Krooninen sairaus

tiivistelmä

TMPRSS2-ERG

risteyksessä onkogeeni on läsnä yli 50%: lla potilaista, joilla on eturauhasen syöpä ja sen ilmentyminen liittyy usein huonoon ennusteeseen. Tavoitteena on saavuttaa geeni pudotus siRNA TMPRSS2-ERG ja arvioida sitten biologisia vaikutuksia tämän eston. Ensiksi suunnittelimme siRNA vastaan ​​kaksi

TMPRSS2-ERG

fuusio variantteja (III ja IV), useimmin tunnistettu potilaiden koepaloja. Kaksi viidestä siRNA: ita testattu havaittiin tehokkaasti estävän mRNA sekä

TMPRSS2-ERG

variantteja ja laskevan ERG proteiinin ilmentymisen. Mikrosiruanalyysi varmistettiin lisäksi ERG esto sekä siRNA TMPRSS2-ERG ja paljasti yksi yhteinen alassäädetty geeni,

ADRA2A

, osallistuvat solujen proliferaatio ja migraatio. SiRNA vastaan ​​TMPRSS2-ERG fuusio variantti IV osoitti korkeimman antiproliferatiivisia vaikutuksia: vähentynyt merkittävästi solujen elinkykyä, lisääntynyt lohkaista kaspaasi-3 ja esti klusterin Antiapoptoottisten proteiineja. Ehdottaa konkreettisia terapeuttinen lähestymistapa, siRNA TMPRSS2-ERG IV konjugoitiin skvaleenia, joka voi itse järjestää kuten nanohiukkaset vedessä. Nanopartikkelit siRNA TMPRSS2-ERG-skvaleenin injektoitiin suonensisäisesti SCID-hiirissä vähensi kasvua VCAP ksenosiirrettyjä kasvaimia, esti onkoproteiinia ilmaisun ja osittain palautettu eriyttäminen (väheneminen Ki67). Johtopäätöksenä tässä tutkimuksessa tarjoaa uuden mahdollisuuden hoito eturauhasen syöpä perustuu siRNA-skvaleeni nanopartikkelien kohdistaminen

TMPRSS2-ERG

risteyksessä onkogeeni.

Citation: Urbinati G, Ali HM, Rousseau Q, Chapuis H, Desmaële D, Couvreur P, et ai. (2015) antineoplastiset vaikutukset siRNA vastaan ​​TMPRSS2-ERG Junction Oncogene eturauhassyövässä. PLoS ONE 10 (5): e0125277. doi: 10,1371 /journal.pone.0125277

Academic Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 14 tammikuu 2015; Hyväksytty: 22 maaliskuu 2015; Julkaistu: 01 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Urbinati et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Mikrosiruanalyysi tutkimukseen liittyvät on toimitettu Array Express tietovarastoon Eurooppa Bioinformatics Institute (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/), tulonumerolla: E-MTAB-2838.

rahoitus: tutkimus näihin tuloksiin johtanut on saanut rahoitusta Agence Nationale de Recherche (ANR), Program P2N, Grant nro NANO 00301.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa .

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA), androgeeni kasvain, on tullut yleisin syöpä miehillä (27% kaikista syövistä miehillä) ja edustaa 4

th kuolinsyy syöpä ja 2

nd miehillä. Vuonna 2014 arvioitu esiintyvyys oli noin 230000 tapauksia Yhdysvalloissa ja 417000 tapausta Euroopassa (ACS. American Cancer Society,

ACS

.

org

; WHO. Euroopan Cancer Observatory,

eu-syöpä

.

