Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Muutokset DNA-metylaation syöpä ovat maailmanlaajuinen hypometylaatio ja geenispesifisiin hypermetylaation. Ei ole selvää, ovatko nämä kaksi epigeneettiset virheet mekaanisesti liitetty tai esiintyä itsenäisesti. Tämä tutkimus suoritettiin määritellä suhde DNA hypometylaatio, hypermetylaation ja mikrosatelliittien epävakautta syöpään.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tutkimme 61 syöpäsolun linjat ja 60 peräsuolen karsinoomat ja niiden viereisten kudosten avulla LINE-1 bisulfiitti-PCR korvikkeena maailmanlaajuisen demetylaatio. Peräsuolen karsinoomat kanssa satunnaista mikrosatelliittien epävakaus (MSI), joista suurin osa johtuu CpG Island metylaatio fenotyyppi (CIMP) ja liittyvät MLH1 promoottori metylaatio, osoittivat keskimäärin eroa LINE-1 metylaatio normaalin viereisten ja syöpä kudoksiin. Mielenkiintoista, jotkut kasvain näytteet tässä ryhmä osoitti kasvua LINE-1 metylointi. Sen sijaan, MSI-havaittiin merkittävä väheneminen LINE-1 metylaatio normaalin viereisten ja syöpä kudoksiin (P 0,001). Mikrosiruanalyysi toistuvia elementin metylaation vahvistanut tämän havainnon ja osoitti suurta vaihtelua hypometylaatio näytteiden välillä. Lisäksi valvomattoman hierarkkinen klusterointi tunnistettu ryhmä erittäin hypometyloidut kasvaimia, koostuu pääasiassa kasvaimia ilman microsatellite epävakautta. Laajensimme LINE-1 analyysi syöpäsolun linjat eri kudosten ja havaitsi, että 50/61 olivat hypometyloidut verrattiin perifeerisen veren lymfosyyttejä ja normaalin paksusuolen limakalvolla. Mielenkiintoista, nämä syöpäsolun linjat oli myös suuri vaihtelu demetylaation, joka oli kudosspesifisiä ja siten todennäköisesti tuloksena peräisin stokastinen prosessi.

Päätelmä /merkitys

Global hypometylaatio on osittain käänteinen in syöpiä mikrosatelliittien epävakautta ja osoittaa myös vaihtelevat suuresti syöpää, mikä saattaa kuvastaa vaihtoehtoisia etenemisen reittejä syövässä.

Citation: Estécio MR, Gharibyan V, Shen L, Ibrahim AE, Doshi K, hän R, et ai . (2007) LINE-1 hypometylaatio in Cancer vaihtelee suuresti ja korreloi käänteisesti Mikrosatelliittimarkkerien Epävakaus. PLoS ONE 2 (5): e399. doi: 10,1371 /journal.pone.0000399

Academic Toimittaja: M. Cristina Cardoso, Max Delbrueck Center for Molecular Medicine, Saksa

vastaanotettu: 10 tammikuu 2007; Hyväksytty: 04 huhtikuu 2007; Julkaistu: 02 toukokuu 2007

Copyright © 2007 Estecio et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Institutes of Health (USA) myöntää CA098006, CA100632 ja CA105346 (JP.JI) ja FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Brasilia) myöntää 99 /09368-1 (MRHE) ja 00 /12361-8 (EHT) B

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on monimutkainen sairaus, joka syntyy sekä geneettiset ja epigeneettiset virheitä. Tärkeys geneettisten muutosten syöpä, mukaan lukien kromosomi poikkeavuudet ja geneettisiä mutaatioita sekä sen aiheuttavat tekijät (esim. Ionisoivan säteilyn ja kemiallisten syöpää aiheuttavien aineiden) ovat nyt hyvin tunnettuja. Epigeneettisenä komponentti solutransformaatioon, oli kuitenkin viime aikoihin asti huonosti. Se on tunnettu vuosikymmenien ajan genomin laajuinen hypometylaatio tapahtuu kasvaimissa verrattuna normaaleihin soluihin [1] – [4] ja yli-ilmentyminen onkogeenien oletettiin olevan seurausta tämän hypometylaatio. DNA hypermetylaation syövän sai huomiota muutamaa vuotta myöhemmin tutkimukset Baylin et al. [5], [6] ja Jones et al. [7]. Jälkimmäinen muutos tapahtuu CpG-saarekkeen edistäjiä yhden kopion geenejä ja heikentää geenin transkriptio, mikä johtaa hiljentäminen kasvainten Supressor geenejä. Useat tutkimukset kuvattu kudosspesifisen kuvio metylaation syövän ja sata tavoitteet geenejä tunnetaan, mukaan lukien kasvaimen synnyssä ja geenit, jotka osallistuvat invaasio, angiogeneesiä ja apoptoosin [8], [9]. Ikään liittyvän luonteen promoottorin hypermetylaatio normaaleissa kudoksissa [10] on ehdotettu alttiudesta tekijä syöpään.

