Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka monelle vastus liittyvä proteiini-1 (MRP1) on merkittävä tekijä monilääkeaineresistenssi ( MDR), sääntelyn mekanismi MRP1 edelleen epäselvä. Nrf2 on transkriptiotekijä, joka säätelee solun puolustusmekanismit vaste antioksidantti vaste-elementit (ARE:) normaaleissa kudoksissa. Viime aikoina Nrf2 on tullut tärkeä tekijä kemoterapian resistenssin tuumorikudoksissa. Esillä olevassa tutkimuksessa, rooli Nrf2-ARE reitin sääntelystä MRP1 tutkittiin. Verrattuna H69 keuhkosyöpään solut, H69AR solut MDR osoittivat merkittävästi korkeampi Nrf2-ARE signalointia ja ilmaus MRP1 samoin. Kun Nrf2 pudotettiin vuonna H69AR soluissa, MRP1 ilme pieneni vastaavasti. Lisäksi nämä H69AR solut alennettu Nrf2 taso palautettu herkkyys chemo huumeiden. Tutkia, miten Nrf2-ARE reitin säätelee MRP1, promoottori MRP1 geenin etsittiin, ja kahden mahdollisen ARE-ARE1 ja ARE2-löytynyt. Käyttämällä reportterigeenin ja siru määritys, sekä ARE1 ja ARE2 osoitti vaste ja vuorovaikutusta Nrf2. 40 syöpätapauksia kudoksissa, ilmaus Nrf2 ja MRP1 mitattiin immunohistokemiallinen (IHC). Koska määrällisestä tiedot IHC osoitti, sekä Nrf2 ja MRP1 osoittivat merkittävästi korkeampi ilmentyminen kasvainkudoksessa kuin viereisen ei-kasvainkudoksessa. Ja tärkeämpää, korrelaatio analyysi kahden geenin osoittaneet, että niiden ilme oli korrelatiivisten. Yhdessä opinnäytetyöt tiedot osoittivat, että Nrf2-ARE koulutusjakson tarvitaan sääntelyä ilmaus MRP1 ja sekaantunut Nrf2 uutena terapeuttisena kohteena MDR.

Citation: Ji L, Li H, Gao P, Shang G, Zhang DD Zhang N, et al. (2013) Nrf2 Pathway Säätelee Moniresistenssi-Resistance-Associated Protein 1 pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (5): e63404. doi: 10,1371 /journal.pone.0063404

Editor: Oliver Eickelberg, Helmholtz Zentrum München /Ludwig-Maximilians-University Munich, Saksa

vastaanotettu: 03 helmikuu 2013; Hyväksytty: 02 huhtikuu 2013; Julkaistu: 7. 2013

Copyright: © 2013 Ji et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoitus tiede- ja teknologianeuvoston komissiolle Shanghai kunta (11ZR1402400 TJ), https://www.stcsm.gov.cn/structure/index.htm; National Natural Science Foundation of China (30900538 HL), https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm; National Institute of Environmental Health (2R01 ES015010 ja Ddz), https://www.niehs.nih.gov/; ja National Cancer Institute (R01 CA154377 on Ddz), https://www.nci.cu.edu.eg/. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

moniresistenssin (MDR) on merkittävä este hoidossa pahanlaatuinen syöpä. Se on ilmiö, jossa syöpäsolut esiintyy alentunut herkkyys suuri joukko liity lääkkeiden eri mekanismien farmakologinen aktiivisuus esiintyy se sitten ensisijainen hoito (luontainen) tai hankitaan aikana tai sen jälkeen [1]. Mekanistisesti vastus ilmiöt voidaan selittää lukuisia seikkoja, jotka olivat vähentyneet lääkeaineen kertymistä johtuen yli-ilmentyminen liikenteen proteiinien lisääntynyt vieroitus, muuttunut tavoitteet ja heikentynyt apoptoosireitin [2]. Yksi laajimmin tutkittu osa MDR on vähentää solunsisäisen lääkeaineen kertymistä, jossa ATP: n sitoutuminen kasetin (ABC) kuljettajat ilmaistaan ​​solukalvon ovat tunnettuja välittäjäaineita MDR [3].

Multidrug-resistenssiin liittyvien proteints (MRPs) kuuluvat subfamily C ABC transporter superperheen (Abcc). Ihmisellä MRP perhe koostuu useista jäsenistä (MRP1-MRP9), joista MRP1 on erittäin tärkeä rooli MDR. Yhtenä lääkkeen kuljettamiseen Abcc proteiineja, MRP1 kloonattiin ensin voimakkaasti yli-ilmennetään doksorubisiini valittu monilääkeresistenttiä ihmisen keuhkokarsinoomasolulinja H69AR [4]. Kasvainsoluissa, 190 kDa: n MRP1 voi resistenssin paitsi doksorubisiini, mutta myös monet muut laajasti käytetty antineoplastinen lääkeaine, kuten metotreksaatti (MTX), daunorubisiini, vinkristiini ja etoposidi [5].

