Krooninen sairaus

tiivistelmä

miRNA säädellä geeniekspressiota at transkription jälkeisellä tasolla ja hienosäätää avain biologisten prosessien, kuten syövän etenemistä. Tässä osoitamme osallistuminen miR-200b metastaattisen leviämisen eturauhasen syöpä. Havaitsimme miR-200B alavirran kohde androgeenireseptorin ja liittyy sen ilmaisun laski tuumorigeenisyyteen ja metastaattisen kapasiteetti eturauhassyövän solut. Yli-ilmentymisen miR-200b PC-3-solujen merkittävästi esti niiden leviämisen ja muodostumista ihonalaisen kasvaimia. Lisäksi käytettäessä potilaalle tehdä malli, miR-200b tukossa spontaani etäpesäke ja angiogeneesiä PC-3-solut. Tämä vähentynyt metastaattinen potentiaali johtui todennäköisesti käänteinen epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon, kuten osoituksena lisääntynyt pan-epiteelin merkki E-kadheriinin ja spesifisten eturauhasen epiteelin sytokeratiineja 8 ja 18. Sen sijaan mesenkymaalisten markkereita, fibronektiini ja vimentiinista, olivat merkittävästi vaimentua by miR-200b. Tuloksemme viittaavat tärkeä rooli miR-200b eturauhassyövän etenemistä ja ilmoittaa sen mahdollisen käyttökelpoisuuden eturauhassyövän hoidossa.

Citation: Williams LV, Veliceasa D, Vinokour E, Volpert OV (2013) miR-200b Estää Eturauhassyöpä EMT, Growth and Metastasis. PLoS ONE 8 (12): e83991. doi: 10,1371 /journal.pone.0083991

Toimittaja: Hari K. Koul, Louisiana State University Health Sciences keskus, Yhdysvallat

vastaanotettu 23 syyskuuta 2013 Hyväksytty: 11 marraskuu 2013; Julkaistu: 31 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Williams et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Herman L . Kretschmer Fund, kautta Northwestern University Urology laitos (OV), itiöitä in Eturauhassyöpä Pilot Award P50 CA090386 (OV), monipuolistaminen Higher Education tiedekunnan Illinoisissa Fellowship Grant (LVV). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MicroRNA (miRNA) ovat lyhyitä, (21-22 nukleotidia) koodaamattomalla RNA, jotka sitoutuvat mRNA ja tukahduttaa geenin ilmentymisen mRNA: n hajoamisen /epävakauden tai heikentynyt käännös [1]. MicroRNA transkriptoidaan ensin 100 emäsparin ensisijaisena miRNA Hiusneularakenteet, jotka myöhemmin pilkkoo Drosha edeltävään miRNA ja viedään tumasta sytoplasmaan jatkokäsittelyä varten [2], [3]. Pilkkominen pre-miRNA by Dicer proteiinit saadaan 22 bp: n kaksijuosteinen molekyylejä, joiden toinen säie on selektiivisesti lastataan Argonaute proteiineja, jotka helpottavat miRNA sitoutumisen 3’UTR kohdesekvenssien RNA: lla. MiRNA pelata keskeisiä rooleja useissa kehitys- ja patologisia prosesseja, mukaan lukien rinta-, iho-, keuhko-, ja kohdunkaula [4] – [9].

miRNA HSA-miR-200B kuuluu perheeseen, joka sisältää miR-200a miR-200c, miR-141, ja miR-429. Häiriöstä mir-200b on lauseketta kriittinen rooli epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) ja etäpesäkkeiden syöpien, kuten rinta-, maha-, ja haiman karsinoomat [10] – [12]. Ihmisen miR-200B osallistuu kaksinkertainen silmukka kahden transkription sääntelyviranomaisten E-kadheriinin, ZEB1 ja ZEB2 [13]. Normaaleissa epiteelisoluissa, miR-200b on ekspressoituu korkeina tasoina; kohdistamalla 3’UTR alueille pro-metastaattisen transkriptiotekijöitä ZEB1 ja ZEB2 se estää ilmaisun ja pysähtyy EMT [10]. Sen sijaan mesenkyymisolujen, jossa ZEB1 /ZEB2 ilme on poikkeuksellisen korkea, ne tukahduttaa miRNA Mir-200 perheen estämällä niiden promoottorin aktiivisuus [13]. Useita tutkimuksia arvioida miR-200b toimivat EMT, vaikka on olemassa muutamia yrityksiä käsitellä rooliaan primaarikasvaimen kasvun.

