Krooninen sairaus

tiivistelmä

lamellipodium, olennainen rakenne solujen vaeltamiseen, on tärkeä rooli hyökkäyksen ja etäpesäke syöpäsoluja. Vaikka Rac1 tunnustetaan keskeinen toimija muodostumista lamellipodioihin, molekyylitason mekanismeista lamellipodial motiliteettiin ei täysin tunneta. Optogenetiikka tekniikka meille mahdollisuuden spatiotemporally valvoa toimintaa valoaktivoituvia Rac1 (PA-Rac1) elävissä soluissa. Käyttämällä tätä järjestelmää, me paljasti rooli fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) in Rac1 riippuvainen lamellipodial motiliteetin PC-3 eturauhasen syöpäsoluja. Paikallisten sininen laser säteilytys PA-Rac1 ilmentävien solujen, lamellipodial motiliteettia palautuvasti aiheuttama. Ensinnäkin, ulospäin laajentamiseen lamellipodium rinnakkain alustaan ​​havaittiin. Pidennetty lamellipodium sitten näytti ruffling aktiivisuutta kehälle. Erityisesti PI (3,4,5) P

3 ja WAVE2 oli lokalisoitu ulottuu lamellipodium on PI3K-riippuvaisella tavalla. Olemme vahvistaneet, että esto PI3K suuresti tukahdutetaan lamellipodial laajennus, kun ruffling aktiivisuus oli vähemmän vaikutusta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Rac1 aiheuttama lamellipodial motiliteettia koostuu kahdesta erillisestä toimintaa, PI3K-riippuvainen ulospäin laajennus ja PI3K-riippumaton ruffling.

Citation: Kato T, Kawai K, Egami Y, Kakehi Y, Araki N (2014 ) Rac1-Dependent Lamellipodial potevilla Eturauhassyöpä PC-3 solujen paljasti optogenetiikka valvonta Rac1 Activity. PLoS ONE 9 (5): e97749. doi: 10,1371 /journal.pone.0097749

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 8. tammikuuta 2014; Hyväksytty: 24 huhtikuu 2014; Julkaistu: 21 toukokuu 2014

Copyright: © 2014 Kato et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Japan Society for Promotion of Science (JSPS) KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) 25861427 TK; 24659087 ja 23390039 ja NA; 26860136 ja 24890154 KK; 25860142 on YE; 24390369 on YK. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Cell maahanmuutolla on merkittävä rooli alkion organogeneesin; haavan paranemista ja immuunivasteita; ja monien tautien patogeneesiä, mukaan lukien syöpä ja metastaasit [1], [2]. Siksi ymmärrys molekyylitason mekanismien solujen vaeltamiseen on tärkeää kehittää uusia terapeuttisia strategioita estämään kasvaimen invaasion ja metastaasin. Solumigraation liittyy prosesseihin polarisoitunut solujen ulokkeen ja adheesion liikesuunnassa, solun supistuminen, purkaminen liima pesäkkeitä, ja takaisinveto kehällä solun takareunan [1]. Aikana kasvain solujen vaeltamiseen, joka liittyy syövän etäpesäkkeitä ja invaasiota, metastaattisen soluilla rajuja muutoksia muotoon. Tämä muodonmuutos johtuu aktiinisytoskeletonver- remodeling, joka säätelee Rho perhe GTPaasit kuten Cdc42 ja Rac1. Rho perhe GTPaasit käyttäytyvät molekyylikytkiminä, pyöräily aktiivisten GTP-sidottu muotoja ja aktiivinen BKT-sidottu muotoja. Rho perhe GTPaasit aktivoituvat guaniininukleotidiä vaihto tekijät (GEFs) ja inaktivoida GTPaasia aktivoivat proteiinit (GAP) [3]. Rac1, jäsen Rho perheen GTPaaseja, johtaa tuotannon levymäiset ulokkeet kutsutaan lamellipodioihin tai kalvo röyhelöitä, kun taas Cdc42, toisen jäsenen Rho perheen luo piikki ulkonemia nimeltään filopodia [3]. Rac1 on hyperactivated metastaattisessa eturauhassyövän solut [4]. Lisäksi esto Rac1 aktiivisuuden lohkojen migraation ja invaasion eturauhassyöpäsolujen [5]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että Rac1-välitteinen lamellipodial muodostuminen on tärkeä rooli eturauhassyövän etäpesäkkeiden.