Vaikka MRP1 on nousi tärkeä tekijä chemoresistance, molekyylitason mekanismi induktioon MRP1 ei ole selvitetty. Useat säätelyelementtejä on jo tunnistettu valvoa ilmaisun ja indusoituvuus MRPs [6], [7], [8]. Kuitenkin on huomattavaa näyttöä siitä, että osoittaa induktio vaiheen II entsyymien ja MRPs on samanlainen. [9], [10], [11]. Koska induktio toisen vaiheen entsyymien pääasiassa välittyvät antioksidantti vaste elementtejä (ARE tai EpREs) [12], se ehdottaa, että todennäköisin ehdokas yhdenmukaistettua sääntelyä ilmentymisen MRPs on myös OVAT [13], joka on yhteinen 5 ”- (G /A) TGACnnnGC (G./A) -3” motiivi [14]. Äskettäin hiiren MRP2 [15], [16], Mrp3 ja Mrp4 geeni [16], OVAT kaltaiset sekvenssit tunnistettiin, mikä viittaa mahdolliseen rooliin ARE motiivin sääntelyn ilmaus MRP1. Esimerkiksi sekä γ-GCS, tunnettu antioksidantti entsyymin ja MRP1 kaikki aiheuttama oksidatiivinen stressi [17]. Se osoitti, että ilmentyminen MRP1 voi olla ajan säätelee redox-aktiiviset yhdisteet, kversetiini MCF-7-solujen [18]. Kuitenkin edelleen reportterigeenimäärityksessä osoitti, että ehdokas ARE motiivi sijaitsee proksimaalisen promoottorin MRP1 geenin näytti olevan merkitystä induktioon. Myöhemmin, oletetun ARE /AP-1-sitoutumiskohdan -511–477 ylävirtaan transkription aloituskohdasta ihmisen MRP1 geeni tunnistettiin ja toimivat transkription tehostaja [19]. Kuitenkaan vieläkään eivät välittäneet induktio lusiferaasireportterigeeniin upon β-naphthoflavone hoitoa, mikä viittaa siihen, että siellä saattaa toinen ARE (t) on olemassa [19]. Vaikka tutkimuksessa käyttäen Nrf2 villityypin ja hiiressä alkion fibroblasteissa vahvisti, että Nrf2 tarvitaan konstitutiiviset ja indusoituvat ilmentymistä MRP1 [20], miten Nrf2 välittää transkriptionaalista aktivaatiota MRP1 jää epäselväksi, koska tarkka ARE (t) ei tunnistettu vielä.

Nrf2 tunnistettiin tärkeimmät transkriptiotekijä, joka välittää ARE-jentymisen [12]. Se säätelee antioksidantti vastausta tuomalla geenien ilmentymistä, joilla on Maailman ARE niiden säätelyalueita, kuten NQO1, GCS, ja HO-1 [21], [22], [23], se säätelee negatiivisesti Kelch kaltainen ECH -associated proteiini 1 (KEAP 1), substraatti adapteri Cul3 riippuvan E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkaisia ​​[24]. Aktivointi Nrf2 reitin säveltää matkapuhelinverkon suojaava järjestelmä, joka edistää solujen eloonjäämistä alle haitallisia ympäristöissä [25], [26]. Kuitenkin viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että konstitutiivisesti korkeatasoinen Nrf2 edistää syövän muodostumisen ja edistää chemoresistance [27], [28], [29], [30], joka on nimeltään pimeä puoli Nrf2 reitin. Down sääntely Nrf2 herkistää solujen kemoterapia-aineiden, kun taas ylös sääntely lisää vastustusta eri syöpäsolujen [31], [32], [33], [34]. Edelleen tukemiseksi rooli Nrf2 on chemoresistance, ilmaus Nrf2 syöpäsoluissa on lisääntynyt hankinnan aikana lääkeresistenssin [35], [36]. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että Nrf2 edistää chemoresistance havaittu monissa syöpätyypeissä. Kuitenkin miten Nrf2 pelaa tällainen rooli on edelleen tuntematon. Esimerkiksi joka molekyyli, joka on tiukasti säännelty Nrf2 koulutusjakson vastaa chemoresistance? On MRP1 yksi ehdokkaista?