Tässä osoitamme, että miR-200B omaa vastaavaa toimintaa eturauhassyövässä. Pyrkimys tunnistaa miRNA jotka edistävät laski aggressiivisuutta ja tuumorigeneesiä eturauhassyövän, suoritimme miRNA profilointi solulinjoja indusoituvan ilmentymisen androgeenireseptorin aiemmin kehitetty meidän laboratoriossa. Huomasimme, että miR-200B oli merkittävästi voimistunut vuonna huonosti tuumorigeenisen PC3 AR-positiivisten solujen ja että yli-ilmentyminen miR-200B vähensivät kasvaimen kasvua. Tämä vähentynyt tumorigeneesin johtui todennäköisesti vähentynyt proliferaatio. Toisaalta, miR-200b voimakkaasti säädelty epiteelisolujen markkeri E-kadheriinin PCA-soluissa, kun taas mesenkymaaliset markkereita fibronektiinin ja vimentiinin olivat samanaikaisesti vähenivät. Yhteisymmärryksessä analyysit suoritetaan muissa elimissä, ZEB1, transkriptionaalisen säädin E-kadheriinin myös vähentynyt upon miR-200B yli-ilmentymisen. Lisäksi miR-200b vähensi invasiivisia potentiaalia PCA solujen

in vitro

ja laski etäpesäke. Tuloksemme osoittavat, että miR-200B vähenee kasvaimen kasvua ja kääntää EMT eturauhassyövän.

Methods

Eläinten hyvinvointi Assurances

Kaikki tutkimuksia koe-eläimillä (hiirillä) hyväksyttiin Northwestern University Animal Care ja käyttää komitean ja suoritetaan yhteisymmärryksessä hyväksyttyjen suuntaviivojen ja ehdottamat National Institutes of Health (Animal varmuus numero A3283-01, voimassaoloaika 31.5.2014).

Solulinjat ja hoito Edellytykset

PC3 transfektoitujen solujen indusoitavissa villin tyypin androgeenireseptorin (AR) tai kontrolli plasmidin luotu aiemmin [14]. Soluja ylläpidettiin RPMI 10% tetrasykliini-free naudan sikiön seerumia (FBS), 2% penisilliini /streptomysiini, 50 ug /ml tseosiinia ja 1 ug /ml Blasticidin. AR ilmaisu, PC3-AR-soluja käsiteltiin 5 päivää, 1 ug /ml Doksisykliini ja 1 nM metyylitrienolonia (R1881) in fenolipunaista RPMI-elatusaineeseen, jota oli täydennetty 10% hiilellä erotettua FBS: ää, 2% penisilliini /streptomysiinillä, 50 ug /ml tseosiinia ja 1 ug /ml Blasticidin. Vanhempien PC3-solut ylläpidettiin RPMI, jossa on 10% FBS: ää ja 2% penisilliini /streptomysiiniä. Kaikki solut kasvatettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, kosteutetussa inkubaattorissa.

immunoblottauksella

Solut maljattiin tiheydellä 100,000 solua per 10 cm malja. Solut kerättiin raaputtamalla fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) ja sentrifugoitiin 2500 rpm 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solupelletti hajotettiin Ripa-puskurilla (Sigma, St. Louis, MO), jota oli täydennetty 1 x proteaasi /fosfataasinestäjällä liuosta (Thermo Scientific, Waltham, MA), ja sentrifugoitiin 12000 rpm 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pitoisuus supernatantissa määritettiin kolmena kappaleena proteiinimäärityksellä (DC Protein Assay, Biorad, Hercules, CA). Lysaatit elektroforeesi 4% -20% Tris-HCI: ää polyakryyliamidigeeleillä (Biorad, Hercules, CA). Proteiini lysaattia siirrettiin yön yli PVDF kalvoja (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA). Kukin kalvo huuhdottiin 1X Tris-puskuroitu suolaliuos, jossa 0,1% Tween 20 (TBS-T), blokattiin 5% rasvattomalla maitoa TBS-T: n ja vasta-aineilla, kuten taulukossa S3.

RNA Extraction

miRNA havaitsemista, kokonais-RNA eristettiin miRNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). MRNA louhinta, kasvaimet olivat snap-jäädytettiin nestetypessä ja siirretään RNA vakautusratkaisua (Ambion, Life Technologies, Grand Island, NY). Kasvaimet pidettiin -80 ° C: ssa ja RNA: n uutto suoritettiin käyttäen miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA-pitoisuus ja puhtaus mitattiin NanoVue Plus spektrofotometrillä (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburg, PA).

