Krooninen sairaus

tiivistelmä

Quercetin ja 2-Methoxyestradiol (2-ME) ovat lupaavia syöpälääkkeen aineita. Edellisessä

in vitro

tutkimus osoitti, että kversetiini synergized 2-Methoxyestradiol joilla on lisääntynyt antiproliferatiivinen ja proapoptoottiset aktiivisuutta sekä androgeeniriippuvaisissa LNCaP ja androgeenistä riippumattomat PC-3 ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme määritettävä, onko niiden yhdistelmä voisi estää LNCaP-ja PC-3-ksenografti kasvaimen kasvua

in vivo

ja tutkia taustalla olevaa mekanismia. Ihmisen eturauhassyöpä LNCaP-ja PC-3-solut istutettiin subkutaanisesti BALB /c-nude-hiirissä. Kun ksenografti kasvaimet olivat saavuttaneet noin 100 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti ajoneuvon hallintaan, kversetiini tai 2-Methoxyestradiol yksinään käsiteltyjen ja yhdistelmä hoitoryhmissä. Sen jälkeen terapeuttisen intervention 4 viikon yhdistelmähoidon kversetiini ja 2-ME i) merkittävästi estivät eturauhassyöpäksenograftista kasvaimen kasvua 46,8% ja LNCaP ja 51,3% PC-3 verrattuna vehikkelikontrolliryhmään, tehokkaampi kuin quercetin (28,4% for LNCaP, 24,8% ja PC3) tai 2-ME (32,1% for LNCaP, 28,9% ja PC3) yksin; ii) oli hyvin siedetty BALB /c-hiirten ja mitään ilmeistä myrkytysreaktioita havaittiin; iii) johti korkeampiin Bax /Bcl-2-suhde, halkaistut kaspaasi-3-proteiinin ilmentymisen ja apoptoosin kurssia; ja iv) vähensi fosforyloidun AKT (Pakt) proteiini tasolla, endoteelikasvutekijä proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen, mikrovaskulaariset tiheys ja proliferaationopeus kuin yhden lääkehoitoa. Nämä vaikutukset olivat merkittävämpiä kuin vehikkeliryhmässä. Siksi yhdistelmä kversetiini ja 2-ME voi toimia uutena kliininen hoito-ohjelma, joka omistaa mahdollisuuksia tehostaa antituumorivaikutusta eturauhassyöpään

in vivo

sekä vähentämään annosta ja sivuvaikutuksia joko kversetiini tai 2-ME yksin . Nämä

in vivo

tulokset luovat edelleen vankka perusta myöhemmin tutkimuksia tästä romaanin hoito-ihmisen eturauhassyövän.

Citation: Yang F, Song L, Wang H, Wang J, Xu Z, Xing N (2015) yhdistelmä Quercetin ja 2-Methoxyestradiol Parantaa Humaani Eturauhassyöpä LNCaP-ja PC-3 solujen Vieraslajisiirteen kasvaimen kasvua. PLoS ONE 10 (5): e0128277. doi: 10,1371 /journal.pone.0128277

Academic Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 9. joulukuuta, 2014; Hyväksytty 23. huhtikuuta 2015 Julkaistu: toukokuu 26, 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: tuettiin Beijing Natural Science Foundation (no. 7122075).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Eturauhassyöpä on toiseksi suurin syy syövän kuolleisuus miehillä, arviolta 233000 uutta tapausta ja 29480 kuolemantapausta Yhdysvalloissa vuonna 2014 [1]. Vaikka se voidaan parantaa eturauhasen tai säteilyn varhaisessa vaiheessa, useimmat potilaat kärsivät paikallisen uusiutumisen ja etäinen etäpesäke myöhemmin [2]. Sen jälkeen kun tehokas hoito androgeeniablaatio ensimmäisen 1-3 vuotta, se yleensä kehittyy kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) ominaista kohonnut eturauhasen antigeenin (PSA), korkeampi etäpesäke korko, lisää aggressiivisuutta, jne [3]. Yhdistelmä doketakselin ja prednisonin, standardi ensilinjan systeemistä kemoterapiaa CRPC, ei ole parantava ja vain pidentää kokonaiselossaoloaikaa aika lyhyeksi ajaksi. Lisäksi se tekee potilaat kärsivät vakavia sivuvaikutuksia [4]. Siksi on kiireesti kehitettävä uusia lääkehoitoja, jotka voivat voittaa nämä puutteet työskentelevät yksin tai yhdistelmänä CRPC.