Tähän mennessä ilmentymisen Rac1 mutanttien, kuten konstitutiivisesti aktiivinen (CA) Rac1Q61L ja vallitsevan negatiivisen (DN) Rac1T17N on laajalti käytetty tutkimiseen osallistumisen Rac1 vuonna lamellipodial muodostumiseen ja poimutuskokoonpanosta [6]. Kuitenkin solun fenotyyppi saadut tiedot käyttämällä Rac1 mutantteja on tulkittava varoen. Johtuen vaikutuksista peruuttamaton, pysyvä ja maailmanlaajuinen ilmentymistä soluissa, se on vaikea sanoa, että fenotyypit ilmentävien solujen Rac1 mutantteja täsmälleen heijastaa proteiinin toiminnan kanssa molekyyli kytkin. Valaista tarkkaa roolia spatiotemporal aktivoinnin Rac1, Wu et al. [7], [8] äskettäin kehitetty kuva-aktivoituva Rac1 (PA-Rac1) järjestelmä fuusioimalla valoa hapen jännite (lov) domeenin ja karboksiterminaalisen kierteisen jatkeen (Jα) sekvenssin aminopäähän konstitutiivisesti aktiivinen Rac1. LOV on proteiini valoa kytkin verkkotunnus

Avena sativa

phototropin 1. tumma, flaviinimono- sitova LOV domain vuorovaikutuksessa Jα ja lohkojen efektori sitoutumiskohta PA-Rac1 määrittämällä suljettuun konformaatioon. Valolla säteilyttäminen 400-500 nm valoa indusoi dissosiaatio LOV domain ja Jα spiraali, ja johtaa Rac1 aktivointia. Tämä kuva aiheuttama aktivointi on palautuva. Käyttämällä tätä järjestelmää, paikallinen Rac1 aktivointi osoitettiin olevan riittävä indusoimaan solun liikkuvuus ja suunnan määrittämiseksi solun liikkuvuus [7], [8].

suhde Rac1 ja fosfatidyyli-3-kinaasi (PI3K) in muodostuminen lamellipodioihin hankaloittaa koska PI3K toimii sekä ylä- ja alavirtaan Rac1 [9]. Fosfatidyyli 3,4,5-trifosfaatin (PI (3,4,5) P

3) tiedetään sitoutuvan Rac GEFs ja sitten nopeuttaa aktiini polymerointi kautta Rac1 aktivointi [10]. Lisäksi positiivista palautetta silmukka on raportoitu välillä PI (3,4,5) P

3 ja Rac solun polariteetti aikana eukaryoottinen kemotaksista [11], [12]. Kuitenkin säätelyyn solujen pullistuma ja polaarisuus, kertomuksia toiminta PI3K alavirtaan Rac1 sekoitetaan [13], [14]. Siten tarkka rooli PI3K alavirtaan Rac1 edelleen kiistanalainen kysymys.

selkeyttämiseksi merkitystä PI3K on Rac1 riippuvaisten lamellipodial motiliteettia, haimme PA-Rac1 järjestelmä syöpäsolujen. Kuvankäsittely PA-Rac1 jossa käytetään sinistä laseria meille mahdollisuuden erottaa kaksi lamellipodial liikkuvia prosesseja elävissä soluissa: lamellipodial laajennus ja oheislaitteiden poimutuskokoonpanosta. Erityisesti olemme havainneet, että PI3K-estäjien tukahdutti aloittamisen lamellipodial laajennus mutta oli vähän vaikutusta reuna-ruffling. Tämä tutkimus osoitti, että Rac1 riippuva lamellipodial liikkumaton prosessit koostuvat kahdesta erotettavissa toimintaa: PI3K riippuva lamellipodial ulospäin laajennus ja PI3K-riippumaton oheislaitteiden ruffling.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja cDNA Constructs

naudan sikiön seerumia (FBS) ja RPMI-1640 saatiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). X-tremeGENE HP DNA transfektioreagenssi hankittiin Roche Diagnostic Systems (Basel, Sveitsi). Muut reagenssit hankittiin Wako Pure Chemicals (Osaka, Japani) tai Nacalai Tesque (Kioto, Japani), ellei toisin ole mainittu.

pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L (plasmidi # 22027) ja pTriEx /mCherry- PA-Rac1 T17N (plasmidi # 22029) saatiin Addgene (Cambridge, MA). Dr. Joel A. Swanson (University of Michigan) ystävällisesti toimitti pmCitrine-AKT-pleckstrin homologiadomeeni (PH) ja pmCitrine-Rac1Q61L. PEGFP-N1-WAVE2 konstruktit antelias lahja tri Tadaomi Takenawa (Koben yliopisto).

Soluviljely ja transfektio

PC-3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen hankittiin American Type Culture Collection (Rockville, MD), ja niitä pidettiin RPMI, joka sisälsi 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa. Elävien solujen kuvantamisen, solut siirrostettiin 25 mm: n peitelaseilla 35 mm maljoille tiheydessä 2,0 x 10

4 solua /malja ja inkuboitiin yön yli ennen transfektiota.

X-tremeGENE HP DNA-transfektio Reagent käytettiin plasmiditransfektiolla mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L lisättiin 35 mm: n annoksia. In kotransfektiojärjestelmää hoitoja, 0,01-0,5 ug sopivilla plasmideilla lisättiin 35 mm astiat yhdessä 0,3 ug: PA-Rac1 plasmidi.