IARC

.

fr

). Tärkeimpiä riskitekijöitä ovat ikä, suvussa ja mustan etnisen alkuperän vaan syövän synnyn seurausta yhteisvaikutuksesta sekä ympäristö- ja sisäiset tekijät [1]. Tavanomainen hoito eturauhasen syöpä on androgeenista vajaushoidon; Huolimatta siitä, korkea vastaus tähän terapia, useimmat potilaat edetä kastraatio vastus [2]. Vuodesta 2010 viisi uutta US Food and Drug Administration-hyväksytty hoidot ovat olleet saatavilla kastraatio kestäviä ja metastasoituneen eturauhasen syöpiä (Kabatsitakseli, Enzalutamide, abirateronin asetaatti, Sipuleucel T,

223Radium kloridi). Kuitenkin sivuvaikutukset näiden uusien lääkkeiden ei ole vielä vakiintunut ja potilas eloonjääminen on parantunut vain hieman, jolloin lievittävää pikemminkin kuin hoitomuotojen [1, 3]. Näin ollen uusien hoitomuotojen kehittämiseen on edelleen erittäin suositeltavaa ja välttämätön.

Tomlins

et al

., Löysivät geenin fuusio nimeltä TMPRSS2-ERG yli 50% eturauhasen syöpiä [4] . TMPRSS2-ERG johtuu uudelleen järjestelyn vaikuttavat kromosomi 21 johtaa fuusio geenin säätelevät androgeenien

TMPRSS2

, jossa transkriptiotekijä

ERG

[5]. Fuusio

TMPRSS2-ERG

johtaa yli-ilmentyminen ERG eturauhanen; Tämä edistää eturauhasen kasvain taudin alkamisen ja etenemisen. Johdonmukaisesti, huomattava määrä tiedot viittaavat siihen, että tämä fuusio antaa aggressiivisempi fenotyyppi, ja se voi vaikuttaa lopputulokseen paikallinen käsitellyt kasvaimet androgeenien puute hoidon [5-11]. Yli 17 selostukset on havaittu

TMPRSS2-ERG

risteykseen onkogeeni ja tunnetuin, kuvannut Wang

et al

. on nimetty variantteja I-VIII [12]. Niiden joukossa yleisin variantit löytyy potilaiden koepaloja ovat variantit III ja IV ja tulos liittymästä eksonin 1

TMPRSS2

kanssa eksonit 4 ja 5

ERG

, vastaavasti. Molemmat fuusiot johtavat yli-ilmentyminen katkaistun mutta toimiva ERG proteiini [12-14]. Lisäksi erilaisia ​​fuusio-transkriptien kuvattu saman kasvaimen [15, 16].

Huolimatta siitä, että pienet häiritsevät RNA: t (siRNA: t) ovat erittäin spesifisiä ja tehokkaita hyvin pieninä pitoisuuksina, ne ovat epästabiileja biologisissa nesteet ja hydrofiilinen luonne vaikeuttaa niiden tavoitteellinen toimitusaika ja sisäänottoa soluihin. Parantaakseen vakautta, suojella heitä nukleaasilta hajoamista ja parantaa niiden hydrofobinen luonne, ne on paremmin kuljettaa ja kehoon [17]. Olemme äskettäin osoittaneet tehokkuutta ”squalenoylation” teknologia vectorise siRNA suunniteltu vastaan ​​

RET /PTC1

ja

RET /PTC3

risteyksessä onkogeenien, ja ehdotti, että squalenoylation tarjoaa uuden ei-kationisia alustan siRNA toimitus [18, 19]. Tietäen, että merkittävä prosenttiosuus eturauhasen pahanlaatuisen suhtautuu

TMPRSS2-ERG

risteyksessä onkogeeni, tavoitteenamme on ottaa käyttöön uusia potentiaalisia terapeuttisia lähestymistavan siRNA kohdistus

TMPRSS2-ERG

risteyksessä onkogeeni potilailla, joilla on eturauhasen syöpä. Tuloksemme osoittavat konkreettisesti kliininen sovellus eturauhassyöpähoidolle perustuu TMPRSS2-ERG knockdown.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

