmen kuvan laskettiin ja määriteltiin MVD tapauskohtaisesti.

In vitro angiogeneesimääritys

in vitro

endoteelin-fibroblastien organotyyppisen yhteisviljelmä määritys modifioitiin aikaisemmin raportoitu [28]. Ensimmäinen (päivä 0), NHDFs ympättiin 24-kuoppaisille levyille (5,0 x 10

4 solua /kuoppa) ja viljeltiin Fibroblast Growth Medium 48 tunnin ajan. Sitten, siRNA ihmisen NOTCH3 transfektoitiin NHDFs mukaisesti edellä kuvatun menetelmän. Seuraavana päivänä (päivä 3), HO1-N-1 tai A549 syöpäsolujen (6,0 x 10

3 solua /kuoppa) ja HUVEC-soluja (3,0 x 10

4 solua /kuoppa) viljeltiin yhdessä kanssa siRNA käsitelty NHDFs endoteelisolujen kasvualusta. Elatusaine vaihdettiin joka toinen päivä. Päivänä 9, solut kiinnitettiin ja immunohistokemiallisesti käsitelty anti-CD31-vasta-ainetta (hiiren monoklonaalinen, 1: 100, NCL-CD31-1A10, Leica Biosystems, Newcastle, UK) ja alkalinen fosfataasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (WP20006, Invitrogen) ja signaali tehtiin näkyväksi käyttämällä BCIP /NBT alustan (11-681-45-001, Roche). Viisi valokuva kuvia korkein CD31-positiivisia kapillaariverkon kussakin kaivossa oli vangiksi käyttämällä käännettyä mikroskooppia (ECLIPSE TS100, Nikon, Tokio, Japani). CD31-positiivinen kapillaariverkon alue analysoitiin kvantitatiivisesti käyttäen NIH image J ohjelmisto.

vaikutus NOTCH3 soluproliferaatioon

vaikutuksen tutkimiseksi NOTCH3 on OSCC solulinjassa lisääntymistä, HO1-N- 1 ympättiin (2,0 x 10

3 solua /kuoppa) päälle 96-kuoppalevylle, joka on päällystetty ihmisen rekombinantti NOTCH3 Fc-kimeeran (R 0,05, **

P

0.01.

NOTCH3 ilmoitettuna valuuttalisiin angiogeneesiä säätelevän

Immuunihistokemialliset Tutkimuksessa käytettiin ihmisen OSCC näytteet osoittivat, että NOTCH3 ilmaisun valuuttalisiin korreloi merkitsevästi T-vaiheen (kasvaimen koko). Tämä tulos viittaa siihen, että NOTCH3-positiivisten valuuttalisiin edistää kasvaimen kasvua stimuloimalla kasvainsoluproliferaation ja /tai parantamalla angiogeneesiä. Tutkimaan näitä mahdollisuuksia, ensin suorittanut

in vitro

solulisäkasvumääritykselle käyttäen HO1-N-1-soluissa, mikä ilmaisee NOTCH ligandin JAG1 määritettynä Western-blottauksella (kuvio 3A). Hoito ihmisen rekombinantti NOTCH3-Fc /kimeeran, joka voi sitoutua sen ligandin, JAG1, ei vaikuttanut HO1-N-1 proliferaatiota (kuvio 3B).

: JAGGED1 ilmentymistä erilaisissa suun syöpäsolulinjoissa analysoitiin Western blot. B: vaikutus NOTCH3 soluproliferaatioon. Leviämisen HO1-N-1-solujen kanssa tai ilman ihmisen rekombinantti NOTCH3-Fc-kimeeran hoitoa seurattiin 72 tuntia.