Quercetin (3, 3 ’, 4’, 5, 7-pentahydroxyflavone, Que), bioaktiivista flavonoidi runsaasti vihanneksia ja hedelmiä erityisesti sipulit, omenat, teetä ja punaviini, on näytteillä lupaava anti-kasvain ominaisuus monissa ihmisen syöpäsoluissa lukien eturauhassyöpä sekä in vitro että in vivo [5,6]. Kuitenkin alhaisen hyötyosuuden, sen anti-kasvain vaikutus on rajoitettu merkittävästi. Jotta päästäisiin eroon tästä puutteesta, quercetin on yhdistetty muihin syöpälääkkeitä parantaa estämällä erilaisten kasvainten kuten eturauhassyöpä [6,7,8].

2-Methoxyestradiol (2-ME), joka on luonnollisen endogeenisen johdannainen 17β-estradioli (E2) harvoin estrogeeninen aktiivisuus, on raportoitu osoittaa syövän toimia laaja kasvaimia [9]. Koska eturauhassyövän, 2-ME voi estää sekä androgeeniriippuvaisten ja androgeenistä riippumattomat syöpäsolujen in vitro ja in vivo [10,11]. Kuitenkin, 2-ME: haittana on rajoitettu biologinen saatavuus ja nopea hajoaminen [12]. Jotta ratkaista ongelman, lääkeyhdistelmä on ehdotettu ja herätti kasvoi syövän vaikutusta vähemmän sivuvaikutuksia verrattuna kerta lääkehoidon [10,13].

Tästä syystä, vaikka yhteinen haitta alhainen biosaatavuus sekä kversetiini ja 2-ME, se vaikuttaa optimistiselta, kun he olivat yhdessä muiden aineiden vuoksi hoidettava syöpä vaikutus. Aiemmin teimme yhdistetyllä käytöllä kversetiini ja 2-ME sekä androgeeniriippuvaisissa LNCaP ja androgeenistä riippumattomat PC-3 ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ja löysi synergistinen antiproliferatiivinen ja proapoptoottiset vaikutus kuin kversetiini tai 2-ME yksinään [14] . Esillä oli tutkia yhdistetty vaikutus kversetiini ja 2-ME LNCaP-ja PC-3-ksenografti kasvaimen in vivo ja tutkia mekanismi ensimmäistä kertaa.

Materiaalit ja menetelmät

Chemical reagenssit

kversetiini, 2-Methoxyestradiol, hydroksipropyyli-β-syklodekstriiniä (HPβCD) ja karboksimetyyliselluloosa (CMC) hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). RPMI-1640-väliaine, 0,25% trypsiini-EDTA: lla ja naudan sikiön seerumia sai Hyclone (Logan, UT, USA), ja Matrigel oli peräisin BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA).

Solulinjat ja Cell Culture

Ihmisen eturauhassyöpä androgeeniriippuvaisissa LNCaP ja androgeenistä riippumattomat PC-3-solulinjojen (kaksi yleisesti käytetty solulinjoja, jotka on käytetty monien muiden tutkijoiden [15,16,17]), joka on saatu Peking Union Medical College, viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Hyclone, Logan, UT), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone) ja asetettiin inkubaattoriin, joka sisälsi 95% ilmaa ja 5% CO

2 37 ° C: ssa.

eläinten tutkimus

Kaikki kokeessa liittyvät menettelyt eläimet komitean hyväksymiä eläinkokeiden ja Ethic komitean Capital Medical University (Luvan numero: 2013-X-83). BALB /c-nude-hiiriin 4-6 viikkoa vanhoja toimittivat ministeriön koe-eläinten Capital Medical University ja pidetään taudinaiheuttajista ympäristössä 12 tunnin valo /pimeä sykli, kontrolloitua kosteutta ja lämpötilaa. Hiiret saivat tottua uuteen ympäristöön viikon ajan ennen koetta.

Ennen virallista in vivo kokeessa, arvioimme myrkyllisyys kahden yhdessä lääkkeiden ja ajoneuvo, joka saa antaa samanaikaisesti käyttämällä kahta ryhmää miespuolinen BALB /c-nude-hiiriin (n = 5 jokaisessa). Liuotin kversetiini oli 25% hydroksipropyyli-β-syklodekstriiniä (HPβCD, w /v DDH

2O) ja 2-Methoxyestradiol oli 25% HPβCD joka sisälsi 0,5% karboksimetyyliselluloosaa (CMC, w /v DDH

2O ) [10,18]. Drug ryhmä annettiin kahta lääkettä, nimittäin liuennut kversetiini ja 2-ME, ja hikkelikontrolliryhmään annettiin kaksi lääkkeetön ajoneuvoja, eli 25% HPβCD sisältävien tai ei sisälsi 0,5% CMC: tä. Käytön jälkeen, toksinen reaktio havaittiin hiirillä molempien ryhmien edustettuina huono psyykkinen, kevyesti kiertämällä kehon, kouristukset ja satunnaisesti kohtalainen hematuria, jotka olivat sopusoinnussa kuvauksen Ehteda A ja voi johtua korkea pitoisuus HPβCD [10 ]. Tästä syystä seuraavassa kokeessa yhdistelmä kversetiini ja 2-ME tehtiin tällä tavalla: kversetiini annettiin päivänä 1, minkä jälkeen 2-ME annettiin päivänä 2.