Tässä tutkimuksessa selvitettiin säätelevä rooli Nrf2 on MRP1 ilmaisua paitsi viljellyissä solutasolla, vaan myös syöpäpotilaiden ”kudosta. Olemme osoittaneet, MRP1 on yksi Nrf2: n alavirran geenien, kuten vahvistettiin kaksi motiivia promoottorialueen MRP1 geenin. Lisäksi on olemassa suuri korrelaatio MRP1 ja Nrf2 ilmentymistä eri pahanlaatuisia kasvaimia. Sanalla, kun yhä enemmän huomiota kiinnitettiin rooliin Nrf2 vuonna chemoresistance, meidän tutkimus osoitti yksityiskohtaisia ​​mekanismi, miten Nrf2 pelaa negatiivinen rooli.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausuma

Lupa käyttää kudosleikkeiden tutkimustarkoituksiin saatiin ja hyväksynyt eettinen komitea Shanghaista Medical College, Fudanin yliopiston Kiinassa, ja kirjallinen suostumus lomake saatiin kaikista potilaista.

reagenssit

Polyklonaalisia vasta-aineita, mukaan lukien anti-Nrf2, MRP1, MRP2, Tubulin, β-aktiini ostettiin kaikki Santa Cruz Inc. (CA, USA). Tert-butyylihydrokinoni (TBHQ), sulforaphane (SFN) ja kaikki kemikaaleja kuten sisplatiini, doksorubisiini ja etoposidi olivat ostettavissa Sigma Co. (St. Louis, MO, USA). Dual-Luciferase Reporter Assay System hankittiin Promega (Madison, WI, USA). Kaikki reagenssit olivat analyyttistä laatua.

Solulinjat, soluviljelmissä ja solunelinkykyisyysmääritys

Pieni keuhkosyöpä solulinjaa H69, monilääkeresistenteistä pienisoluisen keuhkosyövän solulinjassa H69AR, ja MDA-MB -231 solulinja hankittiin ATCC (Manassas, VA, USA). H69 ja H69AR soluja pidettiin ATCC-muotoiltu RPMI-1640 Medium, jota oli täydennetty 10% ja 20% (v /v) naudan sikiön seerumia vastaavasti. MDA-MB-231 viljeltiin ATCC-muotoiltu Leibovitzin L-15-väliaineessa, jossa oli 10% (v /v) naudan sikiön seerumia. Kaikkia viljelmiä kasvatettiin 37 ° C: ssa 5% CO2-ilmakehässä. Solujen elinkelpoisuus mitattiin 3- (4, 5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), joka perustuu toiminnallisen muutoksen mitokondrioiden solukuoleman aikana.

Rekombinantti-DNA-

alukepari suunniteltiin sisälsi Xho I ja Hind III -kohdat, jolloin saatiin 992 bp: n promoottorialueen, -817-175, jossa numerointi suhteessa transkription aloituskohdasta (+1), ihmisen MRP1 geenin ihmisen genomisesta DNA: sta PCR: llä. Toinen neljä paria alukkeita suunniteltiin kloonata kaksi mahdollista ARE elementit promoottorialueen MRP1 geenin ja niiden mutantteja vastaavasti. Monistetut tuotteet puhdistettiin ja pilkottiin restriktioendonukleaasilla, ja sitten kloonattiin pGL3-basic (Promega, Madison, WI). Sekvenssit alukkeet on lueteltu taulukossa 1.

siRNA transfektio ja lusiferaasin reportterigeenimäärityksessä

Nrf2 siRNA ja Hiperfect transfektioreagenssia ostettiin yhtiöltä Qiagen (Valencia, CA) ja transfektio of Nrf2 siRNA suoritettiin valmistajan ohjeiden. Lusiferaasin reportterigeenimäärityksessä, solut transfektoitiin lusiferaasireportteri- plasmideja MRP1-geenin promoottori, ARE, mutantit ja renilla lusiferaasi, sekä ekspressiovektori HA-Nrf2. Tulikärpäsen ja Renilla lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual-lusiferaasireportterigeenin määritys (Promega, Madison, WI) ja analysoitiin GloMax 20/20 luminometrillä (Promega, Madison, WI).

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP ) B

ChIP analyysi suoritettiin protokollien mukaisesti toimittamien Upstate (A osa Millipore, MA). Lyhyesti, MDA-MB-231-soluja tai H69AR soluja tai H69 solut (noin 4 x 10

7) silloittuivat formaldehydin, kerättiin PBS, suspendoitiin uudelleen SDS lyysipuskuria ja sonikoitiin jäällä. Lysaatit laimennettiin sitten ChIP laimennuspuskurilla, esipuhdistettiin proteiini Agarose, ja sitten inkuboitiin vasta-aineiden kanssa (4 ug /näyte) yön yli. Immuunikompleksien kerättiin proteiini A-agaroosi, pestiin ja eluoitiin. DNA-proteiini ristisidosten peruttiin ja DNA otettiin talteen. Suhteelliset määrät DNA kompleksissa kvantitoitiin reaaliaikainen PCR käyttäen LightCyclerTM 480 DNA SYBR vihreä I kit (Roche). Alukkeet on esitetty taulukossa 2 mukaisesti suunniteltu ARE sekvenssien promoottorialueen MRP1 geenin. Vahvistettu ARE sekvenssi NQO1 geeniä käytettiin positiivisena kontrollina Nrf2-vuorovaikutuksen ja promoottorisekvenssin Tubulin geenin negatiivisena kontrollina. Siru määritys toistettiin 3 kertaa.