Drug Hoidot

määrittämiseksi roolia PI3K in Rac1 aiheuttama solun liikkuvuus, solut käsiteltiin PI3K-estäjien säteilytyksen aikana. Käytimme 50 uM LY294002 (Sigma), 100 nM wortmanniini (Sigma), ja 1 uM ZSTK474 (Active Biochemicals), kuten PI3K-estäjien. LY294002 ja wortmanniini, jotka ovat pan-PI3K estäjät, käytetään laajasti työkaluja tutkimiseen erilaisiin signaalitransduktioprosesseista joissa PI3K. ZSTK474 estää myös kaikki neljä PI3K-isoformeja, mutta ei inhiboi PI3K liittyvien kinaasien, kuten mTOR, ja DNA-riippuvaisen proteiinikinaasin. Nämä inhibiittorit liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), säilytettiin -20 ° C: ssa, ja lisättiin soluihin ilmoitetussa lopulliset pitoisuudet. Nämä inhibiittorit ovat tavallisesti lisättiin soluihin 30 minuuttia ennen valoaktivointia, mutta joissakin kokeissa, ne lisättiin aikana valoaktivointia. Valvontaa hoitoja, 0,1% DMSO: ta, soluille.

Fotoaktivaatiota ja Live-solujen Imaging

12-24 tuntia transfektion jälkeen elatusaine korvattiin Ringerin puskurilla (RB ), joka koostuu 155 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM CaCl

2, 1 mM MgCI

2, 2 mM Na

2HPO

4, 10 mM glukoosi, 10 mM HEPES pH 7,2, ja 0,5 mg /ml naudan seerumin albumiinia. 25 mm peitelaseihin pantiin RB-täytetyssä kammiossa on 37 ° C lämpö-ohjattu vaiheessa (Tokai Hit INU-ONI, Shizuoka, Japani). Fotoaktivoinnilla PA-Rac1 ja elävien solujen kuvantaminen suoritettiin käyttäen Axio Observer Z1 -käänteismikroskoopissa varustettu laserskannausyksikkö (LSM700, Zeiss), kuten aiemmin on kuvattu [15]. Jotta photoactivate PA-Rac1, osoitetun alueen ja eturauhasen syövän soluja, jotka ilmentävät mCherry-PA-Rac1 toistuvasti säteilytetyn käyttäen 5 mW 445 nm laser 0,2% virtaa merkitty ajanjaksoja fotobleknande tilassa. Elävien solujen kuvat hankittu kautta 63x Plan-Apochromat /N. A. 1.4 linssi välein 15 sekunnin käyttämällä 10 mW 555 nm laser 0,5% -2,0% valtuudet saada mCherry fluoresenssi ja kirkkaan kentän vaihe-kontrastin kuvia. Visualisoida PI (3,4,5) P

3 tai WAVE2, solut kotransfektoitiin pmCherry-PA-Rac1 ja pmCitrine-AKT-PH domain tai pEGFP-WAVE2, vastaavasti. EGFP tai mCitrine fluoresenssikuvia hankittiin vain ensimmäisen ja viimeisen ajankohtina välttää tahattoman fotoaktivaation jonka 488 nm laser, koska tämä viritysaallonpituus hieman päällekkäinen valoaktivaatioon spektri [8]. Sopeutimme teho 488 nm laser mahdollisimman alhainen, jotta hankinta ensimmäisen kehyksen laserin ei vaikuttaisi PA-Rac1 aktiivisuutta.

Aikaväli kuvia käyttämällä vaihe-kontrastin ja fluoresenssimikroskopiaan olivat otettu 15 sekunnin välein ja koota QuickTime elokuvia Zen 2009 -ohjelmiston (Carl Zeiss). Kymograph analyysit suoritettiin käyttäen MetaMorph kuvankäsittelyohjelma (Molecular Devices). Kuva Tässä esitetyt tiedot edustavat tuloksia vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

Kvantitatiivinen kuva-analyysi

kvantitatiivinen kuva-analyysi lamellipodial laajennuksen vuoksi PA-Rac1 fotoaktivaation puuttuessa tai läsnäolo PI3K-estäjien, otimme mittaukset solun alueella kasvaa vähentämällä alueiden solujen ennen valoaktivointia niiltä jälkeen fotoaktivaation käyttävät MetaMorph kuvankäsittelyohjelmalla.

kvantitatiivinen analyysi mCitrine-AKT-PH ja EGFP-WAVW2 rekrytointi ja valoaktivoidut alueilla fluoresenssin alueiden edun mitattiin käyttäen MetaMorph kuvankäsittelyohjelmalla. Fluoresenssin mCitrine ja EGFP jälkeen 5 min valoaktivoinnin verrattiin fluoresenssivoimakkuudet vastaavalla alueella ennen fotoaktivaation käyttäen vähintään 16 solua.