Hiiret inokuloitiin subkutaanisesti 5 x 10

5 PC-3-solut suspensoitiin 100 ui PBS ja 2 x 10

8 LNCaP suspendoidaan 100 pl Matrigel ja PBS seosta (1: 1) oikealla takana. Kun ksenografti kasvaimet saavuttivat tilavuuden noin 100 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään (n = 8 kussakin ryhmässä) ja käsiteltiin intraperitoneaalisesti. Terapeuttinen aikataulu perustuvat in vitro tuloksia, alustavat kokeet ja monien muiden tutkijoiden tutkimuksia oli seuraava: (1) Vehikkeliverrokkiryhmä: ajoneuvo quercetin päivänä 1, ajoneuvon 2-ME päivänä 2, (2) Quercetin käsitellyssä ryhmässä : quercetin 75mg /kg 1. päivänä, ajoneuvon 2-ME päivänä 2, (3) 2-ME hoidetussa ryhmässä: ajoneuvo quercetin päivänä 1, 2-ME 150 mg /kg päivänä 2, (4) Combination hoitoryhmässä : quercetin 75mg /kg päivänä 1, 2-ME 150 mg /kg ensimmäisenä päivänä 2. Kaksi päivää oli hoitojaksoa ja koko hoito kesti 4 viikon [13,19,20,21,22,23]. Kasvainten kokoa tarkkailtiin välein 2 päivää käyttäen paksuus ja tuumorin tilavuus laskettiin seuraavan kaavan mukaisesti: L x S

2 x 0,5, jossa L on pisin halkaisija ja S edustaa lyhin halkaisija kasvaimen [10]. Hiiret punnittiin samoin. Lopussa hoitotoimenpide, päivänä 29, hiiret nukutettiin kloraalihydraatilla ja tapettiin taittamalla niskasta. Ksenograftikasvaimissa otettiin pois nopeasti ja punnittiin. Yksi osa sitä alettiin nestetyppeen välittömästi myöhempää biomarkkereiden analyysiin ja toinen osa kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin immunohistokemiallista analyysia varten. Seerumin biokemialliset parametrit kuten ALAT, ASAT, kreatiniinin ja ureatypen että heijastunut huumeiden myrkyllisyys havaittiin myös.

Western blot-analyysi

Kasvaimen kudoksia sekoitettiin RIPA lyysipuskuria (Applygen Inc., Peking , Kiina), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche, Switzerland). Lysaatit sentrifugoitiin ja supernatantti otettiin talteen. Jälkeen kvantifioitiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford, USA), 80 ug proteiinia erotettiin 6% -12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) kalvo (Pall, NY, USA), joka sitten estänyt 5% rasvatonta maitoa, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla: Bcl-2 (1: 1000, Cell Signaling, Beverly, MA), Bax (1: 1000, Cell Signaling), kaspaasi-3 (1: 1000, Cell Signaling), AKT ja Pakt (1: 1000, Cell Signaling), VEGF (1: 500, Abcam) 4 ° C: ssa yön yli, GAPDH (1: 10000, sigma) huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita (1: 2000, Cell Signaling), inkuboitiin vielä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Antigeeni-vasta-kompleksin vyöhykkeet havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla kitillä (ECL-Plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). GAPDH: ta käytettiin lastaus ohjaus.

Käänteinen transkriptio-kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (RT-qPCR) B

Kokonais-RNA kasvainkudoksen uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, USA) ja ensimmäinen säikeen cDNA syntetisoitiin käyttäen Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Saksa), jossa oligo- (dT) alukkeita. Sekvenssit VEGF: n ja β-aktiini-alukkeet olivat seuraavat: Ihmisen VEGF: Forward: 5′-TCTACCTCCACCATGCCAAGT-3 ’, käänteinen: 5′-GATGATTCTGCCC TCCTCCTT-3’. β-aktiini: Forward: 5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3 ’, käänteinen: 5’GTGGCCAT CTCTTGCTCGAA-3’. Tarkkuus PCR-tuotteiden varmistettiin DNA-sekvensoinnilla.