Kaikki käytetyt kemikaalit olivat korkeinta analyyttistä laatua . Skvaleenia, siRNA: t, MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi] reagenssia ja paraformaldehydi (PFA, 16%) ostettiin Sigma-Aldrich Chemical Co. (Saint Quentin Fallavier , Ranska). 3′-tiolia modifioitu siRNA: t hankittiin Eurogentec (Belgia) ja Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM), Opti-MEM, vasikan sikiön seerumi (FCS), Lipofectamine RNAiMAX ja PCR-alukkeet ostettiin Life Technologies (Saint Aubin, Ranska). BD Matrigel (tyvikalvon Matrix Growth Factor alennetulla viite 356234) hankittiin Corning (Amsterdam, Alankomaat). Bio-RAD-proteiinin määritys ostettiin Bio-Rad Laboratories (Marnes-la-Coquette, Ranska). Anneksiini V-Fluos -värjäyspakkausta ostettiin Roche (Meylan, Ranska). NucView 488 kaspaasi-3 kit ostettiin VWR (Fontenay-sous-Bois, Ranska). Proteomi Profiler Human Apoptoosi Array pakki ostettiin R niiden sekvenssit selviävät S2 taulukossa. SiRNA ohjaus on sekvenssi siRNA TMPRSS2-ERG IV (1) viidellä epäsuhta. Kaikki yksijuosteiset siRNA: ita syntetisoitiin Sigma-Aldrich Chemical Co. (Saint Quentin Fallavier, Ranska) kuin 21-mer kaksi 3′-overhanging 2′- deoksinukleotidi- tähteitä antamaan stabilointi vastaan ​​nukleaasien [21]. Toimiminen skvaleenin bio-konjugaatio, 3-merkaptopropyyli fosfaattiryhmän esiteltiin 3′-päähän siRNA juosteen (syntetisoidut Eurogentec, Belgia).

In vitro

solussa transfektio

Transient transfektiot suoritettiin, jotta: i) arvioida tehokkaimman siRNA TMPRSS2-ERG suunniteltu [siRNA III (1, 2, 3), tai IV (1, 2)], ii) löydettäisiin tehokkain siRNA pitoisuus, iii) arvioi tehokkuutta siRNA: iden, iv) analysoida knockdown vaikutukset solujen elinkelpoisuuteen, apoptoosin ja säätelyn v) tarkastaa

TMPRSS2-ERG

knockdovvn tehokkuus, ja ilman transfektoimalla aineet, jälkeen siRNA TMPRSS2-ERG squalenoylation.

Transient transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX transfektoimalla mukainen aine valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 8 x 10

5 Vcap Solut siirrostettiin kuusi astian levyillä, joissa DMEM 10% FCS, penisilliini (100 U /ml) ja streptomysiiniä (10 ug /ml), käyttäen eri siRNA pitoisuuksia ja 6 ui Lipofectamine RNAiMAX. Soluja inkuboitiin siRNA 24 h, 48 h ja 72. FAM-leimattua siRNA Ohjaus tarkkailuun käytettiin tehokkuuden siRNA transfektion.

valinta tehokkaan siRNA pitoisuus, VCAP soluja transfektoitiin valitulla tehokas siRNA: t TMPRSS2-ERG III tai IV 2,5 nM, 10 nM, 25 nM ja 50 nM, ja inkuboitiin 48 tuntia. Lopussa hoitoja, mRNA: n ja proteiinit uutettiin soluista voidaan analysoida geenin ja proteiinin pudotus.