määrällisesti vaikutukset PI3K-estäjien laajennettu lamellipodioihin ja poimutuskokoonpanosta aktiivisuus mCitrine-Rac1Q61L-ilmentävien solujen, solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 30 min lisäämisen jälkeen PI3K-estäjien (50 uM LY294002, 100 nM wortmanniini, tai 1 uM ZSTK474) tai pelkkää vehikkeliä (0,1% DMSO). Käyttäen MetaMorph kuvantamisjärjestelmä, suurin halkaisija ilmentävien solujen Rac1Q61L mitattiin ennen ja jälkeen lääkkeen käsittelyjen vaikutuksen arvioimiseksi PI3K inhibition laajennettuun lamellipodial. Samoin reuna-röyhelöt solua kohti laskettiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia vaikutusten arvioimiseksi PI3K estoa ruffling toimintaa. Kolmekymmentä solut kussakin ryhmässä altistettiin kvantitatiivisen kuva-analyysin.

Data esitetään keskiarvoina ± keskivirhe (SE) ja solujen lukumäärä merkitty tekstissä. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Wilcoxonin t-testi ominaisuus Excel 2012 Erot analysoiduista näytteistä katsottiin merkitsevä p 0,05.

Tulokset

Paikallinen aktivointi PA-Rac1 reversiibelisti indusoi Lamellipodial laajennus ja poimutuskokoonpanosta

Valaistaan ​​suhdetta Rac1 aktivointi ja lamellipodial dynamiikka toimme mCherry-fuusioituneet PA-Rac1 osaksi PC-3-solut. Kun olet vahvistanut ilmaus mCherry-PA-Rac1 perustuu mCherry signaali, me säteilytetty syrjäisen alueen soluista käyttäen 445 nm: n laser aikana välein kuva hankinta ja hankitun faasikontrasti- kuvia elävien solujen välein 15 sekuntia konfokaalisella mikroskopia. Tyypillisesti, sen jälkeen kun 1-4 min säteilytyksen kanssa 445 nm laser, ohut levymäinen uloke (eli lamellipodium), joka ulottuu yhdensuuntaisesti substraattiin havaittiin solun reuna-sivusto, joka säteilytettiin 445 nm: n laser. Lamellipodium saavutti enimmäispituus jälkeen 5-6 min PA-Rac1 aktivointia. Tuolloin jälkeen ulospäin laajennus, täysin ulkona lamellipodium käpertyneenä sen etureuna osoittaa reuna ruffling liikettä. Ruffling liikkeet jatkettiin ajaksi säteilytys. Säteilytyksen jälkeen lakkasi, sekä lamellipodial laajennuksen ja oheislaitteiden poimutuskokoonpanosta viipymättä vetäytyi (Fig. 1 ja Movie S1). Edellisessä tutkimuksessa, selkä- ruffling aiheutettiin RAW 264 makrofagien PA-Rac1 aktivointi [15], [16], mutta selkä ruffling ei ollut näkyvä PC-3-solut.

PC-3-solut olivat lyhytaikaisesti transfektoitu pTriEx /mCherry-PA-Rac1 ja alistettiin paikallisia fotoaktivoinnilla PA-Rac1 (suorakulmainen rajattu alue siniset pisteet). Time-lapse kuvia PC-3 ilmentävän solun mCherry-PA-Rac1 aikana hankittiin fotoaktivaation käyttäen 445 nm laser säteilytys. Ylempi ja keskimmäinen paneelit esittävät vaiheittain kontrastin ja mCherry fluoresenssi kuvia, vastaavasti. Kuluneen kertaa aloittamisen jälkeen valoaktivoinnin näkyvät yläosassa. Vuonna pohjalevy, ääriviivat solun muodon ilmoitettuina kuluvaa aikaa piirretään sinisellä (0 min, alkuperäinen), keltainen (3,5 min, jatkotutkimuksessa), ja punainen (6 min, ruffling vaihe). Musta profiilit osoittavat kalvon röyhelöitä. Asteikko bar, 10 pm.

Kun säteilytetty eri aluetta saman solun, joka on lamellipodial laajennusosa syntyy vasta säteilytetty alueella, mikä viittaa siihen, että nämä ilmiöt olivat riippuvaisia ​​paikallisista PA-Rac1 aktivaatio säteilylle (Fig. 2). Yli-ilmentyminen BKT-sidottu (hallitseva negatiivinen) mutantin PA-Rac1 (PA-Rac1 T17N) ei indusoinut joko lamellipodial laajentaminen tai perifeerinen ruffling jälkeen 445-nm laser säteilytys (ei kuvassa). Tämä havainto osoitti, että morfologiset muutokset aiheuttamien 445 nm laser säteilytys ovat riippuvaisia ​​GTP-ladattu Rac1.