Real Time RT-PCR

RNA käänteistranskriptio miScript II RT Kit (Qiagen , Valencia, CA) seuraten valmistajan ohjeita. Saatu cDNA: ta käytettiin reaaliaikaista PCR-analyysiä käyttäen miScript SYBR Green PCR-kittiä (Qiagen, Valencia, CA). Yksittäisten miRNA kvantifiointiin käytimme miScript Primer määritykset (Qiagen, Valencia, CA). Sillä polymeraasiketjureaktio (PCR) analyysi, eteen ja taakse alukkeet suunniteltiin ja hankittiin Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) ja reaktiot suoritetaan käyttämällä SYBR Green Super mix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD). Reaktiot suoritettiin Thermal iCycler (Biorad, Hercules, CA). Kukin näyte testattiin kolmena rinnakkaisena.

miRNA Array Analyysi

PC3-AR-soluja käsiteltiin Doksisykliini (Dox) ja R1881 (kuten edellä kuvattiin) ekspressiota ja aktivointi androgeenireseptorin (AR) vastaavasti. RNA uutettiin yllä kuvatulla tavalla ja 5 ug kutakin näytettä lähetettiin LC Sciences (Houston, TX) ja erilaisia ​​analyysi. Näytteet leimattiin Cy

3 tai Cy

5 ja intensiteetin suhde kutakin käytettiin määrittämään muutoksia miRNA ilmaisun tasolla. 20-nukleotidin RNA-ohjaus komplementaarinen useita ohjaus koettimia täplikäs kummallakin siru sisällytettiin jokaiseen näytteeseen sisäinen kontrolli. Mikrosiruissa tehtiin kolmena kappaleena ihmisen, hiiren ja rotan sekvenssit. Mahdollinen tavoitespektri Valittujen miRNA määriteltiin käyttäen Sangerin miRBase 11.0. Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin t-testi p 0,10, p 0,05 ja p 0,01.

miR-200B-ilmentymän

Sukkula koodaavalla esiasteen sekvenssi HSA-miR-200B (pMIRNA1 pCDH-CMV-MCS-EF 1-copRFP) ja kontrollivektorille (pCDH-CMV-MCS-EF 1-copRFP) System Biosciences (SBI, Mountain View, CA) kasvatettiin Luria-liemessä +50 ug /ml ampisilliinia 30 ° C tasoravistelijassa. Endotoksiinivapaalla plasmidi-DNA eristettiin käyttämällä Endo-Free Maxi Prep Kit (Qiagen, Valencia, CA). Lentivirus- partikkeleita tuotettiin kunkin plasmidin HEK293T-soluissa käyttäen pMD2.G kirjekuoren ja psPAX2 2

toisen sukupolven pakkaus plasmidit (AddGene, Cambridge, MA). Tiitteri määritettiin virtaussytometrialla infektoitujen solujen, kuten aiemmin on kuvattu [15]. Transfektioon, PC3-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille 10

5 solua /kuoppa. Seuraavana päivänä media korvattiin 1 ml 1X DMEM sisältää sopivan MOI lentiviruksesta hiukkasten miR-200B ja tyhjän vektorin ohjaus. Kun 6 tunnin inkuboinnin jälkeen solut syötettiin RPMI, jossa on 10% FBS: ää ja 2% penisilliini /streptomysiinillä ja inkuboitiin vielä 48 tuntia. Transdusoidut solut, jotka ilmentävät korkeita RFP merkki eristettiin ja virtaussytometria yhdistettynä solulajittelussa ja ylläpidettiin RPMI 10% FBS, penisilliiniä /streptomysiiniä ja 1 ug /ml Puro- ylimääräisiä valintaa.

tuumorigeneesiä Analyysit

(1) Ihon alle ymppäyksen.

Lapsen PC3-soluja, PC3-solut transdusoitu ohjaus lentivirus ja miR-200b-soluja kasvatettiin kuten edellä on kuvattu, otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen 2 x 10

7 solua /ml seerumittomassa RPMI. Sata pl solususpensiota (2 x 10

6 solua /hiiri) injektoitiin subkutaanisesti takana takaraajat Kateenkorvattomien uroshiiriä (Nu /Nu, n = 5). Kasvaimet mitattiin microcalipers kolme kertaa viikossa, ja koe lopetettiin 29 päivän kuluttua implantaatiosta. Kasvainten snap-jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempää analyysiä varten.

(2) Orthotopic istutuksen kasvainsolujen suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16].

Lyhyesti , midline viiltoa tehtiin, ylivoimainen sukuelinten alueelle saamaton nukutettujen mies kateenkorvattomissa hiirissä (nu /nu). Virtsarakko externalized ja laajennettiin pumpulipuikolla paljastaa rakkularauhaset ja dorsum eturauhasen. Kasvainsoluihin 50 ui seerumitonta RPMI (10

6 eläintä kohden) injektoitiin eturauhaseen ja lihasten ja ihon suljettiin ompeleilla ja metallinipistimet, vastaavasti. Kaikki toimenpiteet suoritettiin steriilissä ympäristössä. Metallinipistimet poistettiin 2 viikkoa injektion. Kasvaimen kasvu seurattiin GFP fluoresenssi käyttäen pieni eläin kuvantamisjärjestelmä OV100 (Olympus). Koe lopetettiin 20 päivää implantaation. Kasvaimet leikattiin irti ja pikajäädytettiin myöhempää analysointia varten. Arvioida etäpesäke, jäljelle jäänyt fluoresenssi mitattiin poistamisen jälkeen primaarikasvaimen.

proliferaatiotestillä

Solut ympättiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaisilla levyillä 3 x 10

3 solua /hyvin. 24, 48, ja 72 tuntia, 10 ui WST-1-reagenssia (Roche, Indianapolis, IN) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 2 tuntia. Absorbanssi mitattiin kunakin ajankohtana 450 nm aallonpituudella käyttäen Biorad mikrolevynlukijaa (Biorad, Hercules, CA).