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR), immunoblot-määritys

Kun solut kerättiin talteen, kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-liuosta ( Invitrogen, Carlsbad, CA). Yhtä suuret määrät RNA: ta (2 ug) oli käänteistranskriptoitu käyttäen Transcriptor First Strand cDNA-synteesi Kit (Roche, IN, USA). Alukkeet käytettiin seuraavassa PCR-määritys oli lueteltu taulukossa 2. qPCR-olosuhteet olivat seuraavat: yksi sykli alkudenaturaation (95 ° C: ssa 30 s), 40 sykliä monistusta (denaturaatio 95 ° C: ssa 5 s, pariutuminen 60 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 s), jonka jälkeen jäähdytys ajan (50 ° C 5 s). Suhteellinen mRNA: n ekspressio määritettiin käyttäen Roottorin Gene 3000, jossa käytetään muunnosta delta-delta-Ct menetelmä, joka säätää vahvistusta varten tehokkuuden välillä kohteen ja siivous geenejä. PCR-data ilmaistiin suhteellisena kertainen muutos kohdegeenin välillä käsiteltyjen ja kontrolliryhmien. Syklin vaiheessa (Cp) arvot analysoitiin Studentin t-testiä sen määrittämiseksi, P-arvo.

immunoblottimäärityksessä, solut homogenisoitiin lyysin voita (0,1 M Tris-puskuria (pH 7,4), 0,1 mM EDTA) kun läsnä on 1 mM ditiotreitolia (DTT), 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, ja proteaasiestäjäseostabletit (Roche, iN, USA). Yhtäläisen määrä näytettä lisättiin kuhunkin kuoppaan 7,5% geeliä ja alistettiin SDS-PAGE: lla. Geelit siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Sitten membraania inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa yön yli vastaan ​​Nrf2 (110 KD), MRP1 (190 KD), ja MRP2 (~170 KD). Kun oli pesty TBS-T, kalvo inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanin ja hiiren IgG: tä ja signaaleja, visualisoitiin käyttäen ECL-plus western blotting-järjestelmä. Kaikki kokeet edellä mainitut suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ellei toisin mainita.

Potilaat ja immunohistokemiallinen analyysi

kudoksissa (n = 40), mukaan lukien mahasyöpä (n = 10), rintasyövän (n = 10 ), paksusuolen syöpä (n = 10) ja pienisoluinen keuhkosyöpä (n = 10) saatiin Patologian osasto, Shanghai Huashan sairaala, Kiina, sisällä 2007. Kaikki tapausta diagnosoitiin 2 patologia yksitellen kaksoissokkotutkimuksessa tavalla . Parafiini leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 otettiin merkittäviä eroja kaikissa tapauksissa.

Tulokset

Toisin H69-solujen, H69AR solut on suurempi Nrf2 reitin aktivointi ja MRP1 ekspressiotaso

perustason, aktivointi Nrf2 reitin verrattiin välillä H69 ja H69AR soluja. Loppupään geenit Nrf2, kuten NQO1, HO-1: n ja GST oli kohonnut mRNA: n ekspression H69AR soluissa, mutta ei ollut merkittävää eroa TXN mRNA: n ekspressio (kuvio 1, paneeli A, * P 0,05 vs. H69-soluja). Mielenkiintoista oli korkeampi Nrf2 mRNA tasolla H69AR soluja kuin H69-solujen, joilla ei ole eroa Keap1 geenin (kuvio 1, paneeli A, * P 0,05 vs. H69-soluja). Sekä MRP1 ja MRP2 geeni osoitti korkeamman mRNA tasolla H69AR soluissa, erityisesti MRP1 oli yli 70-kertaiseksi H69AR solujen H69 soluihin (kuvio 1, paneeli A * P 0,05 vs. H69 solut). Seuraavaksi proteiini tason Nrf2 mitattiin kahdessa solulinjassa. Yhdenmukainen muutoksiin mRNA-tasolla, H69AR soluilla oli korkeampi Nrf2-reitin aktivaatio kuin H69-solujen (kuvio 1, paneeli B) proteiini tasolla. Lisäksi MRP1 ja MRP2 osoitti myös kohonneen ekspression H69AR soluissa (kuvio 1, paneeli B). Mielenkiintoista, suuri negatiivinen säätelijä Nrf2, Keap1 eivät osoittaneet mitään eroa näiden kahden välillä solulinjoista (kuvio 1, paneeli B). Kun otetaan huomioon tärkeä rooli, joka MRP1 ja MRP2 pelata, H69AR solut ovat monen chemo huumeiden vastustuskyky johtuen korkeasta MRP1 ja MRP2. Kuten MTT tiedot osoittivat, H69AR soluja oli enemmän kannattavuus hinnan kanssa chemo huumeita hoitoon, kuten doksorubisiini, sisplatiini ja etoposidi (kuvio 1, paneeli C, D ja E, * P 0,05 vs. H69 solut).