Aikaväli kuvia PC-3 ilmentävän solun mCherry-PA-Rac1 aikana hankittiin PA-Rac1 valokuva-manipulointia paikallisten lasersäteily eri alueilla. Valittu vaihe-kontrastin ja mCherry fluoresenssi kuvat näytetään. Ensimmäinen, alue 1, säteilytettiin 10 min. Säteilytys sitten siirrettiin alueelle 2. 25 min, säteilytys oli sammutettu. Valittu aika-raukeavat kuvia vaihe-kontrastin ja mCherry fluoresenssin näkyvät. Jatkeena ja lyhentämällä lamellipodioihin on esitetty punainen ja keltainen, vastaavasti. Asteikko bar, 10 pm.

PA-Rac1 aiheuttama Lamellipodial Extension riippuu PI3K

tarkastella estävä vaikutus PI3K PA-Rac1 aiheuttama lamellipodial motiliteettia, me käytetyt LY294002, synteettinen estäjä PI3K. Ensin vahvisti, että solut, jotka ilmentävät PA-Rac1 näytteillä lamellipodial laajennus ja poimutuskokoonpanosta vuoksi valoaktivointia. Lopettamisen jälkeen valoaktivointia, lisäsimme 50gM LY294002 samaan soluihin. Kun säteilytetty samoilla alueilla solujen 30 min lisäämisen jälkeen LY294002, lamellipodial laajennus suuresti tukahdutti PI3K-estäjä (Fig. 3A ja Elokuva S2). Suoritimme saman kokeissa käyttäen 22 PC-3-soluja, ja verrattiin kvantitatiivisesti alueen kasvu johtuu PA-Rac1 aktivoinnin kussakin solussa ennen ja jälkeen hoidon LY294002 (Fig. 3B). Määrällinen kuva-analyysi osoitti, että lisäys solun alueella, koska PA-Rac1 aiheuttama lamellipodial laajennus merkittävästi tukahdutti LY294002 (p 0,01, n = 22, Fig. 3B).

(A) PC 3-soluja transfektoitiin ohimenevästi pTriEx /mCherry-PA-Rac1. Solut altistettiin toistettiin fotoaktivaation puuttuessa (kontrolli) tai läsnä oli 50 uM LY294002. Johtava reuna ulottuu lamellipodium on esitetty punaisella. Asteikko bar, 10 mikrometriä. (B) lisääntynyt solun alueella, koska lamellipodial laajennus kvantitoitiin vähentämällä solun alueella ennen fotoaktivaation alueelta solun 7 min aloittamisen jälkeen PA-Rac1 aktivointi. Tämä kasvu varmistettiin 22 PC-3-solut. Tiedot juoni näyttää lisääntyneen alueella silloin lamellipodial laajennus, joka indusoitiin PA-Rac1 fotoaktivaation puuttuessa [LY (-)] tai läsnä LY294002 [LY (+)]. Merkitys eroja LY (-) ja LY (+) varmistettiin Wilcoxonin t-testi (oikealla). Kasvu lamellipodial alueella, kun läsnä on LY294002 oli merkittävästi pienempi kuin kontrollisolujen (p 0,01). (C) Kymographic analyysi suoritettiin kaksipäinen nuoli sijoitettu poikki lamellipodium PC-3 ilmentävän solun mCherry-PA-Rac1 ennen ja lisäyksen jälkeen LY294002. Laser-säteilytetty alue on merkitty sinisellä suorakulmio. Valkoisen viivan hahmotellaan ulottuvan lamellipodium, ja katkoviiva hahmotellaan alkuperäisen solun muotoon. Alempi paneeli esittää kymograph on lamellipodium muutostilanteissa pitkä. Kymograph osoittaa laajentamista ja takaisinveto on lamellipodium aikana PA-Rac1 aktivointi (sininen 1) ja deaktivointi (musta 1), tässä järjestyksessä. Vihreä nuoli osoittaa lisäämällä LY294002. PI3K-inhibiittori oli vähemmän estävä vaikutus lamellipodial laajennus ja poimutuskokoonpanosta (sininen 2). Kuitenkin aloittamisesta lamellipodial laajennus rajusti esti (musta 2-sininen 3). Mittaviivat 10 um.