Tärkeä ja ratkaisemattomien kysymys on, genominlaajuisten hypometylaatio ja yhden kopion CpG-saarekkeen promoottori hypermetylaation ovat kaksi itsenäistä muutoksia tai jos ne mekaanisesti toisiinsa. Puolueettomat tutkimukset DNA metylaatiomuutokset ovat tunnistaneet sekä usein hypermetylaation ja hypometylaatio useaan eri kasvainten [11] – [14]. Yritykset vastata tähän kysymykseen johti ristiriitaisia ​​havaintoja, jossa jotkut ryhmät tukevat [15], [16] ja muita vääräksi [17], [18] välinen yhteys molempien muutoksia.

Täällä teimme genomi- leveä metylaatio tutkimus syöpäsolulinjoissa ja primaarikasvaimia määrittää suhdetta DNA hypometylaatio, hypermetylaation ja mikrosatelliittien epävakautta syöpä. Retrotransposable elementti LINE-1 käytettiin korvike genominlaajuisten hypometylaatio ja metylointi microarray laajentaneet analyysi muiden luokkien toistuvia elementtejä. Genominlaajuisten metylaatio erosivat peräsuolen karsinoomat kuuluvien erillisten CpG-saarekkeen metylaation fenotyyppi (CIMP) ryhmät, merkittävimmin niitä, joilla liittyvän mikrosatelliittien epävakaus (MSI), jossa hypometylaatio oli harvinaista verrattuna sekä CIMP + /MSI-ja CIMP- /MSI- ryhmiä. Syöpäsolun linjat osoittivat suurta vaihtelua genominlaajuisten demetylaation, joka oli kudosspesifisiä ja siten tuskin on stokastinen prosessi. Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että genominlaajuisten hypometylaatio syövässä on erittäin vaihteleva, jonka syyt ovat tuntemattomia, ja olemassaolo on vahva käänteinen yhteys globaalin hypometylaatio ja mikrosatelliittien epävakautta syöpään.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä ja solulinjoissa

Kuusikymmentä pareina kasvaimen ja normaalisti vierekkäisten paksusuoli näytteet saatiin potilailta hoidettiin Johns Hopkins University (Baltimore, MA). CpG-saarekkeen metylaation fenotyyppi (CIMP) ja microsatellite analyysi aiemmin määritettiin näiden näytteiden [19]. Perifeerisen veren lymfosyytit saatiin viideltä terveiltä luovuttajilta, ja normaali paksusuoli limakalvon kudos ressected viidestä yksilöitä toimitetaan leikkaus laukaukseen haavat tai ei-pahanlaatuinen vaurioita. Tutkimus hyväksyi eettinen komitea Johns Hopkins University (Baltimore, MA), ja suostumus saatiin kaikilta osapuolilta.

Kuusikymmentäyhdeksi syöpäsolulinjoja kahdeksasta eri kudoksista (rinta-, keskushermosto, paksusuoli, leukemia, maksa-, keuhko-, munasarja- ja eturauhas-) saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), ja niitä viljeltiin käyttäen normaaleja menetelmiä. DNA: lla potilaista ja solulinjoissa uutettiin käyttäen standardi fenoli-kloroformiuutolla menetelmiä.

bisulfiittimodifiointi-pyrosekvensointi LINE-1-analyysi

bisulfiittimodifiointi käsittely suoritettiin, kuten on raportoitu [20]. Metyloituvuutta LINE-1-promoottori (GenBank X58075) tutkittiin käyttäen pyrosekvensointi-pohjainen metylointianalyysi. Suoritimme 50 ui PCR: n 60 mM Tris-HCI, pH 8,5, 15 mM ammoniumsulfaattia, 2 mM MgCI2: ta, 10% DMSO: ta, 1 mM dNTP-seosta, 1 yksikkö Taq-polymeraasia, 5 pmol forward-aluketta (5′-TTTTTTGAGTTAGGTGTGGG 3 ’), 5 pmol reverse-biotinyloitua aluketta (5′-BIO-TCTCACTAAAAAATACCAAACAA-3′) ja 50 ng ui bisulfiittikäsiteltyä genomista DNA: ta. PCR-syklien olosuhteet olivat 95 ° C 30 s, 50 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 30 s 50 syklin ajan. Biotinyloidun PCR-tuote puhdistettiin ja valmistettu yksijuosteinen toimimaan templaattina pyrosekvensointi reaktiossa valmistajan suosittelemia käyttämällä pyrosekvensointi Vacuum Prep Tool (pyrosekvensointi, Inc., Westborough, MA). Lyhyesti, PCR-tuote oli sitoutunut streptavidiini Sepharose HP (Amersham Biosciences, Uppsala, Ruotsi) ja sefaroosihelmien sisältävät immobilisoitua PCR-tuote puhdistettiin, pestiin, denaturoitiin 0,2 M NaOH-liuosta, ja pestiin uudelleen. Sitten, 0,3 uM pyrosekvensointi aluketta (5’-GGGTGGGAGTGAT-3 ’), annealing puhdistettua yksijuosteinen PCR-tuote ja pyrosekvensointi suoritettiin käyttäen PSQ HS 96 pyrosekvensointi System (pyrosekvensointi, Inc.).