Yhteensä 20 ui reaktioseosta käsitti 10 ui SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems), 8 ui DDH

2O, 1 ui cDNA-templaattia ja 1 ui alukkeita reagoivat jälkeen lämpökäsittelyyn olosuhteissa: yksi sykli 50 ° C: ssa 2 minuuttia, jota seurasi 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, 40 sykliä 95 ° C: ssa 20 sekunnin ajan ja 60 ° C: ssa 1 minuutti, joka näyte oli kolmena kappaleena (VIIA 7 Real Time PCR System, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). VEGF mRNA taso laskettiin 2

– (ΔΔCt) menetelmällä ja sitten normalisoidaan p-aktiinin ilme.

immunohistokemia

Kasvaimen kudokset ensin kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin . Sen jälkeen kun parafiini poistettiin käyttäen ksyleenin sarja, objektilasit nesteytyksestä on etanolilla sarja ja inkuboitiin 3% H

2O

2, jotta voidaan poistaa endogeenisen peroksidaasin. Sen jälkeen, kun antigeeni haku, kalvot inkuboitiin primaarisen vasta-aineen CD31 (01:50, Abcam), CD34 (1: 100, Abcam), kaspaasi-3 (1: 500, Cell Signaling) ja Ki67 (1: 500, Abcam) 4 ° C yön yli. Leikkeet pestiin PBS: llä 3 kertaa, ja niitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1: 100, Cell Signaling), 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Signaalit visualisoitiin diaminobentsii- reaktio ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Määrä CD31, CD34 värjätään alukset ja kaspaasi-3, Ki67 positiiviset solut analysoitiin 3 random HPF kunkin dian. Osiot primaaristen vasta-aineella poissa ja saman pitoisuuden sekundaarisen vasta-aineen toimi negatiivisena kontrollina.

Tilastollinen

Experiment tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD. SPSS 17.0 ja Sigma Plot 10,0 käytettiin tilastolliseen analyysiin ja juoni. Väliset vertailut käsiteltyjen ryhmien ja ajoneuvon hallinnan suoritettiin käyttämällä Independent-Samples T Test. P-arvo 0,05 pidettiin merkittävästi erilainen.

Tulokset

yhdistelmä kversetiini ja 2-ME lisääntynyt inhibitioon eturauhassyöpäksenograftista kasvaimen kasvua

Male BALB /c-nude-hiirten PC -3 ja LNCaP-solut ksenograftikasvaimissa sai vehikkeliä, Que tai 2-ME, ja niiden yhdistelmä, ja menettely kesti 4 viikkoa. Kun kasvaimet otettiin pois, oli selvää, että sekä PC-3 ja LNCaP ksenograftikasvaimina Que tai 2-ME hoitoryhmässä olivat pienempiä kuin kontrolli, ja inhibitio oli merkittävämpää vuonna Que ja 2-ME co-hoitoryhmässä (kuviot 1A ja 2A). PC-3 ksenograftikasvaimina Que, 2-ME ja yhdistelmähoito ryhmät estyy 24,8%, 28,9% ja 51,3% vastaavasti verrattuna ajoneuvon ohjaus (kuvio 1 B ja 1 C), ja LNCaP, esto korko oli 28,4%, 32,1 % ja 46,8% tässä järjestyksessä (kuvio 2B ja 2C). Koko intervention prosessi, Que, 2-ME ja niiden yhdistelmä oli hyvin siedetty hiirillä valitulla annoksella, laihtuminen kolmessa hoitoryhmässä eivät merkittävästi poikkea ohjaus (kuviot 1D ja 2D). Ei ollut eroa päivittäisen ruoan ja veden kulutus ryhmien välillä samoin. Muita myrkyllisiä reaktio liittyvät huumeiden ja ajoneuvot kuten huono metalli valtio, verivirtsaisuus ei havaittu. Merkittäviä eroja ei havaittu seerumissa biokemialliset parametrit kuten ALAT, ASAT, kreatiniinin ja ureatypen jotka heijastavat huumeiden myrkyllisyys maksan ja munuaisten välillä ennen ja jälkeen hoidon.

(A) PC-3 ksenograftikasvaimissa olivat pienemmät que tai 2-ME hoitoryhmässä kuin ajoneuvon hallinnan, ja inhibitio oli merkittävämpää vuonna que ja 2-ME co-hoitoryhmässä. Kasvaimen paino (B) ja kasvaimen tilavuus (C) vähenivät merkittävästi yhdistelmähoitoa, selvempi kuin Que tai 2-ME yksin. Ei ollut merkittävää eroa hiiren painon ryhmien välillä (D). Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. * P 0,05 verrattuna ohjaus, # P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja quercetin käsitellyssä ryhmässä, ※ P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja 2-ME: lla käsitellyssä ryhmässä.