Seuraavaksi teimme kaksinkertainen immunofluoresenssivärjäyksellä of NOTCH3 ja CD34 (merkki endoteelisolujen ), voiko NOTCH3 ilmentymisen valuuttalisiin liittyy tiheys verisuonten ihmisen kielen OSCC näytteitä. Mikro-aluksen tiheys kasvaimen invasiivista alue oli merkittävästi lisääntynyt NOTCH3 (+) valuuttalisiin ryhmässä verrattuna NOTCH3 (-) valuuttalisiin ryhmä (kuvio 4A ja 4B). Tämä tulos viittasi siihen, että NOTCH3 (+) valuuttalisiin edistää angiogeneesiä. Jotta voitaisiin edelleen tutkia mekanismia tällaisen angiogeneesin, teimme organotyyppisen angiogeneesimääritys by coculturing HO1-N-1-soluissa, HUVEC ja NHDFs onko OSCC aiheuttama NOTCH3 in NHDFs helpottaa astian muodostumisen. Immunofluoresenssivärjäyksellä Tämän yhteistyön kulttuuri oli CD31-positiivisen meshwork muodostama HUVEC ja NOTCH3-positiivisia NHDFs ympäri syöpäsolun pesät (kuvio 4C). Western blot-analyysi osoitti, että NHDFs viljellään kanssa HUVEC yksin, ilman HO1-N-1-solut osoittivat NOTCH3 induktion verrattuna kontrolliin NHDFs. Huomattavasti suuremmat NOTCH3 ilmentymisen havaittiin NHDFs että viljeltiin yhdessä kanssa HUVEC yhdessä HO1-N-1-soluissa (kuvio 4D). Arvioida putken muodostumiseen tässä määrityksessä, me visualisoitiin CD31-positiivisten solujen immunovärjäyksellä. Verrattuna kontrolliryhmään, CD31-positiiviset putken muodostumisen HUVEC läsnäollessa NHDFs ja ohjaus siRNA kasvatti merkittävästi rinnakkaisviljelemällä HO1-N-1. Tämä putken muodostumiseen merkittävästi tukahdutti kun NHDFs transfektoitiin SiN3 (kuvio 4E ja 4F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että OSCCs edistää angiogeneesiä indusoimalla NOTCH3 ekspression valuuttalisiin.

A ja B: vertailu mikroverisuonitiheys (MVD) välillä NOTCH3 (-) valuuttalisiin ja NOTCH3 (+) valuuttalisien tapauksissa. Immunofluorostaining ja α-SMA (vihreä), NOTCH3 (vihreä) ja CD34 (punainen) käyttäen ihmisen kielen OSCC näytteitä. Ca, syöpä pesiä. Pisteviivat osoitti rajapintaan syövän pesiä ja strooman. Nuolet osoitti CD34-positiivinen pienten suonten. Mittakaava, 50 um. Tumat vastavärjättiin mukaan DAPI (A). Määrällinen arviointi MVD näiden kahden ryhmän (B). C-F:

In vitro

angiogeneesimääritys viljellään kanssa HO1-N-1-soluissa, HUVEC ja siRNA transfektoitujen NHDFs. Immunofluorostaining for NOTCH3 (vihreä) ja CD31 (punainen). Ca, HO1-N-1 syöpä pesiä. Pisteviivat osoittavat marginaali HO1-N-1 syöpä pesiä. Mittakaava, 100 um. Tumat vastavärjättiin mukaan DAPI (C). NHDFs eristettiin tästä yhteisviljelmä tehtiin Western blot (D). Edustavia kuva putken muodostumisen HUVEC jokaisessa kunnossa. Mittakaava, 100 um (E). Kvantitatiivinen arviointi putken muodostumiseen alueen (CD31-positiivinen alue) kunkin ehdon (F). siCtrl, negatiivinen kontrolli siRNA. Sin3, siRNA varten NOTCH3. **

P

0,01.

Sen tutkimiseksi, NOTCH3 induktio fibroblasteissa on ainutlaatuinen ominaisuus OSCCs, me viljellään NHDFs solulinjoihin, jotka ovat peräisin syöpää eri elimissä, mukaan lukien kohdunkaulan, keuhko-, rinta-, vatsa-, paksusuoli-, ja haima. Western blotting -analyysi osoitti, että A549-soluja, jotka ovat keuhkojen adenokarsinooma solulinja, stimuloi ekspressiota NOTCH3 on NHDFs tasolle, joka oli samanlainen kuin se, minkä indusoivat HO1-N-1 (kuvio 5A).

in vitro

angiogeneesimääritys osoittivat, että A549-soluja merkittävästi indusoi putki muodostuminen HUVEC kun viljeltiin yhdessä NHDFs ja että tämä meshwork heikkeni huomattavasti NOTCH3 taintumisen vuonna NHDFs (kuvio 5B ja 5C). Western blot-analyysi NHDFs eristetty angiogeneesimääritys osoittivat samanlaisia ​​tuloksia, jotka saatiin, kun NHDFs viljellään kanssa HUVEC ja HO1-N-1 analysoitiin (kuvio 5D). Nämä tulokset osoittavat, että syöpäsoluja, muut kuin OSCC voivat aiheuttaa NOTCH3 in valuuttalisiin ja edistää angiogeneesiä.

: NHDFs viljeltiin yhdessä eri syöpäsolulinjoissa, jotka ovat peräisin ei-suun haavaumia. 3 päivää sen jälkeen, kun yhteisviljelmä, NHDFS eristettiin tästä yhteisviljelmä ja altistettiin Western blot-analyysi havaitsemiseksi NOTCH3 ja α-SMA. B-D: In vitro angiogeneesimääritys viljellään A549, HUVEC ja siRNA transfektoitujen NHDFs. Edustavat kuvat putken muodostumiseen (B) ja sen määrällinen arviointi (C) kussakin kunnossa.