Metyloitua CpG-saarekkeen monistus (MCA) /CpG-saarekkeen mikrosirujen

kuusitoista Kolorektaalituumorien verrattiin normaaleihin näkymisen vieruskudos käyttäen CpG-saarekkeen microarray protokolla kehitetty laboratoriossamme. Jokaisesta näytteestä, MCA amplikonien tuotettiin mukaisesti Toyota et ai. [20] käyttäen RXMA PCR sovittimia. Minimoimaan vahvistus bias takia differentiaaligeometriaan sisällyttämisen fluoresoivia väriaineita, me valinneet epäsuoraa-merkintöjä protokollaa. Tätä sisällyttämistä amino-allyyli dUTP (aa-dUTP, Sigma) otetaan 600 ng kutakin kasvaimen DNA: n ja normaalin DNA tehtiin käyttäen Bioprime DNA-merkintäjärjestelmä protokolla (Life Technologies). Cy5 ja Cy3 fluoresoivia väriaineita kytkettiin aa-dUTP-leimatun kasvain ja normaali viereinen amplikonien vastaavasti ja cohybridized että HCGI12K-Human CpG 12K Array (Microarray Centre, University Health Network, Toronto, Kanada). Hybridisaatio ja hybridisaation jälkeinen pesu menettelyjä mukaan DeRisi ja kollegoiden ja löytyy https://www.microarrays.org. Hybridisoitiin diat skannattiin kanssa GenePix 4000A skanneri (Axon Instruments, Foster City, CA) ja hankitun kuvat analysoitiin ohjelmiston GenePix Pro 6.0. Vain täplien selityksin DNA-sekvenssin kanssa 90% tai enemmän niiden pituudesta päällekkäisten toistuva elementti käytettiin analyysiin. Kaikkiaan 770 täplät edustavat toistuva DNA eri luokkien arvioitiin käyttämällä tätä menetelmää ja metylaation tiedot kunkin täplän oli edustettuna log

2ratio kasvaimen (Cy5, punainen) /normaalin (Cy3, normaali) intensiteetit. Values≥1.0 (2-kertainen muutos) olivat osoitus lisääntynyt metylaation (hypermetylaation) ja values≤-1,0 olivat osoitus laski metylaation (hypometylaatio) kasvaimen. Valvomatta hierarkkinen klusterointi tehtiin käyttäen ohjelmaa CIMminer (https://discover.nci.nih.gov/cimminer/), jossa laskenta etäisyyden käyttäen absoluuttista korrelaatiota ja täydellisen sidoksen klusterointi.

Tilastollinen

merkitys välisistä eroista avulla arvioitiin käyttäen kaksipuolista Studentin t-testiä. P-arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Yksisuuntainen ANOVA käytettiin verrattaessa samankaltaisuus kolme tai useampia ryhmiä. Tilastolliset analyysit tehtiin Statistica- ohjelmistopaketti (StatSoft, Tulsa, OK).

Tulokset

LINE-1 metylointi peräsuolen karsinoomat korreloi MSI asema

soveltaneet pyrosekvensointi mitoitusmenetelmästä metylaation tiheys LINE-1 promoottori. Aiemmissa tutkimuksissa me validoitu sovellettaessa tätä menetelmää arvioida genominlaajuisten metylaatio sisältö [21], [22] ja osoittivat voimakas positiivinen korrelaatio LINE-1 metylointi ja LC-MS (nestekromatografia /massaspektrometria) tiedot. Siten LINE-1 metylaatiotasoilla voidaan käyttää korvikkeena genominlaajuisten demetylaatio. Kartta LINE-1 promoottori alukkeilla ja koetin kannat on esitetty kuviossa 1A. Tämä menetelmä perustuu bisulfiittikäsittelyn DNA jolla muutetaan metyloitumattomat sytosiinit tymidines kun metyloidut sytosiinit ovat ei-reaktiivinen. PCR bisulfiitin käsitellyn DNA tuloksia altaissa sisältävien tuotteiden sekä metyloidut ja metyloitumattoman DNA voidaan erottaa ja kvantitatiivisesti käyttämällä pyrosekvensointi menetelmällä. Edustaja LINE-1 pyrograms on esitetty kuviossa 1B. Olemme tutkineet viisi normaalia paksusuolen limakalvoa ja viisi ääreisverenkierron lymfosyyttien (PBL) DNA-näytteitä terveistä luovuttajista määrittää normaalin LINE-1 metylointi. LINE-1 metylaatio oli samanlainen näissä kahdessa eri kudoksissa, joissa on keskimäärin 71,9% vuonna PBL ja 70,8% normaalissa paksusuolen limakalvolla.