(A) LNCaP ksenograftikasvaimissa olivat pienempiä Que tai 2-ME hoitoryhmässä kuin ajoneuvon hallinnan, ja esto oli merkittävä yhdistelmänä hoitoryhmässä. Que ja 2-ME: Yhdistelmähoito vähensi kasvainten paino (B) ja kasvaimen tilavuus (C) toisistaan, tehokkaampi kuin Que tai 2-ME yksin. Mitään merkittävää vaikutusta hiiren painon havaittiin ryhmien välillä (D). Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. * P 0,05 verrattuna ohjaus, # P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja quercetin käsitellyssä ryhmässä, ※ P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja 2-ME: lla käsitellyssä ryhmässä.

vaikutus kversetiini, jossa on 2-ME yhdistelmä hoidon Bax ja Bcl-2-proteiinin ilmentymisen

Western blot osoitti, että yhdistelmä Que ja 2-ME: parannettu apoptoosin induktion säätelemällä proapoptoottiset proteiini Bax ja anti-apoptoottiset proteiini Bcl-2: n ilmentymisen. Kuten kuviossa 3A esitetään, Bax lisääntynyt ja Bcl-2 laski yhden tai yhdistetyn huumeiden käsitellyissä ryhmissä sekä PC-3 ja LNCaP ksenografti- tuumorikudoksia. Vaikutus indusoiman apoptoosin määritettiin suhde Bax /Bcl-2, joka nostettiin Que tai 2-ME: lla käsitellyssä ryhmässä verrattuna kontrolliin, ja yhdistetty hoito johti kasvaa edelleen (kuvio 3B ja 3C).

(A) Western blot havaittu Bax ja Bcl-2-proteiinin ilmentymisen. (B, C) Bax /Bcl-2-suhde oli edustettuna keskiarvoja ± SD (keskiarvo kolmena kappaleena). * P 0,05 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin, # P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja quercetin käsitellyssä ryhmässä, ※ P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja 2-ME: lla käsitellyssä ryhmässä.

vaikutus kversetiini 2-ME yhdistelmähoito suhteesta katkaistun kaspaasi-3 /kaspaasi-3

Effect quercetin ja 2-ME lohkaistaan ​​kaspaasi-3 /kaspaasi-3-suhteen määritettiin western blot. Kuten on esitetty kuviossa 4A ja 4B, pilkottiin kaspaasi-3 /kaspaasi-3-suhteen koholla kversetiini tai 2-ME käsitelty PC-3 kasvainkudoksen ja tämä vaikutus oli selvempi yhteistyössä hoitoryhmässä. Sama ilmiö havaittiin LNCaP kasvainkudoksessa (kuvio 4A ja 4C).

(A) Western blot havaittu pilkottiin kaspaasi-3 ja kaspaasi-3-proteiinin ekspressio. (B, C) pilkotaan kaspaasi-3 /kaspaasi-3-suhde oli edustettuna keskiarvoina ± SD (keskiarvo kolmena kappaleena). * P 0,05 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin, # P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja quercetin käsitellyssä ryhmässä, ※ P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja 2-ME: lla käsitellyssä ryhmässä.

vaikutus kversetiini 2-ME: n yhdistelmän käyttöä kasvainten lisääntymistä (Ki67) ja apoptoosin (kaspaasi-3) B

immunohistokemiallinen analyysi osoitti, että leviämisen nopeus PC-3 ja LNCaP kasvainkudoksessa vähenivät 36,2 % ja 44,5% vastaavasti yhteistyössä hoitoryhmissä kuin verrokkiryhmän (p 0,05 ja 0,01 vastaavasti), selvempi kuin quercetin (22,6% PC-3, 27,3% ja LNCaP) ja 2-ME (26,7% PC-3 , 32% ja LNCaP) yksinään (kuvio 5A-5C). Vaikka kversetiini tai 2-ME kertahoitona paljon entistä suurempina kaspaasi-3-positiivisten solujen (Quercetin: 1,35 kertainen PC-3, 1,77 kertaisesti LNCaP. 2-ME: 1,8 kertaisesti PC-3, 1,95 kertainen LNCaP verrattuna kontrolli) , co-hoito johti enemmän kaspaasi-3-positiivisten solujen (2,43-kertaisesti PC-3, 2,56 kertainen LNCaP, verrattuna kontrolli) (p 0,01) (kuvio 5D-5F). Nämä tulokset osoittivat, että quercetin yhdistettynä 2-ME esti lisääntymistä ja edistää apoptoosia sekä PC-3 ja LNCaP kasvainkudoksen laajemmassa määrin.