Lisäksi, teimme kymographic analyysi määrittää muutokset pituus lamellipodioihin. Kun olet vahvistanut PA-Rac1 aiheuttama lamellipodial laajennus ja poimutuskokoonpanosta vuoksi PA-Rac1 valoaktivointia lisäsimme LY294002 soluihin aikana PA-Rac1 valoaktivointia. Vaikka pituudet lamellipodioihin olivat muuttuneet reuna ruffling, inhiboiva vaikutus LY294002 on lamellipodial laajennus oli pieni. Perifeerinen ruffling jatkunut ajaksi säteilytys. Välittömästi sen jälkeen valoaktivointia lakannut, sekä lamellipodial laajennus ja oheislaitteiden poimutuskokoonpanosta väistynyt kokonaan. Kun uudelleen säteilytetty samalla alueella, solut eivät näytä lamellipodial laajennus (Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että muodostumista lamellipodium on herkempi PI3K-estäjien kuin on ylläpitää laajennettu lamellipodioihin ja reuna poimutuskokoonpanosta.

Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä 100 nM wortmanniini tai 1 uM ZSTK474 kuten PI3K-estäjien (Fig. S1). Kontrollina sama PA-Rac1 aktivointi kokeet suoritettiin käyttämällä soluja, käsiteltiin 0,1% DMSO: ta, ajoneuvossa estäjiä. PA-Rac1 aiheuttama lamellipodial muodostumista ei inhiboinut DMSO (Fig. S2).

PA-Rac1 Fotoaktivaatiota voi Paikallisesti Aktivoi PI3K ja Kutsu WAVE2

Koska PA-Rac1 aiheuttama lamellipodial laajennus oli estävät PI3K-inhibiittorit, yritimme tehdä selväksi, että PA-Rac1 aktivointi johti PI3K aktivointia. Voit seurata tuotannon PI (3,4,5) P

3 mukaan PI3K, PC-3-solut kotransfektoitiin pmCitrine-AKT-PH ja pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L ja havaittiin käyttäen Zeiss LSM700 (kuvio . 4). Fluoresenssin voimakkuus mCitrine-AKT-PH on lamellipodial etureunan jälkeen 5 min PA-Rac1photoactivation mitattiin käyttäen MetaMorph kuvantamisen ohjelmistoja ja kvantitatiivisesti verrattiin saman alueen ennen valoaktivointia. 5 minuutin kuluttua paikallisen aktivaation PA-Rac1, fluoresenssin intensiteetti mCitrine-AKT-PH oli 125,4% ± 22,3%: n lisäys (n = 16) verrattuna, joka on mitattu ennen valoaktivointia, mikä viittaa siihen, että tasot PI (3,4 , 5) P

3. ulottuvan lamellipodioihin olivat huomattavasti lisääntynyt paikallinen fotoaktivoinnilla PA-Rac1. Kun läsnä on LY294002, ei soluja osoitti kasvua fluoresenssin voimakkuus mCitrine-AKT-PH säteilytyksen jälkeen. Tämä havainto viittaa siihen, että Rac1 fotoaktivaation aktivoi PI3K tuottaa PI (3,4,5) P

3 PI (4,5) P

2: n kalvo ulottuu lamellipodioihin.

PC -3-solut kotransfektoitiin pTriEx /mCherry-PA-Rac1 ja mCitrine-AKT-PH. Vaiheittain sijaan mCherry-PA-Rac1 (punainen fluoresenssi), ja mCitrine-AKT-PH (keltainen fluoresenssi) kuvia on hankittu ennen ja jälkeen PA-Rac1 valoaktivointia. PA-Rac1 fotoaktivaation toistettiin samassa solussa alueen puuttuessa (kontrolli) tai läsnä 50 uM LY294002. Tasot PI (3,4,5) P

3 korotettiin laajentamista lamellipodium valoaktivaatiolla (nuolenpäitä). Läsnäollessa LY294002, PI (3,4,5) P

3 ei lisääntynyt alueella, jossa PA-Rac1 oli valokuva-aktivoitu. Sininen pisteellä suorakulmio osoittaa valoaktivointia alueella. Nostava lamellipodium on hahmoteltu punaisena. Mittaviivat 10 pm.

Lisäksi olemme tutkineet dynamiikka WAVE2 aikana lamellipodioihin-tuotantoprosessista, koska WAVE2 on tärkeä rooli Rac1 aiheuttaman aktiini uudelleenjärjestelyä yhdessä PI (3,4 , 5) P

3 [17] – [19]. Kun 5 min säteilytyksen 445 nm valo, EGFP-WAVE2 lokalisoitu pisteviivalla kärjessä pidennettävän lamellipodial (Fig. 5). Fluoresenssin voimakkuus EGFP-WAVE2 jälkeen valoaktivointia osoitti 315,1% ± 54,4%: n lisäys (n = 17) on etureuna, joka ulottuu lamellipodioihin. Lisäyksen jälkeen LY294002, ei EGFP-WAVE2 rekrytointi eikä lamellipodial laajennus indusoitiin PA-Rac1photoactivation (Fig. 5). Nämä havainnot osoittavat, että WAVE2 värvää PI (3,4,5) P

3 ja edistää Rac1 riippuvainen lamellipodial laajennuksen kautta aktiinin polymeroitumisen.