(A) Suhteellinen mRNA taso Nrf2, Keap1, MRP1, MRP2 yhdessä NQO1, HO-1, GST ja TXN verrattiin H69 ja H69AR solujen reaaliaikaisella RT-PCR käyttäen ΔΔCt menetelmää GAPDH sisäisenä ohjaus. Tulokset ilmaistiin keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (B) Protein taso Keap1, Nrf2, MRP1, MRP2 verrattiin H69 ja H69AR soluissa Western-blottauksella käyttämällä Tubulin sisäisenä kontrollina. Kokeet suoritettiin kolmesti ja edustava immunoblot näytettiin täällä. (C), (D) ja (E) elinkelpoisuus H69 ja H69AR solujen hoitoon Dox, sisplatiini ja etoposidi eri annoksina 24 tunnin määritettiin MTT-määrityksellä. Kokeelliset erot määritettiin kaksisuuntaisella Studentin t-testiä ja p 0,05 otettiin merkittäviä eroja kaikissa tapauksissa.

knockdovvn Nrf2 johtaa vähentyneeseen MRP1 ilmaisun ja säteilyherkälle H69AR solujen multi -chemo lääkkeet

analysoimiseksi sääntelyä MRP1 mukaan Nrf2 erityisiä siRNA käytettiin kaataa Nrf2 ilmaisua. Kuten tulokset osoittivat, ilmentyminen Nrf2 väheni yli 50% toisin kuin mock ryhmään (kuvio 2, paneeli A). Vielä tärkeämpää on, proteiini taso MRP1 myös vähennettävä vastaavasti (kuvio 2, paneeli A), mikä tarkoittaa MRP1 voidaan säännellä Nrf2 kautta. Kuten H69AR osoitti usean chemo huumausaineiden vastus, seuraava vastus mitattiin uudelleen, kun ilmaus Nrf2 joka pudotettiin. Kuten odotettua, H69AR solut palautettiin herkkyyttä kaikkien kolmen kemoterapia huumeiden, kuten doksorubisiini, sisplatiini ja etoposidi, kun erityiset siRNA käytettiin merkittävästi vähentää ilmentymistä Nrf2 (kuvio 2, paneeli B, C ja D, * P 0,05 vs. mock ryhmä). Yhdessä nämä tiedot viittaavat mahdolliseen rooliin Nrf2 sääntelystä MRP1 ja vahvisti roolin Nrf2 in kemoterapian resistenssin.

(A) H69AR soluja suoritettiin transfektoimalla Nrf2 siRNA (10 nM ja 50 nM) 72 tuntia. Proteiinin ilmentyminen Nrf2 ja MRP1 määritettiin western blottauksella käyttämällä β-aktiini sisäisenä kontrollina. Kokeet suoritettiin kolmesti ja edustava immunoblot näytettiin täällä. (B), (C) ja (D) H69AR solut altistettiin knockdovvn Nrf2 siRNA transfektiota. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin solut käsiteltiin Dox, sisplatiini ja etoposidi eri annoksina vielä 24 tunnin ajan, ja ne altistettiin sitten MTT-määritys mittaamaan solujen elinkelpoisuus. Kokeelliset erot määritettiin kaksisuuntaisella Studentin t-testiä ja p 0,05 otettiin merkittäviä eroja kaikissa tapauksissa.

5′-reunustava alue ihmisen MRP1 geeni sisältää kaksi OVAT sekvenssit

määrittämiseksi läsnäolo ARE-sekvenssin 5′-reunustava alue ihmisen MRP1 geenin 992 bp pitkä fragmentti kloonattiin ja sekvensoitiin nukleotidit -817-175, jossa numerointi suhteessa transkription aloituskohtaa (merkitty +1 kuviossa 3). Nukleotidisekvenssin 5′-reunustava alue ihmisen MRP1 geeni esitetään kuviossa 3. transkription aloituskohdasta asetettiin olevan 5′-päähän MRP1 mRNA-sekvenssin, jolla on pisin 5′-transloimaton alue, ja paikallistettiin 175 emäsparia ylävirtaan translaation aloituspaikasta (lihavoitu kuvassa 3). Useat cis- vaikuttavan sekvenssit tunnistettiin. Kiinnostavaa kyllä, kaksi ARE kaltaiset sekvenssit löydettiin syrjäisillä alueilla: yksi asemissa -499–490 (ARE-1, gTGActcaGC, joissa pieniä kirjaimia ilmaisee ei-säilyneitä emäksiä) ja toinen asemissa -66–57 (ARE-2; gTGAgcggGC). Nämä kaksi ovat sekvenssit olivat identtiset aiemmin raportoitu minimaalinen ARE tehostajasekvenssiin (a /g) TGA (C /T /G) nnnGC [37]. Nukleotidit Mutatoitavassa oli lihavoitu kursiivi kuvassa 3.