In vitro

invaasiomääritys

Transwell insertit (Corning, Andover, MA) päällystettiin 100 ul: lla 1 mg /ml fenolipunaista vapaata Growth Factor Reduced Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) ja annettiin kiinteytyä 37 ° C: ssa kudosviljelyinkubaattorissa 24 tuntia . Solut suspendoitiin uudelleen tiheydellä 10

6 solua /200 ui seerumittomassa RPMI, ympättiin kahtena kappaleena yläosassa päällystetyn inserttien ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia, 700 ui 10% FBS lisättiin alempaan kammioon kemoattraktantti. Solut kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen DiffQuick Fixative ratkaisuja (Dade Behring, Malvern, PA) ja 6 kentät oli kuvattu kunkin koetilalle. Invaasio laskettiin prosenttia tunkeutuneet soluja. Koe suoritettiin kahdesti.

Cell Cycle Analysis

Solut siirrostettiin 10

6 solua /ml RPMI: ssä, jota oli täydennetty 0,2% FBS: ää. 48 tunnin kuluttua solut trypsinoitiin, pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä, kiinnitettiin 10 ml: ssa 75% jääkylmää etanolia ja pidettiin yön yli -20 ° C: ssa. Solut pestiin kaksi kertaa 1X PBS: ssä 4 ° C: ssa, suspendoitiin uudelleen 2,0 ml: aan DAPI-värjäyksellä (0,1% Triton X 100 10 ml: ssa PBS: ää, 100 ui 1 mg /ml DAPI) ja analysoitiin FACS: llä.

tilastollinen analyysi

Kaikki määrälliset tulokset hankittiin vähintään kahdesta itsenäisestä kokeesta yhdistettiin, jossa jokainen yksittäinen datapiste suoritettiin kolmena rinnakkaisena. (Keskihajontana) laskettiin käyttäen Microsoft Excel-ohjelmiston. Määrittämään tilastollista merkitystä havaitun difffrences, olemme suorittaneet pareittain vertailun aineistoja käyttäen yksisuuntainen Studentin T-testi. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin P-arvo on enintään 0,05.

Tulokset

miR-200B voimistuvan AR

Edellinen tietoa ryhmämme osoitti, että androgeenireseptorin (AR) inhiboi tuumorigeenistä ominaisuudet AR-negatiivinen eturauhassyöpä-solulinjaa, PC-3 [14]. MicroRNA ovat tärkeitä määritteet biologisia toimintoja, kuten kasvaimen kasvua. Olemme vaatineet miRNA, joita ohjataan AR ja osallistuvat negatiiviseen säätelyyn eturauhassyövän etenemistä. Tätä varten suoritimme miRNA profilointi aiemmin luotu solulinja tetrasykliini-indusoituva AR ilmentymisen ([14], Fig. 1 a). Soluja käsiteltiin Doksisykliini (Dox) varmistaa AR ilmaisun ja R1881, aiheuttaa AR tumaansiirtymiseen ja transkriptioaktiviteettia.

(A) Western blot vahvista indusoituvan AR ilmentymistä PC3-AR soluissa. PC3-AR soluja käsiteltiin 5 päivää doksysykliinillä aiheuttavan AR ilmaisun ja R1881 aiheuttaa AR aktivointia ja tumaansiirtymiseen. Vertailu on käsittelemätön kontrolli. Kokosoluliuotteista käytettiin analyysiä varten. (B). Lämpö kartta miRNA ilmentymisen PC3-AR ja ohjaus soluja. Kokonais-RNA soluista A käytettiin mikrosiruanalyysi ja kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena. Tilastollinen merkitys ilmentyminen muuttuu esitetty on määritetty käyttämällä Studentin t-testiä. P-arvot 0,05 syyksi tilastollista merkittävyyttä.