PC-3-solut kotransfektoitiin pTriEx /mCherry-PA-Rac1 ja pEGFP-N1-WAVE2. Vaiheittain sijaan mCherry-PA-Rac1 (punainen fluoresenssi), ja EGFP-WAVE2 (vihreä fluoresenssi) kuvia on hankittu ennen ja jälkeen PA-Rac1 valoaktivointia. PA-Rac1 fotoaktivaation toistettiin samassa solussa alueen puuttuessa (kontrolli) tai läsnä 50 uM LY294002. Keltaiset arrowheads mukaan WAVE2 rekrytoitiin etureuna laajentamista lamellipodium. Kun läsnä on LY294002, WAVE2 ei palvelukseen kehän soluissa, joissa PA-Rac1 oli fotoaktivoida. Sininen pisteellä suorakulmio osoittaa valoaktivointia alueella. Asteikko bar, 10 pm.

PI3K estäjät eivät vaikuta Laajennettu lamellipodioihin mutta eivät paranna Peripheral ruffling

selkeyttämiseksi vaikutuksen PI3K estoa ylläpitämiseen laajennettu lamellipodioihin, haimme LY294002 PC-3-solut ilmentävät mCitrine-Rac1Q61L, konstitutiivisesti aktiivinen Rac1 mutantti. MCitrine-Rac1Q61L ilmentävien solujen oli hyvin levinnyt lamellipodioihin ympärillä koko kehillä. Kun lisäsimme 50 uM LY294002 näihin soluihin, laajennettu lamellipodioihin pieneni vain hieman, vaikka 30 min. Yllättäen perifeerinen ruffling aktiivisuus oli merkittävästi tehostaa PI3K inhibition Rac1Q61L ilmentävien solujen (Fig. 6 ja elokuva S3). Kvantitatiivinen analyysi muutosten suurin solun halkaisija osoitti, että tämä tekijä ei merkittävästi vaikuta mikään PI3K estäjä, kun taas määrä reuna-röyhelöt oli kasvanut huomattavasti sen jälkeen, kun 30 min PI3K esto (taulukko 1).

PC- 3-solut transfektoitiin pmCitrine-Rac1Q61L. Aikaviivekytkin kuvia vaihe-kontrastin ja mCitrine-Rac1Q61L fluoresenssi vangittiin ennen (vasemmalla) ja jälkeen (oikealla) lisäämällä LY294002. Kymographs luotiin näyttää muutokset pituus lamellipodium on asema kaksipäinen line. MCitrine-Rac1Q61L ilmentävän solun oli laajennettu lamellipodium koko ympärykseltään. Jälkeen lisäämällä 50 uM LY294002, laajennettu lamellipodium oli kutistunut vain hieman, mutta reuna ruffling lausuttiin. Kymographs osoittavat dynaamisia muutoksia pituus johtuu tehostetun ruffling lisäämisen jälkeen LY294002. Mittaviivat 10 um.

Keskustelu

lamellipodioihin voidaan luokitella kolmeen tyyppiin: ohut johtava solun reunalla, joka ulottuu kalvon pitkin kasvualusta, perifeerinen ruffles muodostettu ylöspäin taipuminen etureunan, ja pystysuoran selän poimujen, jotka näkyvät takana etureunan selän solun pinnalla [9], [20]. Kuitenkin erilaisia ​​mekanismeja, jotka säätelevät näiden lamellipodial liikkuvia prosesseja ei ole selvitetty. PC-3-solujen ja muiden syöpäsolujen eivät osoita selkä ruffling, joka havaitaan RAW264 makrofageissa, kun PA-Rac1 aktivointi [15]. Tämä ristiriita on todennäköisesti johtuu eroja näiden solutyyppien. PC-3-solut osoittivat huomattavaa lamellipodial laajennus ja oheislaitteiden poimutuskokoonpanosta upon PA-Rac1 aktivointia. Tässä tutkimuksessa tehtiin karakterisoimiseksi lamellipodial dynamiikkaa ja niiden sääntelyn PC-3 syöpäsolujen, kuten lamellipodial liikkuvuuteen on keskeinen rooli hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden eturauhassyöpäsolujen.