(A, D) immunohistokemiallinen havaitseminen osoitti Ki67 ja kaspaasi-3-positiivisten solujen sekä PC-3 ja LNCaP ksenografti kasvain. Lukumäärä Ki67 (B, C) ja kaspaasi-3 (E, F) positiiviset solut olivat edustettuina tarkoittaa ± SD, lukumäärä oli kolme satunnaista suuritehoinen näkökenttään objektilasia kohti (valomikroskoopilla, hpf, 400 x). * P 0,05 verrattuna kontrolliin, # P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja quercetin käsitellyssä ryhmässä, ※ P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja 2-ME: lla käsitellyssä ryhmässä.

vaikutus kversetiini 2-ME yhdistelmä kohtelu fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /AKT signaalireitin

Western blot paljasti, että ei ollut merkittävää eroa AKT proteiinin ilmentymisen ryhmien välillä sekä PC-3 ja LNCaP -ksenografti kasvainkudoksen (kuvio 6A, 6D ja 6E). Katsovat, Pakt proteiini oli suuresti vähentynyt monoterapiassa ryhmissä verrattuna ajoneuvojen käsiteltyyn ryhmään ja esto oli paljon merkittävämpää kversetiini ja 2-ME yhdistelmä hoidetussa ryhmässä (kuvio 6A-6C).

(A) Pakt ja AKT proteiinin ilmentyminen tutkittiin western blot. Arvot Pakt (B, C) ja AKT (D, E), olivat edustettuina tarkoittaa ± SD (arvot kolmesta itsenäisestä kokeesta). * P 0,05 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin, # P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja quercetin käsitellyssä ryhmässä, ※ P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja 2-ME: lla käsitellyssä ryhmässä.

vaikutus kversetiini ja 2-ME yhdistetty käsittely VEGF-proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen

Kuviosta 7A-7C, voitiin havaita, että yhdistelmä kversetiini ja 2-ME vähensi VEGF-proteiinin ilmentymisen verrattuna yksilöllinen kohtelu, mikä puolestaan ​​osoittivat voimakkaampaa eston kuin ajoneuvon hallinnan. Kuten VEGF mRNA, Q-PCR osoitti alemmalla tasolla yksittäisissä terapiaryhmät kuin kontrolli, ja vaimennusvaikutus vahvistettiin edelleen yhteistyössä hoitoryhmässä tahansa PC-3 tai LNCaP tuumorikudoksista (p 0,01) (kuvio 7D ja 7E ).

VEGF-proteiinin (A) ja mRNA (D, E) ilmentyminen tutkittiin western blot ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR. Arvot VEGF-proteiinin (B, C), ja mRNA: ta (D, E), olivat edustettuina tarkoittaa ± SD (arvot kolmesta itsenäisestä kokeesta). * P 0,05 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin, # P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja quercetin käsitellyssä ryhmässä, ※ P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja 2-ME: lla käsitellyssä ryhmässä.

vaikutus kversetiini 2-ME yhdistelmä hoidon mikroverisuonitiheys

Inhibition vaikutusta mikroverisuonitiheys edustaa CD31 ja CD34 PC-3 ja LNCaP ksenografti kasvainkudoksen quercetin ja 2-ME tutkittiin tarkemmin immunohistokemiallisesti. PC-3 tuumorikudoksia, yhdistelmähoito johti merkittävä lasku CD31 ja CD34 (60.87% ja 56,1% vastaavasti) ilmaisun vertailu ajoneuvon käsitellyssä ryhmässä (P 0,01), kun taas vähentää korko oli 26.09% CD31, 39.02 % CD34 vuonna kversetiini sovellettu ryhmässä ja 43,38% CD31, 36.59% CD34 2-ME käytetty ryhmä (kuvio 8A, 8B, 8D ja 8E). LNCaP kasvain kudoksissa, CD31 ja CD34 olivat laski 50% ja 49.09% vastaavasti yhdessä hoitoryhmässä verrattuna ajoneuvon ohjaus (P 0,01), ja samaan aikaan, kversetiini tai 2-ME: lla on myös tuonut downregulation CD31 ja CD34 (Quercetin: 27.45% CD31, 30% CD34. 2-ME: 29.41% CD31, 32.73% CD34) (kuvio 8A, 8C, 8D ja 8F).

(A, D) immunohistokemiallinen tutkimus osoitti CD31 ja CD34-positiivisten suonten sekä PC-3 ja LNCaP ksenografti- kasvainkudoksen. Lukumäärä CD31 (B, C) ja CD34 (E, F) positiiviset suonet olivat edustettuina tarkoittaa ± SD, lukumäärä oli kolme satunnaista suuritehoinen näkökenttään objektilasia kohti (valomikroskoopilla, hpf, 400 x). * P 0,05 verrattuna kontrolliin, # P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja quercetin käsitellyssä ryhmässä, ※ P 0,05 tarkoittaa merkitsevää eroa yhdistelmä hoitoryhmässä ja 2-ME: lla käsitellyssä ryhmässä.

keskustelu ja päätelmät

lisääntyneestä ja kuolleisuus eturauhassyövän ja perustuu nykyiseen haitallisia hoidon tilanne kastraatio kestävä eturauhassyöpä (CRPC) [1,4], lääkeyhdistelmä on herättänyt suurta huomiota koska etu lisääntynyt syövän vaikutusta, vähemmän huumeiden annosta, vähemmän sivuvaikutuksia, jne. Tässä seuraava aiemmat in vitro -tutkimuksiin [14], teimme tutkimuksen yhdistää kversetiini 2-mE toimimaan ihmisen eturauhassyövän LNCaP ja PC-3-ksenografti kasvaimen BALB /c-nude-hiiri ja totesi, että yhdistetty käyttö parantaa estämällä ksenograftin kasvaimen kasvu, joka johtui apoptoosin induktion esto fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K) /Akt-signaalireitin ja angiogeneesiä.