Nukleotidit luettiin suhteessa transkription aloituskohdasta (+1). Translaation aloituskodonin (ATG) oli lihavoituna. Boxed ilmoitetulla alueella ARE1 ja ARE2 vastaavasti. Nukleotidit voidaan mutatoitunut tässä tutkimuksessa olivat lihavoitu kursivoitu.

Nrf2-välitteinen induktioon MRP1 promoottorin aktiivisuuden riippuvat sekä ARE1 ja ARE2

tutkimiseksi vaste 5 ’ reunusse- alueella MRP1 ja Nrf2, dual lusiferaasireportterigeenillä määritys suoritettiin. Ensinnäkin 992-bp: n fragmentti monistettiin PCR: llä ihmisen genomisesta DNA: sta käyttäen alukkeita, jotka on lueteltu taulukossa 1, ja sen jälkeen PCR-tuote kloonattiin pGL3-perusvektoriin ja nimetty pGL3-wt. Toiseksi, joka perustuu pGL3-p-, kaksi otaksuttu ARE ja mutatoitunut ARE monistettiin ja kloonattiin pGL3-basic vektori, joka nimettiin pGL3-ARE1, pGL3-ARE2, pGL3-ΔARE1 ja pGL3-ΔARE2 (mutatoitunut nukleotidit korostettiin lihavoitu kursiivi taulukossa 1). Toimittaja määrityksessä osoitti, että Nrf2 indusoi promoottorin aktiivisuutta MRP1 geenin kotransfektion jälkeen pGL3-wt kanssa Nrf2 ilmentävien plasmidi (kuvio 4, paneeli A, * P 0,05 vs. kontrolli). Se ilmoitti myös, että induktio MRP1 promoottorin aktiivisuus liittyy kahden mahdollisen ARE, koska molemmat olivat up-säännellään yliekspressio Nrf2. Lisäksi mutaatio niistä ablatoitu induktion vastaavasti (kuvio 4, paneeli A, ** P 0,05 vs. kontrolli, *** P 0,05 vs. kontrolli). Kuitenkin, ei ollut merkittävää eroa induktion välillä ARE. Lisäksi, NQO1 ARE-Luc käytettiin positiivisena kontrollina varmistaa pätevyyden koko määrityksen, ja immunoblot-määritys suoritettiin sen varmistamiseksi, että yli-ilmentyminen Nrf2 oli melko vastaava (kuvio 4, A, ylempi paneeli).

(A) 231-solut transfektoitiin viiden lusiferaasireportteri- konstruktioita (wt-Luc, ARE1-Luc, ARE2-Luc, ΔARE1-Luc ja ΔARE2-Luc), ja promoottorittoman pGL3-basic (pGL3-Luc), NQO1-ARE-Luc ja PRL-TK käytettiin negatiivisena kontrollina, positiivinen kontrolli ja sisäistä valvontaa, vastaavasti. Edellä mainitut plasmidit kotransfektoitiin tai ilman Nrf2-ekspressioplasmidin. 48 tunnin kuluttua solut otettiin talteen ja lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin dual-lusiferaasimäärityssysteamiä (alempi paneeli). Tiedot olivat keskiarvoja ± SD arvoista kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tasavertainen määrä transfektion Nrf2 varmistettiin Western blotilla (ylempi paneeli). (B) 231-soluja käsiteltiin 40 uM TBHQ varten osoitetun ajankohtana, ja sitten korjattiin tehtävä Immunoblottaus- mitata Nrf2-proteiinin taso. Kokeet suoritettiin kolmesti ja edustava immunoblot näytettiin täällä. (C), (D), (E) ja (F) 231-soluja käsiteltiin tai ei ole 40 uM TBHQ: ssa 24 tuntia ja oli silloitettu formaldehydillä. Sonikoitiin kromatiinin alistettiin immunosaostukselle vasta-aineita Nrf2 tai normaali IgG. Saostunut DNA seurasi reaaliaikainen PCR-analyysillä alukkeilla vastaan ​​MRP1 ARE1 (paneeli C), MRP1 ARE2 (paneeli D), NQO1 ARE (paneeli E) ja tubuliinipromoottori (paneeli F). Kokeet suoritettiin kolmesti ja edustaja kolmesta kokeesta näytettiin täällä.