Aiemmat raportit ovat todenneet, että esto PI3K-vaikutus estää kaikki verihiutaleiden kasvutekijä (PDGF) aiheuttama lamellipodial liikkuvia prosesseja fibroblasteissa, kuten laajennus, perifeerinen ruffling, ja selkä ruffle muodostumisen [19]. Koska PI3K osallistuu alkuvaiheessa signaalitransduktion peräisin PDGF-reseptori fibroblasteissa [21], kaikki vastaukset PDGF voitaisiin ajautui PI3K esto. Kuitenkin PI3K-vaikutus on tiettävästi tarpeetonta M-CSF aiheuttama ruffling ja EGF aiheuttama selkä ruffling vuonna A431-soluissa [22], [23]. Näin ollen signaloinnin erillistä reseptoreihin johtaa röyhelöreunaiset muodostumista erilaisissa solutyypeissä. Meidän kokeissa käyttäen optogenetiikka valvontaa Rac1 toimintaa, voimme suoraan aiheuttama Rac1 välittämää lamellipodial aktiivisuutta ilman ylävirtaan signaloinnin reseptoreihin. Koska osallistuminen PI3K alussa signaalin siirtoon eri tyyppisiä reseptoreita voitaisiin näin ollen jättää huomiotta, voimme valaista roolia PI3K vuonna lamellipodial liikkuvuudessa alavirtaan Rac1. Käyttämällä elävien solujen kuvantamisen yhdistettynä PA-Rac1 photomanipulation, voisimme osoittavat selvästi, että lamellipodium ensimmäinen ulottuu ulospäin samansuuntaisesti alustaan, ja että täysin ulkona lamellipodium sitten näyttää ruffling aktiivisuutta curling etureuna. Lisäksi olemme havainneet, että lamellipodial laajennuksen aiheuttama PA-Rac1 aktivointi oli vakavasti huolestuneita PI3K-estäjien, kun reuna-ruffling ei estynyt. Nämä tulokset viittaavat siihen, että kahdenlaisia ​​lamellipodial liikkuvuutta, laajennus ja poimutuskokoonpanosta, differentiaalisesti säätelee PI3K-riippuvaisen ja PI3K-riippumaton signalointireitteihin.

Wiskott-Aldrichin oireyhtymä proteiini (WASP) ja WASP-perheen verprolin-homologista proteiinia (WAVE) perheen proteiinit ovat aktivaattoreita Arp2 /3-riippuvaista polymerointi [17]. WAVE proteiinit liittyvät lamellipodial muodostumisen kautta Rac1 signalointireitin. Voit estää sekainen aktiini polymerointi, WAVE proteiinit esiintyä heteropentameric proteiinikomplekseina haittaavia omia aktiivisia kohtia. Vaikka aallot funktionaalisesti aktivoidaan GTP-sidottu Rac1 kun aktiini polymerointi aloitetaan, aallot ei voi sitoa suoraan GTP-sidottu Rac1. Sen sijaan, IRSp53 (insuliinin reseptori tyrosiinikinaasin substraatti p53) toimii kytkijämolekyyliä yhdistää Rac1 ja WAVE monimutkainen [18]. GTP-sidottu Rac1 indusoi allosteerisessa muutoksen WAVE monimutkainen, joka altistaa sen aktiivisen; WAVE2 aktivoi Arp2 /3 kompleksi, joka tulee ydin aktiinin polymerointi etureunan lamellipodium [24] – [26].

Meidän PA-Rac1-aktivointi kokeissa WAVE2 paikallistettiin etureuna ulottuu lamellipodioihin. Kumpikaan ei kuitenkaan WAVE2 rekrytointi eikä lamellipodial laajennus havaittiin, kun PI3K estyi. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PI (3,4,5) P

3 vaaditaan WAVE2 rekrytointia ja lamellipodial laajennus. Koska WAVE2 on PI (3,4,5) P

3-sitoutuva sekvenssi [19], PI (3,4,5) P

3 voi rekrytoida WAVE2 etureunaan. Suetsugu et ai. [18] ilmoitetaan, että aktiivisuus WAVE2 kompleksin optimoitiin IRSp53 yhdessä aktivoidun Rac1 ja PI (3,4,5) P

3. Lisäksi samanaikainen sitoutuminen GTP: hen sitoutuneen Ras ja happamat fosfolipidit, kuten PI (3,4,5) P

3 WAVE2 tarvitaan tehokasta rekrytointia ja aktivointi WAVE2 [17]. Nämä aiemmat raportit vahvistavat väitteen, että esto lamellipodial pidennys PI3K-estäjien tulokset häiritseekin WAVE2 rekrytointi.

Tässä tutkimuksessa aktivointi PA-Rac1 aiheuttama tuotannon PI (3,4,5 ) P

3 ja rekrytointi WAVE2 kun lamellipodial laajennus aloitettiin. Lisäksi PI3K-estäjien haitannut rekrytointi WAVE2 ja PI (3,4,5) P

3 ja tukahdutti lamellipodial laajennus. Nämä havainnot osoittavat, että PI3K olennainen rooli käynnistämisessä lamellipodial laajennus. Lisäksi käytimme konstitutiivisesti aktiivinen Rac1Q61L-ilmentävien solujen tarkkailla vaste laajennetun lamellipodioihin inhibitioon PI3K. Soluissa, jotka ilmentävät Rac1Q61L, laajennettu lamellipodioihin olivat suhteellisen resistenttejä PI3K-estäjien.