Reaaliaikainen PCR (RT-qPCR) B

Kokonais-RNA uutettiin Vcap soluihin käyttäen RNeasy mini-(Qiagen, Courtaboeuf, Ranska). Ensimmäisen juosteen cDNA muodostettiin M-MLV RT-puskuria pack (Promega, Charbonnières-les-Bains, Ranska). Reaaliaikainen PCR (qPCR) toteutettiin StepOnePlus PCR System (AB Applied Biosystems, Villebon-sur-Yvette, Ranska) käyttäen GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Charbonnières-les-Bains, Ranska) mukaan valmistajan ohjeiden. Näytteet ajettiin kolmena kappaleena; geenisäätelyn määritettiin 2

-ΔΔCt menetelmä ja normalisoitiin GAPDH tasolle. Sillä pudotus kokeiden tulokset on esitetty suhteellisina mRNA-tasoja verrattuna ei-käsiteltyihin soluihin.

immunoblottauksella

Yhteensä proteiiniuutteita saatiin käyttämällä M-PER-reagenssia (Thermo Fisher Scientific Courtaboeuf, Ranska), johon joiden proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Neuilly sur Seine, Ranska). Proteiinit titrattiin Bio-RAD mukainen määritys valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten näytteet ladattiin 10% polyakryyliamidigeelillä (NuPAGE Bis Tris Mini geelit 10%, Life technologies, Saint-Aubin, Ranska) ja proteiinit siirrettiin käyttäen iBlotDry Blotting System (Invitrogen, Ranska). Kalvoja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa joko seuraavista ensisijaisen vasta: monoklonaalinen kanin ERG (EPR 3864 (2), 1: 500, Abcam Biochemicals, Pariisi, Ranska) tai monoklonaalinen kanin kaspaasi-3 (1: 1000, Cell Signalling teknologia, Saint Quentin en Yvelines, Ranska. Ref: 9662). Hiiren monoklonaalinen GAPDH-HRP: tä (1: 1000, Cell Signalling tekniikka, Saint Quentin en Yvelines, Ranska. Ref: 3683) käytettiin sisäisenä kontrollina. Sitten blotit pestiin ja inkuboitiin johdetun anti-kani tai anti-hiiri-vasta-aineita konjugoituna HRP (piparjuuren peroksidaasi, 1: 3000, Cell Signalling teknologia). Bändit visualisoitiin tehostetulla kemiluminesenssin reagenssilla (Invitrogen, Ranska).

elinkyvyn

elinkelpoisuus VCAP solujen arvioitiin MTT: llä 72 h kuluttua inkubaation siRNA TMPRSS2-ERG tai Ohjaus 50 nM pitoisuus. MTT-analyysi suoritettiin myös 72 h kuluttua solujen transfektion siRNA TMPRSS2-ERG III ja IV 0.1 nM, 1 nM, 2,5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM ja 200 nM. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD kaksi erillistä koetta, jotka sisältävät 8 toistetaan kunkin kunnossa ja ilmaistaan ​​elinkelpoisuuden prosenttiosuutena käsiteltyjen solujen verrattuna ei-käsiteltyihin soluihin.