määrän määritys DNA: n metylaatio käyttäen bisulfiitti LINE-1 PCR ja pyrosekvensointi. A) Kaavio CpG-saarekkeen promoottori (GenBank tulonumero. X58075, nukleotidiasemassa 108-520 bp), joka liittyy täyspitkä LINE-1. Jokainen pystysuora viiva edustaa yhtä CpG-sivuston. 3’UTR, 5’UTR- ja kaksi ORF LINE-1 näkyvät yläosassa. Nuolet osoittavat sijainti käytettyjen alukkeiden bisulfiitin PCR (R-Biot ja F) ja pyrosekvensointi (S). B) Edustavia LINE-1 pyrograms normaali ääreisveren lymfosyytit (PBL) ja rintasyövän solulinjoissa (MB-468 ja SKBR3). Pyrogram kvantitoi C metyloidulle ja T for metyloitumaton DNA. Varjostettu alue edustaa CpG kvantitoitiin LINE-1 elementtejä ja prosentuaalinen metylaatio yläpuolella näkyy huippu.

Seuraava arvioitu LINE-1 metylointi kuuteenkymmeneen ensisijainen peräsuolen karsinoomat ja niiden normaali matching limakalvo ja korreloi tämän väestörakenteen, clinopathologic ja molekyylitason muuttujat (taulukko 1). Kolorektaalituumorien keskimäärin 54,9% metylaatio (SEM = 1,1%) vs. 64,3% (SEM = 0,5%) metylaation viereiseen normaaliin kudokseen, mikä vastaa keskimääräistä suhteellista demetylaation 14,6% (P 0,001). Verrattuna LINE-1 metylointi normaalissa paksusuolessa, joka oli keskimäärin 70,8% (SEM = 1,3%), sekä kasvaimen ja vieressä kasvaimen paksusuolen limakalvo oli demetyloidaan, vastaavaan keskimäärin 22,5% ja 9,2%: n suhteellisessa demetylaatio (P = 0,001). Mitään eroja LINE-1 metylointi havaittiin iän tai sukupuolen, mutta merkittävä ero havaittiin puolella, on vähäisempää metylaation normaaleissa vieressä oikealla paksusuoli (63,0%) verrattuna vasemmalle paksusuolen (65,5%, P = 0,016) ja vaihe, jossa alhaisempi metylaation kasvaimia vaiheittain 3 ja 4 (51,9%) verrattuna vaiheita 0-2 (57,1%, P = 0,028).

ensisijainen Kolorektaalituumorien esitteli suuri poikkeama in LINE-1 metylointi eri näytteistä (kuvio 2A), ja kerrostuminen näiden Kolorektaalituumorien ja niiden normaali vieruskudos paljastaa epätasaisen vaihtelua LINE-1 metylointi. CRC satunnaista mikrosatelliittien epävakaus (MSI), joista suurin osa johtuu MLH1 promoottorin metylaation, osoitti eroa LINE-1 metylaatio normaalin viereisten ja syöpä kudoksiin (62,6% ± 1,1% vs. 60,6% ± 1,7%, P = 0,33) , joiden keskimääräinen lasku metyloinnin vain 3,12% ± 2,3%. Sitä vastoin MSI-tapauksia oli merkittävä väheneminen LINE-1 hypometylaatio normaalin viereisten ja syöpä kudoksiin (64,6% ± 0,5% vs. 53,8% ± 1,2%, P 0,0001). Ilmeisesti LINE-1 hypometylaatio oli riippumaton CIMP asema, koska CIMP + /MSI-tapausten ja CIMP-tapausta yhtä hypometyloidut (15,4% ± 2,7% vs. 17,7% ± 2,7%, P = 0,56). Tämä epätasainen jakautuminen suhteellisen demetylaatio mikrosatelliittien epävakaus on edustaa kuvassa 2B, joka kuvaa ylläpito LINE-1 metylaation CIMP + /MSI + kasvaimissa verrattuna normaaliin näkymisen limakalvolle, vaikka CIMP + /MSI-ja CIMP- /MSI- tehdään vakava hypometylaatio, jossa yhdessä tapauksessa esittämällä äärimmäinen suhteellinen demetylaatio (61,3%).