Seuraavaksi vahvistaa todellista sitoutumista Nrf2 kanssa kahden mahdollisen ARE, siru analyysi suoritettiin sekä 231- ja pienisoluinen keuhkosyövän soluja. Mukaan immunoblottimäärityksessä on Nrf2 käsitelty TBHQ 231 soluissa, tunnettu Nrf2 reitin indusoijan, sopivan käsittely- ajan TBHQ, 24 tuntia asetettiin (kuva 4, paneeli B). Joten 231 soluja (4 x 107) käsiteltiin 40 uM TBHQ 24 tuntia, ja sitten korjattiin kohteena ChIP määritystä. Verrattuna negatiivinen kontrolli, sitoutuminen kanssa ARE1 by Nrf2 oli lisääntynyt merkittävästi (kuvio 4, paneeli C, * P 0,05). Lisäksi hoito TBHQ tehnyt sitovan lisääntynyt huomattavasti suuremmat (kuva 4, paneeli C,

# P 0,05). Samoin ARE2 osoitti myös sitova Nrf2 kanssa tai ilman TBHQ hoitoa (kuva 4, paneeli D, * P 0,05,

# P 0,05). Kuitenkin sitoutumista Nrf2 kanssa ARE2 oli pienempi kuin ARE1 sekä perustason ja TBHQ hoidon taso. Koska ilmaus Nrf2 oli paljon suurempi H69AR soluja kuin H69-soluissa (kuvio 1, paneeli B), me seuraavaksi suoritetaan vertaileva Chip analyysi testata onko lisääntynyt Nrf2 in H69AR soluissa oli pakko ARE1 ja ARE2 elementtejä MRP1 promoottori. Yhdenmukainen odotamme, sitoutuminen kanssa ARE1 by Nrf2 lisääntyivät merkittävästi H69AR soluissa verrattuna H69-solujen (kuvio 5, paneeli A * P 0,05). Samanlaisia ​​sitovia tuloksia ARE2 todettiin myös (kuvio 5, paneeli B, * P 0,05). Tämä saattaa viitata molekyylitason selitys lisääntynyt MRP1 ilmentymistä H69AR soluissa. Lisäksi sitoutuminen Nrf2 kanssa ARE2 oli pienempi kuin ARE1 sekä H69 ja H69AR soluja, jotka olivat yhdenmukaisia ​​tuloksia 231-soluissa. Positiiviset ja negatiiviset kontrollit siru määrityksen vakuuttaa kokeilu oli uskottava ja tiedot oli kiinteä (kuva 4, paneeli E ja F ja kuvio 5, paneeli C ja D). Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että kahden mahdollisen ARE sisällä MRP1 geenipromoottorialueen olivat todellisia ARE, joita voidaan säännellä Nrf2.

H69 ja H69AR soluja silloitettu formaldehydillä. Sonikoitiin kromatiinin alistettiin immunosaostukselle vasta-aineita Nrf2 tai normaali IgG. Saostunut DNA seurasi reaaliaikainen PCR-analyysillä alukkeilla vastaan ​​MRP1 ARE1 (paneeli A), MRP1 ARE2 (paneeli B), NQO1 ARE (paneeli C) ja tubuliinipromoottori (paneeli D). Kokeet suoritettiin kolmesti ja edustaja kolmesta kokeesta näytettiin täällä.

ilmentyminen Nrf2 ja MRP1 oli kiinnekohta ja suurempi pahanlaatuisia kasvaimia kuin viereisen ei-kasvainkudoksessa

Täysin , 40 tapauksissa pahanlaatuisten kasvainten, mukaan lukien keuhkosyöpä, rintasyöpä, mahasyöpä ja paksusuolen syöpä, valittiin mitata