Koko genomin mikrosiruanalyysi

kolme riippumatonta transfektiot suoritettiin 50 nM siRNA TMPRSS2-ERG III siRNA TMPRSS2-ERG IV ja siRNA valvonta käyttöön VCAP soluissa. Yhteensä RNA: t käsittelemättömän ja transfektoidut solut uuttamalla RNeasy mini-(Qiagen, Courtaboeuf, Ranska). Protocol on yksityiskohtaisesti Array Express (hakunumero: E-MTAB-2838) ja aikaisemmin kuvattu Gilbert-Sirieix [22]. MRNA Sitten leimattu fluoresoivalla alhaisen input lineaarisen vahvistuksen Kit (Agilent Technologies, Massy, ​​Ranska). Lyhyesti, käänteinen transkriptio suoritettiin käyttämällä M-MLV-käänteistranskriptaasia. Sitten, syaniini 3-leimattua cDNA luotiin käyttäen T7 RNA-polymeraasia. Hybridisaatiot tehtiin 17 tuntia 60 ° C: Agilent ihmisen koko genomin oligo microarray 8x60k joko 1 ug käsittelemättömien solujen tai siRNA TMPRSS2-ERG III siRNA TMPRSS2-ERG IV tai siRNA Ohjaus transfektoiduissa soluissa. Dioja skannattiin käyttäen Agilent 2505 C DNA-siru skanneri ja mikrosirujen kuvat analysoitiin Piirreirrotusmoduuli ohjelmistoversio 10.7.3.1 (Agilent Technologies). Raw tiedostoja normalisoitiin kanssa Limma menettelyä. Me määritelty ylös- tai alaspäin-määräysten suhteita yli kaksinkertaisesti välillä VCAP transfektoitujen solujen siRNA (TMPRSS2-ERG III TMPRSS2-ERG IV ja ohjaus sekvenssit) ja käsittelemättömien VCAP soluja, jotka on hankittu kertainen löytö korko ≤ 0,05 ja vähimmäisvalovoimasta ≥ 100. jotta tulkita biologisen merkityksen genomisen tietojen käytimme nerokkuus ohjelmisto (www.ingenuity.com). Sitten aitoutta microarray aineisto validoitu RT-qPCR, on muutamia TOP 10 ylä- tai alassäädetty geenien siRNA TMPRSS2-ERG III ja IV. Gene alukkeet suunniteltiin käyttäen Oligo Explorer 1.1.0 ja Oligo Analyzer 1.0.2 ohjelmia (Kuopion yliopisto, Kuopio, Suomi, alukkeet sekvenssit selviävät S3 taulukko). Alukkeet valitaan sulamislämpötila 60 ° C ja amplikonin koko 100-200 emäksiä. Näytteet ajettiin kahtena alukkeen sarjaa kiinnostuksen kohteena olevan geenin ja

GAPDH

sisäisenä kontrollina geenin.

anneksiini-V apoptoosimäärityksessä

Apoptoosi määritettiin virtaussytometrialla analyysi käyttämällä anneksiini-V-Fluos värjäys sarja sisältää sekä anneksiini V sitoutuu fluoreseiini ja propidiumjodidilla (PI). Vcap solut transfektoitiin 50 nM siRNA TMPRSS2-ERG III, IV tai siRNA Control läsnä Lipofectamine RNAiMAX. 72 h kuluttua tai 96h inkuboinnit, keskipitkän ja solut kerättiin ja sentrifugoitiin ja sitten värjätään käyttämällä anneksiini-V-Fluos -värjäyspakkausta mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Näytteet analysoitiin sitten virtaussytometrillä (Accuri C6 -virtaussytometrillä, BD Biosciences, San Jose, USA). Kymmenentuhatta tapahtumia valitun väestön analysoitiin ja elektroniset korvaus instrumentin suoritettiin jättää osittain sama emissiospektreissä (Fluoreseiini ja PI). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja käsiteltyjen solujen kussakin vaiheessa solukuoleman verrattuna ei-käsiteltyihin soluihin.

Cell apoptoosin määrityksiä

Apoptoosi arvioitiin IncuCyte järjestelmän (Essen Instruments, Ann Arbor, Michigan, USA), joka mahdollistaa seurannan elävien solujen viljelmässä ajan mittaan ja määrällisesti apoptoottisten solujen laskemalla fluoresoivat tumat läsnä per mm

2 alueen jokaisen kuvan. Kaspaasi 3/7 alustan (NucView488 kaspaasi-3-kit) käytettiin seuraamaan kaspaasiaktiivisuus elävissä soluissa reaaliajassa. Kun substraatti pilkotaan aktivoitu kaspaasi-3/7, korkean affiniteetin DNA-väriaine vapautuu ja kulkeutuu solutumaan värjätä sen kirkkaasti. Wells skannattiin (6 kuvaa /kuoppa) joka 12h, jonka IncuCyte seurannan fluoresenssin kullekin kuvalle.