Differential LINE-1 metylointi keskuudessa CIMP /MSI ryhmien ensisijainen kolorektaalikarsinoomasta näytettä (CRC). A) ja peräsuolen kasvain DNA ja niiden normaali esiintyvät vierekkäisten limakalvoa kuusikymmentä potilasta arvioitiin LINE-1 metylointi. Nämä kasvaimet aiemmin arvioitiin CpG-saarekkeen methylator fenotyyppi (CIMP), käyttäen paneelin yhden kopion geenejä metylointianalyysi, ja mikrosatelliitti epävakaus (MSI) tilan, jolloin tunnistaminen kolmen CIMP /MSI ryhmiä. Normaalissa esiintyvät limakalvo (top) vähän vaihtelua LINE-1 metylaatio havaitaan näytteiden välillä ja CIMP /MSI ryhmissä (keskiarvo metylaatio = 64,3%), kun taas kasvain (alhaalla) useita näytteitä tehdään high LINE-1 demetylaatio (25/60 kasvain näytteet ovat metylaatio tiheys karjua 55%), selkeintä CIMP + /MSI-ja CIMP- /MSI-ryhmiä. B) Suhteellinen LINE-1 demetylaatio in CRC. Suhteellinen demetylaatio laskettiin prosentuaalinen muutos LINE-1 metylaation kasvain verrattuna normaaliin näkymisen limakalvo. Molemmat CIMP + /MSI-ja CIMP- /MSI-näytteet esitetty keskimäärin 16% demetylaatio varten LINE-1, kun taas ei havaittu huomattavia muutoksia varten CIMP + /MSI + näytteitä. Sillä CIMP + ryhmä, 4-9% kasvua metylaation tiheys LINE-1 havaittiin pieni osa näytteistä, useimmat niistä tunnistettu CIMP + /MSI + näytteitä.

metyloituvuutta toistuvia elementtejä käyttäen MCA /CpG-saarekkeen mikrosiruja

lisäksi LINE-1 metylointianalyysi bisulfiitti- PCR ja pyrosekvensointi, me arvioitiin myös metylaatiostatuksen toistuvia elementtejä kuten LINE (pitkä siroteltu ydin- elementit), SINE (lyhyt välissä ydin- osia), LTR (pitkät terminaaliset toistot), DNA: n ja satelliitti-toistojen, kytkemällä MCA (metyloitu CpG-saarekkeen monistus, 20) on CpG-saarekkeen microarray, jotka sisälsivät yhteensä 770 kohdetta edustavat toistuvien DNA eri luokkiin. Ensimmäinen analyysi suoritettiin laskenta hypermetyloitunut (log

2ratio 1,0) ja hypometyloidut (log

2ratio -1,0) toistoa erotellaan niiden eri luokkiin (kuvio 3A). Sillä CIMP + /MSI + näytteet, kunkin yksi toistuu luokkia lukuun ottamatta satelliitti toistoja todettiin rikastaa hypermetylaation kasvainten DNA verrattuna normaaliin viereiseen limakalvoon (hypermetylaation /hypometylaatio = 2,4-kertaiseksi keskiarvo). Rikastuminen hypermetyloitunut sekvenssit laskivat jyrkästi CIMP + /MSI-ja CIMP- /MSI- (0,88-ja 0,71-kertaiseksi). Nämä havainnot viittaavat siihen, että on olemassa voimakkaita paineita huoltoa ja /tai de novo metyloinnin toistuvia elementtejä MSI + ryhmä. Validointi meidän microarray menetelmän tehtiin vertaamalla tuloksia LINE-1 pyrosekvensointi tiedot samalla peräsuolen näytteistä. Tämä analyysi paljasti, että kasvaimia on pienin LINE-1 demetylaatio pyrosekvensointi analyysi osoitti korkeimman rikastamiseen hypermetyloitunut LINE toistoja (kuvio 3B), jossa käänteinen tilanne on havaittu kasvaimia, joilla on korkein LINE-1 demetylaatio. Nämä tulokset tukevat että mikrosiruanalyysi on sopiva tekniikka käyttää metylaatiomuutokset toistuvia elementtejä.