Microarray-analyysi paljasti tilastollisesti merkitsevä ero ilmaus 837 yksittäisten miRNA vastauksena AR aktivointi (p 0,05 määritettynä Opiskelijan T-testi), ja jossa 116 oli osoitti P-arvot ovat alle 0,01 (kuvio 1 b, taulukot S1 ja S2). Valitsimme miRNA jotka muuttunut yli 2-kertainen ja analysoitiin niiden mahdollisia kohteita ja toimintoja käyttämällä Sanger miRBase versiota 11.0 ja Diana Micro T versio 3.0. Kahdeksan miRNA valittiin perustuu niiden mahdollisiin osallistuminen syövän etenemistä kuin määritettiin

in silico

analyysi ja julkaistuja tutkimuksia. Viisi valitun miRNA voimistunut vähemmän tuumorigeeninen PC3-AR-soluja liittyy myös vähentynyt tuumorigeneesiä muissa syövissä (taulukko 1). MicroRNA päässä miR-200 klusterin (miR-200a miR-200b) on osoitettu toimivan tuumorisuppressorien mahalaukun, kohdunkaulan, keuhko-, rinta- ja eturauhassyövän syöpiä [9], [10], [17], [18] . Lisääntynyt miR-200c tasot on liitetty laski etäpesäke melanooma, okasolusyöpä, ja eturauhassyövän [6], [18], [19]. miR-30a ja miR 30-d ekspressio on merkittävästi vähentynyt krooninen myelooinen leukemia, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, munuaissyöpä, ja eturauhassyövän [20] – [23]. Sen sijaan miR-7 ja miR-9 tasot laskivat vähemmän tuumorigeenistä solulinjassa. Sopusoinnussa, miR-7 on tunnistettu onkogeenin munuaissolusyövässä [24] ja miR-9 lauseketta rooli leukemogenesis [25] – [27]. Low miR-196a tasot havaittiin pahanlaatuinen melanooma [28] (taulukko 2).

Olemme validoitu valitse microRNA tunnistaa erilaisia ​​analyysi käyttäen reaaliaikaista PCR. Todellakin, miR-200b, 30a, ja 30d lisättiin, ja miR-9 vähentynyt, ja nämä muutokset olivat tilastollisesti merkitseviä (p≤0.05) (kuvio 2a). Valitsimme miR-200B tarkempaa analysointia, koska se osoitti korkeimman kertaluokkamuutos ja koska se on tiedossa roolia EMT ja etäpesäkkeiden [10], [13].

(A). MiRNA ilmentyminen oli normalisoitu kontrollisolujen (ctrl). PC3-AR ja ohjaus soluja käsiteltiin 5 päivää doksysykliinillä aiheuttavan AR ilmaisun ja R1881 aiheuttaa AR aktivointi- ja tumaansiirtymiseen ja kokonais-RNA kerätään analyysiä varten. Vertailu on käsittelemätön kontrolli ja RNU1A_1 ei-koodaavan RNA: ta käytetään sisäisenä kontrollina. Tilastollinen merkitys havaittu eroja verrattuna kontrolliin on * p≤0.05, ja ** p≤0.01 kuten määritettiin yksisuuntaista Studentin t-testiä. Keskimääräiset arvot on laskettu kaksi erillistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena. (B) AR aktivointi ylössäätelee miR-200b. PC3-AR soluja (harmaat palkit) käsiteltiin 5 päivää sekä doksisykliinihoidon aiheuttavan AR ilmaisun ja R1881 aiheuttaa AR aktivointia ja tumaansiirtymiseen. Vertailu on käsittelemätön kontrolli. Flutamidi lisättiin toisin mainita estää AR toimintaa. Ohjaus (ctrl) PC3-AR-solut jätettiin hoitamatta. RNU1A_1 ei-koodaavat RNA: ta käytettiin sisäisenä kontrollina. *, P 0,05; **, P 0,01 määritettynä Opiskelijat T-testi. Keskimääräiset arvot laskettiin kaksi erillistä koetta suoritettiin kolmena kappaleena.

mitattu miR-200b tasot PC3-AR-soluja käsiteltiin yhdistelmä Doksisykliini, synteettisen androgeenin R1881 ja anti-androgeenin flutamidi , kilpaileva estäjä Jälleenkytkentätoiminto. MiR-200B oli merkittävästi lisääntynyt vastauksena R1881 ja nousun lakkautettiin flutamidia annoksesta riippuvaisella tavalla, mikä viittaa suoran kopioinnin säätely AR (kuva 2b).

miR-200B estää kasvu Eturauhassyöpä -ksenoqraftit

vieressä haetaan vaikutus miR-200b eturauhassyöpäksenografteilla kasvaimien syntyyn. Me yliekspressoitu miR-200b PC3-soluissa transduktion korkean tiitterin lentivirus käyttämällä tyhjän vektorin (pCDH-CMV-MCS-EF 1-copRFP) negatiivisena kontrollina, ja vahvisti miR-200B ilmentyminen reaaliaikaisella RT-PCR (Kuva 3a). Tuloksena solulinjat ja vanhempien PC3-soluja ihon alle ruiskutettiin uros kateenkorvattomiin nude-hiiriin. Tärkeää on, kasvaimia muodostuu soluja, jotka ilmentävät miR-200b olivat huomattavasti pienempiä sitten kasvaimia muodostama vanhempien PC3 ja solut transdusoitiin kontrollivektorilla (kuvio 3b). Tärkeää on, miR-200b ilmentyminen ylläpidettiin kokeen ajan, kun varmistettiin reaaliaikainen RT-PCR: llä (kuvio 3c). Koska kasvain vuorovaikutus sen mikroympäristölle on ratkaiseva merkitys syövän etenemiseen, me suoritetaan potilaalle tehdä istuttaminen PC3-200b ja hallita solulinjoja kuten aiemmin on kuvattu [16] osaksi selkäpuolen eturauhanen mies kateenkorvattomissa hiirissä. Otimme etuna RFP merkki sisällytetty bisistroninen lentivirusvektorilla suorittaa pituus-