Vcap solujen (30000 /kuoppa) ympättiin 96-kuoppalevyille 100 ui DMEM, joka sisälsi FCS: ää ja antibiootteja, ja transfektoidaan 50 nM siRNA TMPRSS2-ERG III, IV tai siRNA ohjaus. Apoptoosin havaitsemiseen kit NucView 488 kaspaasi-3/7 lisättiin ja solujen levyt sijoitettiin IncuCyte mukaisesti inkubaatio-olosuhteissa. Koe suoritettiin kolmena kappaleena ja fluoresoiva apoptoottisten signaalin siRNA transfektoiduissa soluissa verrattiin ei-käsiteltyjä soluja.

Proteome apoptoosin Profiler array

Ensinnäkin, lyhytaikaista transfektiota siRNA: iden TMPRSS2-ERG III, IV ja siRNA valvonta suoritettiin Vcap soluissa 72 tunnin ajan, kuten edellä on kuvattu. Solut hajotettiin ja proteiinipitoisuus määritettiin Bio-RAD mukainen määritys valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jokainen proteiini näyte (ei-käsiteltyjen Vcap soluja, käsiteltiin Vcap solut siRNA TMPRSS2-ERG III, IV tai siRNA Control) inkuboitiin sitten yön yli ”Human Apoptosis Array” (R 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä tasolla.

Tulokset

tunnistaminen TMPRSS2-ERG variantit VCAP soluissa

Ensin tunnettu TMPRSS2-ERG transkription tuotteiden VCAP solulinjassa että ilmentävät endogeenisesti

TMRPSS2-ERG

fuusio onkogeeni. Kahdeksan suunniteltu alukkeita käytettiin tunnistamaan variantteja TMPRSS2-ERG päässä I-VIII (S1 taulukko). Kuten taulukosta 1, RT-qPCR, fuusio variantteja III ja IV todettiin olevan erittäin ilmaistaan ​​VCAP soluissa (Ct vastaavasti 20 ja 23), kun taas variantteja I, II, VII ja VIII olivat heikosti ilmaistu (Ct 30 ). Fusion variantit V ja VI ei havaittu ilmaistaan ​​tässä solulinjassa. Koska fuusio variantit III ja IV ovat erittäin ilmaistu VCAP soluissa ja vastaavat yleisimmät variantit läsnä eturauhassyövän biopsiat, ne valittiin jatkotutkimuksiin myötävaikutuksella pudotus siRNA.

siRNA TMPRSS2-ERG vastaan variantit III ja IV vähentää onkogeenin ilmentymisen ja vaikuttavat VCAP solujen elävyyden

Suunnittelimme 10 siRNA TMPRSS2-ERG liitoksen yli: eksoni 1 TMPRSS2-eksoni IV ERG muunnokseen III ja eksoni 1 TMPRSS2-eksoni V ERG muunnokseen IV . Mukaan Reynoldsin sääntöjä [20], kolme siRNA sekvenssit vastaan ​​variantti III TMPRSS2-ERG ja kaksi siRNA sekvenssit vastaan ​​variantti IV valittiin mahdollisesti olevan tehokas vastaan ​​muunnoksin, kuten on esitetty S2 taulukossa.

tehokkuuden siRNA suunniteltu vastaan ​​

TMPRSS2-ERG

äänenvaimennusjärjestelmissä vastaava fuusio onkogeeni testattiin ensin RT-qPCR klo 24, 48h ja 72h VCAP soluissa. Kuten taulukosta 2, neljä siRNA: t havaittiin tehokas geenien [siRNA TMPRSS2-ERG III (1, 2, 3) ja TMPRSS2-ERG IV (1)]. Huomattavaa on, siRNA TMPRSS2-ERG III (1) ja siRNA TMPRSS2-ERG IV (1) osoitti paremman pitkäaikaisen mRNA inhibitiota verrattuna siRNA ERG (at 72h: 70% inhibitio meidän suunniteltu siRNA

vs

30 % esto kaupallistettu siRNA ERG). On huomioitava, että siRNA TMPRSS2-ERG IV (1) aiheutti eniten eston TMPRSS2-ERG mRNA-tasot sekä varianttien III ja IV (taulukko 2). Kuten odotettua, sekoituskoodin siRNA (siRNA Control) eivät osoittaneet mitään inhibitio fuusio geenin transkriptien.