Metyloidut CpG Island Amplication (MCA) /CpG-saarekkeen microarray toistuville DNA-sekvenssit. A) suhteellinen runsaus hypermetyloitunut ja hypometyloidut toistoja jokaisen CIMP /MSI ryhmä. Suurempi määrä hypermetyloitunut verrattuna hypometyloidut toistoja ei havaittu CIMP + /MSI + ryhmä, ja asteittainen muutos edustus hypermetyloitunut ja hypometyloidut toistoja havaitusta CIMP + /MSI-ja CIMP- /MSI-ryhmiä, jolloin tuloksena on yliedustus of hypometyloidut toistoja Mikrosatelliittimarkkerien vakaa ryhmissä. B) validointi microarray tulokset LINE toistoja. Huomaa, että CIMP /MSI ryhmiä, joilla on korkeampi demetylaation, määritettynä bisulfiitti-pyrosekvensointi LINE-1, esitteli myös useampia hypometyloidut LINE toistuu microarray analyysi, jota edustaa alemman hyper /hypometylaatio suhde. C) valvomaton hierarkkinen klusterointi levitettiin metylaatio dataa joukon 770 toistuvien DNA-sekvenssien poikki kuusitoista Kolorektaalituumorien pariksi niiden normaalilta näyttäviä limakalvo DNA. Kolorektaalikarsi- kasvaimia Dendrogrammi näkyy, ja näyte tunnus kulloinkin sisältyy oikeaan. Terminaali haarat värikoodattu edustamaan CIMP /MSI tila kasvaimen näytteen (punainen, CIMP + /MSI +, sininen, CIMP + /MSI-, vihreä, CIMP- /MSI-). Kaiken näytettä samasta CIMP /MSI ryhmä ryhmitelty yhteen, vahvistamalla eri metylaation kohtalo toistuvaan DNA-sekvenssien metylaatio kussakin ryhmässä. LINE, pitkä välissä ydinaseiden elementtejä; SINE, lyhyt välissä ydinaseiden elementtejä, LTR, pitkä terminaali toistoja; DNA toistot; Satelliitti toistoja.

Lopuksi käyttämällä normalisoitua log

2ratio arvot yksittäisiä paikkoja, teimme valvomatta hierarkkinen klusterointi paljastaa yhtäläisyyksiä 16 peräsuolen kasvain tutkituista tapauksista. Tuloksena klusteroitu kuva kartta osoitti hyvää yhteensopivuutta odotettu erottelu yksittäisten näytteiden tunnetuilla CIMP /MSI tila (kuvio 3C), mikä viittaa siihen, että metylaatio allekirjoitukset näiden kasvainten eivät rajoitu yhden kopion geenejä vaan myös liittyy toistuvia DNA-elementtejä.

hypometylaatio LINE-1 syöpäsolulinjoissa osoittaa kudosspesifisiä vaihtelevuus

Voit tarkistaa, vaihtelevuuteen genominlaajuisten metylaatio rajoittuu ensisijaisesti peräsuolen karsinoomat tai esiintyy myös muissa elimissä, käytimme LINE-1 bisulfiitti-pyrosekvensointi menetelmä kuusikymmentäyksi syöpäsolulinjoissa kahdeksasta eri kudoksista tyypit (rinta-, keskushermostoon, paksusuolen, leukemia, keuhkosyöpä, munasarja-, eturauhas- ja maksa). Mielenkiintoista, löysimme vähentyneen merkittävästi LINE-1 metylointi useimmissa tutkituissa solulinjoissa (kuvio 4). Kaiken 50/61 testattiin syövän solulinjoista hypometyloidut varten LINE-1, jonka suhteellinen demetylaation 15% tai enemmän (absoluuttinen metylaatio tiheys on alle 60%) verrattuna perifeerisen veren lymfosyyttejä ja normaalin paksusuolen limakalvolla. Samoin ensisijainen Kolorektaalituumorien, nämä syöpäsolun linjat näytteillä vaihtelevat suuresti LINE-1 metylointi, jotka vaihtelevat 6,5% (K562, joka on KML solulinjan erytroleukemian ominaisuuksia) ja 74,2% (CEM, akuutin lymfoblastisen leukemian solulinja). On ilmeistä kudosspesifisyyttä varten demetylaatio; alhaisin LINE-1 metylointi todettiin maksassa (24,0%), jonka jälkeen keskushermoston (28,9%), rintojen (29,8%), keuhkojen (35,1%), eturauhasen (41,9%), munasarjojen (49,7%), paksusuoli (46,7%) ja leukemia (56,1%). Vaikka mielenkiintoinen havainto, varoitamme yleistys tietojen koska: (i) LINE-1 metylointi ei tutkittu varten normaaleissa kudoksissa paitsi paksusuolen ja ääreisverenkierron; ja (ii) pieni määrä solulinjoja analysoitiin maksan ja eturauhassyöpää.

LINE-1 metylointi vaihtelua syöpäsolulinjoissa. DNA-näytteet normaalin ääreisveren lymfosyyttien, normaali paksusuoli limakalvo ja kuusikymmentäyksi solulinjat kahdeksasta eri kudoksista tyyppejä tutkittiin LINE-1 metylaation käyttäen bisulfiitin PCR seuraa pyrosekvensointi. Normaali kudokset esitetään korkeita LINE-1 metylointi (yli 70% keskimäärin), ja suuri vaihtelu metylaatiotasoilla havaittiin syöpäsolujen linjat, vähintään metyloinnin tiheys 6,5% on havaittu, että leukemia K562. Niitä pidetään ryhmänä,, leukemia solulinjoja kohtalaisen demetyloidaan (keskimäärin 56,1%), jonka jälkeen munasarjojen, paksusuolen, eturauhasen ja keuhkosyövän solulinjat (vaihtelu 49,7%: sta 35,1%). Keskushermoston (CNS), rinta ja yksi maksasyövän tutkituissa solulinjoissa syvästi demetyloituu (palje 30% keskimäärin). Pisteviiva edustaa keskimääräistä metylaatio terveillä.