Quercetin ja 2-ME lupaavat anti-eturauhasen syöpä aineita. Ainoana lääkkeenä, quercetin on varmistettu estävän eturauhassyövän kasvua sekä in vitro että in vivo [5,6]. Aikaisemmat Tutkimuksessa todettiin myös, että quercetin esti LNCaP kasvua alas sääntelyn androgeenireseptorin ja sen indusoitavissa geenit [24]. Mikä on enemmän, quercetin on erittäin alhainen toksisuus ja harvoin tuota mitään sivuvaikutuksia jopa korkeilla annoksella 200 mg /kg rotilla ja SCID [19,20], ja kliinisiä osoitti, että kokonaiskulutus 1000mg quercetin päivässä voisi olevan hyvin siedettyjä ihmisen ei liittynyt mitään sivuvaikutuksia [25,26]. 2-ME inhiboi myös kasvua eturauhassyöpäsolujen ja ksenografti- kasvain ei tuota luuydintoksisuuden muut MTA [10,11,13]. Suuri annos 150 mg /kg eläimille prekliinisissä polkuja [13] ja 1000 mg tai 1500 mg suun kautta neljä kertaa vuorokaudessa ihmisen vaiheen I ja II kokeissa voitiin hyvin siedetty ilman ilmeisiä toksisia vaikutuksia [27,28].

huolimatta nämä herättävä tulokset eturauhassyövän, kversetiini ja 2-ME sekä haittana on alhainen hyötyosuus diskonttaa niiden anti-eturauhassyövän vaikutus. Siksi ne on yhdistetty muiden aineiden, esimerkiksi quercetin vihreää teetä, ruokavalion kasviestrogeeneja ja tamoksifeenin [6,20,29,30], 2-ME albendat-, doketakselin ja eugenoli [10,13,31], ja kaikki osoittivat lisääntynyttä anti-eturauhasen syöpä vaikutuksen jopa pienellä annoksella, joka suuresti hullun ylös riittämätön hyötyosuutta. Chang et ai raportoi, että yhdistelmä kversetiini ja 2-ME kasvoi sytotoksinen vaikutus maksasolusyövän (HCC) soluihin verrattuna kversetiini tai 2-ME yksin [32]. On arveltu, että samanaikainen käyttö kversetiini ja 2-ME loisi enemmän anti-eturauhassyövän vaikutus enemmän turvallisuutta ja vähemmän toksisuutta. Meidän aikaisemmat in vitro koe osoitti, että yhdistetty käyttö kversetiini ja 2-ME osoitti synergistisen proliferaation inhibitio ja apoptoosin induktion sekä androgeeniriippuvaisissa LNCaP ja androgeenistä riippumattomat PC-3 ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa verrattuna yhden lääkkeen, ja se johtui pidätti solusyklin ja vähentämällä Bcl-2 /Bax suhteen [14]. Mutta se on tuntematon noin in vivo vaikutus eturauhassyövän ja in vitro tuloksia voida suoraan soveltaa kliinisen. Siksi yhdistimme kversetiini 2-ME toimimaan LNCaP ja PC3 ksenografti kasvain ja totesi, että yhdistelmähoito esti ksenograftin kasvaimen kasvua 46,8% ja LNCaP ja 51,3% ja PC3 verrattuna auton hallinnan tehokkaampaa kuin quercetin (28,4% for LNCaP, 24,8% ja PC3) tai 2-ME (32,1% for LNCaP, 28,9% ja PC3) yksinään. Lisäksi ne olivat hyvin siedettyjä ja mitään ilmeistä myrkyllistä reaktiota havaittiin koko käsittelyprosessin. On varmistettu, että yhdistelmä kversetiini ja 2-ME voi estää eturauhassyövän kasvua in vivo suuremmassa määrin enemmän tehoa ja turvallisuutta.

Kohdennettu hoito on katsottu kriittinen kemoterapeuttisen vaikutuksen luonnontuotteita ja phytochemicals [33 ]. Kversetiini ja 2-ME voi toimia joidenkin signaalin johtavia reittejä estää tehokkaasti eturauhassyövän kasvua erityisesti silloin, kun ne yhdistetään.