Sitten tutkimme tehokkuutta siRNA: iden TMPRSS2-ERG estoon proteiinin ilmentymistä 24 h, 48 h ja 72h Western blot käyttämällä ERG vasta-ainetta (kuvio 1a). Niistä siRNA: t on suunniteltu vastaan ​​TMPRSS2-ERG variantti III, sekä siRNA TMPRSS2-ERG III (1) ja (2) osoittivat parempaa vaiennettu tehoa kuin TMPRSS2-ERG III (3) ja saavuttivat suurin aktiivisuus 72. Koskevat siRNA TMPRSS2-ERG variantti IV, vain siRNA TMPRSS2-ERG IV (1) väheni ERG valkuaispitoisuus. Kuten edellisen siRNA, korkein pudotus tehokkuus havaittiin 72 (kuvio 1a).

Vcap-solut transfektoitiin 24 h, 48 h ja 72 h 50 nM siRNA: iden TMPRSS2-ERG III (1, 2, 3 ), siRNA: t TMPRSS2-ERG IV (1, 2), siRNA vastaan ​​ERG villityypin tai siRNA ohjaus. a. Western blot-analyysi: ilmaus ERG proteiinin havaittiin Western blot osoitti vaikutuksia siRNA: iden vastaan ​​TMPRSS2-ERG ERG villityypin tai siRNA ohjaus. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina (kuvat edustavat kolmea riippumatonta koetta). b. MTT solunelinkykyisyysmääritys: Vcap solut transfektoitiin siRNA TMPRSS2-ERG III (1, 2), TMPRSS2-ERG IV (1) ja siRNA Ohjaus 50 nM konsentraatio ja inkuboitiin 72. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SD 2 itsenäisen kokeen sisälsi 8 ​​rinnakkaista kunkin kunnossa. Lukumäärä elinkykyisiä soluja mitattiin ja 100% solujen elinkelpoisuuden vastaa elävien solujen lukumäärään inkuboitiin vain transfektoimalla aineen. *** =

p

0,001, merkittävä lasku verrattuna käsittelemättömiin soluihin tai siRNA ohjaus (Kruskal Wallis seurasi Tukey ja Dunnet testi).

Jotta ymmärtää biologiset vaikutukset onkogeenin pudotus, arvioimme elinkelpoisuus transfektion jälkeen siRNA [siRNA TMPRSS2-ERG III (1 ja 2), IV ja siRNA valvonnan] 50 nM pitoisuus Vcap soluissa. Kuten kuviossa 1 b, MTT määrityksissä havaittiin merkittävä esto in kasvu kaikissa siRNA verrattuna käsittelemättömiin soluihin (

p

0,0001). Kuitenkin vain siRNA TMPRSS2-ERG III (1) ja IV (1) väheni kasvu (vastaavasti 20% ja 40%) verrattuna siRNA ohjaus (kuvio 1 b).

Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että sekä siRNA TMPRSS2-ERG III (1) ja TMPRSS2-ERG IV (1) ovat erittäin tehokkaita mRNA ja proteiini estoja ja pienentää solujen kasvua. Näin ollen nämä siRNA: t valittiin edelleen kattavia tutkimuksia ja eteenpäin nimetty siRNA TMPRSS2-ERG III ja siRNA TMPRSS2-ERG IV vastaavasti.