Toinen merkittävä havainto on, että jotkut solulinjat osoittavat äärimmäistä hypometylaatio. Vaikka leukemiat yleensä läsnä LINE-1 metylaatiotasoilla yhtä PBL, 3/15 solulinjoilla on yli 50% suhteellinen demetylaation (K562, HEL ja TF-1). Samankaltainen tilanne on havaittu muissa kudoksissa, olivat ”demetylaatio mestareita” solulinjat tunnistettiin (SKBR3 rinta- ja OVCA420 munasarjojen). Houkutteleva selitys on, että geenit osallistuvat DNA: n metylaatio huolto puuttuu tai on mutatoitunut näissä solulinjoissa.

Keskustelu

DNA: n metylaatio on tärkeä rooli normaaleissa soluissa, on mukana X-kromosomin inaktivaatiota , painamista ja tukahduttaminen toistuvia elementtejä kuten retrotransposoneja ja endogeeniset retrovirukset [23], [24]. Samaan aikaan,-CpG-saarekkeiden promoottorialueella yhden kopion geenit ovat metylaatio-vapaa, mikä on tärkeää, jotta transkription. Syövän, käänteinen skenaario on todettu, yhden kopion CpG-saarekkeen hypermetylaation ja genominlaajuisten hypometylaatio. Tavoitteena Tämän työn oli määrittää suhde näiden kahden poikkeavien tapahtumien avulla syöpä solulinjoja useista kudoksesta-tyyppejä ja ensisijainen Kolorektaalituumorien mallina.

Vaikka genominlaajuisten demetylaatio ja yhden kopion CpG saari hypermetylaation esiintyy syöpää, se on huonosti ymmärretty, ovatko nämä kaksi muutokset ovat yhteydessä toisiinsa. Tuloksemme perustuu metylaatiotasoilla toistuvia elementtejä, käyttäen sekä tiettyä määritystä varten LINE-1 metylointianalyysi ja microarray alustan, joka käsittää lähes 800 toistuvia DNA-sekvenssit eri luokkiin, osoittavat, että ne kasvaimia korkeimman poikkeavien hypermetylaation (CIMP + /MSI + ), osoitti myös alhaisin genominlaajuisten hypometylaatio, verrattuna normaaliin viereiseen limakalvoon. Itse asiassa nämä kasvaimet osoittivat usein kasvu metyloinnin toistuvia elementtejä, kuten paljastui sekä LINE-1 ja mikrosiruanalyysillä. Mielenkiintoista, CIMP + /MSI-ja CIMP- /MSI-osoittivat korkeampaa LINE-1 hypometylaatio, vahvistamalla ainutlaatuisuutta CIMP + /MSI + kasvaimia. Vaikka CIMP + /MSI-ja CIMP- /MSI-ryhmät olivat yhtä hypometyloidut varten LINE-1, mikä viittaa siihen, että mikrosatelliittien epävakaus on tärkein molekyyli muutos liittyy puute LINE-1 hypometylaatio. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien kanssa puutteesta globaalin hypometylaatio mikrosatelliitti epävakaa kasvaimissa [15]. Konsensus tulkinta näitä tietoja on, että peräsuolen kasvaimet syntyvät kaksi erillistä etenemisen reittejä: maailmanlaajuinen hypermetylaation kanssa mikrosatelliittien epävakaus ja maailmanlaajuinen hypometylaatio kanssa kromosomi epävakautta. On kuitenkin syytä huomata, että CIMP + /MSI + ryhmä ei ole vain ominaista microsatellite epävakaus, mutta myös korkeamman taajuuden hypermetyloitunut CpG saaria. Todellakin, aiheuttava tekijä havaitun mikrosatelliittimerkkien epävakaus on yksinomainen hypermetylaatiota MHL1 näissä kasvaimissa, sekä muita geenejä, kuten p16 ja THBS1 esiintyy myös useammin metyloitavaa CIMP + /MSI + verrattuna CIMP + /MSI- [25]. Lisäksi mikrosiruanalyysi toistuvien DNA kannatti ryhmän olemassaoloa kasvainten (CIMP + /MSI +) voimakasta painetta de novo metylaatio sekä CpG-saarekkeen promoottoreita ja toistuvia elementtejä ja uudelleen luokiteltu Kolorektaalituumorien osaksi niiden tunnetun CIMP /MSI ryhmien . Erityisesti CIMP + /MSI-ja CIMP- /MSI-käytti enimmäkseen klusteroitu toisistaan, mikä viittaa siihen, että mikrosiruanalyysi paljasti joitakin erityispiirteitä kunkin ryhmän ei nähdä LINE-1 bisulfiitti-pyrosequecing. Esimerkiksi SINE toistot osoittavat asteittaista muutosta hypermetylaation /hypometylaatio Mukaan CIMP /MSI, jossa CIMP + /MSI voinnin väli- ryhmään. Myös satelliitti toistoja (lähinnä asiamiehet sentromeerisen ja pericentromeric toistoja) osoitti vakaampi rakenteessa metylaation ja se ehkä liittyy niiden toiminnallista roolia kromosomissa eriytymisen solunjakautumisen aikana. Sitä vastoin, Ehrlich et ai. [18] mukaan hypometylaatio ja hypermetylaation ovat riippumattomia munasarjasyöpiä, joka perustuu kapasiteetti näiden muutosten ennustaa aste maligniteetin munasarjojen kasvaimia. Kuitenkin suoraan verrata hypometylaatio syövät ja ilman korkea metylaation (ts CIMP) ei ole tutkittu. Lisää tutkimuksia tarvitaan vastata miksi ero toistuvia elementtejä luokilla on eri herkkyys DNA hypometylaatio. Yleensä meidän microarray tiedot viittaavat siihen, että jotkut luokat toistuvia elementtejä voidaan soveltaa samoja metylaation paineet CpG- saaria CIMP + syöpiin.