in vivo

kuvantamiseen. Yleinen fluoresenssi valmiiksi leikkely oli merkitsevästi pienempi hiirillä PC3 miR-200B kasvain verrattuna vektorin kontrolliryhmään (kuvio 3d, e). Näin miR-200b ilmentyminen oli riittävä vähentämään kasvaimen kasvua. Lisäksi kuvantaminen vatsan jälkeen kasvaimen poiston paljasti merkittävästi vähemmän fluoresenssia johtuen sekundääristä, mikä viittaa siihen, että miR-200B laski sekä ensisijainen kasvua ja etäpesäkkeiden että PC-3 PCa soluissa (katso alla).

A) Pakko ilmentyminen miR-200b PC3-soluissa. PC3-soluja trasduced kanssa bisistroninen lentiviraalinen sukkulavektori (pMIRNA1 pCDH-CMV-MCS-EF 1-copRFP) koodaus HSA-miR-200B ja tyhjät vektorisäätö (ctrl). Kokonais-RNA eristettiin ja luki- 200b ilmentyminen mitattiin käyttämällä tosiaikaista RT-PCR: llä. Arvot edustavat kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena kappaleena. *, P≤0.01. (B) miR-200B vähensi kasvainten synnyssä PC-3-solut. Vanhempien PC3-soluja, PC3-solut trasduced kanssa miR ohjaus (ctrl) ja miR-200b injektoidaan subkutaani- takaosaan takaraajat Kateenkorvattomien uroshiirillä (n = 5). Kasvain painosta päivänä 29 injektion näytetään. *, P≤0.05; **, P≤0.01. (C) Kasvaimet ylläpidetään miR-200b ilme. Suhteellinen miR-200B ilmentyminen mitattiin reaaliaikaisella RT-PCR kasvainten paneeli (B). * P≤0.05. (D). miR 200b väheni kasvaimen kasvua käytettäessä potilaalle tehdä malli eturauhassyövän. RFP-tagged PC3-ctrl ja PC3-200b solut implaned vuonna prostates Kateenkorvattomien uroshiirillä. Keskimääräinen fluoresenssi mitattiin 20 päivää injektion jälkeen. (E) Fluoresenssi eläintä kohti määritettiin käyttäen koko kehon kuvantamisen, Olympus OV100 järjestelmään. *, P≤0.05. (F) Cell kasvu mitattiin WST-1-määritystä. PC3-ctrl tai PC3 miR-200b-soluja ympättiin 3000 solua per kuoppa 96-kuoppaiselle levylle. Absorbanssi mitattiin ilmoitettu ajankohtina käyttämällä Biorad Model 680 mikrolevyn lukijaa. Tulokset edustavat keskiarvoa kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolmena kappaleena. *, P≤0.05 Studentin T-testi. (G, H) kasvain leikkeitä värjättiin Ki-67, arvioida leviämisen. Huomautus merkittävä lasku Ki-67-positiivisia ytimet läsnäollessa miR-200b. *, P 0,001.

miR-200b hillitsee PCA Solut

etsii tekijöitä, jotka edistävät laski kasvaimen kasvua, suoritimme solusyklin analyysi PC3 ohjaus ja PC3 asennuspalveli- 200b soluja ja havaittiin lievää G2 /M vaiheessa om miR-200B positiivisten solujen viittaa solusyklin pysähtymiseen (kuva S1). Todellakin, WST-1 määrityksessä eläviä soluja paljastivat lievää mutta merkittävä väheneminen solumäärät MIR-200b positiivisia soluja verrattuna vektorisäädön (kuvio 3g, h). Yhdistettynä merkittävä lasku Ki-67 positiivista ytimet PC-3 kasvaimia upon miR-200B ilmaisu (kuvio 3f), tuloksemme viittaavat siihen, että havaitut laski kasvaimen kasvua johtui vähentynyt proliferaatio.

asennuspalveli- 200b kääntää Epiteelin on Mesencymal Transition PCA Solut

Aiemmissa tutkimuksissa miR-200b ilmentyminen rinta-, maha- ja munuaissolukarsinooma korreloi eriytetympää tilassa, ja uudelleen aloittamisen miR-200b kääntää EMT [ ,,,0],10], [11], [29]. Nämä muutokset voivat lopulta vaikuttaa sekä vähentyneeseen kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. Näin ollen, olemme analysoineet tason tunnettujen EMT ja erilaistumisen markkereita ilmaistaan ​​PC-3-solujen läsnä tai poissa ollessa miR-200b. Ensinnäkin, Western blot-analyysi osoitti merkittävää kasvua tyypillinen Differentiaatiomarkkerien eturauhasen epiteelin sytokeratiinivasta CK8 ja CK18 by miR-200B, mikä viittaa eriytetympää tila miR-200b positiivisia soluja (kuva 4).