in vivo

ilmentymisen Nrf2, MRP1, ja NQO1 sekä IHC. Keuhkosyöpä, vain tapaukset, jotka oli diagnosoitu pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC), jossa sekä H69 ja H69AR solujen alkunsa muodossa, valittiin. Verrattuna viereisen ei-kasvainkudoksen, keuhkosyöpä kudos osoitti dramaattisesti korkeampi ilmentymä Nrf2, MRP1 ja NQO1 (kuvio 6, vertaa paneeli b2 A2, b3 ja a3, b4 ja a4). HE värjäys paneelissa eniten vasemmalla paljasti pahanlaatuista liikakasvu ja viereisen ei-kasvainkudoksessa, joka on hyödyllinen paikallistaa positiivisen signaalin IHC leikkeitä. Viereisissä ei-kasvainkudoksessa, Nrf2 ilmentyy pääasiassa ytimet epiteelisolujen (kuvio 6, paneeli a2), ja ekspressio MRP1 oli osoitti sekä solukalvon ja sytoplasmassa (kuvio 6, paneeli a3). Voit näyttää ydinvoiman lokalisoinnin Nrf2, valitun alueen sisällä kunkin kuvan Nrf2 värjäystä oli laajentunut ja sulautui Alkuperäisen valokuvan vasemmassa yläkulmassa (kuva 6, paneeli a2-h2, musta nuoli). Oli vaikea nähdä mitään ilmeistä NQO1 ilmaisua paitsi heikko positiivinen signaali hajallaan soluissa viereisen ei-kasvainkudoksessa (kuvio 6, paneeli a4). Keuhkosyövän kudoksessa, ilmentymisen Nrf2 on rajoitettu syöpäsolun kyhmyt paitsi nekroottisen keskus soluja. Sekä sytoplasmassa ja ytimet osoittivat Nrf2 ilmaisua, mikä oli paljon voimakkaampaa kuin viereisen ei-kasvainkudoksessa (kuvio 6, paneeli b2). Vastaavalla ilmentävät kuvion Nrf2, MRP1 myös ilmaissut selvästi ja hajanaisesti että kyhmyt keuhkosyövän (kuvio 6, paneeli b3). Yhtenä alavirtaan geenin Nrf2, ilmentävän kuvio NQO oli samanlainen Nrf2 (kuvio 6, paneeli b4). Oli vaikea nähdä mitään ilmaisua Nrf2, MRP1 ja NQO1 interstitiaalinen kudos. Rintasyövän kudoksessa, ilmentymisen Nrf2, MRP1 ja NQO1 oli huomattavan korkea (kuvio 6, paneeli d2, d3 ja d4), vaikka lievää ilmentyminen niistä näkyi vieressä olevaan ei-kasvainkudoksessa (kuvio 6, paneeli c2, c3 ja c4). Kolme geenit mahasyövän ja paksusuolen syövän olivat samankaltaisia ​​ilmaista kuvio, eli sanat niistä kasvainkudoksessa oli paljon suurempi kuin viereisen ei-kasvainkudoksessa (kuvio 6, paneeli e1 H4). Lisäksi IHC värjäys tulokset osoittivat mahdollinen korrelaatio Nrf2 ja MRP1 ilme.

unstained kudos diat pienisoluisen keuhkosyövän, mahasyövän, rintasyövän ja paksusuolen syövän sovellettiin HE värjäys (a1-H1) ja IHC värjäys vasta-aineita Nrf2 (a2 H2), MRP1 (a3 h3) ja NQO1 (a4 H4). Baarissa asteikot leimattiin at oikeassa alakulmassa jokaisen kuvia.

Seuraavaksi IHC värjäys osat analysoitiin ja mitattiin ohjelmisto, i-Solution kvantitoimiseksi ilmaus Nrf2, MRP1 ja NQO1 vuonna kaikissa tapauksissa. Ilmaisu esitettiin suhteena positiivisen alueen koko alueella. Kaikilla neljällä syöpäsoluissa, Nrf2, MRP1 ja NQO1 osoittivat merkittävästi suurempi ekspressio, toisin viereisen ei-kasvainkudoksessa (kuvio 7, paneeli A, * P 0,05 vs normaali kudos, vastaavasti). Vahvista korrelaatio niiden ilmaisun kaksittain, Pearsonin korrelaatio koe ensi suoritettu. Keuhkokudoksessa, mukaan lukien sekä kasvainkudoksen ja viereisen ei-tuumorikudoksessa, Pearsonin korrelaatiokerroin (r) välillä Nrf2 ja MRP1 on yhtä suuri kuin 0,899 (kuvio 7, paneeli B, ylempi vasen, ** P 0,001), mikä tarkoittaa, että ilmaisu Näiden kahden geenin oli vastaavuussuhteessa. Yhtenä alavirran geenien Nrf2, ilmaus NQO1 säätelee Nrf2, joten R on yhtä kuin 0,820 (kuva 7, paneeli B, ylempi vasen, ** P 0,005), mikä vahvisti sääntely NQO1 mukaan Nrf2. Kuten korrelaatio Nrf2 ja MRP1 keuhkokudoksessa, kaikki muut 3 kudoksissa osoitti tämän merkittävän korrelaatio myös, kuten mahalaukun kudoksesta (kuvio 7, paneeli B, ylhäällä oikealla), rintakudoksen (kuva 7, paneeli B, alhaalla vasemmalla) ja paksusuolen kudoksen (kuva 7, paneeli B, alhaalla oikealla). Siksi nämä värjäys tiedot ja tilastollinen analyysi osoitti sekä Nrf2 ja MRP1 ilmennettiin paljon suurempi kasvainkudoksessa kuin viereisen ei-kasvainkudoksessa, ja vielä tärkeämpää, ilmentyminen kahden geenin oli vastaavuussuhteessa.

Viisi sattumanvaraisesti näkökentät