Käyttämällä LINE-1 Metylointia korvikkeena maailmanlaajuinen demetylaation, löysimme suuri vaihtelu metylaatiotasoilla eri syövän solulinjoissa, jossa kudosspesifisyyttä. Joissakin kudoksissa, kuten rinta-, keskushermoston ja keuhkojen läpi merkitty LINE-1 demetylaatio syövät melko homogeenisesti. Muissa testattu kudoksissa, kuten paksusuolen ja leukemia, jotkut solulinjat olivat metylaatiotasoilla samanlaisia ​​kuin näytteille normaali paksusuoli ja veren kudosten, kun taas toiset olivat syvästi demetyloitunut. Vaikka seurantatutkimus sisältää normaalit näytteet samoilta tutkittu kudosten tarvitaan Tämän havainnon varmistamiseksi, analyysi suoritetaan Chalichagorn et al. [26] ei osoittivat merkittävää eroa metylaatio normaalin näytteitä eri kudoksista. Samoin meidän tuloksia, aiemman tutkimuksen Flörl et al. [27] oli löytänyt selvä ero virtsarakon ja munuaisten karsinoomat, jossa vain ensimmäinen näytteille LINE-1 demetylaatio. Suuri vaihtelu maailmanlaajuinen hypometylaatio havaittu syytöksiä kuin stokastinen mekanismeja tämän vian, ja ehdottaa myös valikoivaa etua kasvainten Vaikeaa hypometylaatio. Itse asiassa viimeaikaiset kokeet osoittavat, että kasvaimen muodostumisen indusoidaan hiirissä jälkeen maailmanlaajuisen genomi- hypometylaatio [28], [29]. Ehdollisen siirtogeenin tekniikka vähentää ilmentymistä DNMT1, Gaudet et ai. [28] havaittu spontaania muodostumista T-solu-lymfoomat hankkimalla ylimääräisiä genomisia muutoksia. Holm et ai. [29] syntyy hiiriä, jotka jäljittelevät menetys kuvaan (LOI), oletetaan johtuvan hypometylaatio, ja näillä eläimillä kasvainmuodostusta havaittiin myös. Niiden syiden ero demetylaation kesken syövän eri kudoksissa ei tunneta, ja sekä geneettiset ja altistuminen tekijät voivat pelata rooleja tässä. Syvällinen hypometylaatio, kuten havaitaan K562 ja muut voivat liittyä erityisiä lakkaa toimimasta geenien ohjaavat metyloinnin toistuvia elementtejä. Ehdokas geenit ovat niitä, jotka koodaavat proteiineja, jotka on kuvattu kohdistamaan toimivat ”heterochromatin uloskirjautumisen”. Esimerkiksi LSH proteiini, jäsen SnF2 /helikaasi proteiinit, tarvitaan genominlaajuisten metylaatio. Knockout hiirien Lsh geeni näkyy perinataalikuolleisuutta ja osoitti selvästi demetylaation toistuvia elementtejä, on riippumaton muutokset RNA tasojen DNMT1 [30].

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että genominlaajuisten hypometylaatio on hyvin vaihteleva syöpäsoluissa, kuten single-copy-CpG-saarekkeen hypermetylaation. Molemmat muutokset löytyvät kasvaimissa ja jokainen voi edistää tuumorigeneesiä riippumattomien prosesseja. Tutkimuksemme myös näyttöä vahvan käänteinen yhteys globaalin hypometylaatio ja mikrosatelliittien epävakautta syöpä.