(A ). CK 8 ja CK 18 analysoitiin western blot kokonaisproteiinia teissa PC3-ctrl ja PC3 miR-200B-soluissa. (B) kvantitatiivinen analyysi kokeen (A) Image J ohjelmisto. Käyrä edustaa data keskimäärin kaksi itsenäisen kokeen. *, P≤0.05 ja **, p 0,01 Studentin T-testi.

suostumuksella, tasot E-kadheriinin nostettiin (kuvio 5a), mikä viittaa siirtymistä epiteelin fenotyyppiä . Lisäksi vimentiinistä, joka on mesenkymaaliset merkki, tehtiin tilastollisesti merkittävää laskua upon miR-200b ilme. Toinen mesenkymaaliset merkki, fibronektiini (FN) näkyy samanlainen suuntaus, vaikka lasku ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 5b). Koska aikaisemmissa tutkimuksissa miR-200B ohjattu E-kadheriinin ja EMT jonka tukahduttaminen transkriptiotekijä ZEB1, olemme arvioineet molemmat yhteensä ZEB1 proteiinin ja RNA-tasoissa miR-200B-positiivisia ja ohjaus-PC-3-solut. Havaitsimme merkittävän ja toistettavan lasku ZEB1 proteiinia ja mRNA: n vastauksena miR-200b (kuvio 5c, d). Tämä tulos on yhdenmukainen lisääntyneen E-kadheriinin ilmentyminen (kuvio 5a). Tuloksemme osoittavat selvästi, että miR-200B ilmaisun edistää epiteelisolujen ominaisuuksia ja vaimentaa mesenkymaalisten ominaisuuksia PC3-soluissa.

(A) merkkiaineet vaikuttavat miR-200b PC-3-solut. E-kadheriinin, fibronektiinin, ja vimentiinistä havaittiin kokosolulysaateista päässä PC3 ctrl ja PC3 miR-200B-soluissa Western blot. (B) kvantitatiivinen analyysi esitetyssä kokeessa (A) suoritettiin Image J ohjelmisto. *, P 0,05 ja **, p≤0.01 määritettynä Studentin T-testi. Kaksi itsenäistä koetta yhdistettiin. (C) Western blot ZEB1 ja kvantifiointiin suoritettiin kuten edellä (keskiarvo kahdesta kokeesta). (D) päätepiste PCR ZEB1. (E)

In vitro

siirtokuoppaan invaasiomääritys: vertailua PC3-ctrl ja PC3 miR-200B-soluissa. 10% FBS: ää käytettiin kemoattraktantti ja koe suoritettiin kahtena kappaleena. *, P 0,05 Studentin T-testi. (F)

in vivo

spontaanisti metastaaseja PC3-ctrl ja PC3 miR-200B-soluissa. Solut istutettiin ortotooppisesti vatsanpuoleisissa prostates urospuolisten nude-hiirten. Hiiret altistettiin koko kehon kuvantamisen varten RFP-positiivisten massat käyttäen Surface kuva. Lopussa kokeen, eläimet lopetettiin, vatsaonteloon avataan ja etäpesäkkeiden visualisoitu fluoresenssin kuvantamisen poistamisen jälkeen primäärisen kasvaimen sisällä vatsaonteloon ja etuosan seinän vatsan (vatsaonteloon). Kirkas (BF) ja fluoresenssi (RFP, punainen fluoresoiva proteiini) on esitetty. (G) kvantifiointi esitetyssä kokeessa (F). Etäpesäkkeet laskettiin ja koko fluoresenssi kohti etäpesäkkeiden laskettu (vasemmalla). Gross metastaattinen taakka arvioitiin yhteensä fluoresenssi hiirtä kohti. Ctrl osoittaa ohjaus ja 200b osoittavat miR-200b. **, P≤0.01 Studentin T-testi.

miR-200B Vähennykset ja metastaasit PC-3 solujen

Koska miR-200B aiheutti EMT kääntyminen PCa PC- 3-soluissa, oli kohtuullista odottaa vähentynyt invasiivisia potentiaali samoin. Käyttäen normaali menettely mitata soluinvaasiota, havaitsimme merkittävää laskua prosenttiosuuden hyökkäsi solujen johtuu miR-200B ilmentymisen verrattuna kontrolliin (kuvio 5e). Tämä vähentynyt invaasio todennäköisesti taustalla pieneni alueellisen etäpesäke mukaan PC3 miR-200B-soluissa

in vivo

.