Pieniä pitoisuuksia siRNA TMPRSS2-ERG III ja IV estävät onkogeeni ja onkoproteiinia ilmaisuja, mutta ei vaikuttanut solujen elävyyden

jotta voidaan arvioida optimaalinen pitoisuus on edelleen käyttää

in vivo

tutkimuksissa selvitettiin jos siRNA TMPRSS2-ERG III ja IV voisivat estää TMPRSS2-ERG-geenin ja proteiini tasoa pienemmillä pitoisuuksilla kuin 50 nM. RT-qPCR ja Western blot suoritettiin 48 h (aika, joka vastaa korkeinta alassäätöä aktiivisuutta). Mielenkiintoista on, että inhiboivia vaikutuksia sekä siRNA: iden TMPRSS2-ERG havaittiin alkaen 2,5 nM pitoisuus (

p

0,001, kuvio 2a RT-qPCR ja 2b Western blot). Sitten solujen elinkykyisyys testattiin myös 72 h kuluttua transfektion siRNA TMPRSS2-ERG III, IV ja siRNA Ohjaus 0,1-200 nM. Huomattavaa on, että sekä siRNA TMPRSS2-ERG III (

p

0,05) ja IV (

p

0,001) esti merkittävästi kasvuvauhti alkaen 50 nM, kun taas pienemmät pitoisuudet eivät vaikuttaneet solu elinkelpoisuus ja korkeammat pitoisuudet eivät kasvaneet solujen kuolleisuutta (kuvio 2c). Mitä tulee siRNA ohjaus, lasku solujen elinkelpoisuuden havaittiin suurilla pitoisuuksilla (100 nM, 150 nM ja 200 nM), mikä todennäköisesti johtuu tahattoman myrkyllisiä vaikutuksia, vaikka se ei vaikuta solujen elinkelpoisuuden 50 nM konsentraatio. Siksi 50 nM konsentraatio näyttää olevan optimaalinen annos saadaan paras konkreettisia vaikutuksia kannalta geenin pudotus tehokkuuden ja solujen kuolleisuus (kuvio 2).

VCAP solut transfektoitiin 72 h 2,5 nM 50 nM siRNA TMPRSS2-ERG III siRNA TMPRSS2-ERG IV tai siRNA ohjaus. a. RT-qPCR analyysi: suhteellinen TMPRSS2-ERG fuusio variantit III ja IV mRNA analysoitiin ja verrattiin ei-käsiteltyjen solujen. Tulokset on normalisoitu GAPDH mRNA: n ilmentymisen. Bars: keskiarvo ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. * =

p

0,05; *** =

p

0,001, merkittävää muutosta verrattuna käsittelemättömiin soluihin käyttäen Kruskal Wallis seurasi Tukey ja Dunnet testi. b. Western blot-analyysiä käytettiin havaitsemaan vaikutuksia siRNA TMPRSS2-ERG III, IV tai siRNA ohjaus ekspressioon ERG proteiinia. GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina (kuvat edustavat kolmea riippumatonta koetta). c. MTT elinkelpoisuuden määritys: siRNA TMPRSS2-ERG III siRNA TMPRSS2-ERG IV tai siRNA Ohjaus transfektoitiin 72 eri pitoisuuksilla (0,1 nM-200 nM). Sata prosenttia solujen elinkelpoisuuden vastaa elävien solujen lukumäärään inkuboitiin transfektoimalla aineen vain. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD kaksi erillistä koetta, jotka sisältävät 8 rinnakkaista kustakin kunnossa. * =

p

0,05, ** =

p

0,01, *** =

p

0,001, merkittävä lasku verrattuna käsittelemättömiin soluihin (TA ) tai siRNA ohjaus (Kruskal Wallis seurasi Tukey ja Dunnet testi).

Yhdistelmä siRNA TMPRSS2-ERG III ja IV ei parantunut knockdown tehoa ja solukasvuneston

sitten arvioitiin jos molempia siRNA: iden TMPRSS2-ERG III ja siRNA TMPRSS2-ERG IV parantunut TMPRSS2-ERG-geenin ja proteiinin estoja. a. b. c. b. c. d.