Bcl-2-perheen proteiinit, mukaan lukien antiapoptoottisten Bcl-2 ja proapoptoottiset Bax, on tärkeä välittäjä mitokondrion apoptoosireitin. Aktivoidut Bax auttaa toinen mitokondrioita johdettu aktivaattori kaspaasin (Smac) ja sytokromi-c release että näin aktivoida kaspaasi-3 osaksi katkaistuun kaspaasi-3 johtaa solun apoptoosin, kun taas antiapoptoottisten proteiini Bcl-2 estää Bax aktivaation sitomalla ja metalleja sitovia se kerroit syöpäsolut paeta apoptoosin [30,34]. Näin ollen, Bax /Bcl-2 -suhde ja taso pilkottiin kaspaasi-3 osoittavat terapeuttista vastetta ja jotka ovat hyvin tärkeitä apoptoosin [33]. Kversetiini lisääntynyt Bax /Bcl-2-suhde 1,3-kertainen androgeenin herkkien LAPC-4 eturauhassyöpäsolujen ksenografti kasvain [6]. Kumar, et ai raportoi, että kversetiini hoito lisäsi merkittävästi Bax /Bcl-2 -suhde ja kaspaasi-3: n aktiivisuuden in PC-3-soluja [30]. 2-ME esti lisääntymistä ja indusoi apoptoosia LNCaP ja PC3-solujen in vitro ja in vivo fosforylaation Bcl-2 [35,36]. Nykyinen tutkimus osoitti, että kversetiini ja 2-ME käyttää yksinään lisäsi proapoptoottiset proteiinin Bax, vähentynyt antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja kohonnut Bax /Bcl-2 -suhde mikä johtaa kaspaasi-3-aktivaation, joka vuorostaan ​​indusoi apoptoosia, ja se esti ksenograftin kasvaimen kasvua. Nämä tulokset vahvistettiin lisäksi immunohistokemiallista analyysiä kaspaasin 3 ja Ki67 positiivisia soluja. Lisäksi kaikki nämä vaikutukset parannettu yhdistelmä kversetiini ja 2-ME johtaa kasvaimen inhibitio suuremmassa määrin.

AKT, joka on seriini /treoniini proteiinikinaasi, jonka omistaja on PI3K /AKT selviytymisreittiin, on tärkeä rooli solujen eloonjäämistä ja apoptoosin, kun se aktivoidaan osaksi fosforyloituu AKT (Pakt). Pakt on ylössäädelty ja sillä on tärkeä rooli eloonjäämistä ja proliferaatiota ihmisen eturauhasen syöpäsolujen [37]. Korkea Pakt liittyy korkea-asteen ja korkea Gleason eturauhasen kasvaimia ja toimii itsenäisesti ennusta biokemiallisten uusiutuminen [38]. Näin ollen, AKT on pidetty lupaavana terapeuttisena kohteena eturauhasen syöpä. Kim et al osoitti, että quercetin vähensi Pakt proteiini helpottaa perävaunu indusoi apoptoosin LNCaP ja DU145 solulinjat [39]. Lee et al osoitti, että quercetin alennettu Pakt taso johtaa tukahduttaminen fosforyloidun Bad ja vaikuttaa suhde Bcl-xL: n ja Bax, joka sitten kasvoi aktiivisuus Bax ja johti lopulta LNCaP-solujen apoptoosin [40]. 2-ME valoherkkä PC-3 solujen fas välittämää apoptoosia estämällä Pakt [41]. Meidän kokeessa, kversetiini ja 2-ME voi vastaavasti vähentynyt Pakt proteiinin ilmentymistä sekä LNCaP-ja PC-3-ksenografti kasvainkudoksen, mutta Pakt vähentynyt huomattavasti ilmeisesti kun yhdistelmähoito on sovellettu. Estämällä Pakt signaalireitin, kasvaimen kasvu estyi tehokkaasti.

Angiogeneesi viittaa sukupolven uusien verisuonten ennestään verisuonistossa varmistaa kasvaimia saada riittävästi happea ja ravinteita, ja sitä säätelevät monet angiogeenisten tekijöiden, joista verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) on tärkein yksi [42]. Syöpälääkkeet voi inhiboida angiogeneesiä vähen- tämisessä VEGF jonka läpi kasvaimen kasvu estyy. Pratheeshkumar et al havaitsivat, että kersetiini vähensi VEGF tasoa PC-3-soluissa ja inhiboi verisuonen muodostumista sekä in vitro että in vivo. Tällä tavalla PC-3-solut ja ksenograftikasvaimissa inhiboi [43]. Quercetin myös vähensi merkitsevästi VEGF eritystä LNCaP [44]. Mabjeesh et ai valaistu, että 2-ME huomattavasti vähentynyt VEGF tasolla annoksesta riippuvaisella tavalla PC-3-soluja, ja sitten angiogeneesiä ja kasvaimen kasvu estyi [45].