Orthotopic injektion vanhempien PC-3 ja vektorisäädön solujen selkäpuoli prostates Kateenkorvattomien mies hiirille aiheutti spontaaniin etäpesäkkeiden, kuten havaittiin poistamisen jälkeen primäärikasvaimissa (Fig. 5f ja kuvio S2). Yleisenä johtuva fluoresenssi etäpesäkkeitä oli dramaattisesti vähentynyt hiirissä istutettu PC-3-solut yli-ilmentävät miR-200b (kuvio 5f, g ja kuvio S2). Niinpä meidän tiedot viittaavat siihen, että miR-200B merkittävästi vähentää mesenkymaalisten piirteitä eturauhassyövän soluissa ja vähentää siten niiden invasiivisen ominaisuudet ja metastaattista potentiaalia.

miR-200B Vähentää tuumoriangiogeneesissa

Toinen ominaisuus, joka voi mahdollistaa etäpesäke on angiogeneesiä ja EMT on usein mukana lisääntynyt angiogeneesiä. Ilmaisu Mir-200b näytti kääntää angiogeenisten kytkimen PC-3-solujen kuten osoituksena pieneni mikrovaskulaarisia tiheys miR-200b kasvain verrattuna vanhempien PC-3 tai vektorisäätö kasvaimet (Fig. 6).

Palasia kasvaimista muodostama ohjaus ja miR-200B positiivisia PC-3 kasvaimia värjättiin endoteelimerkkiaineelle CD31 ja määrää mikrosuonten kohti kentän määritettiin kymmenessä 10 × kenttiä. *, P 0,01.

Keskustelu

miR-200 perhe on kasvain esti perheen mikroRNA että kriittisiä rooleja tukahduttamista EMT. Vaikka rooli miR-200 perheen rinta- ja joissakin muissa epiteelisyövissä on vakiintunut, on olemassa muutamia havaintoja yhdistää miR-200 eturauhassyövän. Pienimuotoinen tutkimus (20 potilasta) ehdottaa yhdistyksen välillä biokemiallisten uusiutuminen jälkeen eturauhasen ja alempien tasojen miR-200C [30]. Eräässä tutkimuksessa, jonka hän

et al.

Osoittaa, että alhainen miR-200b-3p androgeeni-riippumaton solujen aiheuttama vähentynyt ilmentyminen p-53-liittyvän proteiinin p73 ja osaltaan edistää proliferaatiota [31] . Kaksi klusterit, jotka koodaavat miR-200 perhe löytyvät kromosomeissa 1 ja 12, joissa miR-200b miR-200a, ja miR-429 kromosomissa 1 ja miR-200C ja miR-141 kromosomissa 12. MicroRNA 200c arvellaan epiteelin-spesifinen, ja sen ilmentyminen on tukahdutettu hypermetylaatiota proksimaalisen CpG-saarekkeen fibroblasteissa ja rintasyövän solulinjoissa [32]. PC-3, mutta ei LNCaP ja DU145 PCa soluja, samanlainen hypermetylaatiota CpG-saarekkeen osuu alhainen miR-200c ja miR-141 [32]. Vastaa meidän tuloksia, tässä tutkimuksessa PC3 solujen negatiivisia miR-200c ja miR-141, näyttää selkeä mesenkymaalisten fenotyyppi ja kyky ja metastaasit [32]. Kahdessa tutkimuksessa osoittavat roolin miR-200 kasvainten synnyssä jonka PCA kantasoluja. Varren kaltainen PCa solujen ilmentymisen Sox2, Nanog, Oct4, Lin28B ja /tai Notch1 on sopusoinnussa parannettu klonogeenisten eloonjääminen ja kyky muodostaa sferoideja (prostaspheres). Nämä tavoitteet perustuvat kaltaisia ​​piirteitä on kytketty vähentynyt ilmentyminen miR-200b /c ja /tai anna-7 perheen jolloin uudelleen ilmentäminen miR-200 estää prostasphere muodostumista ja vähentää Notch1 ja Lin28B, kuljettajat itseuudistumisen [33] . Vuonna liity tutkimuksessa invasiivisia tuumorigeenisen kloonit peräisin eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) -1 solulinjaa kroonisesti alttiina TGF-β näyttö näkyvästi EMT ominaisuuksia korkea SNAI2, ZEB1, ja ZEB2, kaikki vahvistivat miR-200 tavoitteet; kuitenkin, pohjapinta miR-200 tasot näissä soluissa säilyvät muuttumattomina viittaa eriäviä mekanismi [34].

Augmented varsi kaltaisia ​​piirteitä ehdottavat parannettu kasvainten muodostumiseen. Todellakin, useat ryhmät ovat osoittaneet, että miR-200B muuttaa kasvuvauhti kokeellisia kasvaimia viljellyt PCa soluihin [35]. Tuloksemme selvästi vahvistaa nämä havainnot.